CN105434476A

CN105434476A - 一种脆弱拟杆菌在预防和/或治疗炎症性肠病中的应用

Info

Publication number: CN105434476A
Application number: CN201510728725.7A
Authority: CN
Inventors: 智发朝; 白杨; 王晔; 刘洋洋; 王从峰
Original assignee: Guangzhou Zhiyi Biotechnology Co Ltd
Current assignee: Guangzhou Zhiyi Biotechnology Co Ltd
Priority date: 2015-10-29
Filing date: 2015-10-29
Publication date: 2016-03-30
Anticipated expiration: 2035-10-29
Also published as: CN105434476B; WO2017071347A1

Abstract

一种脆弱拟杆菌ZY-312在预防和/或治疗炎症性肠病中的应用，包括脆弱拟杆菌ZY-312用于制备预防和/或治疗炎症性肠病的药物、药物组合物、食品、保健品及食品添加剂等的应用。本发明经由活体内及体外的相关实验证实，脆弱拟杆菌ZY-312对炎症性肠病，包括溃疡性结肠炎或克罗恩病，具有优异的抵抗力且无毒副作用，可持久且有效地应用于制备预防和/或治疗炎症性肠病的药物、药物组合物、食品、保健品或食品添加剂，这些药物、药物组合物、食品、保健品或食品添加剂可用于预防和治疗炎症性肠病，具有重大应用价值。

Description

一种脆弱拟杆菌在预防和/或治疗炎症性肠病中的应用

技术领域

本发明涉及微生物技术领域，特别是脆弱拟杆菌ZY-312在预防和/或治疗炎症性肠病中的应用，包括制备药物、药物组合物、食品、保健品及食品添加剂等的应用。

背景技术

炎症性肠病(Inflammatoryboweldisease，IBD)是一组不明原因的慢性肠道炎症性疾病，包括溃疡性结肠炎(Ulcerativecolitis，UC)和克罗恩病(Crohn'sdisease，CD)。前者又称非特异性溃疡性结肠炎，是一种原因不明的直肠和结肠的炎症，病变主要限于大肠黏膜与黏膜下层。后者为一种慢性肉芽肿性炎症，病变可累及胃肠道各部位，而以末段回肠及临近结肠为主，多呈节段性、非对称性分布(蒋蔚茹.炎症性肠病的认识与治疗进展[J].上海医药,2010,05:207-210.)。炎症性肠病的发病机制尚未阐明，目前认为是基因上易感人群对肠道共生微生物产生过度的先天或后天免疫反应所致(蒋蔚茹.炎症性肠病的认识与治疗进展[J].上海医药,2010,05:207-210.)。肠黏膜屏障功能损伤参与了IBD的发生(毛靖伟,王英德.肠黏膜屏障在炎症性肠病中作用机制的研究进展[J].世界华人消化杂志,2010,07:695-698.)。

IBD在不同国家、地区、种族人群中的发病率不同，有显著的地域和种族差异。Molodecky等(MolodeckyNA，SoonIS，RabiDM，etal.Increasingincidenceandprevalenceoftheinflammatoryboweldiseaseswithtime，basedonsystematicreview[J].Gastroenterology，2012，142(1):46-54.)检索了1950-2010年有关IBD流行病学研究的文献，结果显示欧洲、亚洲、北美洲UC最高发病率分别为24.3/10万、6.3/10万、19.2/10万；CD最高发病率分别为12.7/10万、5.0/10万、20.2/10万。欧洲、北美洲UC最高患病率分别为505/10万、249/10万；CD最高患病率分别为322/10万、319/10万。可见IBD在亚洲的发病率低于欧美国家。据报道日本UC、CD的发病率分别为每年0.5人/10万和0.08人/10万(陆星华.克罗恩病的诊断和治疗[J].中华消化内镜，2007，1(6)：26-35.)。

近20年来，IBD病例数在国内迅猛增加。1989-2007年间我国IBD文献报道病例数逐渐增多(HuRW，OuyangQ，ChenXetal.AnalysisofthearticlesofinflammatoryboweldiseaseintheliteratureChinainrecentfifteenyears[J].ChinJGastroenterol，2007，12:74-77.)。Jiang等(JiangXL，CuiHF.Ananalysisof10218ulcerativecolitiscasesinChina[J].WorldJGastroenterol，2002，8(1):158-161.)分析了1981-2000年国内文献报道的10218例UC患者，发现10年间病例数上升了3.08倍。Wang等(WangY，OuyangQ；APDW2004ChineseIBDworkinggroup.UlcerativecolitisinChina:retrospectiveanalysisof3100hospitalizedpatients[J].JGastroenterolHepatol，2007，22(9):1450-1455.)和中国IBD工作组(

APDW2004ChineseIBDWorkingGroup.Retrospectiveanalysisof515casesofCrohn’sdiseasehospitalizationinChina:nationwidestudyfrom1990to2003[J].JGastroenterolHepatol，2006，21(6):1009-1015.)对1990-2003年间IBD住院患者进行回顾性研究，共收集3100例UC和515例CD患者，结果显示我国IBD住院患者呈逐渐增加趋势，粗略推测UC患病率约为11.6/10万，CD约为1.4/10万，增长情况与日本、韩国、新加坡等国家相似。

西方国家IBD发病年龄多呈双峰状分布，UC第一个发病年龄高峰为30-39岁，CD为20-29岁，UC和CD第二个发病年龄高峰为60-70岁，以第一个高峰病例数为多。亚洲国家IBD发病年龄第二高峰少见，UC和CD发病年龄高峰较西方国家延迟10年。

两项我国多中心研究显示，3100例UC患者中19例(0.6％)死亡，515例CD患者中7例(1.4％)死亡，死亡率明显低于西方国家。

炎症性肠病目前尚缺乏有效的治疗手段，其治疗药物包括以下几类：

(1)氨基水杨酸类制剂

从20世纪30年代以来，柳氮磺吡啶(Sulfasalazine，SASP)一直是治疗IBD的有效药物，但其代谢产物磺胺吡啶会产生不良反应。现已研究出新型制剂如缓控释制剂、局部治疗制剂提高其在结肠的浓度，从而发挥最大效益，并降低药物的毒副作用。

(2)肾上腺糖皮质激素(GCS)

GCS是单一应用最为有效的抑制急性活动性炎症的药物，近期疗效好，有效率可达90％，它能够控制炎症、抑制自身免疫反应、减轻中毒症状。常用药物有氢化可的松、地塞米松和泼尼松等，但该类药物长期使用易产生不良反应。目前已有新一代GCS制剂问世，如布地奈德(Budesonide)、二丙酸倍氯松和巯氢可的松等，此类药物抗炎作用强，而全身副反应少。另外IBD的治疗还有多种局部治疗剂，如灌肠剂、泡沫剂及栓剂，局部用药大大减轻了全身的副反应。

(3)免疫抑制剂

传统免疫抑制剂包括：硫唑嘌呤(AZA)、6-巯基嘌呤(6–MP)及氨甲蝶呤(MTX)等。这些免疫抑制剂也可用于IBD的治疗，总体来说是有效的，但不是对所有IBD患者均有效，而且不良反应较多。新型免疫抑制剂，如环孢素A(CsA)、他克莫司(FK506)和霉菌酚(MMF)等对IBD有效，但其疗效和安全性尚有待于进一步评价。

(4)单克隆抗体

氨基水杨酸类制剂、肾上腺糖皮质激素和免疫抑制剂虽然对大多数病例有较好的疗效，但上述药物的有效性和安全性均具有一定程度的局限性，随着对IBD发病机制研究的深入，单克隆抗体治疗成为研究的新方向。

20世纪90年代英夫利昔(Infliximab，IFX)-人鼠嵌合型TNF-α单抗问世，10余年的临床应用证实其无论对活动性或缓解期CD在临床症状、内镜下病变改善、溃疡及瘘管愈合等方面均有卓越疗效。由于IFX在国内上市时间尚短，其应用适应证仅为CD及其并发症，但在国外已用于激素及免疫抑制剂无效或不能耐受的中、重度UC患者。随着IFX临床应用经验的不断积累以及纯人源化抗TNF-α的IgG单抗阿达姆(Adalimumab)、人源化抗α24整联蛋白(Integrin)的IgG4单抗Natalizumab和聚乙二醇化人抗TNF-α抗体Fab片段产品赛妥珠(CertolizumabPegol)等新一代药物的出现，单克隆抗体的疗效越来越被人们所认同。许多大型临床对照研究均证实，单克隆抗体不但在诱导缓解方面疗效明显优于传统药物，而且在维持治疗中也有巨大的优势(ColombelJF，KammMA，SchwartzD，etal.Sustainabilityofadalimumabinfistulahealingandresponse：2yeardatafromCHARMand12-monthopen-labelextensionfollow-upstudy[J].AmJGastroenterol，2007，102(11):2541-2550.)。目前普遍的做法是：对于中、重度IBD和高危病人，若传统药物无效，则立即采用单克隆抗体诱导缓解。

限制单克隆抗体应用的原因除价格昂贵，潜在的危险性也是重要因素。如使用IFX的病人罹患结核或组织胞浆菌病等感染的可能性明显增加。此外，神经系统脱髓鞘病变、充血性心力衰竭以及淋巴瘤等疾病的患病率也有提高。

(5)抗生素

对有细菌感染的IBD患者和重症患者应选用抗生素，青霉素类、妥布霉素、新型头霉素和头孢菌素均可酌情选用。近年来，甲硝唑也广泛用于IBD的治疗，甲硝唑可抑制肠内厌氧菌并有免疫抑制、影响白细胞趋化等作用，对UC和CD均有良好效果，它能促进瘘管愈合和预防复发，不良反应有恶心、呕吐、肢端感觉异常等，目前作为二线药物在GCS或SASP无效时可考虑使用。

(6)微生态制剂

由于肠道菌群失调和腔内抗原刺激是IBD触发和复发的重要原因，近10年来开始应用微生态制剂以改善肠道微环境，恢复机体正常菌群、下调免疫反应，以达到控制肠道炎症及维持缓解的目的。微生态制剂包括益生菌、益生元和合生元制剂。益生菌为含有特定的充足数量活菌的制剂；益生元为功能性低聚糖，它不易被人体消化吸收，却可在肠道被肠道的有益菌双岐杆菌吸收和利用，起到促进双岐杆菌的作用；合生元是益生菌与益生元的混合制剂，或加入维生素、微量元素等。

人类应用益生菌虽有百余年历史，但真正应用于临床还是最近几十年才开始。Kruis等(KruisW，FricP,PokrotnieksJ,etal.MaintainingremissionofulcerativecolitiswiththeprobioticEscherichiacoliNissle1917isaseffectiveaswithstandardmwsalazine.Gut,2004.53:1617-1623.)在327例UC患者维持治疗中比较美沙拉嗪和益生菌的治疗效果。两组患者分别口服美沙拉嗪50mg(3次/d)和大肠埃希菌Nissle1917(1次/d)。两组的复发率、缓解天数及疾病活动指数相接近，说明益生菌治疗可取得与抗炎药物相似的疗效，且无药物副作用。给予18例活动期UC患者长双歧杆菌和菊粉、寡果糖治疗l个疗程后，治疗组的乙状结肠镜评分降低，而安慰剂组无改善，治疗组临床症状改善(FurrieE，MacfarlaneS,KennedyA,etal.Synbiotictherapy(Bifidobacteriumlongum/Synergy1)initiatesresolutionofinflamationinpatientswithactiveulcerativecolitis:arandomisedcontrolledpilottrial.Gut,2005.54:242-249.)。传统药物治疗无反应的34例轻、中度活动期UC患者接受一种益生菌制剂VSL3治疗，缓解率为53％，24％患者有反应。说明VSL3对UC有一定的治疗作用(BibiloniR，FedorakRN,TannockGW,etal.VSL#3probiotic-mixtureinducesremissioninpatientswithactiveulcerativecolitis.AmJGastroenterol,2005.100:1539-1546.)。

Rembacken等(RembackersBJ.Non-pathogenicescherichiacoliversusmesalazineforthetreatmentofulcerativecolitis:arandomizedtrial[J].Lancet，1999，354(9)：635-639.)在116例活动性UC患者中采用随机对照双模拟法比较了美沙拉嗪和大肠埃希菌的疗效和维持缓解的效果。结果美沙拉嗪组的缓解率为75％，大肠埃希菌组为68％；达到缓解的天数美沙拉嗪组为44天，大肠埃希菌组为42天；复发率美沙拉嗪组为73％，大肠埃希菌组为67％；平均缓解天数美沙拉嗪组为206天(中位数为175天)，大肠埃希菌组为221天(中位数为185天)，故提示在维持缓解方面，非致病性大肠埃希菌与美沙拉嗪同样有效。

综上，说明一些临床研究证实益生菌治疗IBD的疗效。肠道菌群与IBD发病密切相关，随着对肠道黏膜免疫系统及IBD遗传易感性研究的不断完善，微生态制剂在用于治疗IBD方面将非常有前景。

传统药物如氨基水杨酸类制剂、糖皮质激素、免疫抑制剂等不良反应较多，而单克隆抗体药物又价格昂贵；微生态制剂因其对其他细菌具有明显的调节作用和较少的毒副作用而逐渐成为IBD治疗的新手段，也成为目前研究的热点。

脆弱拟杆菌(Bacteroidesfragilis)是革兰氏阴性厌氧细菌中拟杆菌属的成员，属于拟杆菌门，完全不同于厚壁菌门的双歧杆菌、乳酸菌等。拟杆菌属有25个菌种，仅来自人类的有10个菌种，仅来自动物的有10个菌种，来自人和动物的有5个菌种。

脆弱拟杆菌是一种专性厌氧细菌，依培养基的不同和生长阶段的不同，菌体形态呈现多形性，一般条件下菌体为杆状、两端钝圆、着色深，中间色浅且不均匀，有荚膜、无芽胞、无动力，有些有空泡，菌体长短不一。依据能否合成、分泌脆弱拟杆菌肠毒素(BFT)可将其分为产肠毒素型脆弱拟杆菌(EnterotoxigenicBacteroidesfragilis,ETBF)和非产肠毒素型脆弱拟杆菌(NontoxigenicBacteroidesfragilis，NTBF)。脆弱拟杆菌作为人及动物肠道正常菌群的一部分，主要存在于结肠中。此外，呼吸道、胃肠道及泌尿生殖道粘膜也可定植生长。脆弱拟杆菌作为一种条件致病菌，当宿主粘膜受损时，可侵犯粘膜下层，引起感染，也可经血液流动，引起身体其它器官，如肠道、腹腔、肝、肺、脑组织、软组织、骨髓等的化脓性感染并伴发脓肿。

本领域已经对脆弱拟杆菌进行了大量研究。张季阶从发育良好的婴儿或低龄动物肠道中分离出一种拟杆菌菌株BF839，将其制成活菌制剂后能够增加儿童生长发育，对防治急慢性肠炎、菌群失调、上呼吸道感染和神经官能症等具有较好疗效(参见公开号为CN1056314A的中国发明专利申请；及：张季阶，等.脆弱拟杆菌(BF839)菌液的临床应用研究.中国生物制品学杂志，1995年，第8卷，第2期，第63-65页)。智发朝等在2012年从婴儿粪便中分离出一种具有益生菌特性的脆弱拟杆菌菌株(称为Bd312)(保藏编号为CGMCCNO.7280)，可用于治疗炎症性肠病、腹泻等(参见公开号为CN103146620A，CN103142658A，CN103156888A的中国发明专利申请)；此外，智发朝等还对该菌株Bd312进行了进一步鉴定，发现该菌株Bd312在细菌形态、培养特性、生理生化反应结果与脆弱拟杆菌相似，经BLASTN序列比对，所分离菌株Bd312与脆弱拟杆菌标准株ATCC25285同源性达99％，药敏实验提示，菌株Bd312对头孢拉定、阿莫西林、庆大霉素、磺胺甲嗯唑、甲氧苄啶敏感，急慢性毒性试验提示无毒性(参见刘洋洋，等.健康婴儿体内的无毒脆弱拟杆菌的分离及鉴定.中华医学杂志，2014年，第94卷，第30期，第2372-2374页)。

早期筛选出的脆弱拟杆菌ZY-312，经由活体内及体外的相关实验证实，此菌株除了对抗生素相关性腹泻、肥胖及糖尿病、脑膜炎等具有良好的预防及治疗效果之外，未见其对炎症性肠病，特别是溃疡性结肠炎或克罗恩病，具有优异的抵抗力的相关研究及报道。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是提供一种脆弱拟杆菌ZY-312在预防和/或治疗炎症性肠病的应用，并提供用于预防和/或治疗炎症性肠病的药物组合物、食品、保健品及食品添加剂，其均包含所述脆弱拟杆菌ZY-312。

为了解决上述问题，本发明提供了一种脆弱拟杆菌在制备预防和/或治疗炎症性肠病的药物中的应用，其中，该脆弱拟杆菌为保藏号为CGMCCNo.10685的脆弱拟杆菌ZY-312。

上述的应用，其中，所述药物含有药学有效剂量的脆弱拟杆菌ZY-312和药学上可接受的载体。

上述的应用，其中，所述药学有效剂量为10⁶-10¹⁰CFU。

上述的应用，其中，所述药学上可接受的载体为奶粉、乳糖、环糊精、麦芽糖、葡萄糖、甘油、谷氨酸钠、维生素C、甘露糖、半乳糖、甘露聚醇或甲基纤维素。

上述的应用，其中，所述炎症性肠病为溃疡性结肠炎或克罗恩病。

为了更好地实现上述目的，本发明还提供了一种用于预防和/或治疗炎症性肠病的药物组合物，其中，所述药物组合物含有药学有效剂量的保藏号为CGMCCNo.10685的脆弱拟杆菌ZY-312。

上述的药物组合物，其中，所述药学有效剂量为10⁶-10¹⁰CFU。

为了更好地实现上述目的，本发明还提供了一种用于预防和/或治疗炎症性肠病的食品，其中，所述食品含有保藏号为CGMCCNo.10685的脆弱拟杆菌ZY-312。

为了更好地实现上述目的，本发明还提供了一种用于预防和/或治疗炎症性肠病的保健品，其中，所述保健品含有保藏号为CGMCCNo.10685的脆弱拟杆菌ZY-312。

为了更好地实现上述目的，本发明还提供了一种用于预防和/或治疗炎症性肠病的食品添加剂，其中，所述食品添加剂含有保藏号为CGMCCNo.10685的脆弱拟杆菌ZY-312。

本发明的技术效果在于：

本发明通过对脆弱拟杆菌ZY-312，经由活体内及体外的相关实验证实，此菌株除了对抗生素相关性腹泻、肥胖及糖尿病、脑膜炎等具有良好的预防及治疗效果之外，还发现其对炎症性肠病，包括溃疡性结肠炎或克罗恩病，具有优异的抵抗力且无毒副作用，可持久且有效地应用于预防和/或治疗炎症性肠病。利用本发明的脆弱拟杆菌ZY-312可以制备成药物、食品、保健品或食品添加剂的形式。所述药物、食品、保健品或食品添加剂含有脆弱拟杆菌ZY-312。这些药物、食品、保健品或食品添加剂可用于预防和治疗炎症性肠病，具有重大应用价值。

以下结合附图和具体实施例对本发明进行详细描述，但不作为对本发明的限定。

附图说明

图1为本发明一实施例的各组大鼠DAI评分变化；

图2为本发明一实施例的各组大鼠结肠组织损伤评分变化。

脆弱拟杆菌(Bacteroidesfragilis)ZY-312于2015年4月2日保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心(CGMCC)，其保藏编号为CGMCCNo.10685，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号。

具体实施方式

下面结合附图对本发明的结构原理和工作原理作具体的描述：

近年来我国的炎症性肠病患病率逐年增加，而目前该病的发病因素及致病机制尚未明确，是多种因素导致的病变，一般主要考虑与外界环境、基因遗传、免疫力以及感染等多方面综合因素相关。该病的主要临床表现为腹痛、腹泻、黏性血便等，如并发溃疡必须及时治疗，否则极易引发肠穿孔，威胁患者的生命安全。近年来有相关研究报道，IBD与肠道菌群失调有密切关系，人体肠道有大量的微生物，不完全统计，数量高达400种以上，其中就以双歧杆菌与嗜酸乳杆菌为主，大约占到微生物总量的98％以上，通常人体在正常情况下，肠道内的微生物处于相对平衡状态，可一旦失衡，菌群失调可导致相关疾病的发生。目前认为肠道菌群失调可能是IBD诱发及复发的关键因素。

本发明在多种疾病模型中对脆弱拟杆菌(Bacteroidesfragilis)的作用进行了检测和鉴定，第一次发现脆弱拟杆菌ZY-312对炎症性肠病具有优异的预防和/或治疗效果。本发明的脆弱拟杆菌ZY-312，保藏号为CGMCCNo.10685，在预防和/或治疗炎症性肠病中的应用具体包括：

脆弱拟杆菌在制备预防和/或治疗炎症性肠病的药物中的应用，其中，所述药物含有药学有效剂量，本实施例中，该药学有效剂量为10⁶-10¹⁰CFU，优选为10⁹CFU)的脆弱拟杆菌ZY-312和药学上可接受的载体(如奶粉、乳糖、环糊精、麦芽糖、葡萄糖、甘油、谷氨酸钠、维生素C、甘露糖、半乳糖、甘露聚醇、甲基纤维素等)。其中，所述炎症性肠病通常为溃疡性结肠炎或克罗恩病。

另外，脆弱拟杆菌ZY-312还可用于制备预防和/或治疗炎症性肠病的药物组合物，其中，所述药物组合物含有药学有效剂量的脆弱拟杆菌ZY-312，该药学有效剂量为10⁶-10¹⁰CFU。

脆弱拟杆菌ZY-312还可用于制备预防和/或治疗炎症性肠病的食品、保健品及食品添加剂等，所述食品、保健品及食品添加剂等均可加入一定比例的脆弱拟杆菌ZY-312成分。

下面以具体实施例进一步说明本发明的脆弱拟杆菌ZY-312在预防和/或治疗炎症性肠病中的作用：

实施例1

脆弱拟杆菌ZY-312的培养

1、所用试剂和仪器名称如下表：

2、活菌计数方法

活菌计数采用10倍系列稀释法：

取100μL菌液加入900μL培养基中，逐步梯度稀释至合适浓度。每个平板点4个浓度梯度，每个梯度重复点样3次，每次点样20μL。在生化培养箱中37℃、厌氧培养48h，数菌落数(取菌落数为3-30的浓度梯度计数)。

活菌数(CFU/mL)＝三个点样菌落总和/3×50×稀释度

3、培养方法

步骤1：取一支冻干保存菌种(ZY-312、Bd-312或ATCC25285，其培养方法相同，故不一一例举)，加入200μLTSB培养基，复溶，吸取20μL血平皿划线，经厌氧罐气体控制系统抽气后，在生化培养箱中37℃、厌氧培养48h；

步骤2：挑取单克隆菌落接入10mLTSB培养基，加入5％(v/v)肽牛血清，在生化培养箱中37℃、厌氧培养12h；

步骤3：取1瓶500mLTSB培养基，分别加入5％(v/v)肽牛血清，接入1％(v/v)菌种，在生化培养箱中37℃、厌氧培养48h；

步骤4：取菌液离心，用离心机进行离心，离心条件为6000rpm、10min。用生理盐水洗涤2次，最后用生理盐水复溶菌泥备用并进行活菌计数。

实施例2

脆弱拟杆菌ZY-312治疗大鼠实验性结肠炎的效果

选健康成熟的SD大鼠70只，雌雄各半，体质量200±20g，购自广东省实验动物中心，饲养于SPF级动物房，随机分成7组，每组10只，所有大鼠实验前适应环境1周，喂食普通大鼠饲料。

采用5％DSS(dextransulfatesodium，DSS，购自美国西格玛公司)溶液诱导大鼠慢性溃疡性结肠炎模型，70只SD大鼠随机分为如下7组：

正常对照组、模型组、美沙拉嗪组、ZY-312组、Bd-312组、ATCC25285组和联合组(ZY-312+美沙拉嗪)，采用DAI积分及组织损伤学评分检测各干预组疗效。动物分组表如下：

编号

造模

分组

动物只数

A	否	正常对照组	10
				B	是	模型组	10
C	是	美沙拉嗪组	10
				D	是	ZY-312组	10
E	是	Bd-312组	10
				F	是	ATCC25285组	10
G	是	联合组	10

1、实验动物模型：

50gDSS加入1000mL蒸馏水中，充分溶解，配制成5％DSS溶液，每日新鲜配制。依据Cooper等研究方法(Cooper,H.S.,Murthy,S.N.,Shah,R.S.,Sedergran,D.J.,1993.Clinicopathologicstudyofdextransulfatesodiumexperimentalmurinecolitis.LaboratoryInvestigation69,238–249.)，大鼠自由饮用5％DSS溶液7天，正常饮水10天，以上为1个循环，反复4个循环，建立大鼠慢性溃疡性结肠炎模型。10只SD大鼠为正常对照组，其余60只大鼠采用随机抽签的方法将大鼠分为6组，每组10只，分别为模型组、美沙拉嗪组、ZY-312组、Bd-312组、ATCC25285组和联合组(ZY-312+美沙拉嗪)，剂量设计：ZY-312、Bd-312、ATCC25285，均为5×10⁹CFU/只；美沙拉嗪，0.4g/Kg^-1d^-1；模型组只造模不给药；联合组为ZY-312含5×10⁹CFU/只且含美沙拉嗪，0.4g/Kg^-1d^-1；造模成功后开始给药，每天灌胃1次，连续灌胃1周。

2、大鼠疾病活动度积分的计算：

参照Hamamoto等标准(MuranoM,MaemuraK,HirataI,ToshinaK,NishikawaT,HamamotoN,SasakiS,SaitohO,KatsuK.TherapeuticeffectofintracolonicallyadministerednuclearfactorkappaB(p65)antisenseoligonucleotideonmousedextransulphatesodium(DSS)-inducedcolitis.ClinExpImmunol2000；120:51-58)，每日观察大鼠的体质量、大便性状和隐血情况，计算每只大鼠的疾病积分活动(DAI)积分，评估结肠炎活动程度。

3、病理学观察：

预冷生理盐水将大肠洗净，于大肠末端距离肛门1cm处剪取0.5cm大肠，4％多聚甲醛浸泡，石蜡包埋，切片，HE染色做病理检查。其余部分结肠组织进行组织病理学评分。组织学损伤程度用炎症、病变深度、隐窝破坏及病变范围评分的乘积表示，取平均值作为结肠组织学损伤计分。

4、实验观察指标：

(1)正常对照组大鼠毛色光滑、精神活跃、进食正常、无腹泻、无血便、大便球形；

(2)模型组大鼠毛色干枯、精神萎靡、反应迟钝、体型消瘦、食量降低、体质量减轻。

造模成功后予以美沙拉嗪、ZY-312、Bd-312、ATCC25285，以及美沙拉嗪与ZY-312联合治疗1周，整个实验过程中无大鼠死亡，观察结果如下：

(1)模型组大鼠食量降低，毛色干枯、拱背和拖尾，出现稀便，部分肛周可见血迹；

(2)美沙拉嗪组大鼠毛色欠光滑、精神欠活跃、反应不灵活，但好于模型组；

(3)Bd-312组大鼠毛色欠光滑、精神欠活跃、反应不灵活；

(4)ATCC25285组大鼠毛色欠光滑、精神欠活跃、反应不灵活；

(5)ZY-312组明显好于Bd-312组、ATCC25285组和美沙拉嗪组；

(6)联合组明显好于Bd-312组、ATCC25285组和美沙拉嗪组，与ZY-312组相近。

以上结果显示：ZY-312组明显优于Bd-312和ATCC25285组，也明显好于美沙拉嗪组，ZY-312组与联合组效果相近。表明ZY-312明显改善了炎症性肠病小鼠症状，症状明显优于Bd-312、ATCC25285、美沙拉嗪组。

大鼠疾病活动度的变化参考Hamamoto等的方法(MuranoM,MaemuraK,HirataI,ToshinaK,NishikawaT,HamamotoN,SasakiS,SaitohO,KatsuK.TherapeuticeffectofintracolonicallyadministerednuclearfactorkappaB(p65)antisenseoligonucleotideonmousedextransulphatesodium(DSS)-inducedcolitis.ClinExpImmunol2000；120:51-58)对每只大鼠的体质量下降、大便性状和粪便隐血情况进行综合评分。结果如下：

(1)正常对照组DAI评分始终稳定在零水平；

(2)模型组大鼠炎症逐渐加重；

(3)美沙拉嗪组、ZY-312组及联合组大鼠DAI评分也逐渐升高，但明显低于模型组、Bd-312组和ATCC25285组，差异有统计学意义(参见图1，图1为本发明一实施例的各组大鼠DAI评分变化)。

以上结果显示：ZY-312组综合评分明显优于Bd-312和ATCC25285组，也明显好于美沙拉嗪组，ZY-312组与联合组效果相近。表明ZY-312治疗炎症性肠病小鼠效果显著，效果明显优于Bd-312、ATCC25285及美沙拉嗪组。

结肠黏膜损伤组织病理变化参照Dieleman等的评分标准(DielemanLA,PalmenMJ,AkolH,etal.Chronicexperimentalcolitisinducedbydextransulfatesodium(DSS)ischaracterizedbyTh1andTh2Cytokines[J].Clinical&ExperimentalImmunology,1999,114(3):385-91.)对每只大鼠的结肠病理切片进行组织损伤学评分。参见图2，图2为本发明一实施例的各组大鼠结肠组织损伤评分变化，具体为各组大鼠第7天的结肠炎症浸润评分、病变深度评分、隐窝破坏及总体组织损伤评分直方图。正常对照组大鼠组织学损伤评分为0分，模型组评分9.01分。美沙拉嗪组、ZY-312组、Bd-312组、ATCC25285组、联合组组织学损伤评分分别为7.12、6.31、8.87、8.93、5.69，ZY-312组、联合组与模型组差异显著(P<0.01)，其中联合组效果最优。

以上结果显示：ZY-312组评分明显优于Bd-312和ATCC25285组，也明显优于美沙拉嗪组，联合组效果极其显著。表明ZY-312治疗炎症性肠病小鼠效果显著，效果明显优于Bd-312、ATCC25285及美沙拉嗪。

实验结果显示，Bd-312和ATCC25285组与模型组结果相近，在治疗过程中，效果不明显。美沙拉嗪组能够明显降低大鼠大鼠DAI评分、结肠组织损伤评分，但是与模型组相比，ZY-312组和联合组可显著降低大鼠DAI评分、结肠组织损伤评分，且优于美沙拉嗪组。当ZY-312与美沙拉嗪联合应用时，效果显著，源于ZY-312通过上调肠道局部的免疫功能，促进机体免疫恢复，从而有效纠正了抑炎和抗炎动态失衡，降低炎症反应，减少了炎性因子的释放。实验结果充分表明ZY-312组和联合组在治疗炎症性肠病中的优势，ZY-312显著优于脆弱拟杆菌其他菌株(例如Bd-312和ATCC25285)。

当然，本发明还可有其它多种实施例，在不背离本发明精神及其实质的情况下，熟悉本领域的技术人员当可根据本发明作出各种相应的改变和变形，但这些相应的改变和变形都应属于本发明所附的权利要求的保护范围。

Claims

1.一种脆弱拟杆菌在制备预防和/或治疗炎症性肠病的药物中的应用，其特征在于，该脆弱拟杆菌为保藏号为CGMCCNo.10685的脆弱拟杆菌ZY-312。

2.如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述药物含有药学有效剂量的脆弱拟杆菌ZY-312和药学上可接受的载体。

3.如权利要求2所述的应用，其特征在于，所述药学有效剂量为10⁶-10¹⁰CFU。

4.如权利要求2或3所述的应用，其特征在于，所述药学上可接受的载体为奶粉、乳糖、环糊精、麦芽糖、葡萄糖、甘油、谷氨酸钠、维生素C、甘露糖、半乳糖、甘露聚醇或甲基纤维素。

5.如权利要求1、2或3所述的应用，其特征在于，所述炎症性肠病为溃疡性结肠炎或克罗恩病。

6.一种用于预防和/或治疗炎症性肠病的药物组合物，其特征在于，所述药物组合物含有药学有效剂量的保藏号为CGMCCNo.10685的脆弱拟杆菌ZY-312。

7.如权利要求6所述的药物组合物，其特征在于，所述药学有效剂量为10⁶-10¹⁰CFU。

8.一种用于预防和/或治疗炎症性肠病的食品，其特征在于，所述食品含有保藏号为CGMCCNo.10685的脆弱拟杆菌ZY-312。

9.一种用于预防和/或治疗炎症性肠病的保健品，其特征在于，所述保健品含有保藏号为CGMCCNo.10685的脆弱拟杆菌ZY-312。

10.一种用于预防和/或治疗炎症性肠病的食品添加剂，其特征在于，所述食品添加剂含有保藏号为CGMCCNo.10685的脆弱拟杆菌ZY-312。