CN105431167A - 非天然发生因子h结合蛋白(fhbp)及其使用方法 - Google Patents

Abstract

提供了非天然发生因子H结合蛋白(fHbp)及使用此类蛋白的方法，所述蛋白自变体3fHbp衍生、能引发针对至少一种脑膜炎奈瑟氏菌菌株的杀菌性抗体。在某些实施方案中，公开了自天然发生变体3fHbp衍生的非天然发生fHbp。所述非天然发生fHbp可以包括选自精氨酸、赖氨酸、苯丙氨酸、酪氨酸、或色氨酸的氨基酸对天然发生变体3fHbp第223位组氨酸的替代，其中第223位的编号方式基于成熟fHbp？ID？1的编号方式。所述非天然发生fHbp可以具有比fHbp？ID？79要低的对人因子H(fH)的亲和力。

Description

非天然发生因子H结合蛋白(FHBP)及其使用方法

对相关申请的交叉引用

本申请要求2013年8月2日提交的、流水号61/861,662的美国临时专利申请的优先权，通过援引将该申请的公开内容完整收入本文。

关于联邦政府资助的研究的声明

本发明是在(美国)国家卫生研究院，国家变态反应和传染病研究所授予的基金的资助下完成的，基金号R01AI099125-01。政府对本发明享有某些权利。

导言

脑膜炎奈瑟氏菌(Neisseriameningitidis)是一种革兰氏阴性细菌，寄居于人上呼吸道，对最值得注意的脑膜炎和败血病的全球零星和周期性流行爆发负有责任。两岁以下儿童中的感染和死亡率最高。与其它革兰氏阴性细菌相似，脑膜炎奈瑟氏菌典型地具有细胞质膜、肽聚糖层、外膜和菌毛，外膜与荚膜多糖一起构成细菌壁，菌毛突出在外环境中。有荚膜的脑膜炎奈瑟氏菌菌株是儿童和年轻成人中细菌性脑膜炎和败血症的一项主要原因。侵入性脑膜炎奈瑟氏菌感染的流行上驱动了能赋予跨越不同菌株，特别是跨越具有不同血清型或血清亚型的遗传多样性B群菌株的免疫力的有效疫苗的研究。

因子H结合蛋白(fHbp，在本领域也称作脂蛋白2086(Fletcheretal.(2004)InfectImmun72:2088-2100)、基因组衍生的奈瑟氏菌抗原(GNA)1870(Masignanietal.(2003)JExpMed197:789-99)或“741”)是一种在脑膜炎奈瑟氏菌细菌中表达的表面暴露的脂蛋白。fHbp结合人补体因子H(fH)，其下调补体活化。fH对细菌表面的结合是病原体在未免疫人血清或血液中存活及规避先天性宿主防御的一种重要机制。最近，发现人因子H基因簇的遗传变异影响发生脑膜炎球菌疾病的易感性(DavilaSetal.(2010)NatGeneticsdoi:10.1038/ng.640)。fH对fHbp的结合对于人fH是特异性的，而且能说明为什么脑膜炎奈瑟氏菌严格地是人病原体。

仍然需要能引发有效杀菌抗体应答的fHbp多肽。

发明概述

提供了非天然发生因子H结合蛋白及使用此类蛋白的方法，所述蛋白自变体3fHbp衍生、能引发针对至少一种脑膜炎奈瑟氏菌菌株的杀菌性抗体。

在某些实施方案中，公开了自天然发生变体3fHbp衍生的非天然发生因子H结合蛋白(fHbp)。非天然发生fHbp可以包括选自精氨酸、赖氨酸、苯丙氨酸、酪氨酸、或色氨酸的氨基酸对天然发生变体3fHbp第223位组氨酸的替代，其中第223位的编号方式基于成熟fHbpID1的编号方式。非天然发生fHbp可以具有比fHbpID79要低的对人因子H(fH)的亲和力。

在某些实施方案中，所述组氨酸可以用精氨酸替代。

在某些情况中，所述变体3fHbp可以是模块群VfHbp。在其它情况中，所述变体3fHbp可以是模块群IIfHbp。

例示性的非天然发生fHbp可以包括与fHbpID79的氨基酸序列具有至少90％序列同一性的氨基酸序列。

在某些情况中，非天然发生fHbp可以包括带有氨基酸替代H223R的fHbpID28的氨基酸序列。

在某些情况中，非天然发生fHbp可以包括带有氨基酸替代H223R的fHbpID67的氨基酸序列。

在某些情况中，非天然发生fHbp可以包括带有氨基酸替代H223R的fHbpID175的氨基酸序列。

在某些情况中，非天然发生fHbp可以包括带有氨基酸替代H223R的fHbpID79的氨基酸序列。

在某些情况中，非天然发生fHbp可以包括带有氨基酸替代H223R的fHbpID45的氨基酸序列。

在另一个实施方案中，提供了一种免疫原性组合物。免疫原性组合物可以包括：a)本文中公开的非天然发生fHbp；和b)药学可接受赋形剂。

在某些情况中，非天然发生fHbp可以在自表达该非天然发生fHbp的脑膜炎奈瑟氏菌菌株制备的囊泡制备物的表面上表达。

在某些情况中，非天然发生fHbp可以在免疫原性组合物中作为分离的多肽存在。

在例示性的情况中，药学可接受赋形剂可以包括佐剂。

在某些情况中，免疫原性组合物可以进一步包括别的脑膜炎奈瑟氏菌抗原。

提供了一种在哺乳动物中引发针对脑膜炎奈瑟氏菌的抗体应答的方法。所述方法可以涉及对哺乳动物施用本文中公开的非天然发生fHbp或本文中提供的免疫原性组合物。

在某些情况中，所述施用提供针对脑膜炎奈瑟氏菌的杀菌性抗体的生成。

还公开了一种核酸，其编码本文中提供的非天然发生fHbp。本文中还提供了一种重组表达载体，其包括编码非天然发生fHbp的核酸。例示性的实施方案包括一种经遗传修饰的宿主细胞，其包括编码非天然发生fHbp的核酸或包括编码非天然发生fHbp的核酸的重组表达载体。

本文中公开了另一种免疫原性组合物。此免疫原性组合物可以包括：a)自经遗传修饰的奈瑟氏菌宿主细胞获得的囊泡，该宿主细胞经编码依照本公开文本的非天然发生fHbp的核酸遗传修饰，使得该经遗传修饰的宿主细胞生成所编码的非天然发生fHbp，其中该囊泡包括所编码的非天然发生fHbp；和b)药学可接受赋形剂。

在某些情况中，所述囊泡可以是天然外膜囊泡。

在某些情况中，所述宿主细胞可以经遗传修饰以提供降低或缺无的lpxL1基因和/或lpxL2基因多肽产物活性。

在例示性的实施方案中，所述宿主细胞经遗传修饰以提供升高的奈瑟氏菌抗原表达。

提供了一种在哺乳动物中引发针对奈瑟氏菌的抗体应答的方法。所述方法可以包括对哺乳动物施用免疫原性组合物，该免疫原性组合物包括：a)自经遗传修饰的奈瑟氏菌宿主细胞获得的囊泡，该细胞经编码依照本公开文本的非天然发生fHbp的核酸遗传修饰，使得该经遗传修饰的宿主细胞生成所编码的非天然发生fHbp，其中该囊泡包括所编码的非天然发生fHbp；和b)药学可接受赋形剂。

附图简述

图1。SDS-聚丙烯酰胺凝胶，指示重组fHbpID79野生型和突变体的大小和纯度。道1，Benchmark梯状物(Invitrogen)；道2，fHbpID79野生型；道3，fHbpID79H223R突变体；道4，fHbpID79H223A突变体。在凝胶上加载2μg每种重组fHbp。注意：氨基酸编号方式基于成熟fHbpID1的编号方式。详情见实施例1。

图2。人因子H对fHbpID79突变体H223A和H223R的结合，通过ELISA。小图A显示人因子H的结合。fHbpID79野生型(WT)，圆形符号；fHbpID79H223A突变体，三角形符号；fHbpID79H223R突变体，星号符号。小图B显示对照单抗JAR11的结合。注意：氨基酸编号方式基于成熟fHbpID1的编号方式。详情见实施例2。

图3。人因子H对fHbpID22突变体T221A和H223A的结合，通过ELISA。小图A显示人因子H的结合。fHbpID22野生型(WT)，圆形符号；fHbpID22T221A突变体，星号符号；fHbpID22H223A突变体，三角形符号。小图B显示对照单抗JAR13的结合。注意：T221和H223的编号方式基于成熟fHbpID1的编号方式。详情见实施例3。

图4。成熟fHbpID1、fHbpID22、fHbpID79、和fHbpID28的氨基酸序列的比对。H223以箭指示。

图5。成熟v.3fHbp的氨基酸序列的比对。H223以箭指示。

图6。fHbp模块群I-IX的示意图。

图7。显示小鼠对fHbpID79疫苗的杀菌应答的图。测试了fHbpID79野生型(WT)和fHbpID79H223R突变体。对于fHbp疫苗，每个符号代表一份个体血清样品的滴度；对于铝对照组，每个符号代表三份血清样品的合并物的滴度。水平线代表每个组的几何均值滴度。

在描述本发明和本发明的特定例示性实施方案之前，要理解，本发明不限于所描述的特定实施方式，因为它们当然可以有变化。还要理解，本文中使用的术语仅用于描述特定实施方案的目的，而非意图是限制性的，因为本发明的范围仅会由所附权利要求限制。

在提供一个数值范围的情况中，应理解为本发明内涵盖该范围的上限和下限之间的每个居间数值(差值为下限的单位的十分之一，除非上下文另有明示)及该所描述的范围中的任何其它所描述的或居间的数值。这些较小范围的上限和下限可以独立包括在该较小范围中，这也涵盖在本发明内，服从在所描述的范围中任何具体排除的限度。在所描述的范围包括两个限度之一或二者时，本发明中还包括排除了那些所包括的限度之一或二者的范围。

要领会，为清楚起见在分开的实施方案的上下文中描述的本发明的某些特征也可以在单个实施方案中组合提供。相反，为简要起见在单个实施方案的上下文中描述的本发明的多个特征也可以分开或以任何合适子组合提供。本发明具体涵盖且本文中公开了相对于参照氨基酸序列涉及氨基酸修饰(包括氨基酸替代)的实施方案的所有组合，就好像每一个组合均单独地和明确地公开，到达此类组合涵盖具有期望特征的多肽，例如所具有的对人fH的亲和力比天然发生fHbp要低的非天然发生fHbp多肽。此外，本发明还具体涵盖且本文中公开了描述此类氨基酸修饰的实施方案中列出的此类氨基酸修饰(包括氨基酸替代)的所有子组合，就好像此类氨基酸修饰的每一个此类子组合单独地和明确地在本文中公开。

除非另有定义，本文中使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属领域普通技术人员的共同理解相同的含义。通过援引将本文中提到的所有出版物收入本文，用于公开和描述与所引用的出版物相关的方法和/或材料。

必须注意，如本文和所附权利要求书中使用的，单数形式“一个”、“一种”、和“所述/该”包括复数对象，除非上下文另有明确说明。因此，例如，提到“一个/种抗原”包括多个/种此类抗原，提到“所述/该蛋白”包括提到一个/种或多个/种蛋白，等等。

提供本文中讨论的出版物仅仅是因为它们在本申请的申请日之前公开。本文中无一内容要解释为承认本发明不能通过发明在先而早于此类出版物。此外，所提供的出版日期可能不同于实际的公开日期，可能需要独立确认。

发明详述

如上所述，提供了能引发针对至少一种脑膜炎奈瑟氏菌菌株的杀菌性抗体的自变体3fHbp衍生的非天然发生因子H结合蛋白及使用此类蛋白的方法。

定义

“因子H结合蛋白”(fHbp)，在文献中也称作GNA1870、GNA1870、ORF2086、LP2086(脂蛋白2086)、和“741”，指一类脑膜炎奈瑟氏菌多肽。fHbp在自然界中是作为在脑膜炎奈瑟氏菌菌株的表面上表达的脂蛋白找到的。基于氨基酸序列可变性和免疫学交叉反应性(Masignanietal.(2003)JExpMed197:789-99)，fHbp已经被细分成三个fHbp变体群(在一些报告(Masignanietal.(2003)JExpMed197:789-99)中称作变体1(v.1)、变体2(v.2)和变体(v.3)，在其它报告(参见例如Fletcheretal.(2004)InfectImmun72:2088-2100))中称作家族A和B)。依照neisseria.org或pubmlst.org/neisseria/fHbp/网站，还给在脑膜炎奈瑟氏菌中找到的每个独特fHbp指派fHbp肽ID。因为变体2(v.2)fHbp蛋白(来自菌株8047，fHbpID77)和变体3(v.3)fHBP(来自菌株M1239，fHbpID28)的长度与MC58(fHbpID1)的长度分别相差-1和+7个氨基酸残基，所以用于提到v.2和v.3fHbp蛋白的残基的编号方式不同于基于这些蛋白的实际氨基酸序列的编号方式。

术语“异源”或“嵌合”指由自不同来源或祖先序列衍生的结构定义的两个成分。例如，在嵌合多肽的语境中使用“异源”时，嵌合多肽可以包括可操作连接的氨基酸序列，它们可以衍生自不同系统发生群的不同多肽(例如，来自α祖先氨基酸序列的第一成分和来自β祖先氨基酸序列的第二成分)。含有两个或更多个限定区段，每个区段来自不同祖先的嵌合多肽可以是天然发生的或人造的(非天然发生的)。关于天然发生嵌合体的更多详情参见BeerninkPT,GranoffDM(2009)Microbiology155:2873-83。非天然发生嵌合体指“人造嵌合体”，而且涵盖带有自然界中没有找到的异源成分的fHbp。

“异源”或“嵌合”多肽还可以含有两个或更多个不同成分，每个衍生自不同fHbp(例如变体1、2、或3)。各成分可以在沿着fHbp多肽长度的任何位置处可操作连接。

在编码上文所述任何嵌合多肽的多核苷酸的上下文中，“异源”可以包括自不同基因(例如，来自编码fHbpv.1多肽的核酸的第一成分和来自编码fHbpv.2多肽的核酸的第二成分)或不同祖先氨基酸序列(α或β)衍生的可操作连接的核酸序列。

其它例示性“异源”核酸包括表达构建体，其中包含编码序列的核酸可操作连接调节元件(例如启动子)，所述调节元件来自与编码序列的遗传来源不同的遗传来源(例如，为了提供感兴趣宿主细胞中的表达，所述感兴趣宿主细胞的遗传来源相对于于启动子、编码序列或二者可能是不同的)。例如，可操作连接编码fHbp多肽或其结构域的多核苷酸的T7启动子被说成是异源核酸。

在重组细胞的语境中，“异源”可以指宿主细胞中存在与之遗传来源不同的核酸(或基因产物，诸如多肽)。例如，一种菌株的奈瑟氏菌氨基酸或核酸序列对于另一菌株的奈瑟氏菌宿主是异源的。

在氨基酸序列或多核苷酸序列的语境中(例如，“衍生自”fHbp变体3，例如fHbpID79的氨基酸序列)，“衍生自”旨在指示多肽或核酸所具有的序列基于参照多肽或核酸(例如天然发生fHbp蛋白或编码核酸)的序列，而且不旨在限制生成蛋白质或核酸的来源或方法。衍生氨基酸序列或多核苷酸序列的参照多肽和参照多核苷酸的非限制性例子包括天然发生fHbp，例如fHbpID79，和非天然发生fHbp。在细菌菌株的语境中，“衍生自”旨在指示通过亲本菌株的体内传代或体外培养而获得的菌株，和/或通过修饰亲本菌株而获得的重组细胞。

“保守性氨基酸替代”指一个氨基酸残基被共享氨基酸侧链的化学和物理特性(例如电荷、大小、疏水性/亲水性)的另一氨基酸替代。“保守性替代”意图包括下述氨基酸残基组内的替代：gly、ala；val、ile、leu；asp、glu；asn、gln；ser、thr；lys、arg；和phe、tyr。可以自呈递感兴趣表位的多肽的氨基酸序列的比对得出关于此类替代的指导。

术语“保护性免疫”表示施用于哺乳动物的疫苗或免疫日程表诱导阻止、延迟由脑膜炎奈瑟氏菌引起的疾病发生、或降低所述疾病的严重程度、或减轻或一并消除所述疾病的症状的免疫应答。保护性免疫可以伴有杀菌性抗体的生成。应当注意的是，本领域中公认，针对脑膜炎奈瑟氏菌的杀菌性抗体的生成预示着疫苗在人中的保护作用(Goldschneideretal.(1969)J.Exp.Med.129:1307；Borrowetal.(2001)InfectImmun.69:1568)。

短语“由脑膜炎奈瑟氏菌菌株引起的疾病”涵盖人感染脑膜炎奈瑟氏菌中存在的任何临床症状或临床症状组合。这些症状包括但不限于：脑膜炎奈瑟氏菌致病株寄居上呼吸道(例如鼻咽和扁桃体粘膜)、细菌渗透入粘膜和粘膜下血管床、败血症、败血性休克、炎症、出血性皮肤损伤、纤维蛋白溶解和血液凝结的激活、器官功能障碍(诸如肾、肺、和心力衰竭)、肾上腺出血和肌肉梗死形成、毛细管渗漏、水肿、外周肢体缺血、呼吸窘迫综合征、心包炎和脑膜炎。

在抗原(例如多肽抗原)的语境中，短语“与抗体特异性结合”或“特异性免疫反应性的”指基于和/或检验可能还包括其它分子的异质群的样品中抗原的存在情况的结合反应。如此，在指定条件下，一种或多种规定抗体与样品中的一种或多种特定抗原结合，且不以显著量与样品中存在的其它分子结合。在抗原的表位(例如多肽的表位)的语境中，“与抗体特异性结合”或“特异性免疫反应性的”指基于和/或检验可能还包括其它表位的异质群的抗原(例如多肽)以及抗原的异质群中表位的存在情况的结合反应。如此，在指定条件下，一种或多种规定抗体与抗原中的一个特定表位结合，且不以显著量与抗原和/或样品中存在的其它表位结合。

短语“以足以引发免疫应答的量”表示在施用特定抗原制备物之前和之后测定的免疫应答指标之间有检测得到的差异。免疫应答指标包括但不限于：抗体滴度或特异性，如通过诸如酶联免疫测定法(ELISA)、杀菌测定法、流式细胞术、免疫沉淀、Ouchterlony免疫扩散等测定法检测的；结合检测测定法，例如点、Western印迹或抗原阵列的；细胞毒性测定法等。

“表面抗原”是脑膜炎奈瑟氏菌的表面结构(例如外膜、荚膜、菌毛、等)中存在的抗原。

“分离的”指感兴趣分子处于与该分子可天然发生的环境不同的环境。“分离的”旨在包括实质性富集了感兴趣化合物/多肽和/或其中的感兴趣化合物/多肽得到部分或充分纯化的样品内的化合物/多肽。

“富集”表示对样品进行非天然操作(例如由科学家或临床医生进行的)，使得感兴趣化合物以比起始样品中化合物的浓度要大的浓度(例如至少大3倍、至少大4倍、至少大8倍、至少大64倍、或更多)存在，所述起始材料诸如生物学样品(例如其中天然存在化合物的样品或在施用后存在于其中的样品)，或在其中制备化合物的样品(例如，如细菌多肽、抗体、多肽、等等的情况)。

在靶基因的语境中，“敲除”指基因序列中导致靶基因功能降低(例如诸如靶基因表达检测不到或不显著，和/或基因产物无功能或无显著功能)的改变。例如，脂多糖(LPS)合成中涉及的基因的“敲除”指示基因的功能实质性降低，使得基因的表达检测不到或仅以不显著的水平存在和/或基因产物的生物学活性(例如酶活性)相对于修饰前显著降低或检测不到。“敲除”涵盖条件性敲除，其中靶基因的改变可以在例如暴露于预先限定的条件组(例如温度、渗透压)、暴露于促进靶基因改变的物质、等等时发生。靶基因的“敲入”指基因中导致靶基因提供的功能升高的遗传改变。

非天然发生fHbp多肽

在描述本公开文本涵盖的更多fHbp之前，描述一些天然发生fHbp是有帮助的。依照neisseria.org和pubmlst.org/neisseria/fHbp网站，给在脑膜炎奈瑟氏菌中找到的独特天然发生fHbp均指派一个fHbp肽ID。贯穿本公开文本会采用这种fHbp命名规则。

为方便和清楚起见，选择fHbpID1(脑膜炎奈瑟氏菌菌株MC58的v.1fHbp)的天然氨基酸序列作为参照序列用于描述所有天然发生和非天然发生fHbp氨基酸序列中的氨基酸位置，涵盖本文中描述的fHbp嵌合体和/或突变体。下文呈现了fHbpID1的氨基酸序列：

fHbpID1(v.1)

CSSGGGGVAADIGAGLADALTAPLDHKDKGLQSLTLDQSVRKNEKLKLAAQGAEKTYGNGDSLNTGKLKNDKVSRFDFIRQIEVDGQLITLESGEFQVYKQSHSALTAFQTEQIQDSEHSGKMVAKRQFRIGDIAGEHTSFDKLPEGGRATYRGTAFGSDDAGGKLTYTIDFAAKQGNGKIEHLKSPELNVDLAAADIKPDGKRHAVISGSVLYNQAEKGSYSLGIFGGKAQEVAGSAEVKTVNGIRHIGLAAKQ

(SEQIDNO:1)。

在提到fHbp中的氨基酸残基位置时，本文中使用的位置编号对应于fHbpID1的氨基酸残基编号。

各种fHbp的比对及每种fHbp中与fHbpID1的氨基酸残基对应的氨基酸残基见图4。如图4和SEQIDNO:1所示，位置编号1指fHbpID1中显示的第一个氨基酸残基，为半胱氨酸。本文中提到的fHbp有时可以在N端含有额外的前导序列。例如，fHbpID1可以在N端具有前导序列VNRTAFCCLSLTTALILTA(SEQIDNO:2)。然而，任何fHbp中的氨基酸位置编号1在本文中仍然定义为，与上文比对中为fHbpID1显示的氨基酸位置1处的半胱氨酸对应的位置，该氨基酸是前导序列(如果存在的话)之后的第一个残基。

图4显示变体1、2、和3fHbp的fHbp序列的比对。注意：fHbpID28(变体3)或fHbpID79(变体3)中的氨基酸位置230对应于fHbpID1的氨基酸位置223。参照v.2fHbp(例如fHbpID22)，所述氨基酸位置为222。H223以箭指示。该比对是使用在EuropeanBioinformaticInstitute网站处可得的ClustalW实施的。氨基酸同一性以星号代表；强相似性以冒号代表；弱相似性以句点代表；无相似性以空白空间代表。

本公开文本提供了自天然发生变体3fHbp(v.3fHbp)衍生的非天然发生fHbp、包含该非天然发生fHbp的组合物、及使用该非天然发生fHbp和组合物的方法。在某些实施方案中，非天然发生fHbp包含选自精氨酸、赖氨酸、苯丙氨酸、酪氨酸、或色氨酸的氨基酸对天然发生变体3fHbp第223位组氨酸的替代，其中第223位的编号方式基于成熟fHbpID1的编号方式，其中非天然发生fHbp具有比天然发生变体3fHbp要低的对人因子H(fH)的亲和力。

参照fHbpID79或fHbpID28的序列，本文所述非天然发生fHbp中被替代的组氨酸对应于第230位。具体而言，被突变的组氨酸是v.3fHbp的氨基酸序列的序列TYHLA内的H。

如本文中使用的，人因子H(“人fH”)指包含下文所示氨基酸序列(SEQIDNO:3)的蛋白，及其天然发生人等位变体。

人因子H(fH)

MRLLAKIICLMLWAICVAEDCNELPPRRNTEILTGSWSDQTYPEGTQAIYKCRPGYRSLGNVIMVCRKGEWVALNPLRKCQKRPCGHPGDTPFGTFTLTGGNVFEYGVKAVYTCNEGYQLLGEINYRECDTDGWTNDIPICEVVKCLPVTAPENGKIVSSAMEPDREYHFGQAVRFVCNSGYKIEGDEEMHCSDDGFWSKEKPKCVEISCKSPDVINGSPISQKIIYKENERFQYKCNMGYEYSERGDAVCTESGWRPLPSCEEKSCDNPYIPNGDYSPLRIKHRTGDEITYQCRNGFYPATRGNTAKCTSTGWIPAPRCTLKPCDYPDIKHGGLYHENMRRPYFPVAVGKYYSYYCDEHFETPSGSYWDHIHCTQDGWSPAVPCLRKCYFPYLENGYNQNHGRKFVQGKSIDVACHPGYALPKAQTTVTCMENGWSPTPRCIRVKTCSKSSIDIENGFISESQYTYALKEKAKYQCKLGYVTADGETSGSIRCGKDGWSAQPTCIKSCDIPVFMNARTKNDFTWFKLNDTLDYECHDGYESNTGSTTGSIVCGYNGWSDLPICYERECELPKIDVHLVPDRKKDQYKVGEVLKFSCKPGFTIVGPNSVQCYHFGLSPDLPICKEQVQSCGPPPELLNGNVKEKTKEEYGHSEVVEYYCNPRFLMKGPNKIQCVDGEWTTLPVCIVEESTCGDIPELEHGWAQLSSPPYYYGDSVEFNCSESFTMIGHRSITCIHGVWTQLPQCVAIDKLKKCKSSNLIILEEHLKNKKEFDHNSNIRYRCRGKEGWIHTVCINGRWDPEVNCSMAQIQLCPPPPQIPNSHNMTTTLNYRDGEKVSVLCQENYLIQEGEEITCKDGRWQSIPLCVEKIPCSQPPQIEHGTINSSRSSQESYAHGTKLSYTCEGGFRISEENETTCYMGKWSSPPQCEGLPCKSPPEISHGVVAHMSDSYQYGEEVTYKCFEGFGIDGPAIAKCLGEKWSHPPSCIKTDCLSLPSFENAIPMGEKKDVYKAGEQVTYTCATYYKMDGASNVTCINSRWTGRPTCRDTSCVNPPTVQNAYIVSRQMSKYPSGERVRYQCRSPYEMFGDEEVMCLNGNWTEPPQCKDSTGKCGPPPPIDNGDITSFPLSVYAPASSVEYQCQNLYQLEGNKRITCRNGQWSEPPKCLHPCVISREIMENYNIALRWTAKQKLYSRTGESVEFVCKRGYRLSSRSHTLRTTCWDGKLEYPTCAKR

天然发生fHbp具有高概率与fH复合，结合的fH能针对宿主的免疫系统掩盖fHbp上的一个或多个表位。因而，与fH复合和/或结合的fHbp可能无法像未复合的fHbp那样作为有效的免疫原。相反，具有相对较低的对fH的亲和力的fHbp当作为免疫原(例如在疫苗组合物中)施用时能向接受免疫的宿主的免疫系统呈递对fH具有高亲和力的fHbp不呈递的表位。本文中公开的非天然发生fHbp对人fH具有低亲和力，而且在引发针对脑膜炎奈瑟氏菌的杀菌性抗体和/或提供针对脑膜炎奈瑟氏菌的保护性免疫中是有用的。非天然发生fHbp在自然界中找不到，是人造的和/或经过人有意修饰。可以经由化学合成或重组方法来生成非天然发生主题fHbp。非天然发生fHbp相对于衍生它的天然发生fHbp包括突变。因此，本公开文本的非天然发生fHbp包括非天然发生fHbp氨基酸序列。

如本文中使用的，“低亲和力”、“更低的亲和力”、或“低fH结合者”指所具有的对人fH的结合亲和力比v.3fHbp(例如fHbpID79)的要低的fHbp。

本文中公开的非天然发生fHbp和人fH的结合亲和力是野生型v.3fHbp对人fH的结合亲和力的85％或更少。例如，在一些实施方案中，主题非天然发生fHbp对人fH的结合亲和力是野生型fHbp对人fH的结合亲和力的约85％至约75％、约75％至约65％、约65％至约55％、约55％至约45％、约45％至约35％、约35％至约25％、约25％至约15％、约15％至约10％、约10％至约5％、约5％至约2％、约2％至约1％、或约1％至约0.1％、或少于0.1％。作为一个例子，在一些实施方案中，主题非天然发生fHbp对人fH的结合亲和力是v.3fHbp对人fH的结合亲和力的约85％至约75％、约75％至约65％、约65％至约55％、约55％至约45％、约45％至约35％、约35％至约25％、约25％至约15％、约15％至约10％、约10％至约5％、约5％至约2％、约2％至约1％、或约1％至约0.1％、或少于0.1％。

可以就解离常数(K_D)而言描述结合亲和力。主题非天然发生fHbp和人fH所具有的解离常数(K_D；M)可以是野生型fHbp(诸如v.3fHbp，例如fHbpID79或fHbpID28)和人fH的K_D的至少超过约80％、至少超过约100％、至少超过约120％、至少超过约140％、至少超过约160％、至少超过约200％、或更多。主题非天然发生fHbp的K_D也可以描述为fHbpID79的K_D的约2倍、约3倍、约5倍、约10倍、约15倍、约20倍、高达约50倍或更多倍。例如，主题非天然发生fHbp和人fH所具有的的K_D可以是fHbpID79和人fH的K_D的110％或约15倍。

如上所述，主题非天然发生fHbp衍生自v.3fHbp。归类为变体群3(v.3)的fHbp记载于Masignanietal.(2003)JExpMed197:789-99和PajonRetal.(2010)Vaccine28:2122-9。BeerninkP.T.andGranoffD.M.(2009)Microbiology.2009Sep；155(Pt9):2873-83中提供了已知的v.3fHbp和GenBank登录号的列表。表1显示了例示性v.3fHbp的列表，包括来源脑膜炎奈瑟氏菌菌株、荚膜群、和对应模块群、肽ID、GenBank登录号。

表1

由Masignanietal.(2003)定义的变体群

§由Fletcheretal.(2004)定义的亚家族

||neisseria.org处的fHbp肽数据库中的肽鉴别号

由五个各自α和β区段的不同组合定义的模块群。群II完全由β型区段构成，而群V由α和β区段的天然嵌合体构成。

fHbpID67的序列在分子分型和微生物基因组多样性(在pubmlst.org处)的公共数据库处可得且本文中也有提供(见SEQIDNO:21)。

下文显示了天然发生v.3fHbp的一些例子的氨基酸序列。虽然v.3fHbp包括前导序列，但是下文所示序列不包括此前导序列，而是始于与参照上文提供的fHbpID1序列的第1位对应的半胱氨酸残基。

FHbpID28

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fHbpID46

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fHbpID76

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fHbpID29

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fHbpID99

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fHbpID30

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fHbpID64

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fHbpID45

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fHbpID47

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fHbpID79

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fHbpID84

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fHbpID59

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fHbpID82

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fHbpID31

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fHbpID85

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fHbpID70

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fHbpID72

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fHbpID67

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fHbpID175

CSSGGGGSGGGGVAADIGAGLADALTAPLDHKDKGLKSLTLEDSISQNGTLTLSAQGAERTFKAGDKDNSLNTGKLKNDKISRFDFIRQIEVDGQLITLESGEFQIYKQDHSAVVALQIEKINNPDKIDSLINQRSFLVSGLGGEHTAFNQLPDGKAEYHGKAFSSDDAGGKLTYTIDFAAKQGHGKIEHLKTPEQNVELAAAELKADEKSHAVILGDTRYGSEEKGTYHLALFGDRAQEIAGSATVKIGEKVHEIGIAGKQ(SEQIDNO:22)

如上所述，本文中公开的非天然发生fHbp可以衍生自天然发生v.3fHbp。上文列出了例示性v.3fHbp。天然发生fHbp具有自不同祖先(α和/或β)衍生的可变区段。由于可变区段，分子架构显示是模块化的，而且fHbp变体可以根据五个可变区段(A、B、C、D、和E)的不同组合细分成模块群，每个可变区段衍生自命名为α或β型的两种遗传谱系之一(PajonRetal.(2010)Vaccine28:2122-9；BeerninkPT,GranoffDM(2009)Microbiology155:2873-83)。命名为I至VI的六种模块群占据所有已知fHbp变体的>95％(PajonRetal.(2010)Vaccine28:2122-9)。

图6中提供了fHbp模块结构的示意图。显示了自242种独特氨基酸变体的系统发生分析推导的9种fHbp模块群的示意图。显示了相应的Masignani变体群命名及每个fHbp模块群内观察到的独特序列的数目。自α谱系衍生的可变区段以灰色描绘，而自β谱系衍生的可变区段以白色描绘。

在某些实施方案中，v.3fHbp可以是模块群IIfHbp。II群fHbp完全由β型区段构成(fHbp可变区段：A_β，B_β，C_β，D_β，和E_β)。表1中提供了例示性模块群IIfHbp。

在某些实施方案中，v.3fHbp可以是模块群VfHbp。模块群VfHbp由α和β区段的天然嵌合体构成且具有来自指定祖先的下述fHbp可变区段：A_β，B_β，C_β，D_α，和E_β。表1中提供了例示性模块群VfHbp。

在某些实施方案中，v.3fHbp可以是模块群VIIIfHbp。模块群VIIIfHbp由α和β区段构成且具有来自指定祖先的下述fHbp可变区段：A_β，B_α，C_β，D_β，和E_β。表1中提供了例示性模块群VIIIfHbp。

在某些实施方案中，v.3fHbp可以是模块群IXfHbp。模块群IXfHbp由α和β区段构成且具有来自指定祖先的下述fHbp可变区段：A_β，B_α，C_β，D_α，和E_β。表1中提供了例示性模块群IXfHbp。

在某些实施方案中，包含选自精氨酸、赖氨酸、苯丙氨酸、酪氨酸、或色氨酸的氨基酸对天然发生变体3fHbp第223位组氨酸的替代的非天然发生fHbp可以具有与天然发生变体3fHbp的氨基酸序列至少90％相同的氨基酸序列。在某些情况中，同一性可以是在一个区段(例如模块架构中定义的可变区段)内、在两个或更多个可变区段中、或在全长成熟蛋白中的。

主题非天然发生fHbp可以包含与变体3fHbp(例如fHbp79)具有至少90％、至少95％、至少98％、至少99％氨基酸序列同一性的氨基酸序列。在某些情况中，主题非天然发生fHbp可以与v.3fHbp的氨基酸序列相差1个氨基酸(aa)至25个氨基酸，例如与v.3fHbp的氨基酸序列相差1个aa、2个aa、3个aa、4个aa、5个aa、6个aa、7个aa、8个aa、9个aa、10个aa、13个aa、15个aa、18个aa、20个aa、22个aa、24个aa、或25个aa。如此，例如，主题非天然发生fHbp可以相对于衍生该主题fHbp的v.3fHbp具有至多一处、至多两处、至多三处、至多四处、至多六处、至多八处、至多十处、至多十二处、至多十四处、至多十六处、至多十八处、高达至多25处或更多处修饰(例如替代、删除、或插入)。所述一处或多处氨基酸改变可以相对于没有改变的fHbp降低fHbp对人fH的亲和力。

在一些实施方案中，主题非天然发生fHbp包含精氨酸对天然发生变体3fHbp第223位组氨酸的替代。如上所述，v.3fHbp可以是fHbpID46、fHbpID28、fHbpID76、fHbpID29、fHbpID99、fHbpID30、fHbpID64、fHbpID45、fHbpID47、fHbpID79、fHbpID84、fHbpID59、fHbpID82、fHbpID31、fHbpID85、fHbpID70、fHbpID72、fHbpID67、或fHbpID175。

图5中提供了例示性v.3fHbp的比对。还指示了H223的位置。比对中还包括参照序列fHbpID1。值得注意的是，fHbpID1在第223位处不具有组氨酸。该比对是使用在EuropeanBioinformaticInstitute网站处可得的ClustalW实施的。氨基酸同一性以星号代表；强相似性以冒号代表；弱相似性以句点代表；无相似性以空白空间代表。

如本文中所示，自v.3fHbp衍生且含有H223R替代的fHbp具有相对于天然发生v.3fHbp降低的对人fH的结合。如此，含有相对于精氨酸替代而言保守的氨基酸替代的非天然发生fHbp也预期具有与天然发生v.3fHbp相比降低的对人fH的结合。因此，本公开文本涵盖相对于精氨酸(R)而言保守的氨基酸替代，诸如还涵盖氨基酸替代H223K。另外，还涵盖对fH结合fHbp提供空间位阻的氨基酸替代--例示性氨基酸替代包括用具有庞大疏水性侧链的氨基酸诸如苯丙氨酸、酪氨酸、和色氨酸替代。因此，还涵盖氨基酸替代H223F、H223Y、和H223W。

一般而言，主题非天然发生fHbp不包括丙氨酸对第223位组氨酸的替代。

主题非天然发生fHbp的一项特征是当施用于宿主(例如哺乳动物，诸如小鼠或人)时，主题fHbp能以与衍生它的v.3fHbp(例如fHbpID79、46、28、67、175、或59)引发的杀菌应答相当或更高的水平引发杀菌应答。用于测定杀菌应答的水平的方法是本领域已知的。在某些情况中，经主题fHbp免疫的小鼠的几何均值杀菌滴度是经变体3fHbp(例如fHbpID79)免疫的小鼠的几何均值杀菌滴度的至少约70％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约100％、至少约110％、至少约120％、至少约150％、至少约175％、至少约200％、或超过200％。在一些情况中，经主题fHbp免疫的小鼠的几何均值杀菌滴度比经变体3fHbp(例如fHbpID79)免疫的对照小鼠的几何均值杀菌滴度要高至少2倍、至少2.5倍、至少5倍、至少10倍、或超过10倍。主题fHbp可以排除所引发的杀菌应答比变体3fHbp(例如fHbpID79)引发的杀菌应答显著要低的fHbp。

在许多情况中，主题非天然发生fHbp维持并呈递受到对一种或多种脑膜炎奈瑟氏菌菌株具有杀菌活性的抗体结合的构象表位。如此，此类fHbp突变体可以维持在天然发生v.3fHbp中找到的表位，同时展现与天然发生v.3fHbp对fH的结合亲和力相比降低的对fH的结合。对fHbp的构象具有最小影响或没有影响，使得突变体fHbp引发杀菌性抗体的突变体被认为是优良的疫苗候选物。可以以多种方式来确定突变体是否对fHbp的构象有影响，包括JAR31、JAR33、或JAR11抗体的结合。因而，本文中公开的非天然发生fHbp可以结合JAR31、JAR33、或JAR11抗体。

本公开文本的fHbp可以具有别的特征，它们在下文有更为详细的描述。

嵌合fHbp

本公开文本的非天然发生fHbp可以是嵌合fHbp。本公开文本的嵌合fHbp可以描述为具有来自变体群1或2的fHbp(v.1或v.2fHbp)的N端域(fHbpN)，而C端域(fHbpC)可以衍生自v.3fHbp(例如fHbpID79)，即包含选自精氨酸、赖氨酸、苯丙氨酸、酪氨酸、或色氨酸的氨基酸对天然发生变体3fHbp第223位组氨酸的替代的非天然发生fHbp。

在某些实施方案中，本公开文本的嵌合非天然发生fHbp可以具有来自变体群1的fHbp(例如fHbpID1)的fHbpN域和自v.3fHbp(例如fHbpID28)衍生的fHbpC域，即包含选自精氨酸、赖氨酸、苯丙氨酸、酪氨酸、或色氨酸的氨基酸对天然发生变体3fHbp第223位组氨酸的替代的嵌合非天然发生fHbp。

在某些实施方案中，本公开文本的嵌合非天然发生fHbp可以具有自变体群1fHbp(例如fHbpID1)衍生的fHbpN域和自v.3fHbp(例如fHbpID79)衍生的fHbpC域，即包含选自精氨酸、赖氨酸、苯丙氨酸、酪氨酸、或色氨酸的氨基酸对天然发生变体3fHbp第223位组氨酸的替代的非天然发生fHbp。在某些情况中，fHbpN域可以具有天然发生v.1fHbp第41位精氨酸的替代。在某些情况中，所述替代可以是R41S。

“fHbpN”指始于约残基第8位并止于约残基第136位的连续氨基酸序列。“fHbpC”指始于约残基第141位并止于约残基第255位的连续氨基酸序列。fHbpN和fHbpC之间的居间序列是两个结构域之间的接头。

可以修饰以包括H223R、H223W、H223F、H223Y、或H223K替代的例示性嵌合fHbp可以是任何已知人工嵌合体，诸如Beerninketal.(2008)Infec.Immun.76:2568-2575和WO2009/114485中记载的那些，通过援引将其公开内容收入本文。含有替代的嵌合体可以具有相对于相应嵌合fHbp降低的对人fH的亲和力，同时仍然维持对于引发杀菌应答重要的表位，诸如在相应嵌合fHbp中找到的表位。可以在经过修饰的嵌合体中维持的fHbp表位包括在相应嵌合fHbp中找到的表位，诸如WO2009/114485中记载的表位，通过援引将其公开内容收入本文。例如，经过修饰的嵌合fHbp可以含有对于引发针对含有变体1fHbp的菌株(例如N端结构域中的表位，诸如由单抗JAR4和/或JAR5定义的表位)和/或含有变体2和/或3fHbp的菌株(例如由单抗JAR10、JAR11、JAR13、和/或JAR36定义的表位)的杀菌性抗体应答重要的表位。

下文显示了例示性嵌合体：

嵌合体1/79

cssggggvaadigagladaltapldhkdkglqsltldqsvrkneklklaaqgaektygngdslntgklkndkvsrfdfirqievdgqlitlesgefqvykqshsaltafqteqiqdsehsgkmvakrqfrigdiaGEHTAFNQLPGGKAEYHGKAFSSDDAGGKLTYTIDFAAKQGHGKIEHLKTPEQNVELASAELKADEKSHAVILGDTRYGSEEKGTYHLALFGDRAQEIAGSATVKIGEKVHEIGIAGKQ

(SEQIDNO:23)。小写字母对应于自fHbpID1衍生的氨基酸序列，而大写字母对应于自fHbpID79衍生的氨基酸。与fHbpID79中的H223对应的位置为粗体且标有下划线。相应地，本公开文本的嵌合非天然发生fHbp可以包括具有H223变成H223R、H223W、H223F、H223Y、或H223K的替代的嵌合体1/79的序列。

嵌合体1(R41S)/79

cssggggvaadigagladaltapldhkdkglqsltldqsvskneklklaaqgaektygngdslntgklkndkvsrfdfirqievdgqlitlesgefqvykqshsaltafqteqiqdsehsgkmvakrqfrigdiaGEHTAFNQLPGGKAEYHGKAFSSDDAGGKLTYTIDFAAKQGHGKIEHLKTPEQNVELASAELKADEKSHAVILGDTRYGSEEKGTYHLALFGDRAQEIAGSATVKIGEKVHEIGIAGKQ

(SEQIDNO:24)。小写字母对应于自fHbpID1衍生的氨基酸序列，而大写字母对应于自fHbpID79衍生的氨基酸。第41位包括丝氨酸对R的替代。与fHbpID79中的H223对应的位置为粗体且标有下划线。相应地，本公开文本的嵌合非天然发生fHbp可以包括具有H223变成H223R、H223W、H223F、H223Y、或H223K的替代的嵌合体1(R41S)/79的序列。

一般而言，主题非天然发生fHbp不包括丙氨酸对第223位组氨酸的替代。

主题非天然发生嵌合fHbp可以包含与变体3fHbp(例如fHbp79)具有至少90％、至少95％、至少98％、至少99％氨基酸序列同一性的氨基酸序列。同一性可以是在主题嵌合fHbp中自v.3fHbp衍生的区域和v.3fHbp的相应区域内的。例如，在fHbpC域衍生自v.3fHbp的嵌合蛋白中，同一性可以是在fHbpC域中的。

主题嵌合非天然发生fHbp的一项特征是当施用于宿主(例如哺乳动物，诸如小鼠或人)时，主题fHbp能以与衍生该嵌合体的变体群fHbp(例如fHbpID1和fHbpID79)引发的杀菌应答相当或更高的水平引发杀菌应答。

用于测定杀菌应答水平的方法是本领域已知的。在某些情况中，经主题嵌合fHbp免疫的小鼠的几何均值杀菌滴度是经fHbpID1或fHbpID79免疫的小鼠的几何均值杀菌滴度的至少约70％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约100％、至少约110％、至少约120％、至少约150％、至少约175％、至少约200％、或超过200％。在有些情况中，经主题fHbp免疫的小鼠的几何均值杀菌滴度比经fHbpID1或fHbpID79免疫的对照小鼠的几何均值杀菌滴度要高至少2倍、至少2.5倍、至少5倍、至少10倍、或超过10倍。

主题fHbp可以排除所引发的杀菌应答比fHbpID1或fHbpID79引发的杀菌滴度显著要低的fHbp。

在许多情况中，主题非天然发生嵌合fHbp维持并呈递受到对一种或多种脑膜炎奈瑟氏菌菌株具有杀菌活性的杀菌性抗体结合的构象表位。如此，此类fHbp突变体可以维持在天然发生fHbp中找到的表位，同时展现与天然发生fHbp对fH的结合亲和力相比降低的对fH的结合。对fHbp的构象具有最小影响或没有影响，使得嵌合fHbp引发杀菌性抗体的本公开文本的非天然发生嵌合fHbp被认为是优良的疫苗候选物。可以以多种方式来确定变体是否对fHbp的构象有影响，包括诸如JAR4、JAR5、JAR31、JAR33、或JAR11等抗体的结合。

本公开文本的fHbp可以具有别的特征，它们在下文有更为详细的描述。

缀合物

本公开文本的主题fHbp可以在多肽的N和/或C端含有一个或多个别的元件，诸如多肽(例如具有与主题fHbp异源的氨基酸序列)和/或载体分子。可以融合别的异源氨基酸序列，例如用于提供N端甲硫氨酸或其衍生物(例如焦谷氨酸)(作为在细菌宿主细胞(例如大肠杆菌)中表达的结果)和/或用于提供在其N端或C端具有融合配偶的嵌合多肽。感兴趣的融合配偶包括例如谷胱甘肽-S-转移酶(GST)、麦芽糖结合蛋白(MBP)、His₆标签、等等，以及来自其它蛋白(特别是脂蛋白)的前导肽。融合配偶可以提供别的特征，诸如推动主题fHbp的分离、纯化、检测、免疫原性。

可以连接至主题fHbp的其它元件包括载体分子(例如载体蛋白，例如钥孔虫戚血蓝蛋白(KLH))。别的元件可以经由接头(例如柔性接头)连接至肽。载体涵盖免疫调控剂，即直接或间接修饰免疫应答的分子。特定的一类免疫调控剂包括刺激或帮助刺激免疫学应答的免疫调控剂。例子包括抗原和抗原载体，诸如毒素或其衍生物，包括破伤风类毒素。还涵盖方便施用和/或在要针对脑膜炎奈瑟氏菌接受疫苗接种或治疗的受试者中提高免疫原性的其它载体。载体分子也可以推动对感兴趣的细胞或组织的投递。别的模块也可能有助于免疫原性或与疫苗中的成分一起形成复合物。载体分子可以起支架蛋白的作用，以推动在膜表面上展示抗原(例如囊泡疫苗)。

在一个例子中，在N和/或C端修饰主题fHbp以包括脂肪酸(例如脂肪族羧酸基团)。脂肪酸可以经由柔性接头共价连接至fHbp。可以用于修饰主题fHbp的末端(例如N端末端，例如在N端)的脂肪酸的一个例子是月桂酸。当共价附着至另一分子时，月桂酸称作月桂酰基团(例如月桂酰硫酸酯)。月桂酸含有十二个碳原子及十个亚甲基基团，式为CH₃-(CH₂)₁₀-COOH。可以连接至主题肽的其它脂肪酸包括辛酸(10C)、肉豆蔻酸(14C)、和棕榈酸(16C)。详情参见WesterinkMAetal.(1995)Proc.Natl.Acad.Sci.USA92:4021-4025。还涵盖的是，本文中涵盖可用于将主题fHbp锚定入细菌外膜的任何疏水性模块，用于缀合至本公开文本的fHbp的N和/或C端末端(例如在N端)，其中疏水性模块可以任选通过本文中描述的接头(例如柔性接头)缀合至肽。例如，疏水性五肽FLLAV(SEQIDNO:25)，如记载于LowellGHetal.(1988)J.Exp.Med.167:658-63。

如上所述，脂肪酸以及上文所述其它别的元件连接至fHbp的一种方式是经由接头(例如月桂酰-Gly-Gly)。适用于修饰本公开文本的fHbp的接头包括“柔性接头”。合适接头可以容易地选择，而且可以是合适的不同长度任一，诸如1个氨基酸(例如Gly)至20个氨基酸、2个氨基酸至15个氨基酸、3个氨基酸至12个氨基酸，包括4个氨基酸至10个氨基酸、5个氨基酸至9个氨基酸、6个氨基酸至8个氨基酸、或7个氨基酸至8个氨基酸，而且可以是1、2、3、4、5、6、或7个氨基酸。

柔性接头的例子包括甘氨酸聚合物(G)_n、甘氨酸-丝氨酸聚合物(包括例如(GS)_n、GSGGS_n和GGGS_n，其中n是至少1的整数)、甘氨酸-丙氨酸聚合物、丙氨酸-丝氨酸聚合物、和本领域已知的其它柔性接头。甘氨酸和甘氨酸-丝氨酸聚合物是感兴趣的，因为这些氨基酸均是相对未结构化的(unstructured)，而且因此可以作为成分之间的中性系链。甘氨酸聚合物是特别感兴趣的，因为甘氨酸甚至比丙氨酸到达显著更多的Ramachandran(或phi-psi)空间，而且比具有更长侧链的残基受约束少得多(参见Scheraga,Rev.ComputationalChem.11173-142(1992))。例示性柔性接头包括但不限于GGSG(SEQIDNO:26)、GGSGG(SEQIDNO:2)、GSGSG(SEQIDNO:28)、GSGGG(SEQIDNO:29)、GGGSG(SEQIDNO:30)、GSSSG(SEQIDNO:31)、等等。普通技术人员会认识到，缀合至上文所述任何元件的fHbp的设计可以包括全部或部分柔性的接头，使得接头可以包括柔性接头以及一个或多个赋予不同柔性的结构的部分。

天然fHbp通常含有N端半胱氨酸，对其可以共价附着脂质模块。此半胱氨酸残基在天然发生蛋白中通常是脂质化的，而且在本文中公开的主题fHbp中可以是脂质化的。如此，在本文中描述的氨基酸序列中，在此位置提到“半胱氨酸”或“C”具体包括提到未经修饰的半胱氨酸以及脂质化的半胱氨酸(例如由于翻译后修饰)。如此，主题fHbp可以是脂质化的或非脂质化的。用于在体外(参见例如Anderssonetal.(2001)J.ImmunologicalMethods255:135-48)或体内生成脂质化蛋白质的方法是本领域已知的。例如，先前已经通过去污剂提取自大肠杆菌蛋白质的膜级分纯化脂质化的fHbp(Fletcheretal.(2004)InfectionandImmunity72:2088-100)，该方法可以适应脂质化fHbp的生成。脂质化蛋白质可能是感兴趣的，因为它们可能比可溶性蛋白质更具免疫原性(参见例如Fletcheretal.(2004)InfectionandImmunity72:2088-100)。

会领会的是，可以修饰编码异源fHbp的核苷酸序列以优化密码子选择，从而推动感兴趣宿主细胞(例如大肠杆菌、脑膜炎奈瑟氏菌、人(在基于DNA的疫苗的情况中)、等等)中的表达。用于生成经过密码子优化的序列的方法是本领域已知的。

编码fHbp的核酸

本公开文本提供了一种编码主题fHbp的核酸。在一些实施方案中，主题核酸会存在于重组表达构建体中。还提供了包含主题核酸的经遗传修饰的宿主细胞。

本公开文本的fHbp多肽和编码核酸可以衍生自任何合适脑膜炎奈瑟氏菌菌株。正如本领域中已知的，基于同与不同表面抗原相互作用的多克隆(Frasch,C.E.andChapman,1973,J.Infect.Dis.127:149-154)或单克隆抗体的反应，将脑膜炎奈瑟氏菌菌株分入血清学群(荚膜群)、血清型(PorB表型)和亚型(PorA表型)。荚膜群鉴定传统上基于荚膜多糖中的免疫学可检测差异，但是正在被编码特定酶的基因的PCR替代，所述酶负责结构不同的荚膜多糖的生物合成。已知约12种荚膜群(包括A、B、C、X、Y、Z、29-E、和W-135)。荚膜群A、B、C、Y和W-135的菌株对几乎所有脑膜炎球菌疾病负有责任。血清型鉴定传统上基于称作孔蛋白B(PorB)的外膜蛋白中由单克隆抗体定义的抗原性差异。目前知道定义约21种血清型的抗体(Sacchietal.,1998,Clin.Diag.Lab.Immunol.5:348)。血清亚型鉴定基于称作孔蛋白A(PorA)的外膜蛋白上由抗体定义的抗原性差异。血清型鉴定和血清亚型鉴定二者正在被用于鉴定分别编码与单抗反应性有关的PorB和PorA可变区的基因的PCR和/或DNA测序替代(例如Sacchi,Lemosetal.,同上；Urwinetal.,1998,Epidem.andInfect.120:257)。

虽然可以使用任何荚膜群的脑膜炎奈瑟氏菌菌株，但是荚膜群B的脑膜炎奈瑟氏菌菌株可以是衍生编码fHbp及其结构域的核酸的来源。

用于构建本文中涵盖的主题fHbp的编码fHbp多肽的核酸是本领域已知的。各种fHbp及其序列在neisseria.org和pubmlst.org/neisseria/fHbp网站可得。fHbp多肽的例子还记载于例如美国专利申请号61/174,424、PCT申请号PCT/US09/36577、WO2004/048404；Masignanietal.(2003)JExpMed197:789-799；Fletcheretal.(2004)InfectImmun72:2088-2100；Welschetal.,JImmunol,2004,172:5606-5615；及WO99/57280。fHbp变体的核酸(及氨基酸)序列也可见GenBank。

为了鉴定涵盖用于本文中公开的主题fHbp的有关氨基酸序列，应当注意，未成熟fHbp包括约19个残基的前导序列。此外，当提供了一种氨基酸序列时，普通技术人员能容易想到能编码并表达具有此氨基酸序列的多肽的核酸的序列。

在本文中提供的特定氨基酸序列和核酸序列以外，本公开文本还涵盖具有与氨基酸和核酸序列的此类例子至少80％、至少85％、至少90％、或至少95％相同的序列的多肽和核酸。在两条或更多条多核苷酸序列，或两条或更多条氨基酸序列的上下文中，术语“相同”或百分比“同一性”指在指定区域上(例如V_E或参照氨基酸或核苷酸序列中长度为至少约40、45、50、55、60、65或更多个氨基酸或核苷酸，可以直至全长的区域(例如全长fHbp))为了最大对应性进行比较或比对时，相同的或具有规定百分比的相同氨基酸残基或核苷酸(例如，在规定区域上至少80％、至少85％、至少90％、或至少95％相同)的两条或更多条序列或子序列。本公开文本具体涵盖天然发生多态性和合成产生的氨基酸序列及其编码核酸二者。

对于序列比较，通常一条序列作为参照序列(例如天然发生fHbp多肽序列或其片段)，与其比较测试序列。当使用序列比较算法时，将测试和参照序列输入计算机程序，在必要时指派序列坐标，并指派序列算法程序参数。然后，序列比较算法基于指派的程序参数计算测试序列相对于参照序列的百分比序列同一性。

适合于确定百分比序列同一性的算法的例子有BLAST和BLAST2.0算法，它们分别记载于Altschuletal.(1990)J.Mol.Biol.215:403-410及Altschuletal.(1977)NucleicAcidsRes.25:3389-3402。公众可以通过(美国)国家生物技术信息中心获得用于实施BLAST分析的软件。别的例示性算法包括ClustalW(HigginsD.,etal.(1994)NucleicAcidsRes22:4673-4680)。

不同的一些残基位置因保守性氨基酸替代而不同。保守性氨基酸替代指具有相似侧链的残基的互换。例如，具有脂肪族侧链的一组氨基酸是甘氨酸、丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、和异亮氨酸；具有脂肪族-羟基侧链的一组氨基酸是丝氨酸和苏氨酸；具有含酰胺侧链的一组氨基酸是天冬酰胺和谷氨酰胺；具有芳香族侧链的一组氨基酸是苯丙氨酸、酪氨酸、和色氨酸；具有酸性侧链的一组氨基酸是天冬氨酸和谷氨酸；具有碱性侧链的一组氨基酸是赖氨酸、精氨酸、和组氨酸；而具有含硫侧链的一组氨基酸是半胱氨酸和甲硫氨酸。

两条核酸之间的序列同一性也可以就两种分子在严格条件下彼此杂交而言进行描述。遵循本领域中的标准方法选择杂交条件(参见例如Sambrook,etal.,MolecularCloning:ALaboratoryManual,SecondEdition,(1989)ColdSpringHarbor,N.Y.)。严格杂交条件的一个例子是在50℃或更高及0.1×SSC(15mM氯化钠/1.5mM柠檬酸钠)杂交。严格杂交条件的另一个例子是在42℃在下述溶液中温育过夜：50％甲酰胺、5×SSC(150mMNaCl，15mM柠檬酸三钠)、50mM磷酸钠(pH7.6)、5×Denhardt氏溶液、10％硫酸右旋糖苷、和20mg/ml变性剪切鲑鱼精DNA，随后在约65℃在0.1×SSC中清洗滤膜。严格杂交条件是至少与上文代表性条件一样严格的杂交条件，其中与上文特定严格条件至少约80％一样严格，通常至少90％一样严格的条件认为是至少一样严格的。

生成方法

可以通过任何合适方法来生成本公开文本的fHbp，包括重组和非重组方法(例如化学合成)。在使用重组技术来生成主题fHbp的情况中，所述方法可以涉及任何合适构建体和任何合适宿主细胞，它可以是原核细胞或真核细胞，通常是细菌或酵母宿主细胞，更通常是细菌细胞。用于将遗传材料导入宿主细胞的方法包括例如转化、电穿孔、接合、和磷酸钙法、等等。可以选择转移方法，从而提供所导入的fHbp编码核酸的稳定表达。fHbp编码核酸可以作为可遗传附加体元件(例如质粒)提供，或者可以整合至基因组。

用于转移fHbp编码核酸的合适载体可以在组成上有变化。整合载体可以是条件性复制或自杀性质粒、噬菌体、等等。构建体可以包括各种元件，包括例如启动子、可选择遗传标志(例如赋予抗生素(例如卡那霉素、红霉素、氯霉素、或庆大霉素)抗性的基因)、复制起点(用于促进宿主细胞例如细菌宿主细胞中的复制)、等等。载体的选择会依赖于多种因素，诸如想要在其中繁殖的细胞的类型和繁殖的目的。某些载体对于扩增和制备大量期望DNA序列是有用的。其它载体适合于培养中的细胞中的表达。还有其它载体适合于完整动物中的细胞中的转移和表达。适宜载体的选择完全在本领域的技术内。许多此类载体是可购得的。

在一个例子中，载体是基于附加体型质粒的表达载体，所述附加体型质粒含有可选择药物抗性标志和提供在不同宿主细胞中(例如在大肠杆菌和脑膜炎奈瑟氏菌二者中)自主复制的元件。此类“穿梭载体”的一个例子是质粒pFP10(Pagottoetal.(2000)Gene244:13-19)。

可以通过例如将感兴趣多核苷酸插入构建体主链中(通常借助DNA连接酶附着至载体中经过切割的限制酶位点)来制备构建体。或者，可以通过同源重组或位点特异性重组来插入期望核苷酸序列。通常，通过在期望核苷酸序列的侧翼附着与载体同源的区域来实现同源重组，而可以通过使用推动位点特异性重组的序列(例如cre-lox、att位点、等)来实现位点特异性重组。可以通过例如连接寡核苷酸、或通过使用包含同源区域和期望核苷酸序列一部分二者的引物的聚合酶链式反应来添加含有此类序列的核酸。

载体可以提供宿主细胞中的染色体外维持，或者可以提供整合入宿主细胞基因组。载体在本领域公知的众多出版物中有充足描述，包括例如ShortProtocolsinMolecularBiology,(1999)F.Ausubel,etal.,eds.,Wiley&Sons。载体可以提供编码主题fHbp的核酸的表达，可以提供主题核酸的扩增，或二者。

可以使用的载体的例子包括但不限于自重组噬菌体DNA、质粒DNA或粘粒DNA衍生的载体。例如，可以使用质粒载体，诸如pBR322、pUC19/18、pUC118、119和M13mp系列载体。pET21也是可以使用的表达载体。噬菌体载体可以包括λgt10、λgt11、λgt18-23、λZAP/R和EMBL系列噬菌体载体。可以使用的其它载体包括但不限于pJB8、pCV103、pCV107、pCV108、pTM、pMCS、pNNL、pHSG274、COS202、COS203、pWE15、pWE16和卡隆粒9系列载体。

对于主题fHbp的表达，可以采用表达盒。如此，本公开文本提供了包含主题核酸的重组表达载体。表达载体提供转录和翻译调节序列，而且可以提供诱导型或组成型表达，其中编码区可操作连接在转录起始区、及转录和翻译终止区的转录控制下。这些控制区对于衍生主题fHbp的fHbp可以是天然的，或者可以衍生自外源来源。通常，转录和翻译调节序列可以包括但不限于启动子序列、核糖体结合位点、转录起始和终止序列、翻译起始和终止序列、和增强子或激活子序列。启动子可以是组成型或诱导型的，而且可以是强组成型启动子(例如T7等等)。

表达载体通常具有位于启动子序列附近的方便的限制性位点，以提供编码感兴趣蛋白的核酸序列的插入。可以存在在表达宿主中运转的选择标志以推动对含有载体的细胞的选择。另外，表达构建体可以包括别的元件。例如，表达载体可以具有一种或两种复制系统，如此容许它在生物体中(例如在用于表达的哺乳动物或昆虫细胞中及在用于克隆和扩增的原核宿主中)得到维持。另外，表达构建体可以含有选择标志基因，以容许对经过转化的宿主细胞的选择。选择基因是本领域公知的，而且会随所使用的宿主细胞而变化。

应当注意，本公开文本的fHbp可以包含别的元件，诸如可检测标记物，例如放射性标记物、发荧光标记物、生物素标记物、和免疫学可检测标记物(例如HA标签、多组氨酸标签)等等。可以提供fHbp的别的元件以推动通过各种方法(例如亲和捕捉等)的分离(例如生物素标签、免疫学可检测标签)。任选地，可以通过共价或非共价附着在支持物上固定化主题fHbp。

可以根据本领域已知的方法来实现fHbp的分离和纯化。例如，可以通过免疫亲和纯化自经遗传修饰以表达fHbp的细胞的裂解物或合成反应混合物分离fHbp，免疫亲和纯化通常涉及：使样品接触抗fHbp抗体(例如抗fHbp单抗，诸如JAR5单抗或本领域已知的其它适宜JAR单抗)，清洗以去除非特异性结合的材料，并洗脱特异性结合的fHbp。可以通过透析和蛋白质纯化方法中通常采用的其它方法来进一步纯化分离的fHbp。在一个例子中，可以使用金属螯合物层析法来分离fHbp。

宿主细胞

多种合适宿主细胞任一可以用于生成fHbp。一般而言，可以依照常规技术在原核生物或真核生物(通常是细菌，更通常是大肠杆菌或奈瑟氏菌，例如脑膜炎奈瑟氏菌)中表达本文所述fHbp。因而，本公开文本进一步提供了经过遗传修饰的宿主细胞，其含有编码主题fHbp的核酸。用于生产(包括大规模生产)主题fHbp的宿主细胞可以选自多种可得宿主细胞任一。用于表达的宿主细胞的例子包括原核或真核单细胞生物体的细胞，诸如细菌(例如大肠杆菌菌株)、酵母(例如酿酒酵母、毕赤酵母物种、等等)，而且可以包括最初自高等生物体诸如昆虫、脊椎动物(特别是哺乳动物，例如CHO、HEK、等等)衍生的宿主细胞。通常，细菌宿主细胞和酵母对于主题fHbp生产是特别感兴趣的。

可以以基本上纯或基本上分离的形式(即基本上不含其它奈瑟氏菌或宿主细胞多肽)或基本上分离的形式制备主题fHbp。主题fHbp可以存在于组合物中，其相对于可能存在的其它成分(例如其它多肽或其它宿主细胞成分)富集该多肽。可以提供纯化的主题fHbp，使得多肽存在于基本上不含其它表达多肽的组合物中，例如，少于90％、通常少于60％且更通常少于50％的组合物是由其它表达多肽构成的。

用于囊泡生成的宿主细胞

在要在膜囊泡(如下文更详细讨论的)中提供主题fHbp的情况中，遗传修饰奈瑟氏菌宿主细胞以表达主题fHbp。可以修饰多种奈瑟氏菌菌株任一以生成主题fHbp，而且，任选的是，可以在本文中公开的方法中使用生成或能够经修饰以生成其它感兴趣抗原诸如PorA的菌株。

用于遗传修饰奈瑟氏菌菌株及表达期望多肽的方法和载体是本领域已知的。载体和方法的例子可参见WO02/09746及O’Dwyeretal.(2004)InfectImmun72:6511-80。强启动子(特别是组成性强启动子)是特别感兴趣的。启动子的例子包括porA、porB、lbpB、tbpB、p110、hpuAB、lgtF、opa、p110、lst、hpuAB、和rmp的启动子。在某些实施方案中，通过重组技术修饰奈瑟氏菌菌株以提供足够高水平的本文中公开的非天然发生fHbp的生成。一般生成此类经过修饰的菌株以提供表达水平超出未经遗传修饰以表达非天然发生fHbp的亲本细胞中的fHbp生成1.5、2、2.5、3、3.5、4、4.5、5、5.5、6、6.5、7、7.5、8、8.5、9、9.5、或10倍或更多的非天然发生fHbp。在某些实施方案中，可以遗传修饰亲本细胞以敲除内源fHbp及过表达非天然发生fHbp。

致病性奈瑟氏菌物种或自致病性奈瑟氏菌物种衍生的菌株，特别是对人致病性的或自对人致病性或共生性的菌株衍生的菌株对于用于膜囊泡生成是特别感兴趣的。奈瑟氏菌物种的例子包括脑膜炎奈瑟氏菌(N.meningitidis)、金黄奈瑟氏菌(N.flavescens)、淋病奈瑟氏菌(N.gonorrhoeae)、乳酸奈瑟氏菌(N.lactamica)、多糖奈瑟氏菌(N.polysaccharea)、灰色奈瑟氏菌(N.cinerea)、粘膜奈瑟氏菌(N.mucosa)、浅黄奈瑟氏菌(N.subflava)、干燥奈瑟氏菌(N.sicca)、长形奈瑟氏菌(N.elongata)、等等。

脑膜炎奈瑟氏菌菌株对于遗传修饰以表达主题fHbp及用于囊泡生成是特别感兴趣的。可以根据可能想要的多种不同特征来选择用于囊泡生成的菌株。例如，可以根据下述各项来选择菌株：想要的PorA类型(“血清亚型”，如上文描述的)、荚膜群、血清型、等等；降低的荚膜多糖生成；等等。例如，生产菌株可以生成任何期望PorA多肽，而且可以表达一种或多种PorA多肽(或是天然的或是由于遗传工程的)。菌株的例子包括生成赋予血清亚型P1.7,16；P1.19,15；P1.7,1；P1.5,2；P1.22a,14；P1.14；P1.5,10；P1.7,4；P1.12,13的PorA多肽的菌株；以及生成此类PorA多肽的变体的菌株，所述变体可以保留或不保留与在血清亚型鉴定中使用的常规血清学试剂的反应性。还感兴趣的是根据PorA可变区(VR)分析而表征的PorA多肽(参见例如Russelletal.(2004)EmergingInfectDis10:674-678；SacchiCTetal.(1998)ClinDiagnLabImmunol5:845-55；Sacchietal.(2000)J.InfectDis182:1169-1176)。已经鉴定出了大量不同VR类型，它们可以分类入VR1和VR2家族“原型”。描述这种命名法及其与在先类型鉴定方案的相关性的网络可访问数据库可见neisseria.org/nm/typing/pora。某些PorAVR1和VR2类型的比对可参见Russelletal.(2004)EmergingInfectDis10:674-678。

或者/另外，生产菌株可以是荚膜缺陷型菌株。荚膜缺陷型菌株可以提供基于囊泡的疫苗，其提供降低的风险在接受疫苗施用的受试者中引发显著自身抗体应答(例如，由于生成与宿主细胞表面上的唾液酸交叉反应的抗体)。如本文中使用的，“荚膜缺陷型”或“荚膜多糖缺陷的”指细菌表面上的荚膜多糖的水平比天然发生菌株要低，或者，在菌株经过遗传修饰的情况中，比衍生该荚膜缺陷型菌株的亲本菌株要低。荚膜缺陷型菌株包括表面荚膜多糖生成降低至少10％、20％、25％、30％、40％、50％、60％、75％、80％、85％、90％或更多的菌株，而且包括在细菌表面上检测不到荚膜多糖(例如通过使用抗荚膜多糖抗体的全细胞酶联免疫吸附测定法(ELISA))的菌株。

荚膜缺陷型菌株包括因天然发生或重组产生的遗传修饰而荚膜缺陷的菌株。天然发生荚膜缺陷型菌株(参见例如Dolan-Livengoodetal.(2003)J.Infect.Dis.187:1616-28)，以及鉴定和/或产生荚膜缺陷型菌株的方法(参见例如Fissehaetal.(2005)Infect.Immun.73:4070-4080；Stephensetal.(1991)InfectImmun59:4097-102；Froschetal.(1990)MolMicrobiol.4:1215-1218)是本领域已知的。

修饰奈瑟氏菌宿主细胞以提供降低的荚膜多糖生成可以包括修饰一种或多种涉及荚膜合成的基因，其中所述修饰提供相对于修饰前的亲本细胞降低的水平的荚膜多糖。此类遗传修饰可以包括一种或多种荚膜生物合成基因的核苷酸和/或氨基酸序列的变化，使得菌株变成荚膜缺陷的(例如由于一种或多种荚膜生物合成基因中的一处或多处插入、删除、替代、等等)。荚膜缺陷型菌株可以是一种或多种荚膜基因缺乏或无功能的。

特别感兴趣的是唾液酸生物合成中有缺陷的菌株。此类菌株可以提供具有降低的风险引发与人唾液酸抗原交叉反应的抗唾液酸抗体的囊泡的生成，而且可以进一步提供改良的生产安全性。具有唾液酸生物合成中的缺陷(由于天然产生修饰或工程改造修饰)的菌株可以是唾液酸生物合成途径中的多种不同基因任一中有缺陷的。特别感兴趣的是N-乙酰基葡糖胺-6-磷酸2-差向异构酶基因(称作synXAAF40537.1或siaAAAA20475)编码的基因产物中有缺陷的菌株，此基因灭活的菌株是尤其感兴趣的。例如，在一个实施方案中，通过破坏功能性synX基因产物的生成来生成荚膜缺陷型菌株(参见例如Swartleyetal.(1994)JBacteriol.176:1530-4)。

也可以使用非重组技术自天然发生菌株产生荚膜缺陷型菌株，例如通过使用杀菌性抗荚膜抗体来选择荚膜多糖水平降低的菌株。

在本公开文本涉及使用两种或更多种菌株的情况中(例如为了生成含有来自不同菌株的呈递主题fHbp的囊泡的抗原性组合物)，可以选择在一项或多项菌株特征中不同的菌株，例如为了提供在所使用的主题fHbp、PorA、等等中不同的囊泡。

囊泡的制备

本公开文本涵盖的抗原性组合物通常包括自表达主题fHbp的奈瑟氏菌细胞制备的囊泡。如本文中提到的，“囊泡”旨在涵盖外膜囊泡以及微囊泡(也称作大疱(bleb))。

抗原性组合物可以含有自经遗传修饰以表达主题fHbp的脑膜炎奈瑟氏菌培养株的外膜制备的外膜囊泡(OMV)。OMV可以自在液体或固体培养基培养物中生长的脑膜炎奈瑟氏菌获得，优选通过将细菌细胞与培养基分开(例如通过过滤或使得细胞形成团粒的低速离心、等等)、裂解细胞(例如通过添加去污剂、渗透休克、超声波处理、空腔化、匀浆、等等)及将外膜级分与胞质分子分开(例如通过过滤；或通过外膜和/或外膜囊泡的差异沉淀或聚集；或通过使用特异性识别外膜分子的配体的亲和分离方法；或通过使外膜和/或外膜囊泡形成团粒的高速离心；等等)；外膜级分可以拥有生成OMV。

抗原性组合物可以含有含有主题fHbp的微囊泡(MV)(或“大疱”)，其中MV或大疱在经遗传修饰以表达主题fHbp的脑膜炎奈瑟氏菌菌株的培养期间释放。例如，MV可以如下获得，即在液体培养基中培养脑膜炎奈瑟氏菌菌株，将完整细胞与液体培养基分开(例如通过过滤，或通过只使细胞但不使较小的大疱形成团粒的低速离心，等等)，然后收集无细胞培养基中存在的MV(例如通过过滤，MV的差异沉淀或聚集，或使大疱形成团粒的高速离心，等等)。通常可以基于培养物中生成的大疱的量来选择用于生成MV的菌株(例如，可以以合理数目培养细菌以提供适合于本文所述方法中分离和施用的大疱的生成)。生成高水平的大疱的一种例示性菌株在PCT公开号WO01/34642中有记载。在大疱生成以外，也可以基于NspA生成来选择用于MV生成的菌株，其中生成较高水平的NspA的菌株可能是特别感兴趣的(例如具有不同NspA生成水平的脑膜炎奈瑟氏菌的，参见例如Moeetal.(1999)Infect.Immun.67:5664)。用于生成大疱的感兴趣的其它菌株包括具有灭活的GNA33基因的菌株，该基因编码细胞分离、膜结构和毒力所需的脂蛋白(参见例如Adu-Bobieetal.(2004)InfectImmun.72:1914-1919)。

本公开文本的抗原性组合物可以含有来自1、2、3、4、5或更多种菌株的囊泡，这些菌株彼此可以是同源的或异源的，通常是异源的。例如，菌株可以是就PorA和/或衍生主题fHbp的fHbp而言同源或异源的。可以自表达超过一种主题fHbp(例如1、2、3、或更多种主题fHbp)的菌株制备囊泡，所述主题fHbp可以由来自不同变体(v.1、v.2、或v.3)或亚变体(例如v.1、v.2、或v.3的亚变体)的fHbp氨基酸序列构成。

抗原性组合物可以包含呈递相同或不同主题fHbp的OMV和MV的混合物，其中所述主题fHbp可以任选呈递来自fHbp变体和/或亚变体的不同组合的表位，且其中所述OMV和/或MV可以来自相同或不同菌株。来自不同菌株的囊泡可以作为混合物施用，或者可以连续施用。

在需要时(例如，在用于生成囊泡的菌株与内毒素或特别高水平的内毒素有关时)，任选处理囊泡以降低内毒素，例如为了降低施用后的毒性。虽然如下文讨论不太想要，可以通过用合适的去污剂(例如BRIJ-96、脱氧胆酸钠、月桂酰肌氨酸钠、EmpigenBB、TritonX-100、吐温20(聚氧乙烯山梨聚糖单月桂酸酯)、吐温80(浓度0.1-10％，优选0.5-2％)、和SDS)提取来实现降低内毒素。在使用去污剂提取时，优选使用除脱氧胆酸盐以外的去污剂。

可以在不使用去污剂(例如不使用脱氧胆酸盐)的情况下制备抗原性组合物的囊泡。虽然去污剂处理对于去除内毒素活性是有用的，但是它可能在囊泡生成期间通过提取而消减天然fHbp脂蛋白和/或主题fHbp(包括脂化的fHbp)。因此，可能特别想要使用不需要去污剂的技术来降低内毒素活性。在一种办法中，使用生成相对较少内毒素(脂多糖，LPS)的菌株，从而避免在用于人前自最终制备物去除内毒素的需要。例如，可以自降低或清除了脂寡糖或疫苗中可能不想要的其它抗原(例如Rmp)的奈瑟氏菌突变体制备囊泡。

可以自含有导致脂质A的毒性活性降低或检测不到的遗传修饰的脑膜炎奈瑟氏菌菌株制备囊泡。例如，此类菌株可以是在脂质A生物合成中遗传修饰的(Steeghsetal.(1999)InfectImmun67:4988-93；vanderLeyetal.(2001)InfectImmun69:5981-90；Steeghsetal.(2004)JEndotoxinRes10:113-9；Fisshaetal.(2005)InfectImmun73:4070)。可以通过修饰LPS，诸如下调和/或灭活分别由lpxL1或lpxL2编码的酶来使免疫原性组合物脱毒。在lpxL1突变体中生成的五酰化脂质A的生成指示由lpxL1编码的酶将C12添加至GlcNII的2’位处的N连接的3-OHC14。在lpxL2突变体中找到的主要脂质A种类是四酰化的，指示由lpxL2编码的酶将另一个C12添加至GlcNI的2位处的N连接的3-OHC14。导致这些基因的表达降低(或不表达)(或这些基因的产物活性降低或无活性)的突变导致脂质A的毒性改变(vanderLeyetal.(2001)InfectImmun69:5981-90)。四酰化(lpxL2突变体)和五酰化(lpxL1突变体)脂质A的毒性不如野生型脂质A。脂质A4’-激酶编码基因(lpxK)中的突变也降低脂质A的毒性活性。用于囊泡(例如MV或OMV)生成特别感兴趣的是经遗传修饰以提供功能性LpxL1编码的蛋白减少或检测不到的脑膜炎奈瑟氏菌，例如遗传修饰奈瑟氏菌细菌(例如脑膜炎奈瑟氏菌菌株)以提供lpxL1基因的基因产物的活性降低或无活性的情况。例如，可以遗传修饰奈瑟氏菌细菌以具有lpxL1基因敲除，例如破坏lpxL1基因的情况。参见例如美国专利公开号2009/0035328。可以遗传修饰奈瑟氏菌细菌以提供lpxL2基因的基因产物的活性降低或无活性。可以遗传修饰奈瑟氏菌细菌以提供lpxL1基因和lpxL2基因的基因产物的活性降低或无活性。此类囊泡提供与对于LPS生成而言是野生型的脑膜炎奈瑟氏菌菌株相比降低的毒性，同时保留主题fHbp的免疫原性。

也可以通过在涉及多粘菌素B抗性(此类抗性与在脂质A的4’磷酸根上添加氨基阿拉伯糖有关)的基因/基因座中引入突变来改变LPS毒性活性。这些基因/基因座可以是编码UDP-葡萄糖脱氢酶的pmrE，或许多肠细菌共同的抗微生物肽抗性基因中可能涉及氨基阿拉伯糖合成和转移的区域。存在于这个区域中的基因pmrF编码多萜醇磷酸酯甘露糖基转移酶(GunnJ.S.,Kheng,B.L.,KruegerJ.,KimK.,GuoL.,HackettM.,MillerS.I.,1998,Mol.Microbiol.27:1171-1182)。

PhoP-PhoQ调节系统(它是一种磷酸中继两成分调节系统)中的突变(例如PhoP组成性表型，PhoPc)，或低Mg++环境或培养条件(它们激活PhoP-PhoQ调节系统)导致在4’-磷酸根上添加氨基阿拉伯糖及用2-羟基肉豆蔻酸根替换肉豆蔻酸根(肉豆蔻酸根的羟基化)。这种经过修饰的脂质A展示降低的刺激人内皮细胞表达E-选择蛋白和人单核细胞分泌TNF的能力。

多粘菌素B抗性菌株也适合使用，因为此类菌株显示出具有降低的LPS毒性(参见例如vanderLeyetal.(1994)In:ProceedingsoftheninthinternationalpathogenicNeisseriaconference.TheGuildhall,Winchester,England)。或者，可以将模拟多粘菌素B结合活性的合成肽添加至抗原性组合物以降低LPS毒性活性(参见例如Rusticietal.(1993)Science259:361-365；Porroetal.(1998)ProgClinBiolRes.397:315-25)。

也可以通过选择培养条件来降低内毒素。例如，在每升培养基含有0.1mg-100mg氨基阿拉伯糖的生长培养基中培养菌株提供降低的脂质毒性(参见例如WO02/097646)。

组合物和配制剂

为方便起见，本文中使用“组合物”、“抗原组合物”、“抗原性组合物”或“免疫原性组合物”一般指包含本文中公开的主题非天然发生fHbp的组合物，该主题fHbp可以任选进行缀合以进一步增强免疫原性。本公开文本具体涵盖对于在人中引发抗体，例如针对脑膜炎奈瑟氏菌的抗体，例如针对脑膜炎奈瑟氏菌的杀菌性抗体有用的组合物。

抗原性组合物含有免疫有效量的主题非天然发生fHbp，而且可以在需要时进一步包括其它相容成分。本公开文本的组合物可以含有一种或多种上文所述非天然发生fHbp。

本公开文本涵盖的免疫原性组合物包括但不限于包含下述各项的组合物：

a)上文提供的非天然发生fHbp；和

b)药学可接受赋形剂，

其中所述fHbp可以作为重组蛋白和/或在基于囊泡的组合物(例如OMV)中提供。

组合物可以含有别的感兴趣抗原，诸如孔蛋白A、孔蛋白B、NspA、菌毛蛋白、或其它奈瑟氏菌蛋白。另外，本发明的抗原组合物可以包含别的奈瑟氏菌抗原，诸如PCT公开号WO99/24578、WO99/36544、WO99/57280、WO00/22430、和WO00/66791中例示的那些，以及此类蛋白的抗原性片段。

组合物可以含有超过一种类型的fHbp，其中每种fHbp可以呈现来自fHbp变体和/或亚变体不同组合的表位。例如，组合物可以含有上文所述非天然发生fHbp和天然发生v.1和/或v.2fHbp。在另一个例子中，组合物可以含有上文所述非天然发生fHbp和突变体v.1和/或v.2fHbp，特别是在突变体fHbp具有相对于天然发生的对应fHbp降低的对人fH的结合的情况。v.1和v.2fHbp的此类突变体在US2011/0256180中有描述，通过援引将其收入本文。在本发明的组合物中可以作为分开的实体或在融合多肽内组合v.1和/或v.2fHbp氨基酸序列与本公开文本的非天然发生fHbp氨基酸序列。

在某些情况中，组合物可以包括自奈瑟氏菌宿主细胞获得的囊泡，该宿主细胞经编码上文所述非天然发生fHbp的核酸遗传修饰，使得该经遗传修饰的宿主细胞生成所编码的非天然发生fHbp，其中该囊泡包含所编码的非天然发生fHbp；和药学可接受赋形剂。

宿主细胞可以进一步修饰以表达别的感兴趣抗原，诸如孔蛋白A、孔蛋白B、NspA、菌毛蛋白、或其它奈瑟氏菌蛋白。另外，本发明的抗原组合物可以包含别的奈瑟氏菌抗原，诸如PCT公开号WO99/24578、WO99/36544、WO99/57280、WO00/22430、和WO00/66791中例示的那些，以及此类蛋白的抗原性片段。

“免疫有效量”表示将该量以单剂或作为一系列相同或不同抗原性组合物的一部分施用于个体有效引发有效治疗或预防例如奈瑟氏菌(特别是脑膜炎奈瑟氏菌，更特别的是脑膜炎奈瑟氏菌B、C、或Y群)感染的症状或引起的疾病的抗体应答。此量根据以下因素而变化：要治疗的个体的健康和身体状况、年龄、个体的免疫系统生成抗体的能力、期望的保护程度、疫苗的配方、主治医师对医疗状况的评估、及其它相关因素。预期该量会落在相对较宽的范围中，其可以通过常规试验来测定。

剂量摄生法可以是单剂日程表或多剂日程表(例如包括加强剂)，在不同时间施用抗原性组合物的单位剂量形式。如本文中使用的，术语“单位剂量形式”指作为用于人和动物受试者的统一剂量合适的物理上离散的单位，每个单位含有足以产生期望效果的预定数量的本公开文本的抗原性组合物，该组合物与药学可接受赋形剂(例如药学可接受稀释剂、载剂或媒介)联合提供。抗原性组合物可以与其它免疫调节剂联合施用。

抗原性组合物可以在药学可接受赋形剂中提供，其可以是溶液，诸如无菌水溶液，常常是盐水溶液，或者，它们可以以粉剂形式提供。如果想要，此类赋形剂可以是基本上惰性的。

在一些实施方案中，主题免疫原性组合物包含存在于囊泡中的主题fHbp。在一些实施方案中，主题免疫原性组合物包含存在于MV中的主题fHbp。在一些实施方案中，主题免疫原性组合物包含存在于OMV中的主题fHbp。在一些实施方案中，主题免疫原性组合物包含包含主题fHbp的MV和OMV的混合物。囊泡(诸如MV和OMV)在上文中有描述。

抗原性组合物可以进一步含有佐剂。可用于人的已知合适佐剂的例子包括但不必然限于：明矾、磷酸铝、氢氧化铝、MF59(4.3％w/v角鲨烯、0.5％w/v吐温80^TM、0.5％w/v司盘85)、含CpG的核酸(其中胞嘧啶是未甲基化的)、QS21、MPL、3DMPL、来自Aquilla的提取物、ISCOMS、LT/CT突变体、聚(D,L-丙交酯-共-乙交酯)(PLG)微粒、QuilA、白介素、等等。对于实验动物，可使用弗氏、N-乙酰基-胞壁酰-L-苏氨酰-D-异谷氨酰胺(thr-MDP)、N-乙酰基-正-胞壁酰-L-丙氨酰-D-异谷氨酰胺(CGP11637，称作正-MDP)、N-乙酰基-胞壁酰-L-丙氨酰-D-异谷氨酰胺酰-L-丙氨酸-2-(1'-2'-二-棕榈酰-sn-甘油-3-羟基磷酰基氧)-乙胺(CGP19835A，称作MTP-PE)、和RIBI，其在2％角鲨烯/吐温80乳液中含有自细菌提取的三种成分，单磷酰基脂质A、海藻糖二霉菌酸酯和细胞壁骨架(MPL+TDM+CWS)。可以通过测量针对免疫原性抗原或其抗原性表位的抗体的量来测定佐剂的有效性。

增强组合物的有效性的进一步例示性佐剂包括但不限于：(1)水包油乳液配制剂(有或无其它特异性免疫刺激剂，诸如胞壁酰肽(见下文)或细菌细胞壁成分)，诸如例如(a)MF59^TM(WO90/14837；Chapter10inVaccinedesign:thesubunitandadjuvantapproach,eds.Powell&Newman,PlenumPress1995)，含有5％角鲨烯、0.5％吐温80、和0.5％司盘85(任选含有MTP-PE)，使用微流化仪配制成亚微米颗粒；(b)SAF，含有10％角鲨烯、0.4％吐温80、5％普朗尼克嵌段聚合物L121、和thr-MDP，或是微流化为亚微米乳液或是旋振以产生较大粒径的乳液，和(c)RIBI^TM佐剂系统(RAS)(RibiImmunochem,Hamilton,Mont.)，含有2％角鲨烯、0.2％吐温80、和一种或多种细菌细胞壁成分，诸如单磷酰基脂质A(MPL)、海藻糖二霉菌酸酯(TDM)、和细胞壁骨架(CWS)，优选MPL+CWS(Detox^TM)；(2)皂苷佐剂，诸如可以使用QS21或Stimulon^TM(CambridgeBioscience,Worcester,Mass.)或自其生成的颗粒，诸如ISCOM(免疫刺激性复合物)，该ISCOMS可以不含别的去污剂，例如WO00/07621；(3)完全弗氏佐剂(CFA)和不完全弗氏佐剂(IFA)；(4)细胞因子，诸如白介素(例如IL-1、IL-2、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-12(WO99/44636)、等)、干扰素(例如伽马干扰素)、巨噬细胞集落刺激因子(M-CSF)、肿瘤坏死因子(TNF)、等；(5)单磷酰基脂质A(MPL)或3-O-脱酰基化MPL(3dMPL)，例如GB-2230221、EP-A-0689454，任选地，当与肺炎球菌糖一起使用时基本上不含明矾，例如WO00/56358；(6)3dMPL与例如QS21和/或水包油乳液的组合，例如EP-A-0835318、EP-A-0735898、EP-A-0761231；(7)含有CpG基序的寡核苷酸(Krieg,Vaccine,2000,19:618-622；Krieg,CurrOpinMolTher,2001,3:15-24；Romanetal.,Nat.Med,1997,3:849-854；Weineretal.,PNASUSA,1997,94:10833-10837；Davisetal.,J.Immunol,1998,160:810-876；Chuetal.,J.Exp.Med,1997,186:1623-1631；Lipfordetal.,Ear.J.Immunol.,1997,27:2340-2344；Moldoveamietal.,Vaccine,1988,16:1216-1224；Kriegetal.,Nature,1995,374:546-549；Klinmanetal.,PNASUSA,1996,93:2879-2883；Ballasetal.,J.Immunol,1996,157:1840-1845；Cowderyetal.,J.Immunol,1996,156:4570-4575；Halpernetal.,CellImmunol,1996,167:72-78；Yamamotoetal.,Jpn.J.CancerRes.,1988,79:866-873；Staceyetal.,J.Immunol.,1996,157:2116-2122；Messinaetal.,J.Immunol,1991,147:1759-1764；Yietal.,J.Immunol,1996,157:4918-4925；Yietal.,J.Immunol,1996,157:5394-5402；Yietal.,J.Immunol,1998,160:4755-4761；及Yietal.,J.Immunol,1998,160:5898-5906；国际专利申请WO96/02555、WO98/16247、WO98/18810、WO98/40100、WO98/55495、WO98/37919及WO98/52581)，即含有至少一个CG二核苷酸，其中胞嘧啶是未甲基化的；(8)聚氧乙烯醚或聚氧乙烯酯，例如WO99/52549；(9)聚氧乙烯山梨聚糖酯表面活性剂与辛苯聚醇的组合(WO01/21207)，或聚氧乙烯烷基醚或酯表面活性剂与至少一种别的非离子型表面活性剂诸如辛苯聚醇的组合(WO01/21152)；(10)皂苷和免疫刺激性寡核苷酸(例如CpG寡核苷酸)(WO00/62800)；(11)免疫刺激剂和金属盐颗粒，例如WO00/23105；(12)皂苷和水包油乳液，例如WO99/11241；(13)皂苷(例如QS21)+3dMPL+IM2(任选+固醇)，例如WO98/57659；(14)起免疫刺激剂作用来增强组合物功效的其它物质。胞壁酰肽包括N-乙酰基-胞壁酰-L-苏氨酰-D-异谷氨酰胺(thr-MDP)、N-25乙酰基-正胞壁酰-L-丙氨酰-D-异谷氨酰胺(正-MDP)、N-乙酰基-胞壁酰-L-丙氨酰-D-异谷氨酰胺酰-L-丙氨酸-2-(1'-2'-二棕榈酰-sn-甘油-3-羟基磷酰基氧)-乙胺(MTP-PE)、等。特别感兴趣的是对于施用于人合适的佐剂。

抗原组合物可以含有其它成分，诸如药用级甘露醇、乳糖、淀粉、硬脂酸镁、糖精钠、滑石、纤维素、葡萄糖、蔗糖、镁、碳酸盐、等等。组合物可以根据需要含有药学可接受辅助物质以接近生理条件，诸如pH调节和缓冲剂、毒性调节剂等等，例如乙酸钠、氯化钠、氯化钾、氯化钙、乳酸钠等等。

配制剂中主题fHbp的浓度可以大幅变化(例如，以重量计，自小于约0.1％，通常处于或至少约2％至多达20％至50％或更多)，而且通常会主要依照所选择的具体施用模式和患者的需要，基于流体体积、粘度、和基于患者的因素来选择。

含有主题fHbp的配制剂可以以溶液、悬浮液、片剂、丸剂、胶囊剂、粉剂、凝胶剂、乳膏剂、洗剂、软膏剂、气雾剂等形式提供。已经认识到口服施用会要求保护组合物免于消化。这通常通过将组合物与使之对酸和酶水解有抗性的药剂联合或在有适宜抗性的载剂中封装组合物来实现。保护不被消化的手段是本领域公知的。

还可以提供含有fHbp的配制剂，使得增强施用后fHBP的血清半衰期。例如，在将分离的fHbp配制用于注射的情况中，fHbp可以在脂质体配制剂中提供，制备成胶体，或用于延长血清半衰期的其它常规技术。有多种方法可用于制备脂质体，如例如Szokaetal.,Ann.Rev.Biophys.Bioeng.9:467(1980)，美国专利No.4,235,871、No.4,501,728和No.4,837,028中记载的。制剂还可以以控释或缓释形式提供。

免疫接种

本公开文本提供了一种在哺乳动物宿主中诱导针对至少一种奈瑟氏菌菌株的免疫应答的方法。所述方法通常涉及对有所需要的个体施用有效量的主题免疫原性组合物。本公开文本还提供了本发明的非天然发生因子H结合蛋白(fHbp)，其用作药物(例如免疫原性组合物或疫苗)或诊断试剂。本公开文本进一步提供了本发明的核酸或蛋白质在制备用于在哺乳动物中预防奈瑟氏菌(例如脑膜炎球菌)感染的药物中的用途。

一般将含有fHbp的抗原性组合物施用于有风险获得奈瑟氏菌疾病的人受试者以预防或至少部分阻滞疾病发生及其并发症。将足以实现这一点的量定义为“治疗有效剂量”。对于治疗用途有效的量会取决于例如抗原性组合物、施用方式、患者的重量和总体健康状态、及处方医师的判断。可以施用单剂或多剂抗原性组合物，这取决于患者需要和可耐受的剂量和频率及施用路径。

一般以在宿主中有效引发免疫应答，特别是体液免疫应答，例如杀菌性抗体应答的量施用含有fHbp的抗原性组合物。如上所述，用于免疫接种的量会有变化，而且范围一般可以是约1μg至100μg/70kg患者，通常是5μg至50μg/70kg。实质性更高的剂量(例如10mg至100mg或更高)在口服、鼻、或表面施用路径中可能是合适的。初始施用可以继以相同或不同的含有fHbp的抗原性组合物的强化免疫接种。疫苗接种通常涉及至少一次加强，更通常的是两次加强。

一般而言，免疫接种可以通过任何合适路径的施用来实现，包括口服、鼻、鼻咽、胃肠外、肠、胃部、表面、经皮、皮下、肌肉内，以片剂、固体、粉剂、液体、气雾剂形式，局部或系统施用组合物，添加或不添加赋形剂。用于制备可胃肠外施用的组合物的实际方法会是本领域技术人员已知或明白的，而且在诸如Remington’sPharmaceuticalScience,第15版,MackPublishingCompany,Easton,Pa.(1980)等出版物中有更详细描述。

可以通过已知方法来评估抗fHbp免疫应答(例如，通过在初始免疫接种之前和之后自个体获得血清，并证明个体的免疫状况的改变，例如免疫沉淀测定法、或ELISA、或杀菌测定法、或Western印迹、或流式细胞术测定法、等等)。

可以将抗原性组合物施用于免疫学上就脑膜炎奈瑟氏菌而言未免疫的人受试者。在一个特定实施方案中，所述受试者是约5岁或更小，优选约两岁或更小的人儿童，而且在下述时间任一项或多项施用所述抗原性组合物：出生后两周，1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、或11个月，或1年或15、18、或21个月，或在2、3、4、或5岁时。

一般可能希望在疾病症状的第一项体征之前，或在可能或实际暴露于感染或疾病(例如由于奈瑟氏菌暴露或感染)的第一项体征时启动免疫接种。

筛选方法

在一个例子中，评估主题fHbp在疫苗组合物中的功效的方法涉及：(a)给宿主动物(例如非人哺乳动物宿主动物，例如啮齿动物，例如小鼠)免疫接种包含本公开文本的fHbp的组合物；并(b)测量宿主中杀菌性抗体的水平。主题方法还可以包括评估施用了包含主题fHbp的疫苗的宿主动物对奈瑟氏菌细菌的易感性。

在另一个例子中，所述方法可以涉及生成及鉴定由主题fHbp引发的抗体。所述方法涉及自宿主动物分离具有对fHbp的结合亲和力的抗体，使细菌细胞与分离的抗体接触，并评估抗体对细菌细胞的结合。另外的步骤可以包括：评估针对fHbp的抗体与人因子H的竞争性结合；评估将抗体施用于接触过细菌性病原体的动物时针对细菌性病原体的杀菌活性。在一些实施方案中，所述抗体在抗体群中，而且所述方法可以进一步包括：自所述抗体群分离一种或多种结合所述细菌细胞的抗体。一个具有特色的方面是针对细菌细胞杀菌性的分离的抗体，其可以包括例如能够降低细菌在人血液中的生存力的补体介导的杀菌活性和/或调理吞噬活性。

特别感兴趣的细菌性病原体是多种多样荚膜组的任何或所有变体群的脑膜炎奈瑟氏菌，诸如脑膜炎奈瑟氏菌血清群B、脑膜炎奈瑟氏菌血清群C、脑膜炎奈瑟氏菌血清群X、脑膜炎奈瑟氏菌血清群Y、脑膜炎奈瑟氏菌血清群W-135、等等。

评估对fHbp的响应的方法

本公开文本提供了用于测定fHbp会在个体中引发杀菌应答的可能性的方法；及评估fHbp变体包括在免疫原性组合物中的合适性的方法。

测定fHbp会引发杀菌应答的可能性

本公开文本提供了一种测定本公开文本的非天然发生fHbp(例如奈瑟氏菌疫苗中存在的fHbp)会在个体中引发针对至少一种脑膜炎奈瑟氏菌菌株的杀菌应答的可能性的方法。所述方法通常涉及测定自已经免疫接种fHbp的个体获得的血清中存在的抗体抑制fH结合fHbp的能力。抗体抑制fH结合fHbp的水平比对照抗体(该对照抗体抑制fH结合fHbp但不生成杀菌应答)抑制fH结合fHbp的水平高至少约10％、至少约25％、至少约50％、至少约75％、至少约2倍、至少约10倍、至少约50倍、至少约100倍、或超过100倍指示该fHbp很可能引发针对至少一种脑膜炎奈瑟氏菌菌株的杀菌应答。

可以使用本文中描述的测定法或任何其它已知测定法来测定通过免疫接种主题fHbp引发的抗体抑制fH结合fHbp的程度。例如，fH和/或fHbp可以包含可检测标记物，而且可以通过检测fH/fHbp复合物中存在的带标记物的成分的量和/或检测游离fH和/或游离fHbp(例如不在fH/fHbp复合物中的fH或fHbp)中存在的标记的量来评估对fH/fHbp结合的抑制。

在一个例子中，用于评估fH结合fHbp的测定法涉及使用在支持物上固定化的fHbp(例如在微量滴定板的孔上固定化的fHbp)。将固定浓度的人fH与测试抗体(例如抗血清，例如来自已经接受抗体引发剂量的免疫原性组合物的人或非人测试动物(例如小鼠)的)的稀释物的混合物添加至孔，并温育足够长的时间以容许抗体结合。清洗孔后，用含有带标记物的成分的特异性抗fH抗血清(例如山羊或驴)或带标记物的二抗(例如家兔抗山羊或抗驴抗血清)检测结合的fH。可以通过未添加人或小鼠抗体的情况中结合的fH的量来计算对结合的fH的百分比抑制。

在此类测定法的另一种变化中，通过流式细胞术来评估测试抗血清存在或缺失下fH对活细菌的结合。将细菌细胞与固定浓度的fH(例如带可检测标记物的fH)和含有抗体的测试血清的不同稀释物一起温育。清洗细菌，并检测结合的fH(例如如上文所述)。

如此，来自免疫接种主题fHbp的个体的抗血清抑制fH/fHbp结合的能力充当直接评估该抗血清的杀菌活性的替代物。本公开文本中用于测定主题fHbp会在个体中引发杀菌应答的可能性的方法能给临床医师或其他医疗人员提供关于特定免疫原性组合物是否在个体中有效引发杀菌应答的信息。

根据ELISA，结果免疫接种的个体可以具有相似的血清IgG抗fHbp抗体滴度。总体上提供更好的fH结合抑制的抗血清指示更有效、更好质量的抗fHbp抗体应答，而且会赋予更大的保护。如此，例如，如果在比较两名个体中的抗奈瑟氏菌抗体应答时(通过抗fHbp抗体，即1:10,000的血清稀释物的抑制与另一个体的1:3000稀释物相比)，具有更高抑制活性的个体具有更好质量的抗fHbp抗体，其会赋予更大的保护。如此，fH抑制测定法是补体介导的杀菌滴度测定法的替代物，与fH抑制相比，该补体介导的杀菌滴度测定法通常需要花费更多时间，且检测难度更大。

评估主题非天然发生fHbp

本公开文本提供了评估或预测本文中公开的非天然发生fHbp会在个体中有效引发杀菌性抗体应答的可能性的方法。所述方法通常涉及评估对fHbp变体特异性的抗体抑制fH结合fHbp的能力。通过免疫接种fHbp变体引发的抗体抑制fH结合fHbp的强度与针对fHbp变体引发的抗体的杀菌活性正相关。认为引发在高血清稀释度抑制fH结合fHbp的抗体的fHbp变体是用于引发针对一种或多种奈瑟氏菌菌株的保护的疫苗的合适候选物。

例如，本公开文本提供了一种测定具有比fHbpID79要低的对人fH的亲和力的非天然发生fHbp会在个体中引发针对至少一种脑膜炎奈瑟氏菌菌株的杀菌性抗体的可能性的方法。所述方法通常涉及测定在测试非人动物中针对非天然发生fHbp引发的抗体抑制fH结合fHbp的能力。针对非天然发生fHbp引发的抗体抑制fH结合fHbp的水平比在测试非人动物中针对fHbpID79引发的抗体抑制fH结合fHbp的水平高至少约10％、至少约25％、至少约50％、至少约75％、至少约2倍、至少约10倍、至少约50倍、至少约100倍、或超过100倍指示该非天然发生fHbp很可能引发针对至少一种脑膜炎奈瑟氏菌菌株的杀菌应答。

合适的测试非人动物包括例如小鼠、大鼠、家兔、等等。可以使用本文中描述的测定法或任何其它已知测定法来测定针对fHbp变体引发的抗体抑制fH结合fHbp的程度。使用本文中描述的测定法或任何其它已知测定法容易测定抗体的杀菌活性。

用于测定具有比fHbpID79要低的对人fH的亲和力的给定的非天然发生fHbp会在个体中引发针对至少一种脑膜炎奈瑟氏菌菌株的杀菌性抗体的可能性的主题方法对于例如在疫苗开发过程中鉴定合适的免疫原(和/或消除不合适的免疫原)可能是有用的。

实施例

应理解，本文中描述的实施例和实施方案仅用于例示目的，而且据此的各种修改或变化是本领域技术人员会想到的且要包括在本申请的精神和界限及所附权利要求的范围内。据此通过援引完整收录本文中引用的所有出版物、专利、和专利申请用于所有目的。

实施例1：突变体fHbpID79的生成

为了生成具有降低的对人因子H的结合的v.3fHbp蛋白突变体，将H223A和H223R替代引入fHbpID79。图1显示SDS-聚丙烯酰胺凝胶，指示重组fHbpID79野生型和突变体的大小和纯度。组氨酸的编号方式基于参照fHbpID1的氨基酸序列的氨基酸位置，如图4中提供的比对中所示。组氨酸第223位对应于v.3fHbp(见图4和5)中的组氨酸230。组氨酸第223位对应于v.2fHbp(例如fHbpID22；见图4)中的组氨酸222。道1，Benchmark梯状物(Invitrogen)；道2，ID79野生型；道3，H223R突变体；道4，H223A突变体。在凝胶上加载2μg每种重组fHbp。使用NuPAGE4-12％聚丙烯酰胺/Bis-Tris凝胶及MES运行缓冲液(Invitrogen)。凝胶用SimplyBlueSafeStain(Invitrogen)染色。

实施例2：具有降低的fH结合的v.3fHbp突变体的鉴定

通过ELISA测定了人因子H对ID79突变体H223A和H223R的结合。结果显示于图2。图2，小图A显示人因子H的结合。fHbpID79野生型(WT)，圆形符号；H223A突变体，三角形符号；H223R突变体，星号符号。图2，小图B显示对照单抗JAR11的结合。

虽然H223A突变体只有结合的略微降低，但是H223R突变体显示没有检测得到的对人因子H的结合(图2，小图A)。对照抗fHbp单抗JAR11对H223A和H223R突变体蛋白的结合与野生型fHbpID79相似(图2，小图B)。

使纯化的重组fHbpID79野生型或突变体蛋白(2μg/ml，在PBS中)吸附至微量滴定板的孔。用PBS/1％BSA封闭非特异性结合。对于小图A中的数据，将纯化的人因子H的连续稀释液(0.0012至20μg/ml)添加至孔，并将板于室温温育1小时。清洗后，将绵羊抗人因子H(1:2000稀释；小图A)或抗fHbp单抗JAR11(0.00032至25μg/ml；小图B)添加至孔，并于室温温育1小时。再次清洗后，添加驴抗绵羊IgG(1:5000；Sigma；小图A)或山羊抗小鼠IgG(1:5000；Sigma；小图B)，并将板于室温温育1小时。再次清洗后，添加磷酸酶底物(对硝基苯基磷酸酯，1mg/ml；Sigma)，并在于室温温育30分钟后测量405nm处的光密度。

实施例3：具有降低的fH结合的fHbp突变体

将T221A和H223A替代个别引入fHbpID22(变体群2)。T221和H223的编号方式基于参照fHbpID1的氨基酸序列的氨基酸位置，如图4中提供的比对中所示。T221对应于v.2fHbp(例如fHbpID22)中的氨基酸第220位，而H223对应于v.2fHbp(例如fHbpID22)中的氨基酸第222位。

虽然T221A突变体显示没有检测得到的对人因子H的结合，但是H223A突变体只显示与野生型fHbpID22蛋白相比略微降低的结合(图3，小图A)。对照抗fHbp单抗JAR13的结合与野生型fHbpID22蛋白、T221A突变体、和H223A突变体相似(图3，小图B)。

通过ELISA测定了人因子H对ID22突变体T221A和H223A的结合。图3，小图A显示人因子H的结合。fHbpID22野生型(WT)，圆形符号；T221A突变体，星号符号；H223A突变体，三角形符号。图3，小图B显示对照单抗JAR13的结合。使纯化的重组fHbpID22野生型或突变体蛋白(2μg/ml，在PBS中)吸附至微量滴定板的孔。用PBS/1％BSA封闭非特异性结合。对于小图A中的数据，将纯化的人因子H的连续稀释液(0.00032-25μg/ml)添加至孔，并将板于室温温育1小时。清洗后，将绵羊抗人因子H(1:2000稀释；小图A)或抗fHbp单抗JAR13(0.00032至25μg/ml；小图B)添加至孔，并于室温温育1小时。再次清洗后，添加驴抗绵羊IgG(1:5000；Sigma；小图A)或山羊抗小鼠IgG(1:5000；Sigma；小图B)，并将板于室温温育1小时。再次清洗后，添加磷酸酶底物(对硝基苯基磷酸酯，1mg/ml；Sigma)，并在于室温温育30分钟后测量405nm处的光密度。

实施例4：杀菌应答

给野生型CD-1小鼠免疫接种10μg重组fHbpID79疫苗及作为佐剂的氢氧化铝(600μg每剂；Alhydrogel，BrenntagBiosector)。给一组六只动物免疫接种单独的佐剂，并给多组八只动物各免疫接种重组fHbp疫苗。以三周间隔给予三剂疫苗，并在第三剂后三周收集血液。使用血清合并物(对于佐剂对照组，各来自3只小鼠的2份合并物)和个体血清(对于fHbp疫苗组)实施血清杀菌测定法。使用在含有0.25％葡萄糖和0.02mMCMP-NANA，作为补体来源的IgG消减的人血清的Mueller-Hinton培养基中生长的对数期细菌实施杀菌测定法。滴度定义为温育60分钟后相对于含有来自未免疫小鼠的血清的阴性对照孔导致细菌50％存活的血清稀释度的倒数。结果显示于图7。

Claims (24)

1.一种非天然发生因子H结合蛋白(fHbp)，其自天然发生变体3fHbp衍生，所述非天然发生fHbp包含：

选自精氨酸、赖氨酸、苯丙氨酸、酪氨酸、或色氨酸的氨基酸对天然发生变体3fHbp第223位组氨酸的替代，其中第223位的编号方式基于成熟fHbpID1的编号方式，

其中所述非天然发生fHbp具有比fHbpID79要低的对人因子H(fH)的亲和力。

2.权利要求1的非天然发生fHbp，其中所述组氨酸用精氨酸替代。

3.权利要求1-2任一项的非天然发生fHbp，其中所述变体3fHbp是模块群VfHbp。

4.权利要求1-2任一项的非天然发生fHbp，其中所述变体3fHbp是模块群IIfHbp。

5.权利要求1-3任一项的非天然发生fHbp，其中所述非天然发生fHbp包含与fHbpID79的氨基酸序列具有至少90％序列同一性的氨基酸序列。

6.权利要求1-5任一项的非天然发生fHbp，其中所述非天然发生fHbp包含包含氨基酸替代H223R的fHbpID28。

7.权利要求1-5任一项的非天然发生fHbp，其中所述非天然发生fHbp包含包含氨基酸替代H223R的fHbpID175或fHbpID67。

8.权利要求1-5任一项的非天然发生fHbp，其中所述非天然发生fHbp包含包含氨基酸替代H223R的fHbpID79。

9.权利要求1-5任一项的非天然发生fHbp，其中所述非天然发生fHbp包含包含氨基酸替代H223R的fHbpID45。

10.一种免疫原性组合物，其包含：

a)依照权利要求1-9任一项的非天然发生fHbp；和

b)药学可接受赋形剂。

11.权利要求10的免疫原性组合物，其中所述非天然发生fHbp在自表达该fHbp的脑膜炎奈瑟氏菌菌株制备的囊泡制备物的表面上表达。

12.权利要求10的免疫原性组合物，其中所述非天然发生fHbp作为分离的多肽存在。

13.权利要求11-12任一项的免疫原性组合物，其中所述药学可接受赋形剂包含佐剂。

14.权利要求10-13任一项的免疫原性组合物，其进一步包含别的脑膜炎奈瑟氏菌抗原。

15.一种在哺乳动物中引发抗体应答的方法，该方法包括对哺乳动物施用依照权利要求1-9任一项的非天然发生fHbp或依照权利要求10-14任一项的免疫原性组合物。

16.权利要求15的方法，其中所述施用提供针对脑膜炎奈瑟氏菌的杀菌性抗体的生成。

17.一种核酸，其编码依照权利要求1-10任一项的fHbp。

18.一种重组表达载体，其包含权利要求17的核酸。

19.一种经遗传修饰的宿主细胞，其包含权利要求17的核酸或权利要求18的重组表达载体。

20.一种免疫原性组合物，其包含：

a)自经遗传修饰的奈瑟氏菌宿主细胞获得的囊泡，该宿主细胞经编码依照权利要求1-9任一项的非天然发生fHbp的核酸遗传修饰，使得该经遗传修饰的宿主细胞生成所编码的非天然发生fHbp，其中该囊泡包含所编码的非天然发生fHbp；和

b)药学可接受赋形剂。

21.权利要求20的免疫原性组合物，其中所述囊泡是天然外膜囊泡。

22.权利要求20-21任一项的免疫原性组合物，其中所述宿主细胞经遗传修饰以提供降低或缺无的lpxL1基因和/或lpxL2基因多肽产物活性。

23.权利要求20-22任一项的免疫原性组合物，其中所述宿主细胞经遗传修饰以提供升高的奈瑟氏菌抗原表达。

24.一种在哺乳动物中引发抗体应答的方法，该方法包括对哺乳动物施用权利要求20-23任一项的免疫原性组合物。