CN105420392A - 一组与新生儿肌张力低下表型相关的基因新突变及检测试剂盒 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一组与新生儿肌张力低下表型相关的基因新突变及检测试剂盒。本发明所提供的肌张力低下相关基因新突变得到的产品为：D1)MPZ突变蛋白质，为MPZ发生p.Lys201AsnfsTer51突变得到的蛋白质；D2)MTM1突变蛋白质，为MTM1的第413位的Ser突变为Arg得到的蛋白质；D3)编码MPZ突变蛋白质的DNA分子或cDNA分子；D4)编码MTM1突变蛋白质的DNA分子或cDNA分子；D5)含有M的DNA分子或cDNA分子，M为将MTM1基因第四个内含子第2位的T突变为C得到的DNA分子。本发明的与肌张力低下表型相关的三个新发突变对开展新生儿肌张力低下的分子诊断具有重要意义。

Description

一组与新生儿肌张力低下表型相关的基因新突变及检测试剂盒

技术领域

本发明涉及生物技术领域中一组与新生儿肌张力低下表型相关的基因新突变及检测试剂盒。

背景技术

肌张力低下是婴幼儿较为常见的异常临床表现，在不同时期临床表现各异。新生儿期起病呈四肢松软，伴有吸吮无力、喂养困难，称之为“松软儿”；在儿童期以云顶发育迟缓为主，表现独立走路时间推迟，流涎，语言发育延迟，反射减弱以及关节，四肢运动有关的神经对刺激反应的延迟等。

新生儿肌张力低下病因繁多，绝大多数为遗传因素。有染色体数目异常导致的新生儿肌张力低下，如唐氏综合征。有染色体结构异常导致的新生儿肌张力低下，如Prader-Willi综合症。有单基因病导致的新生儿肌张力低下：神经肌肉疾病，如雷特综合征、脊肌萎缩症、强直性肌营养不良、先天性肌营养不良等；先天性代谢缺陷病，如苯丙酮尿症、丙酸血症、甲基丙二酸血症、半乳糖血症、尿素循环疾病等；线粒体疾病，如MELAS综合征、Leigh综合症等。根据肌张力低下的病因可分为中枢性和周围性；根据其受累部位，肌张力低下可呈现全身性、局灶性或节段性。

新生儿肌张力低下临床表现复杂，医生常常难以准确地找出病因，患者往往得不到及时有效的治疗，相当多的患儿在确诊和治疗之前即已死亡，或因贻误治疗时机造成智力和身体的终生残疾。

导致新生儿肌张力低下的遗传疾病多，大部分有多个致病基因。传统的生化检测灵敏度低、准确性差，且需结合影像学、细胞生物学、遗传学等领域的其他多种检测手段进行确诊，费用高、耗时长，容易耽误患者的最佳治疗时间。常规的分子遗传学检测方法如PCR、Sanger测序、MLPA技术等一次只能对一个基因或一个基因的部分区域进行检测。因此采用上述方法很难对导致新生儿肌张力低下的多个致病基因同时进行检测，检出率低，临床上很难对疾病进行确诊。

自人类基因组计划后发展起来的新一代高通量测序技术，因其通量高，迅速占领了市场。近几年，新一代高通量测序技术不断完善，检测变异的准确性也逐步提高，与此同时，衍生起来的靶向重测序技术大大降低了检测成本,在遗传性疾病检测应用中极具前景。在美国，未经FDA审批的临床技术可以通过参比实验室CLIA途径进入临床，实验室具备严格的质量控制且实验室管理人员有相应的资质，实验室就可以合法收费并提供自己验证过LDT的临床服务。美国医学遗传学和基因组学实验室质量评估委员会(ACMG)分别于2008年4月、2013年9月和2015年3月提出了变异分类、报告与解释的标准和新一代高通量测序用于临床实验室检测的标准。中国于2014年12月批准了第一批高通量测序临床应用试点单位，正在建立技术标准，开展遗传病、产前诊断、胚胎植入前筛查等应用评估。

发明内容

本发明发现了三个新发突变——MPZ基因的c.602delA突变、MTM1基因的c.1237A>C突变和MTM1基因的c.231+2T>C突变与肌张力低下表型相关，所要解决的技术问题是如何诊断肌张力低下或筛查肌张力低下患者。

为解决上述技术问题，本发明首先提供了下述任一产品：

D1)MPZ突变蛋白质，为MPZ发生p.Lys201AsnfsTer51突变其它氨基酸残基不变得到的蛋白质(序列22所示的蛋白质)；

D2)MTM1突变蛋白质，为MTM1的第413位的Ser突变为Arg，其它氨基酸残基不变得到的蛋白质(序列24所示的蛋白质)；

D3)编码所述MPZ突变蛋白质的DNA分子或cDNA分子；

D4)编码所述MTM1突变蛋白质的DNA分子或cDNA分子；

D5)含有M的DNA分子或cDNA分子，所述M为将MTM1基因第四个内含子第2位的T突变为C得到的DNA分子；

D6)由所述D1)和所述D2)中的至少一个与X1组成的成套蛋白质；所述X1为108个与肌张力低下相关的蛋白质发生突变得到的蛋白质中的至少一个；所述108个与肌张力低下相关的蛋白质为AARS、ALG1、ALG11、ALG12、ALG13、ALG2、ALG3、ALG6、ALG8、ALG9、B4GALT1、CDKL5、CNBP、COG1、COG4、COG5、COG6、COG7、COG8、COL6A1、COL6A2、COL6A3、DDOST、DHDDS、DMPK、DNAJB2、DOLK、DPAGT1、DPM1、DPM2、DPM3、DYNC1H1、EGR2、FGD4、FIG4、FKRP、FKTN、FOXG1、GARS、GDAP1、GMPPA、HSPB1、HSPB8、IGHMBP2、ISPD、KIF1B、LAMA2、LARGE、LITAF、LMNA、LRSAM1、MAGT1、MAN1B1、MARS、MCEE、MECP2、MED25、MFN2、MGAT2、MMAA、MMAB、MMADHC、MOGS、MPDU1、MPI、MTMR2、MUT、NDRG1、NEFL、PEX1、PEX10、PEX12、PEX13、PEX14、PEX16、PEX19、PEX2、PEX26、PEX3、PEX5、PEX6、PGM1、PMM2、PMP22、POMGNT1、POMT1、POMT2、PRX、RAB7A、RFT1、RYR1、SBF1、SBF2、SEPN1、SH3TC2、SLC35A1、SLC35A2、SLC35C1、SMN1、SMN2、SRD5A3、SSR4、STT3A、STT3B、TAZ、TMEM165、TRPV4和TUSC3基因；

D7)由所述D3)、所述D4)和所述D5)中的至少一个与X2组成的成套DNA分子或cDNA分子；所述X2为编码所述X1的DNA分子或cDNA分子。

上述产品中，D1)可为序列22所示的蛋白质；D2)可为序列24所示的蛋白质；D3)可为序列21所示的DNA分子；D4)可为序列23所示的DNA分子；D5)可为序列25所示的DNA分子。序列21为MPZ基因发生c.602delA突变得到的核苷酸序列；序列23为MTM1基因发生c.1237A>C突变得到的核苷酸序列；序列25为MTM1基因发生c.231+2T>C突变得到的核苷酸序列。

为解决上述技术问题，本发明还提供了诊断或辅助诊断肌张力低下患者的成套试剂，为成套试剂1。

本发明所提供的成套试剂1，由名称为G1的检测MPZ基因c.602delA突变的物质、名称为G2的检测MTM1基因c.1237A>C突变的物质和名称为G3的检测MTM1基因c.231+2T>C突变的物质组成；所述MPZ基因c.602delA突变为缺失MPZ基因编码序列的第602位核苷酸得到的基因；所述MTM1基因c.1237A>C突变为将MTM1基因编码序列的第1237位核苷酸得到的基因；所述MTM1基因c.231+2T>C突变为将MTM1基因第四个内含子第2位的T突变为C得到的DNA分子。

上述成套试剂1中，所述MPZ基因c.602delA突变后的核苷酸序列可为序列21；所述MTM1基因c.1237A>C突变后的核苷酸序列可为序列23；所述MTM1基因c.231+2T>C突变后的核苷酸序列可为序列25。

上述成套试剂1中，所述MPZ基因c.602delA突变可为杂合突变；所述MTM1基因c.1237A>C突变可为纯合突变；所述MTM1基因c.231+2T>C突变可为纯合突变。

上述成套试剂1中，所述G1可为检测MPZ基因c.602delA突变的探针对和/或引物对，所述探针对中的两条探针可分别与MPZ基因c.602delA突变位点的上游和下游特异结合，所述引物对中的两条引物可分别与MPZ基因c.602delA突变位点的上游和下游特异结合；

所述G2可为检测MTM1基因c.1237A>C突变的探针对和/或引物对，所述探针对中的两条探针可分别与MTM1基因c.1237A>C突变位点的上游和下游特异结合，所述引物对中的两条引物可分别与MTM1基因c.1237A>C突变位点的上游和下游特异结合；

所述G3可为检测MTM1基因c.231+2T>C突变的探针对和/或引物对，所述探针对中的两条探针可分别与MTM1基因c.231+2T>C突变位点的上游和下游特异结合，所述引物对中的两条引物可分别与MTM1基因c.231+2T>C突变位点的上游和下游特异结合。

上述成套试剂1中，所述检测MPZ基因c.602delA突变的引物对的两条引物的序列可分别为序列表中序列1和序列2；所述检测MPZ基因c.602delA突变的探针对的两个探针的序列可分别为序列表中序列3和序列4；

所述检测MTM1基因c.1237A>C突变的引物对的两条引物的序列可分别为序列表中序列5和序列6；所述检测MTM1基因c.1237A>C突变的探针对的两个探针的序列可分别为序列表中序列7和序列8；

所述检测MTM1基因c.231+2T>C突变的引物对的两条引物的序列可分别为序列表中序列9和序列10；所述检测MTM1基因c.231+2T>C突变的探针对的两个探针的序列可分别为序列表中序列11和序列12。

为解决上述技术问题，本发明还提供了下述A1)-A4)中的任一种诊断或辅助诊断肌张力低下患者的成套试剂，该成套试剂为成套试剂2：

A1)所述G1；A2)所述G2；A3)所述G3；A4)由所述G1、所述G2和所述G3这三种中的至少两种组成的成套试剂。

为解决上述技术问题，本发明还提供了诊断或辅助诊断肌张力低下患者的成套试剂，该成套试剂为成套试剂3。

本发明所提供的成套试剂3，由所述成套试剂1或所述成套试剂2与检测108个与肌张力低下相关基因突变的物质组成；所述108个与肌张力低下相关基因为AARS、ALG1、ALG11、ALG12、ALG13、ALG2、ALG3、ALG6、ALG8、ALG9、B4GALT1、CDKL5、CNBP、COG1、COG4、COG5、COG6、COG7、COG8、COL6A1、COL6A2、COL6A3、DDOST、DHDDS、DMPK、DNAJB2、DOLK、DPAGT1、DPM1、DPM2、DPM3、DYNC1H1、EGR2、FGD4、FIG4、FKRP、FKTN、FOXG1、GARS、GDAP1、GMPPA、HSPB1、HSPB8、IGHMBP2、ISPD、KIF1B、LAMA2、LARGE、LITAF、LMNA、LRSAM1、MAGT1、MAN1B1、MARS、MCEE、MECP2、MED25、MFN2、MGAT2、MMAA、MMAB、MMADHC、MOGS、MPDU1、MPI、MTMR2、MUT、NDRG1、NEFL、PEX1、PEX10、PEX12、PEX13、PEX14、PEX16、PEX19、PEX2、PEX26、PEX3、PEX5、PEX6、PGM1、PMM2、PMP22、POMGNT1、POMT1、POMT2、PRX、RAB7A、RFT1、RYR1、SBF1、SBF2、SEPN1、SH3TC2、SLC35A1、SLC35A2、SLC35C1、SMN1、SMN2、SRD5A3、SSR4、STT3A、STT3B、TAZ、TMEM165、TRPV4和TUSC3基因。

上述成套试剂3中，所述检测MECP2基因突变的物质可为由核苷酸序列分别为序列13和序列14的两个探针组成的探针对；

所述检测MUT基因突变的物质为由核苷酸序列分别可为序列15和序列16的两个探针组成的探针对；

所述检测MPZ基因突变的物质为由核苷酸序列分别可为序列17和序列18的两个探针组成的探针对；

所述检测PMP22基因突变的物质为由核苷酸序列可分别为序列19和序列20的两个探针组成的探针对。

为解决上述技术问题，本发明还提供了诊断或辅助诊断肌张力低下患者的试剂或试剂盒。

本发明所提供的诊断或辅助诊断肌张力低下患者的试剂或试剂盒，包括所述成套试剂1、所述成套试剂2或所述成套试剂3。具体来说，所述诊断或辅助诊断肌张力低下患者的试剂或试剂盒可由所述成套试剂1、所述成套试剂2或所述成套试剂3与进行基因测序所需的试剂组成。所述进行基因测序所需的试剂可为illumina公司生产的TruSeqCustomAmpliconKit试剂。

为解决上述技术问题，本发明还提供了检测与肌张力低下相关基因突变的方法。

本发明所提供的检测与肌张力低下相关基因突变的方法，包括利用所述成套试剂1、所述成套试剂2或所述成套试剂3检测待测样本的MPZ基因、MTM1基因和/或所述108个与肌张力低下相关基因这108个基因中的至少一种基因的序列，与相应的基因相比，确定上述基因是否突变。

上述方法中，所述检测与肌张力低下相关基因突变可为检测待测样本与肌张力低下相关基因中是否存在无义突变(nonsensevariant)、移码突变(frameshift)、选择性剪切变异(Splicingvariant)、错义突变(missensevariant)、氨基酸截断或插入变异(nonframeshift)和/或密码子丢失(stoplost)。

所述检测与肌张力低下相关基因突变具体可为检测待测样本MPZ基因、MTM1基因、MECP2基因、MUT基因、MPZ基因和/或PMP22基因否突变。所述MPZ基因突变可为MPZ基因c.602delA突变，所述MTM1基因突变可为MTM1基因c.1237A>C突变和/或MTM1基因c.231+2T>C突变。

与肌张力低下相关基因的突变可导致出现相应基因的单核苷酸多态性，如MPZ基因c.602delA突变可导致MPZ基因编码序列的第602位缺失或为A，MTM1基因c.1237A>C突变可导致MTM1基因编码序列第1237位出现二等位多态性，该位点为A或C，MTM1基因c.231+2T>C突变可导致MTM1基因的第四个内含子的第2位出现二等位多态性，该位点为T或C。

上述方法中，检测MPZ基因c.602delA突变的方法可包括：

a1)检测待测样本中MPZ基因的cDNA序列，

a2)将步骤a1)的序列与MPZ基因的cDNA序列相比，步骤a1)的序列对应于MPZ基因cDNA序列的第602位缺失A，MPZ基因存在c.602delA突变。

检测MTM1基因c.1237A>C突变的方法可包括：

b1)检测待测样本中MTM1基因的cDNA序列，

b2)将步骤b1)的序列与MTM1基因的cDNA序列相比，步骤b1)的序列对应于MTM1基因cDNA序列的第1237位为C，MTM1基因存在c.1237A>C突变。

检测MTM1基因c.231+2T>C突变的方法可包括：

c1)检测待测样本中MTM1基因的第四个内含子序列，

c2)将步骤c1)的序列与MTM1基因的第四个内含子序列相比，步骤c1)的序列对应于MTM1基因第四个内含子序列的第2位为C，MTM1基因存在c.231+2T>C突变。

上述方法中，所述待测样本可来自于待测个体(如新生儿)的血液或组织，也可来自于待测胎儿的母体的血液或羊水。

为解决上述技术问题，本发明还提供了下述任一应用：

Ⅰ、所述成套试剂或所述试剂或试剂盒的下述E1)-E10)中任一应用：

E1)在制备诊断或辅助诊断肌张力低下患者产品中的应用；

E2)在诊断或辅助诊断肌张力低下患者中的应用；

E3)在制备筛查或辅助筛查肌张力低下患者产品中的应用；

E4)在筛查或辅助筛查肌张力低下患者中的应用；

E5)在制备预测肌张力患病风险产品中的应用；

E6)在预测肌张力患病风险中的应用；

E7)在制备检测与肌张力低下相关基因是否突变产品中的应用；

E8)在检测与肌张力低下相关基因是否突变中的应用；

E9)在制备检测与肌张力低下相关蛋白质是否突变产品中的应用；

E10)在检测与肌张力低下相关蛋白质是否突变中的应用；

Ⅱ、权利要求1所述产品的所述E1)-E6)中任一应用。

上述应用中，所述患者可为新生儿、婴幼儿或胎儿。

上述应用中，所述与肌张力低下相关基因突变可为MPZ基因、MTM1基因、MECP2基因、MUT基因、MPZ基因和/或PMP22基因的突变，如MPZ基因c.602delA突变、MTM1基因c.1237A>C突变和/或MTM1基因c.231+2T>C突变。所述与肌张力低下相关蛋白质突变可为MPZ、MTM1、MECP2、MUT、MPZ和/或PMP22蛋白质的突变，如MPZ蛋白质p.Lys201AsnfsTer51突变和/或MTM1蛋白质p.Ser413Arg突变。

本发明的发明人通过调研疾病数据库和文献，并根据与现有临床检验技术互补的原则，确定了与新生儿肌张力低下相关的110个致病基因，对110个基因的编码外显子和选择性剪切位点设计多重探针序列，然后采用新一代高通量靶向重测序技术，对导致新生儿肌张力低下的110个致病基因的编码外显子和选择性剪切位点进行测序，通过临床样本验证和生物信息分析，基于人群和疾病数据库系统，筛选出已知的致病基因突变，对数据库没有收录的基因突变，进行生物信息学功能预测筛查出新的致病基因突变，并在家系及正常人群中验证排除，发现了三个新发突变——MPZ基因的c.602delA突变、MTM1基因的c.1237A>C突变和MTM1基因的c.231+2T>C突变与肌张力低下表型相关。

本发明的三个新发突变对开展新生儿肌张力低下的分子诊断具有重要意义。

附图说明

图1为高通量测序的文库制备和数据分析流程。

图2为对MPZ基因和MTM1基因突变的检测结果。其中，A为MPZ基因c.602delA的杂合突变后测序峰图，B为MPZ基因c.602delA的杂合突变后的测序结果与MPZ基因的序列比对图，C为MTM1基因c.1237A>C的纯合突变后测序峰图，D为MTM1基因c.1237A>C的纯合突变后测序的测序结果与MTM1基因的序列比对图，E为MTM1基因c.231+2T>C的纯合突变后测序峰图，F为MTM1基因c.231+2T>C的纯合突变后测序结果与MTM1基因的序列比对图。

图3为变异质量控制的步骤和条件。

具体实施方式

下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围。

下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

实施例1、与新生儿肌张力低下有关的基因突变的发现

本实施例用新一代高通量靶向重测序技术，对有肌张力低下表型的71例临床样本和17例无肌张力低下表型的正常人样本进行了已知110个致病基因的外显子和选择性剪切位点的高通量测序，结合生物信息分析发现了MPZ基因的c.602delA突变，MTM1基因的c.1237A>C突变和MTM1基因的c.231+2T>C突变与新生儿肌张力低下有关，并通过正常人样本筛选和Sanger测序验证了这三个变异。

一、与新生儿肌张力低下有关的基因突变的发现

流程图如图1所示。

1.样本采集

采集了71例临床具有肌张力低下表型的婴幼儿的外周血样本，并采集了17例无肌张力低下表型的正常人外周血样本，EDTA抗凝，-80摄氏度保存。肌张力低下的诊断标准为：新生儿期起病呈四肢松软，伴有吸吮无力、喂养困难，称之为“松软儿”；在儿童期以云顶发育迟缓为主，表现独立走路时间推迟，流涎，语言发育延迟，反射减弱以及关节，四肢运动有关的神经对刺激反应的延迟等。无肌张力低下表型的正常人为不符合上述诊断标准的人。

2.文库制备和测序

采用illumia的DesignStudio平台针对110个基因的编码外显子和选择性剪切位点设计探针，得到一套探针组合物，这110个基因为：AARS、ALG1、ALG11、ALG12、ALG13、ALG2、ALG3、ALG6、ALG8、ALG9、B4GALT1、CDKL5、CNBP、COG1、COG4、COG5、COG6、COG7、COG8、COL6A1、COL6A2、COL6A3、DDOST、DHDDS、DMPK、DNAJB2、DOLK、DPAGT1、DPM1、DPM2、DPM3、DYNC1H1、EGR2、FGD4、FIG4、FKRP、FKTN、FOXG1、GARS、GDAP1、GMPPA、HSPB1、HSPB8、IGHMBP2、ISPD、KIF1B、LAMA2、LARGE、LITAF、LMNA、LRSAM1、MAGT1、MAN1B1、MARS、MCEE、MECP2、MED25、MFN2、MGAT2、MMAA、MMAB、MMADHC、MOGS、MPDU1、MPI、MPZ、MTM1、MTMR2、MUT、NDRG1、NEFL、PEX1、PEX10、PEX12、PEX13、PEX14、PEX16、PEX19、PEX2、PEX26、PEX3、PEX5、PEX6、PGM1、PMM2、PMP22、POMGNT1、POMT1、POMT2、PRX、RAB7A、RFT1、RYR1、SBF1、SBF2、SEPN1、SH3TC2、SLC35A1、SLC35A2、SLC35C1、SMN1、SMN2、SRD5A3、SSR4、STT3A、STT3B、TAZ、TMEM165、TRPV4和TUSC3基因。

检测MPZ基因突变的探针序列为序列3和序列4：

序列3(检测MPZ基因c.602delA突变的上游探针序列)

5’TGTCCTCGGGGTGGTGCTGTTGCTG3’

序列4(检测MPZ基因c.602delA突变的下游探针序列)

5’TGAGGGGTGGGATGGGAACAGTCAAG3’

检测MTM1基因突变的探针序列为序列7、8、11和12：

序列7(检测MTM1基因c.1237A>C突变的上游探针序列)

5’CTGCAAACAGTGCAGATGGATAAACAT3’

序列8(检测MTM1基因c.1237A>C突变的下游探针序列)

5’CGTGAGTCAGTAGGGAGTTATAAGATA3’

序列11(检测MTM1基因c.231+2T>C突变的上游探针序列)

5’GCAAAGAACCACTGTTCTACACCTAAC3’

序列12(检测MTM1基因c.231+2T>C突变的下游探针序列)

5’AGATACCAAGATACACAACAAATGGCA3’

检测MECP2基因突变的探针序列为序列13和14：

序列13(检测MECP2基因突变的上游探针序列)

5’GGTATGCTTTTGTAGTGTCGAAGTGTC3’

序列14(检测MECP2基因突变的上游探针序列)

5’GTATATGTCCTGGTTTGGCCATCTGTT3’

检测MUT基因突变的探针序列为序列15和16：

序列15(检测MUT基因突变的上游探针序列)

5’ACACATAGAGGCATTTAGAAAATGGGC3’

序列16(检测MUT基因突变的上游探针序列)

5’AGTTATGATCAAAGAAGAGAGTAAAGCT3’

检测MPZ基因突变的探针序列为序列17和18：

序列17(检测MPZ基因突变的上游探针序列)

5’TGGGGGACTTGACAGCAGGCCGGA3’

序列18(检测MPZ基因突变的上游探针序列)

5’GCTTCGACGCGTCCTTTCCTGGCTTGT3’

检测PMP22基因突变的探针序列为序列19和20：

序列19(检测PMP22基因突变的上游探针序列)

5’GAGAGCAAGTTGTTTTCCTTGTTCCCA3’

序列20(检测PMP22基因突变的下游探针序列)

5’ATAGGGAAGGGAGGAAGGGAAAACAGA3’

采用illuminaTruSeqCustomAmpliconKit试剂对71例临床样本和17例正常对照样本进行文库制备和合并。合并后的文库采用MiSeq测序仪进行测序，读长2×300bp。下述方法中的步骤(c)、(d)、(e)、(f)、(g)和(h)所用试剂均是illumina公司生产的TruSeqCustomAmpliconKit试剂。

(a)基因组DNA的提取

提取各外周血样本的基因组DNA，提取方法可参照《分子克隆实验指南》中提供的基因组DNA提取方法，也可购买商品化试剂盒(如QIAGEN公司)按照说明书操作。

(b)基因组DNA的质控

对提取的基因组DNA进行质控，Nanodrop2000分光光度计测纯度，要求OD₂₆₀/OD₂₈₀在1.8～2.0之间；Qubit荧光光度计测定浓度，要求浓度不低于3.5ng/μL，总量不低于50ng。

(c)探针与基因组DNA杂交

将成套探针和杂交缓冲液依次加到稀释后的基因组DNA中，95℃孵育1min，然后缓慢降温到40℃，得到杂交混合液。

(d)杂交产物的纯化

组装过滤板，用缓冲液预洗过滤板孔。将杂交混合液加入到过滤膜中，离心，过滤掉没有与基因组DNA结合的探针，然后用洗涤buffer进行洗涤，离心，得到探针-基因组DNA杂交复合物。

(e)探针的延伸-连接

向纯化后的探针-基因组DNA杂交复合物中，加入延伸-连接酶和buffer混合液，37℃孵育45min。

(f)延伸-连接产物的纯化

孵育结束后，将得到的延伸-连接产

物采用AMPureXP磁珠(美国Beckman公司)进行纯化，去除未反应完的酶、buffer和dNTPMixture。

(g)PCR扩增

取96孔PCR板，将i5接头管按PCR板A-H的方向排列，将i7接头管按PCR板1-12的方向排列，向PCR板的每行(1-12)加入相同的i5接头，向PCR板每列(A-H)加入相同的i7接头；向PCR板孔中加入PCRmastermix；再向每个孔中加入纯化后的延伸-连接产物。短暂离心，进行PCR扩增，扩增条件：95℃预变性3min；95℃变性30s,66℃退火30s,72℃延伸60s共扩增25～30个循环；最后72℃延伸5min。

(h)PCR扩增产物的纯化

扩增后得到的PCR产物，使用AMPureXP磁珠(美国Beckman公司)进行纯化，并按照产品推荐的方案进行实验操作。

(i)文库的质控

纯化后的PCR产物进行浓度检测和扩增片段大小检测。使用Qubit荧光光度计用BR试剂粗略测定浓度，使用QPCR仪准确测定浓度。用Agilent2100生物分析仪检测文库大小分布，上样量1uL,文库大小分布要求：单峰、片段大小在600bp左右。

(j)文库的合并

对质控合格的文库进行合并，根据每个文库的浓度计算每个文库合并时加入的体积，等摩尔合并各个文库；根据测序仪的数据通量、目标区域大小和需要的覆盖深度，计算合并的文库个数。

(k)文库的稀释和上机测序

用杂交稀释buffer(illumina公司产品，货号：为MS-102-3003)稀释合并后的文库，然后按照测序仪的操作说明进行簇生成和测序。

3.数据分析采用MiSeq测序仪配套的数据分析软件MiSeqReporter进行原始数据的处理、分析，检测SNP和Indel变异。

对检测的SNP和Indel变异使用snpEff软件进行注释。尤其关注无义突变(nonsensevariant)、移码突变(frameshift)、选择性剪切变异(Splicingvariant)、错义突变(missensevariant)、氨基酸截断或插入变异(nonframeshift)和密码子丢失(stoplost)六种变异类型。

利用ClinVar等疾病数据库和其他突变数据库筛选出已知的致病突变，利用人群数据库，如dbSNP数据、千人基因组数据库、ESP(外显子组测序数据库)过滤掉已知变异。同时利用正常对照样本的测序结果对剩下的变异进行过滤。选取患者中存在的变异，而正常对照样本中不存在的变异。

利用SIFT、Polyphen、MutationTaster等多款预测软件对SNP进行功能预测。预测结果为致病SNP为潜在的致病突变。在这些突变中发现MPZ基因发生了c.602delA的杂合突变，MTM1基因发生了c.1237A>C的纯合突变和c.231+2T>C的纯合突变。使用Sanger测序证实了该突变的存在，且在17例正常对照样本中证实该突变不存在。利用UCSC数据库的100个脊椎动物的比较基因组分析发现MPZ基因的c.602delA突变，MTM1基因的c.1237A>C突变和MTM1基因的c.231+2T>C突变位于高度保守位点。

4.实验结果

通过110个致病基因的靶向重测序及生物信息分析发现三名患者各自发生了一个位点的突变，分别是MPZ基因上c.602delA的杂合突变，MTM1基因上c.1237A>C的纯合突变和MTM1基因上c.231+2T>C的纯合突变。OMIM数据库注释MPZ基因和MTM1基因对应的疾病如表1。

表1、OMIM数据库注释MPZ基因和MTM1基因对应的疾病

通过家系内共分离实验及患者的临床表现与基因突变相关疾病的表型信息证明，MPZ基因上c.602delA的杂合突变与进行性神经性腓骨肌萎缩症(Charcot-Marie-Toothdisease，CMT)有关；MTM1基因上c.1237A>C的纯合突变和MTM1基因上c.231+2T>C的纯合突变与X连锁的肌小管性肌病(Myotubularmyopathy,X-linked)有关。

野生型MPZ基因cDNA编码区序列，加粗字体表示突变型缺失位点:

ATGGCTCCTGGGGCTCCCTCATCCAGCCCCAGCCCTATCCTGGCTGTGCTGCTCTTCTCTTCTTTGGTGCTGTCCCCGGCCCAGGCCATCGTGGTTTACACCGACAGGGAGGTCCATGGTGCTGTGGGCTCCCGGGTGACCCTGCACTGCTCCTTCTGGTCCAGTGAGTGGGTCTCAGATGACATCTCCTTCACCTGGCGCTACCAGCCCGAAGGGGGCAGAGATGCCATTTCGATCTTCCACTATGCCAAGGGACAACCCTACATTGACGAGGTGGGGACCTTCAAAGAGCGCATCCAGTGGGTAGGGGACCCTCGCTGGAAGGATGGCTCCATTGTCATACACAACCTAGACTACAGTGACAATGGCACGTTCACTTGTGACGTCAAAAACCCTCCAGACATAGTGGGCAAGACCTCTCAGGTCACGCTGTATGTCTTTGAAAAAGTGCCAACTAGGTACGGGGTCGTTCTGGGAGCTGTGATCGGGGGTGTCCTCGGGGTGGTGCTGTTGCTGCTGCTGCTTTTCTACGTGGTTCGGTACTGCTGGCTACGCAGGCAGGCGGCCCTGCAGAGGAGGCTCAGTGCTATGGAGAAGGGGAATTGCACAAGCCAGGAAAGGACGCGTCGAAGCGCGGGCGGCAGACGCCAGTGCTGTATGCAATGCTGGACCACAGCAGAAGCACCAAAGCTGTCAGTGAGAAGAAGGCCAAGGGGCTGGGGGAGTCTCGCAAGGATAAGAAATAGCGGTTAG

野生型MPZ基因编码的蛋白质氨基酸序列，加粗字体表示突变型移码突变起始位点:MAPGAPSSSPSPILAVLLFSSLVLSPAQAIVVYTDREVHGAVGSRVTLHCSFWSSEWVSDDISFTWRYQPEGGRDAISIFHYAKGQPYIDEVGTFKERIQWVGDPRWKDGSIVIHNLDYSDNGTFTCDVKNPPDIVGKTSQVTLYVFEKVPTRYGVVLGAVIGGVLGVVLLLLLLFYVVRYCWLRRQAALQRRLSAMEKGKLHKPGKDASKRGRQTPVLYAMLDHSRSTKAVSEKKAKGLGESRKDKK

突变型MPZ基因cDNA编码区序列(序列表中序列21)，“[]”表示缺失位点:

ATGGCTCCTGGGGCTCCCTCATCCAGCCCCAGCCCTATCCTGGCTGTGCTGCTCTTCTCTTCTTTGGTGCTGTCCCCGGCCCAGGCCATCGTGGTTTACACCGACAGGGAGGTCCATGGTGCTGTGGGCTCCCGGGTGACCCTGCACTGCTCCTTCTGGTCCAGTGAGTGGGTCTCAGATGACATCTCCTTCACCTGGCGCTACCAGCCCGAAGGGGGCAGAGATGCCATTTCGATCTTCCACTATGCCAAGGGACAACCCTACATTGACGAGGTGGGGACCTTCAAAGAGCGCATCCAGTGGGTAGGGGACCCTCGCTGGAAGGATGGCTCCATTGTCATACACAACCTAGACTACAGTGACAATGGCACGTTCACTTGTGACGTCAAAAACCCTCCAGACATAGTGGGCAAGACCTCTCAGGTCACGCTGTATGTCTTTGAAAAAGTGCCAACTAGGTACGGGGTCGTTCTGGGAGCTGTGATCGGGGGTGTCCTCGGGGTGGTGCTGTTGCTGCTGCTGCTTTTCTACGTGGTTCGGTACTGCTGGCTACGCAGGCAGGCGGCCCTGCAGAGGAGGCTCAGTGCTATGGAGAAGGGGA[]ATTGCACAAGCCAGGAAAGGACGCGTCGAAGCGCGGGCGGCAGACGCCAGTGCTGTATGCAATGCTGGACCACAGCAGAAGCACCAAAGCTGTCAGTGAGAAGAAGGCCAAGGGGCTGGGGGAGTCTCGCAAGGATAAGAAATAGCGGTTAG

突变型MPZ基因编码的蛋白质(该蛋白质为MPZ发生p.Lys201AsnfsTer51突变得到的蛋白质，该蛋白质由序列21所示的DNA分子编码)氨基酸序列(序列表中序列22)，其中加粗字体表示与野生型MPZ相同的序列:

NCTSQERTRRSAGGRRQCCMQCWTTAEAPKLSVRRRPRGWGSLARIRNSG

野生型MTM1基因cDNA编码区序列，[]表示c.1237A>C突变位点:

ATGGCTTCTGCATCAACTTCTAAATATAATTCACACTCCTTGGAGAATGAGTCTATTAAGAGGACGTCTCGAGATGGAGTCAATCGAGATCTCACTGAGGCTGTTCCTCGACTTCCAGGAGAAACACTAATCACTGACAAAGAAGTTATTTACATATGTCCTTTCAATGGCCCCATTAAGGGAAGAGTTTACATCACAAATTATCGTCTTTATTTAAGAAGTTTGGAAACGGATTCTTCTCTAATACTTGATGTTCCTCTGGGTGTGATCTCGAGAATTGAAAAAATGGGAGGCGCGACAAGTAGAGGAGAAAATTCCTATGGTCTAGATATTACTTGTAAAGACATGAGAAACCTGAGGTTCGCTTTGAAACAGGAAGGCCACAGCAGAAGAGATATGTTTGAGATCCTCACGAGATACGCGTTTCCCCTGGCTCACAGTCTGCCATTATTTGCATTTTTAAATGAAGAAAAGTTTAACGTGGATGGATGGACAGTTTACAATCCAGTGGAAGAATACAGGAGGCAGGGCTTGCCCAATCACCATTGGAGAATAACTTTTATTAATAAGTGCTATGAGCTCTGTGACACTTACCCTGCTCTTTTGGTGGTTCCGTATCGTGCCTCAGATGATGACCTCCGGAGAGTTGCAACTTTTAGGTCCCGAAATCGAATTCCAGTGCTGTCATGGATTCATCCAGAAAATAAGACGGTCATTGTGCGTTGCAGTCAGCCTCTTGTCGGTATGAGTGGGAAACGAAATAAAGATGATGAGAAATATCTCGATGTTATCAGGGAGACTAATAAACAAATTTCTAAACTCACCATTTATGATGCAAGACCCAGCGTAAATGCAGTGGCCAACAAGGCAACAGGAGGAGGATATGAAAGTGATGATGCATATCATAACGCCGAACTTTTCTTCTTAGACATTCATAATATTCATGTTATGCGGGAATCTTTAAAAAAAGTGAAGGACATTGTTTATCCTAATGTAGAAGAATCTCATTGGTTGTCCAGTTTGGAGTCTACTCATTGGTTAGAACATATCAAGCTCGTTTTGACAGGAGCCATTCAAGTAGCAGACAAAGTTTCTTCAGGGAAGAGTTCAGTGCTTGTGCATTGCAGTGACGGATGGGACAGGACTGCTCAGCTGACATCCTTGGCCATGCTGATGTTGGATAGCTTCTATAGGAGCATTGAAGGGTTCGAAATACTGGTACAAAAAGAATGGATA[GTTTTGGACATAAATTTGCATCTCGAATAGGTCATGGTGATAAAAACCACACCGATGCTGACCGTTCTCCTATTTTTCTCCAGTTTATTGATTGTGTGTGGCAAATGTCAAAACAGTTCCCTACAGCTTTTGAATTCAATGAACAATTTTTGATTATAATTTTGGATCATCTGTATAGTTGCCGATTTGGTACTTTCTTATTCAACTGTGAATCTGCTCGAGAAAGACAGAAGGTTACAGAAAGGACTGTTTCTTTATGGTCACTGATAAACAGTAATAAAGAAAAATTCAAAAACCCCTTCTATACTAAAGAAATCAATCGAGTTTTATATCCAGTTGCCAGTATGCGTCACTTGGAACTCTGGGTGAATTACTACATTAGATGGAACCCCAGGATCAAGCAACAACAGCCGAATCCAGTGGAGCAGCGTTACATGGAGCTCTTAGCCTTACGCGACGAATACATAAAGCGGCTTGAGGAACTGCAGCTCGCCAACTCTGCCAAGCTTTCTGATCCCCCAACTTCACCTTCCAGTCCTTCGCAAATGATGCCCCATGTGCAAACTCACTTCTGA

野生型MTM1基因编码的蛋白质氨基酸序列，[]表示p.Ser413Arg突变位点:

MASASTSKYNSHSLENESIKRTSRDGVNRDLTEAVPRLPGETLITDKEVIYICPFNGPIKGRVYITNYRLYLRSLETDSSLILDVPLGVISRIEKMGGATSRGENSYGLDITCKDMRNLRFALKQEGHSRRDMFEILTRYAFPLAHSLPLFAFLNEEKFNVDGWTVYNPVEEYRRQGLPNHHWRITFINKCYELCDTYPALLVVPYRASDDDLRRVATFRSRNRIPVLSWIHPENKTVIVRCSQPLVGMSGKRNKDDEKYLDVIRETNKQISKLTIYDARPSVNAVANKATGGGYESDDAYHNAELFFLDIHNIHVMRESLKKVKDIVYPNVEESHWLSSLESTHWLEHIKLVLTGAIQVADKVSSGKSSVLVHCSDGWDRTAQLTSLAMLMLDSFYRSIEGFEILVQKEWI[FGHKFASRIGHGDKNHTDADRSPIFLQFIDCVWQMSKQFPTAFEFNEQFLIIILDHLYSCRFGTFLFNCESARERQKVTERTVSLWSLINSNKEKFKNPFYTKEINRVLYPVASMRHLELWVNYYIRWNPRIKQQQPNPVEQRYMELLALRDEYIKRLEELQLANSAKLSDPPTSPSSPSQMMPHVQTHF

c.1237A>C突变型MTM1基因cDNA编码区序列(序列表中序列23)，“[]”表示突变位点:

ATGGCTTCTGCATCAACTTCTAAATATAATTCACACTCCTTGGAGAATGAGTCTATTAAGAGGACGTCTCGAGATGGAGTCAATCGAGATCTCACTGAGGCTGTTCCTCGACTTCCAGGAGAAACACTAATCACTGACAAAGAAGTTATTTACATATGTCCTTTCAATGGCCCCATTAAGGGAAGAGTTTACATCACAAATTATCGTCTTTATTTAAGAAGTTTGGAAACGGATTCTTCTCTAATACTTGATGTTCCTCTGGGTGTGATCTCGAGAATTGAAAAAATGGGAGGCGCGACAAGTAGAGGAGAAAATTCCTATGGTCTAGATATTACTTGTAAAGACATGAGAAACCTGAGGTTCGCTTTGAAACAGGAAGGCCACAGCAGAAGAGATATGTTTGAGATCCTCACGAGATACGCGTTTCCCCTGGCTCACAGTCTGCCATTATTTGCATTTTTAAATGAAGAAAAGTTTAACGTGGATGGATGGACAGTTTACAATCCAGTGGAAGAATACAGGAGGCAGGGCTTGCCCAATCACCATTGGAGAATAACTTTTATTAATAAGTGCTATGAGCTCTGTGACACTTACCCTGCTCTTTTGGTGGTTCCGTATCGTGCCTCAGATGATGACCTCCGGAGAGTTGCAACTTTTAGGTCCCGAAATCGAATTCCAGTGCTGTCATGGATTCATCCAGAAAATAAGACGGTCATTGTGCGTTGCAGTCAGCCTCTTGTCGGTATGAGTGGGAAACGAAATAAAGATGATGAGAAATATCTCGATGTTATCAGGGAGACTAATAAACAAATTTCTAAACTCACCATTTATGATGCAAGACCCAGCGTAAATGCAGTGGCCAACAAGGCAACAGGAGGAGGATATGAAAGTGATGATGCATATCATAACGCCGAACTTTTCTTCTTAGACATTCATAATATTCATGTTATGCGGGAATCTTTAAAAAAAGTGAAGGACATTGTTTATCCTAATGTAGAAGAATCTCATTGGTTGTCCAGTTTGGAGTCTACTCATTGGTTAGAACATATCAAGCTCGTTTTGACAGGAGCCATTCAAGTAGCAGACAAAGTTTCTTCAGGGAAGAGTTCAGTGCTTGTGCATTGCAGTGACGGATGGGACAGGACTGCTCAGCTGACATCCTTGGCCATGCTGATGTTGGATAGCTTCTATAGGAGCATTGAAGGGTTCGAAATACTGGTACAAAAAGAATGGATAGTTTTGGACATAAATTTGCATCTCGAATAGGTCATGGTGATAAAAACCACACCGATGCTGACCGTTCTCCTATTTTTCTCCAGTTTATTGATTGTGTGTGGCAAATGTCAAAACAGTTCCCTACAGCTTTTGAATTCAATGAACAATTTTTGATTATAATTTTGGATCATCTGTATAGTTGCCGATTTGGTACTTTCTTATTCAACTGTGAATCTGCTCGAGAAAGACAGAAGGTTACAGAAAGGACTGTTTCTTTATGGTCACTGATAAACAGTAATAAAGAAAAATTCAAAAACCCCTTCTATACTAAAGAAATCAATCGAGTTTTATATCCAGTTGCCAGTATGCGTCACTTGGAACTCTGGGTGAATTACTACATTAGATGGAACCCCAGGATCAAGCAACAACAGCCGAATCCAGTGGAGCAGCGTTACATGGAGCTCTTAGCCTTACGCGACGAATACATAAAGCGGCTTGAGGAACTGCAGCTCGCCAACTCTGCCAAGCTTTCTGATCCCCCAACTTCACCTTCCAGTCCTTCGCAAATGATGCCCCATGTGCAAACTCACTTCTGA

c.1237A>C突变型MTM1基因编码的蛋白质氨基酸序列(序列表中序列24)，“[]”表示突变位点:

MASASTSKYNSHSLENESIKRTSRDGVNRDLTEAVPRLPGETLITDKEVIYICPFNGPIKGRVYITNYRLYLRSLETDSSLILDVPLGVISRIEKMGGATSRGENSYGLDITCKDMRNLRFALKQEGHSRRDMFEILTRYAFPLAHSLPLFAFLNEEKFNVDGWTVYNPVEEYRRQGLPNHHWRITFINKCYELCDTYPALLVVPYRASDDDLRRVATFRSRNRIPVLSWIHPENKTVIVRCSQPLVGMSGKRNKDDEKYLDVIRETNKQISKLTIYDARPSVNAVANKATGGGYESDDAYHNAELFFLDIHNIHVMRESLKKVKDIVYPNVEESHWLSSLESTHWLEHIKLVLTGAIQVADKVSSGKSSVLVHCSDGWDRTAQLTSLAMLMLDSFYRSIEGFEILVQKEWI[]FGHKFASRIGHGDKNHTDADRSPIFLQFIDCVWQMSKQFPTAFEFNEQFLIIILDHLYSCRFGTFLFNCESARERQKVTERTVSLWSLINSNKEKFKNPFYTKEINRVLYPVASMRHLELWVNYYIRWNPRIKQQQPNPVEQRYMELLALRDEYIKRLEELQLANSAKLSDPPTSPSSPSQMMPHVQTHF

野生型MTM1基因(c.231+2T>C)位点上下游序列，[]表示突变位点:

Tagggtagcagcagcagtattctcattcacttctattgtcaccttgccccaggtagtgacagcattgtgggaaa gctcagggaagcactgttagtgcctggaggtggtgtggccccactagttctcccactaccccaactcaacccag cacggtaatgtagaaacattgccagtgcttgctttcagccttttcagtaatttttaaaattgtagttattctta gctgaatagtttatattaaattagtgccatttgttgtgtatcttggtatctatttccattattttagggtactt tttttatcttaatag(Intron3)ACAAAGAAGTTATTTACATATGTCCTTTCAATGGCCCCATTAAGGGAAGAGTTTACATCACAAATTATCGTCTTTATTTAAGAAGTTTGGAAACG(Exon4)g[ aagtagaatataagacca taaagatgaccctaactgttaaagataatgctaaattgtttctcttctactttgcaagattgactgtgggtcaa attaacatggggtatatttgcttc(Intron4)

突变型MTM1基因(c.231+2T>C)突变位点上下游序列(第四个内含子部分序列为序列表中序列25)，“[]”表示突变位点:

Tagggtagcagcagcagtattctcattcacttctattgtcaccttgccccaggtagtgacagcattgtgggaaa gctcagggaagcactgttagtgcctggaggtggtgtggccccactagttctcccactaccccaactcaacccag cacggtaatgtagaaacattgccagtgcttgctttcagccttttcagtaatttttaaaattgtagttattctta gctgaatagtttatattaaattagtgccatttgttgtgtatcttggtatctatttccattattttagggtactt tttttatcttaatag(Intron3)ACAAAGAAGTTATTTACATATGTCCTTTCAATGGCCCCATTAAGGGAAGAGTTTACATCACAAATTATCGTCTTTATTTAAGAAGTTTGGAAACG(Exon4)g aagtagaatataagacca taaagatgaccctaactgttaaagataatgctaaattgtttctcttctactttgcaagattgactgtgggtcaa attaacatggggtatatttgcttc(Intron4)

5.变异的质量控制步骤和条件

每个样本检测出的变异数目有几百个，按照MiSeqReporter软件默认的质量控制条件，通过质量控制的变异经Sanger测序法验证的一致率为61.42％，没有通过质量控制的变异经Sanger测序法验证的一致率为17.78％。由此可见按照默认的质量控制条件会有较高的假阳性和假阴性。为降低假阳性和假阴性，建立了一套基于MiSeq扩增子测序的变异质量控制步骤和条件：

(a)过滤掉标记为“R8”的变异；

(b)过滤掉标记为“LowVariantFrequency”的变异；

(c)过滤掉标记为“LowGQX”的变异；

(d)过滤掉QUAL值小于50的变异；

(e)基因型杂合时，过滤掉测序深度小于20乘的变异；基因型为纯合时，过滤掉测序深度小于4乘的SNP和测序深度小于10乘的Indel。

按照上述质量控制步骤和条件，通过质量控制的变异经Sanger测序法验证一致率为89.28％，没有通过质量控制的变异经Sanger测序法验证一致率为1.69％。由此可见，按照调整后的质量控制步骤和条件，大大的降低了假阳性和假阴性。

变异质量控制的步骤和条件如图3所示。

二、与新生儿肌张力低下有关的基因突变的Sanger法测序验证

分别对三个样本中检测到的突变进行Sanger测序验证。具体方法步骤如下：

(1)基因组DNA提取

对检测到上述三个突变的临床样本，采用QIAGENMiniKit从外周血中提取基因组DNA。对提取的基因组DNA进行质量控制，OD260/280在1.8～2.0之间，OD260/230在1.8～2.0之间。

(2)引物设计及PCR反应

参考人类基因组序列数据库GRCh37/hg19，采用Primer3.0分别针对MPZ基因的c.602delA突变位点、MTM1基因的c.1237A>C突变位点和c.231+2T>C突变位点设计特异性引物，引物序列见下表：

(3)PCR反应体系

按下表向PCR管中加入各组分，反应总体积50μL。

试剂	体积/每个反应
		10×PCR Buffer(mg2+plus)	5μL
dNTP Mixture(each 10mM)	1μL
		TaKaRa Taq(5U/μL)	0.25μL
正向引物	2μL
		反向引物	2μL
基因组DNA	100ng
		ddH2O	Up to 50μL

(4)PCR热循环条件

将PCR管短暂离心，然后于PCR仪上按照下表中的热循环条件进行扩增反应。

(5)Sanger测序

将PCR产物测序结果见图2。图2显示了三个样本的突变检测结果。图2中A为MPZ基因第5个外显子c.602delA的杂合突变峰图，图2中B为MPZ基因野生型DNA序列和突变DNA序列比对结果。图2中C为MTM1基因第11个外显子c.1237A>C的纯合突变峰图，图2中D为MPZ基因野生型DNA序列和突变DNA序列比对结果。图2中E为MTM1基因第4个内含子c.231+2T>C的纯合突变峰图，图2中F为MTM1基因野生型DNA序列和突变DNA序列比对结果。箭头指示的位置为突变位点。

Claims (10)

1.下述任一产品：

D1)MPZ突变蛋白质，为序列22所示的蛋白质；

D2)MTM1突变蛋白质，为序列24所示的蛋白质；

D3)编码所述MPZ突变蛋白质的DNA分子或cDNA分子；

D4)编码所述MTM1突变蛋白质的DNA分子或cDNA分子；

D5)含有M的DNA分子或cDNA分子，所述M为将MTM1基因第四个内含子第2位的T突变为C得到的DNA分子；

D6)由所述D1)和所述D2)中的至少一个与X1组成的成套蛋白质；所述X1为108个与肌张力低下相关的蛋白质发生突变得到的蛋白质中的至少一个；所述108个与肌张力低下相关的蛋白质为AARS、ALG1、ALG11、ALG12、ALG13、ALG2、ALG3、ALG6、ALG8、ALG9、B4GALT1、CDKL5、CNBP、COG1、COG4、COG5、COG6、COG7、COG8、COL6A1、COL6A2、COL6A3、DDOST、DHDDS、DMPK、DNAJB2、DOLK、DPAGT1、DPM1、DPM2、DPM3、DYNC1H1、EGR2、FGD4、FIG4、FKRP、FKTN、FOXG1、GARS、GDAP1、GMPPA、HSPB1、HSPB8、IGHMBP2、ISPD、KIF1B、LAMA2、LARGE、LITAF、LMNA、LRSAM1、MAGT1、MAN1B1、MARS、MCEE、MECP2、MED25、MFN2、MGAT2、MMAA、MMAB、MMADHC、MOGS、MPDU1、MPI、MTMR2、MUT、NDRG1、NEFL、PEX1、PEX10、PEX12、PEX13、PEX14、PEX16、PEX19、PEX2、PEX26、PEX3、PEX5、PEX6、PGM1、PMM2、PMP22、POMGNT1、POMT1、POMT2、PRX、RAB7A、RFT1、RYR1、SBF1、SBF2、SEPN1、SH3TC2、SLC35A1、SLC35A2、SLC35C1、SMN1、SMN2、SRD5A3、SSR4、STT3A、STT3B、TAZ、TMEM165、TRPV4和TUSC3基因；

D7)由所述D3)、所述D4)和所述D5)中的至少一个与X2组成的成套DNA分子或cDNA分子；所述X2为编码所述X1的DNA分子或cDNA分子。

2.诊断或辅助诊断肌张力低下患者的成套试剂，由名称为G1的检测MPZ基因c.602delA突变的物质、名称为G2的检测MTM1基因c.1237A>C突变的物质和名称为G3的检测MTM1基因c.231+2T>C突变的物质组成；所述MPZ基因c.602delA突变为缺失MPZ基因编码序列的第602位核苷酸得到的基因；所述MTM1基因c.1237A>C突变为将MTM1基因编码序列的第1237位核苷酸得到的基因；所述MTM1基因c.231+2T>C突变为将MTM1基因第四个内含子第2位的T突变为C得到的DNA分子。

3.根据权利要求2所述的成套试剂，其特征在于：所述G1为检测MPZ基因c.602delA突变的探针对和/或引物对，所述探针对中的两条探针分别与MPZ基因c.602delA突变位点的上游和下游特异结合，所述引物对中的两条引物分别与MPZ基因c.602delA突变位点的上游和下游特异结合；

所述G2为检测MTM1基因c.1237A>C突变的探针对和/或引物对，所述探针对中的两条探针分别与MTM1基因c.1237A>C突变位点的上游和下游特异结合，所述引物对中的两条引物分别与MTM1基因c.1237A>C突变位点的上游和下游特异结合；

所述G3为检测MTM1基因c.231+2T>C突变的探针对和/或引物对，所述探针对中的两条探针分别与MTM1基因c.231+2T>C突变位点的上游和下游特异结合，所述引物对中的两条引物分别与MTM1基因c.231+2T>C突变位点的上游和下游特异结合。

4.根据权利要求3所述的成套试剂，其特征在于：所述检测MPZ基因c.602delA突变的引物对的两条引物的序列分别为序列表中序列1和序列2；所述检测MPZ基因c.602delA突变的探针对的两个探针的序列分别为序列表中序列3和序列4；

所述检测MTM1基因c.1237A>C突变的引物对的两条引物的序列分别为序列表中序列5和序列6；所述检测MTM1基因c.1237A>C突变的探针对的两个探针的序列分别为序列表中序列7和序列8；

所述检测MTM1基因c.231+2T>C突变的引物对的两条引物的序列分别为序列表中序列9和序列10；所述检测MTM1基因c.231+2T>C突变的探针对的两个探针的序列分别为序列表中序列11和序列12。

5.诊断或辅助诊断肌张力低下患者的成套试剂，为下述A1)-A4)中的任一种：

A1)权利要求2-4中任一所述G1；

A2)权利要求2-4中任一所述G2；

A3)权利要求2-4中任一所述G3；

A4)由权利要求2-4中任一所述G1、所述G2和所述G3这三种中的至少两种组成的成套试剂。

6.诊断或辅助诊断肌张力低下患者的成套试剂，由权利要求2-5中任一所述成套试剂与检测108个与肌张力低下相关基因突变的物质组成；所述108个与肌张力低下相关基因为AARS、ALG1、ALG11、ALG12、ALG13、ALG2、ALG3、ALG6、ALG8、ALG9、B4GALT1、CDKL5、CNBP、COG1、COG4、COG5、COG6、COG7、COG8、COL6A1、COL6A2、COL6A3、DDOST、DHDDS、DMPK、DNAJB2、DOLK、DPAGT1、DPM1、DPM2、DPM3、DYNC1H1、EGR2、FGD4、FIG4、FKRP、FKTN、FOXG1、GARS、GDAP1、GMPPA、HSPB1、HSPB8、IGHMBP2、ISPD、KIF1B、LAMA2、LARGE、LITAF、LMNA、LRSAM1、MAGT1、MAN1B1、MARS、MCEE、MECP2、MED25、MFN2、MGAT2、MMAA、MMAB、MMADHC、MOGS、MPDU1、MPI、MTMR2、MUT、NDRG1、NEFL、PEX1、PEX10、PEX12、PEX13、PEX14、PEX16、PEX19、PEX2、PEX26、PEX3、PEX5、PEX6、PGM1、PMM2、PMP22、POMGNT1、POMT1、POMT2、PRX、RAB7A、RFT1、RYR1、SBF1、SBF2、SEPN1、SH3TC2、SLC35A1、SLC35A2、SLC35C1、SMN1、SMN2、SRD5A3、SSR4、STT3A、STT3B、TAZ、TMEM165、TRPV4和TUSC3基因。

7.根据权利要求6所述的成套试剂，其特征在于：所述检测MECP2基因突变的物质为由核苷酸序列分别为序列13和序列14的两个探针组成的探针对；

所述检测MUT基因突变的物质为由核苷酸序列分别为序列15和序列16的两个探针组成的探针对；

所述检测MPZ基因突变的物质为由核苷酸序列分别为序列17和序列18的两个探针组成的探针对；

所述检测PMP22基因突变的物质为由核苷酸序列分别为序列19和序列20的两个探针组成的探针对。

8.诊断或辅助诊断肌张力低下患者的试剂或试剂盒，包括权利要求2-7中任一所述成套试剂。

9.检测与肌张力低下相关基因突变的方法，包括利用权利要求2-7中任一所述成套试剂检测待测样本的MPZ基因、MTM1基因和/或权利要求6中所述108个与肌张力低下相关基因这108个基因中的至少一种基因的序列，与相应的基因相比，确定上述基因是否突变。

10.下述Ⅰ或Ⅱ的应用：

Ⅰ、权利要求2-7中任一所述成套试剂或权利要求8所述试剂或试剂盒的下述E1)-E10)中任一应用：

E1)在制备诊断或辅助诊断肌张力低下产品中的应用；

E2)在诊断或辅助诊断肌张力低下中的应用；

E3)在制备筛查或辅助筛查肌张力低下患者产品中的应用；

E4)在筛查或辅助筛查肌张力低下患者中的应用；

E5)在制备预测肌张力患病风险产品中的应用；

E6)在预测肌张力患病风险中的应用；

E7)在制备检测与肌张力低下相关基因是否突变产品中的应用；

E8)在检测与肌张力低下相关基因是否突变中的应用；

E9)在制备检测与肌张力低下相关蛋白质是否突变产品中的应用；

E10)在检测与肌张力低下相关蛋白质是否突变中的应用；

Ⅱ、权利要求1所述产品的所述E1)-E6)中任一应用。