CN105424661B - 一种比率荧光、比率吸收或目视检测微量f-的探针方法 - Google Patents
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Abstract
本发明一种比率荧光、比率吸收或目视检测微量F‑的探针方法，属分析化学领域。方法是用(E)‑2‑(2,4‑二乙酰氧基苯基)乙烯基‑8‑乙酰氧基喹啉，简称探针，作为检测微量F‑的荧光和比色探针。在乙腈溶液中，利用探针形成的比率荧光强度或比率吸光度随F‑浓度变化，用校正曲线法定量测定F‑；荧光法和紫外‑可见吸收法检测F‑的浓度线性范围分别为20~200μM和40~400μM，检测限分别为1.6μM和16.5μM；探针用于定性和半定量目视检测微量F‑，日光和紫外灯下探针溶液颜色随F‑浓度增加，分别由无色变为黄色至橙红色或由蓝色变为黄色至橙红色；还可用浸有探针的滤纸条检测F‑离子，检测限低至50μM。
Description
技术领域
本发明属分析化学领域，具体地说是一种用比率荧光、比率吸收和目视检测微量F-的探针方法。
背景技术
荧光探针能高灵敏、高选择检测特定离子，特别适用于生物和特殊样品的测定，是荧光探针应用的主要方法。具备比率荧光、比率吸收性能的探针是利用不同波长荧光发射或吸收的比率变化进行测定，有更高的检测灵敏度和准确度。用比率荧光、比率吸收方式检测有别于单一波长范围的荧光或吸收强度的变化检测，在实际应用中受到探针自身浓度、测试条件、光源强度波动及仪器敏感性等因素的影响小，通过两个不同波长下荧光的比值变化，能够将影响测定准确性的因素降低，使检测的响应线性范围、检测限特别是准确性等显著提高。目前，利用比率荧光或比率吸收进行离子测定的探针试剂的报道相对较少。
氟是电负性最大的元素，化学性质活泼。作为重要的阴离子，氟离子广泛存在于环境和生命活动过程中。实现对氟离子简便、快速、准确的检测在临床医学及食品、环境分析中尤为重要。开发结构简单、价格低廉、灵敏度和选择性优越的氟离子荧光试剂在很多相关领域具有应用价值。大多数的氟离子荧光探针为单一波长检查，且受共存离子干扰。同时具备比率荧光和比率吸收检测性能的为数极少，而又具备裸眼识别检测则更具优势。
本发明利用一种简单结构的喹哪啶衍生物作为检测微量氟离子荧光探针，利用探针与氟离子形成比率荧光和比率吸收的光谱特性，控制探针与测定离子的浓度比，即可用荧光及紫外-可见吸收光谱进行检测。同时，还可利用探针与氟离子识别时强烈的颜色变化，分别在紫外灯下和可见光下实现氟离子的快速、定性、半定量检测。方法简便、准确、可视性好，检测速度快，可操作性强。
发明内容
本发明目的在于建立了一种新的高灵敏、高选择、定量检测微量氟离子的荧光和紫外-可见吸收光谱方法；半定量、定性检测微量氟离子的目视检测探针方法。
本发明一种比率荧光、比率吸收或目视检测微量F-的探针方法是用化学名为(E)-2-(2,4-二乙酰氧基苯基)乙烯基-8-乙酰氧基喹啉的化合物作为检测F-的荧光或比色探针试剂，简称探针，其结构如下：
检测方法为：（1）荧光光谱法测定时，探针在乙腈溶液中，以350nm为激发波长，F-离子使探针在415nm 处的荧光峰降低，在560nm处出现新荧光峰，形成比率荧光，在475nm处有等发射点，560nm与415nm处的比率荧光强度随F-离子浓度而变化；（2）紫外-可见吸收光谱法测定时，探针在乙腈溶液中，F-离子使探针在 280nm和340nm处的紫外吸收峰降低，在455nm处出现新的吸收峰，在360nm处有等吸收点，455nm与340nm处形成比率吸收，比率吸收强度随F-离子浓度而变化；（3）目视检测F-离子时颜色变化明显：日光下探针溶液颜色随F-浓度的增加，由无色逐渐变为黄色至橙红色；在365nm紫外灯下溶液荧光颜色随F-离子的浓度增加，由蓝色逐渐变为黄色至橙红色；用浸有探针的滤纸条作测试纸，测定不同浓度的F-离子，滤纸条颜色随F-离子的浓度增加，在日光下的颜色由无色逐渐变为黄色至橙红色；在365nm紫外灯下滤纸条的荧光颜色由蓝色逐渐变为黄色至橙红色。
所述的一种比率荧光、比率吸收或目视检测微量F-的探针方法是在乙腈介质中，荧光法检测F-离子时，应控探针: F-离子的摩尔浓度大于或等于1:2；紫外-可见吸收法检测F-离子时，应控制探针: F-离子摩尔浓度大于或等于1:4。
所述的一种比率荧光、比率吸收或目视检测微量F-的探针方法是（1）探针荧光法检测F-时，其它共存阴离子包括Cl-，Br-，I-，AcO-，HSO4 -，NO3 -，ClO4 -，H2PO4 -，PF6 -之一，在浓度与F-相同时，对F-的测定无干扰；（2）探针紫外-可见吸收光谱法检测F-时，其它共存阴离子Cl-，Br-，I-，AcO-，HSO4 -，NO3 -，ClO4 -，H2PO4 -，PF6 -之一，在浓度与F-相同时，对F-的测定无干扰。
所述的一种比率荧光、比率吸收或目视检测微量F-的探针方法的应用是（1）探针用光谱法定量检测微量F-离子：荧光法检测F-的浓度线性范围为20~200μM，检测限为1.6μM；紫外-可见吸收法检测F-的浓度线性范围为40~400μM，检测限为16.5μM ；（2）探针用目视法定性、半定量检测微量F-离子：用探针在溶液中或用浸有探针的滤纸检查F-离子浓度的检测范围均为50μM~10mM，检测限均低至50μM。
本发明方法的关键技术是控制探针与待测离子的浓度比。所用探针化合物结构简单，合成容易，成本低廉。检测方法不仅可用荧光光谱、紫外-可见吸收光谱中的比率荧光和比率吸收定量检测微量F-离子，同时，还可利用探针用目视法定性、半定量，在溶液中或用试纸检测微量F-离子。本发明有别于其他如离子色谱、离子选择性电极等氟离子检测方法，具有灵敏、准确、简便、快速。可适用于特殊样品如生物、及其微量的样品检测。
附图说明
图1 探针与阴离子的荧光光谱。
在浓度为10μM的探针的乙腈溶液中，分别加入10μM阴离子F-，Cl-，Br-，I-，AcO-，HSO4 -，NO3 -，ClO4 -，H2PO4 -，PF6 -时，没有观察到荧光光谱明显的变化；而加入20μM上述阴离子时，只有F-的加入使探针在415nm 处的荧光峰降低，同时，在560nm处出现新荧光峰，形成比率荧光。表明在此条件下探针仅对F-有识别检测作用。激发波长为350nm。
图2 探针与阴离子的紫外-可见吸收光谱。
在浓度为10μM的探针的乙腈溶液中，分别加入30μM F-，40μM 的阴离子Cl-，Br-，I-，AcO-，HSO4 -，NO3 -，ClO4 -，H2PO4 -，PF6 -时，没有观察到紫外-可见吸收光谱明显的变化；而40μM F-的加入使探针在280nm和340nm处的吸收峰降低，同时，在455nm处出现新的吸收峰，形成比率吸收。表明在此条件下探针仅对F-有识别检测作用。
图3 不同浓度的F-对探针的荧光光谱滴定图。
在浓度为10μM的探针的乙腈溶液中，分别加入不同浓度F-到探针溶液中，随F-的加入，测得荧光光谱滴定曲线。探针在475nm处出现一个等发射点，560nm与415nm波长处的荧光强度形成比率荧光，随F-浓度而变化。测试的激发波长为350nm。
图4 不同浓度F-对探针的紫外-可见吸收光谱滴定图。
在浓度为10μM的探针的乙腈溶液中，分别加入不同浓度F-到探针溶液中，随F-的加入，测得紫外-可见吸收光谱滴定曲线。探针在352nm处出现一个等吸收点，455nm与340nm波长处吸光度形成比率吸收，随F-浓度而变化。
图 5 共存阴离子对探针荧光法检测F-的影响。
在浓度为10μM的探针的乙腈溶液中，加入0.2mM的F-后探针在415nm 处的荧光峰降低，同时，在560nm处出现新荧光峰。测定560nm与415nm 处形成的比率荧光强度；再分别向探针-F-混合溶液中加入0.2mM的其他阴离子Cl-，Br-，I-，AcO-，HSO4 -，NO3 -，ClO4 -，H2PO4 -，PF6 -后测其比率荧光强度变化。黑色条表示在探针中加入不同阴离子后在波长560nm和415nm处的比率荧光强度。白色条表示在探针-F-混合溶液再分别加入上述其他共存阴离子后在波长560nm和415nm处的比率荧光强度变化。表明探针检测F-的比率荧光强度不受上述其他阴离子共存的影响。测试的激发波长为350nm，比率荧光波长为560nm 与415nm。纵坐标为波长分别为560nm与415nm处荧光强度的比值。
图 6 共存阴离子对探针紫外-可见吸收法检测F-的影响。
在浓度为10μM的探针的乙腈溶液中，加入0.4mM的F-后，探针在280nm和340nm 处的吸收峰降低，同时在455nm处出现新的吸收峰。测定455nm与340nm处形成的比率吸收；再分别向其混合溶液中加入0.4mM的其他阴离子Cl-，Br-，I-，AcO-，HSO4 -，NO3 -，ClO4 -，H2PO4 -，PF6 -后测其比率吸光度变化。黑色条表示在探针中加入不同阴离子后在波长455nm 与340nm处比率吸收值。白色条表示在探针-F-溶液再分别加入上述其他共存阴离子后在波长455nm与340nm处的比率吸收值变化。表明探针检测F-的比率吸收不受上述其他试阴离子共存的影响。比率吸收波长为455nm 与340nm。纵坐标为吸收波长分别为455nm与340nm处吸光度的比值。
图7 探针检测F-的荧光光谱法校正曲线。
在浓度为10μM的探针的乙腈溶液中分别加入不同浓度F-，测定比率荧光值。纵坐标为波长分别为560nm与415nm处荧光强度的比值，横坐标为F-的浓度。F-浓度在20~200μM范围内与探针的比率荧光强度成线性关系。激发波长为350nm。
图8 探针检测F-的紫外-可见吸收光谱法校正曲线。
在浓度为10μM的探针的乙腈溶液中分别加入不同浓度F-，测定比率吸收值。纵坐标为吸收波长分别为455nm与340nm处吸光度的比值，横坐标为F-的浓度。F-浓度在40 ~400μM范围内与探针的比率吸光度成线性关系。
图9 浓度为10 mM探针检测不同浓度F-的溶液颜色变化。
上图为可见光下观察，在F-的浓度50μM~10mM范围内，随F-浓度增加，探针检测F-溶液颜色由无色变为黄色逐渐变为橙红色。下图为365nm紫外灯下观察，在F-的浓度50μM~10mM范围内，随F-浓度增加，探针检测F-溶液荧光颜色由蓝色逐渐变为黄色至橙红色。
其中各数字代表1：探针+0μM F-；2：探针+50μM F-；3：探针+0.1mM F-；4：探针+0.5mM F-；5：探针+1mM F-；6：探针+10mM F-。
图10 滤纸条测试探针检测不同浓度F-的染色变化。
上图为可见光下观察，浸有浓度为0.1mM的探针的滤纸条检测浓度在50μM~10mM范围内的F-颜色变化，随F-浓度增加，滤纸颜色由无色逐渐变为黄色至橙红色。
下图为365nm紫外灯下观察，浸有浓度为0.1mM的探针的滤纸条检测浓度在50μM~10mM范围内的F-颜色变化，随F-浓度增加，滤纸的荧光由蓝色逐渐变为黄色至橙红色。
其中各数字代表1：探针+0μM F-；2：探针+50μM F-；3：探针+0.1mM F-；4：探针+0.5mM F-；5：探针+1mM F-；6：探针+10mM F-。
具体实施方式
实施例一：
本发明分析方法中各种试剂的配制方法是：
（1）探针溶液的配制方法：称取40 mg的探针（分子式：C23H19NO6
分子量：405.12），乙腈溶解，配制成浓度为1mM 的溶液100mL。
（2）F-储备液配制方法：称取四丁基氟化铵63.0 mg，用乙腈溶解，配制成浓度为20mM 的溶液10mL。
（3）其它共存阴离子溶液的配制：取分析纯的各种阴离子的四丁基铵盐，用乙腈溶解，并配制成浓度为20mM 的溶液。
所用试剂为分析纯试剂，试验用水为二次蒸馏水。
本发明所用紫外-可见分光光度计型号为UV-1800，日本岛津公司生产；荧光分光光度计型号为 Cary Eclipse荧光分光光度计，美国VARIAN公司生产；手提式紫外灯WFH-204B上海光学仪器厂。
实施例二：
本发明所用的荧光探针试剂(E)-2-(2,4-二乙酰氧基苯基)乙烯基-8-乙酰氧基喹啉的制备方法是以8-羟基喹哪啶，2,4-二羟基苯甲醛为原料，以乙酸酐为溶剂，合成得到，合成路线如下：
具体工艺条件为：三口烧瓶中，在溶有8-羟基喹哪啶的乙酸酐溶液中，加入2,4-二羟基苯甲醛，按摩尔比8-羟基喹哪啶:2,4-二羟基苯甲醛等于1:2，氮气保护下，回流，反应结束，浓缩除去溶剂乙酸酐，经硅胶柱层析洗脱，洗脱剂（氯仿:乙酸乙酯，3:1，v/v），回流反应温度为139℃，反应时间5h，反应溶剂为乙酸酐。
实施例三：
（1）荧光光谱法对F-检测
在10mL 容量瓶中加入探针（0.1mM，1mL），F-（20mM，0.1 ~1mL），用乙腈稀释至刻度，摇匀，进行荧光光谱测定；
设置荧光激发波长为350nm，在1cm的比色皿中加入约3ml探针（浓度为10μM）的乙腈溶液进行光谱扫描，探针在415nm波长处有荧光发射。分别加入10μM的阴离子F-，Cl-，Br-，I-，AcO-，HSO4 -，NO3 -，ClO4 -，H2PO4 -，PF6 -时，没有观察到荧光光谱明显的变化。当阴离子的加入量为20μM时，只有F-的加入使探针在415nm 处的荧光峰降低，同时在560nm处出现新荧光峰（如图1）。
在乙腈溶液中，以350nm为荧光激发波长，在10m探针溶液中逐渐滴加不同浓度的F-离子得到荧光光谱滴定曲线（如图3）。测定F-浓度变化时探针在560nm和415nm处的荧光强度的比值，获得比率荧光校正曲线（如图7）。由校正曲线的斜率和测定10次空白值的标准偏差，测定并计算得到探针荧光法检测F-的浓度线性范围和检出限列于表1。
探针检测F-在560nm和415nm处的比率荧光值在上述其他阴离子分别作为共存离子存在于探针-F-混合溶液中，当共存阴离子浓度与F-离子相当时，对检测F-的比率荧光强度影响的相对偏差在 5%以内，不干扰测定（如图5）。
（2）紫外-可见吸收光谱法对F-检测
在10mL 容量瓶中加入探针（0.1mM，1mL），F-（20mM，0.2 ~ 2mL），用乙腈稀释至刻度，摇匀，进行紫外光谱测定。
在1cm的比色皿中加入约3ml探针（浓度为10μM）的乙腈溶液进行紫外吸收光谱测试，分别加入30μM的阴离子F-，Cl-，Br-，I-，AcO-，HSO4 -，NO3 -，ClO4 -，H2PO4 -，PF6 -时，没有观察到紫外吸收光谱明显的变化。当阴离子的加入量为40μM时，只有F-的加入使探针在 280nm和340nm处的吸收峰降低，同时在455nm处出现新的吸收峰（如图2）。
在乙腈溶液中，在10μM探针溶液中逐渐滴加不同浓度的F-离子得到吸收光谱滴定曲线（如图4）。测定F-浓度变化时探针在455nm和340nm处的吸光度的比值，获得比率吸收校正曲线（如图8）。由校正曲线的斜率和测定10次空白值的标准偏差，测定并计算得到探针紫外吸收法检测F-的浓度线性范围和检出限列于表2。
探针检测F-在455nm和340nm处的比率吸收值在上述其他阴离子分别作为共存离子存在于特征-F-混合溶液中，当其他阴离子浓度与测试的F-离子相当时，对检测F-的比率吸收值影响的相对偏差在 5%以内，不干扰测定（如图6）。
实施例四：
探针荧光光谱校准曲线法测定合成样品中微量F-。
1．取数个10.0ml容量瓶，每个容量瓶中依次加入浓度为0.1mM探针的乙腈溶液1ml。
2．依次在各容量瓶中加入不同浓度的F-标准溶液，乙腈定容到10ml，摇匀。
3. 其中1个容量瓶中加样品溶液，乙腈定容到10ml，摇匀。
3．在荧光分光光度计上以350nm为激发波长，测定波长415nm和560nm处的荧光强度，平行测定3次，并计算波长560nm和415nm处的荧光强度比值。
4．绘制出波长560nm和415nm处的荧光强度比值对标准F-浓度的标准曲线（如图7），根据样品溶液中560nm和415nm处荧光强度比值，利用标准曲线求得样品溶液中F-的浓度。结果如表3所示。
实施例五：
探针紫外-可见光谱标准曲线法测定合成样品中微量F-。
1．取数个10.0ml容量瓶，每个容量瓶中依次加入浓度为0.1mM的探针1ml。
2．依次在各容量瓶中加入不同浓度的F-标准溶液，用乙腈定容到10ml，摇匀。
3. 其中1个容量瓶中加样品溶液，乙腈定容到10.0ml，摇匀。
4．在紫外-可见分光光度计上，测定波长455nm和340nm处的吸收值，平行测定3次，计算波长455nm和340nm处吸收值的比值。
5．绘制出波长455nm和340nm处吸收值的比值对标准F-浓度的校准曲线（如图8），根据样品溶液在波长455nm和340nm处吸收值的比值，利用校准曲线求得样品溶液中F-的浓度。结果如表4所示。
实施例六：
1. 溶液中F-检测
在浓度为10 mM探针的乙腈溶液中，分别加入0~10mM不同浓度F-溶液后观察溶液颜色变化。可见光下观察，在F-的浓度50μM~10mM范围内，随F-浓度增加，探针检测F-溶液颜色由无色变为黄色逐渐变为橙红色（如图9上图）。365nm紫外灯下观察，在F-的浓度50μM~10mM范围内，随F-浓度增加，探针检测F-溶液荧光颜色由蓝色逐渐变为黄色至橙红色（如图9下图）。检测限为50μM。
2. F-浓度测试纸
将滤纸条（1cm×2cm）浸入溶有浓度0.1mM的探针乙腈溶液中约10 min，让测试滤纸条充分吸收探针分子后在空气中将溶剂挥发，然后再浸入含有不同浓度（50μM~10mM）F-溶液中，待溶剂挥发。日光下观察到随F-离子浓度增加，测试条颜色明显由无色逐渐变为黄至橙红色（如图10上图）；紫外光下则由蓝色逐渐变为黄色至橙红色（如图10下图）。检测限为50μM。
Claims (4)
1.一种比率荧光、比率吸收或目视检测微量F-的探针方法，其特征是用化学名为(E)-2-(2,4-二乙酰氧基苯基)乙烯基-8-乙酰氧基喹啉的化合物作为检测F-的荧光或比色探针试剂，简称探针，其结构如下：
检测方法为：（1）荧光光谱法测定时，探针在乙腈溶液中，以350nm为激发波长，F-离子使探针在415nm 处的荧光峰降低，在560nm处出现新荧光峰，形成比率荧光，在475nm处有等发射点，560nm与415nm处的比率荧光强度随F-离子浓度而变化；（2）紫外-可见吸收光谱法测定时，探针在乙腈溶液中，F-离子使探针在 280nm和340nm处的紫外吸收峰降低，在455nm处出现新的吸收峰，在360nm处有等吸收点，455nm与340nm处形成比率吸收，比率吸收强度随F-离子浓度而变化；（3）目视检测F-离子时颜色变化明显：在乙腈溶液中，日光下探针溶液颜色随F-浓度的增加，由无色逐渐变为黄色至橙红色；在365nm紫外灯下溶液荧光颜色随F-离子的浓度增加，由蓝色逐渐变为黄色至橙红色；用浸有探针的滤纸条作测试纸，测定不同浓度的F-离子，滤纸条颜色随F-离子的浓度增加，在日光下的颜色由无色逐渐变为黄色至橙红色；在365nm紫外灯下滤纸条的荧光颜色由蓝色逐渐变为黄色至橙红色。
2.根据权利要求1所述的一种比率荧光、比率吸收或目视检测微量F-的探针方法，其特征是在乙腈介质中，荧光法检测F-离子时，应控探针:F-离子的摩尔浓度大于或等于1:2；紫外-可见吸收法检测F-离子时，应控制探针: F-离子摩尔浓度大于或等于1:4。
3.根据权利要求1所述的一种比率荧光、比率吸收或目视检测微量F-的探针方法，其特征是（1）探针荧光法检测F-时，其它共存阴离子包括Cl-，Br-，I-，AcO-，HSO4 -，NO3 -，ClO4 -，H2PO4 -，PF6 -之一，在摩尔浓度与F-相同时，对F-的测定无干扰；（2）探针紫外-可见吸收光谱法检测F-时，其它共存阴离子Cl-，Br-，I-，AcO-，HSO4 -，NO3 -，ClO4 -，H2PO4 -，PF6 -之一，在浓度与F-相同时，对F-的测定无干扰。
4.按照权利要求1所述的一种比率荧光、比率吸收或目视检测微量F-的探针方法的应用，其特征是（1）探针用光谱法定量检测微量F-离子：荧光法检测F-的浓度线性范围为20~200μM，检测限为1.6μM；紫外-可见吸收法检测F-的浓度线性范围为40~400μM，检测限为16.5μM ；（2）探针用目视法定性、半定量检测微量F-离子：用探针在溶液中或用浸有探针的滤纸检查F-离子浓度的检测范围均为50μM~10mM，检测限均低至50μM。
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