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CN105420299A - 用于生产酶的方法 - Google Patents

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CN105420299A
CN105420299A CN201510681174.3A CN201510681174A CN105420299A CN 105420299 A CN105420299 A CN 105420299A CN 201510681174 A CN201510681174 A CN 201510681174A CN 105420299 A CN105420299 A CN 105420299A
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CN
China
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enzyme
single cell
cell oil
microorganism
protein
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Application number
CN201510681174.3A
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English (en)
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A·马尔姆
S·拉科索
O·帕斯蒂宁
H·卡海林
M·穆尤宁
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Neste Oyj
Original Assignee
Neste Oyj
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Publication date
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Abstract

本发明涉及用于生产酶和单细胞油的过程。所述过程包括在单细胞油生产过程中适于单细胞油产生和酶产生的条件下培育能够同时产生单细胞油和酶的微生物。获得包含单细胞油和酶的微生物培养物，并且将至少部分的所述微生物培养物、从所述微生物培养物分离的上清液和/或微生物细胞，从上清液富集的蛋白质级分和/或从细胞所获得的蛋白质级分用作酶制备物或用作酶的来源。单细胞油从微生物细胞回收并且用作生物燃料、生物燃料组分或用作生物燃料生产的原料。根据所述过程产生的酶用于相同或另一个工业过程中。

Description

用于生产酶的方法
本申请是发明名称为“用于生产酶的方法”、申请日为2011年12月19日的中国专利申请201180066059.5的分案申请。
发明领域
本发明涉及用于生产酶的方法。具体而言，本发明涉及用于单细胞油过程中生产酶的过程和所述酶在相同或其他过程中的应用。
背景技术
某些微生物能够在合适的生理条件下积累胞内三酰甘油，单细胞油。已经利用该特性主要生产专门用途和高价值产品如化妆品和营养应用的单细胞油。迄今，已经通过其中生产的工艺经济性和适用性并不占优明显地位的小规模或中等规模生产过程满足用于这些目的的单细胞油的需求。
目前，对于使用非化石原料作为运输用燃料前体的化石原料的替代物，存在日益增加的兴趣。主要挑战似乎是单细胞油的生产应当以如此庞大的规模进行，从而不可避免对于加工大规模含水微生物常见的问题。在特征上，单细胞油生产过程需要高能量输入并产生大量的含水侧流和单细胞碎片。因此，用于超大规模含水微生物加工的目前技术似乎不是经济可行的并且涉及几个有关环境的问题。
碳水化合物是地球上储量最丰富的生物质并且因此大规模生产单细胞油的唯一现实底物。木质纤维素是地球上最丰富的碳水化合物来源。然而，木质纤维素生物材料或其他复合生物材料需要充分加工以使它们由微生物可用作养分和用作单细胞油的来源。伴随木质纤维素生物质的加工，同时将出现不可发酵的侧流(sidestream)，如木质素。在另一方面，单细胞油生产过程本身产生仍含有相当量养分的细胞物质和侧流。
已经在现有技术的一些出版物中提出再利用各种发酵过程的侧流和总体过程经济性的改善。单细胞油生产的数量上占优势的侧流是发酵废水和从细胞取出油后剩余的细胞碎片。US2009/0064567A1公开了通过培育原生藻菌(Stramenopile)界微生物借助异养发酵生产生物油。此公开提出使脱脂生物质或水解的生物质再循环至用于培养微生物的培养基。
发明简述
本发明的一个目的是为现有技术中遇到的问题提供解决方案。具体而言，本发明旨在为大规模生产单细胞油中遇到的问题提供技术上有益的解决方案。
具体而言，本发明的一个目的是提供解决方案，所述解决方案使提高大规模单细胞油生产的经济性成为可能。
本发明的另一个目的是提供解决方案，所述解决方案使减低大规模单细胞油生产造成的环境负担成为可能。
本发明特别旨在解决与制造交通用生物燃料相关的问题。
为实现这些目的，本发明特征在于独立权利要求所列的特征。其他权利要求代表本发明的优选实施方案。
本发明方法基于以下发现：单细胞油生产过程的侧流包含显著量的养分，所述养分可以充当微生物(例如产油微生物)的碳源。
现在已经令人惊讶地发现在单细胞油生产过程的侧流还包含显著量的蛋白质，尤其酶。因此，所述微生物培养物或其级分可以用作酶的来源或用作酶制备物或用作酶制备物的组分。
在一个方面，本发明提供用于生产酶的过程，所述过程包括在适于单细胞油产生和适于酶产生的条件下培育能够同时产生单细胞油(脂质)和酶的微生物，并且所述单细胞油(脂质)和酶由所述微生物产生。
在本发明的一个实施方案中，回收包含微生物细胞和使用过的培养基的微生物培养物。
在本发明的另一个实施方案中，讲上清液和/或微生物细胞与微生物培养物分离并且回收所述上清液和/或细胞。
此外，在本发明的另一个实施方案中，在微生物培养物中或在上清液中富集蛋白质级分并且回收富集的蛋白质级分。这可以通过例如浓缩微生物培养物的水相(培养液)或上清液实现。
此外，在本发明的另一个实施方案中，通过自溶或诱导的细胞溶解从细胞回收由微生物产生的胞内酶。可以从上清液收获从细胞释放的酶。
根据本发明的一个优选实施方案，酶从上清液回收。分泌至培养基或因细胞溶解所释放的酶是细胞外的并且可以从上清液回收。
根据本发明的又一个实施方案，培养基是固态或半固态的并且将酶在回收之前导入水相。
在本发明的多种实施方案中，从微生物培养物或其级分以催化活性形式回收酶。
在本发明的一个实施方案中，将包含催化活性酶的微生物培养物或液相导入相同的生物技术过程中，或用所述酶预处理所述过程中使用的原料，如聚合物生物质。
在本发明的另一个实施方案中，将包含催化活性酶的微生物培养物或液相导入另一个过程中，或将所述过程中使用的原料(如聚合物生物质)预处理。
在本发明的又一个实施方案中，将包含微生物产生的酶的微生物培养物或液相导入使用不能产生酶的微生物的生物技术过程中，或将所述过程中使用的原料(如聚合物生物质)预处理。
相同的或另一个过程优选地是单细胞油生产过程。
根据本发明的一个实施方案，该过程是使用聚合物生物质和/或聚合物糖(如木质纤维素)作为原料的过程。
在另一个实施方案中，将微生物培养物或上清液的富含蛋白质级分导入另一个工业过程中或将它用来处理供给至另一个工业过程的原料。
在另一个实施方案中，将微生物培养物或上清液的富含蛋白质级分导入另一个生物技术过程中或将它用来处理供给至其他生物技术过程的原料，如聚合物生物质和/或聚合物糖。
在本发明的又一个实施方案中，将所述微生物培养物中或所述上清液中的蛋白质级分富集、回收并任选地纯化、稳定、干燥和/或配制并且在各种应用中用作酶制备物或用作酶的来源。
在本发明的又一个实施方案中，酶是胞内的并且从细胞获得。将胞内酶回收并任选地富集、纯化、分离、稳定、干燥和/或配制。
生产单细胞油和酶的主要优点是在大规模单细胞油生产的背景下考虑单细胞油生产的成本效率和与工艺侧流相关的环境事项。另外，集成方法导致更高效地利用聚合物生物质，同时减少含水发酵过程常见的侧流的生物需氧量。
本发明提供几项经济及环境优点：
-处理木质纤维素材料或包含其他聚合物糖生物质的材料的能量成本因使用本身来自单细胞油过程的酶替代商业酶处理和热机械和化学处理而降低。
-从单细胞油生产发酵过程的液体剩余物中取出酶蛋白减少了从单细胞油生产过程释放的发酵液的生物耗氧负荷。
-在取出细胞物质后，基本上无细胞的发酵废液更适合再利用。
-从发酵废水中减少或取出酶蛋白(而不是在工艺流中造成生物负荷)、将它们为催化目的再利用并且作为单细胞油生产过程或其他工业过程或尤其生物技术过程中的养分使用时，改善单细胞油过程的碳平衡。
-从发酵液回收的酶可以用于水解微生物或微生物组分的聚合物化合物。
-可以通过使用已知并验证过的单元操作和工业适用微生物物种实施本发明的方法。
-本发明有助于木质纤维素材料用于生产单细胞油的经济和技术可用性。
附图简述
图1工艺方案
图2是每体积培养液在水解试验中所释放的木糖。作为底物，使用200mg桦木木聚糖。
图3是每蛋白质在水解试验中所释放的木糖。作为底物，使用200mg桦木木聚糖。
图4是每体积培养液在水解试验中所释放的木糖。作为底物，使用200mg桦木木聚糖。
图5是每蛋白质在水解试验中所释放的木糖。作为底物，使用200mg桦木木聚糖。
图6是每体积培养液在水解试验中所释放的葡萄糖。作为底物，使用1g纤维素。
图7是每蛋白质在水解试验中所释放的葡萄糖。作为底物，使用1g纤维素。
图8是每体积培养液在水解试验中所释放的木糖。作为底物，使用200mg桦木木聚糖。
图9是每蛋白质在水解试验中所释放的木糖。作为底物，使用200mg桦木木聚糖。
图10是每体积培养液在水解试验中所释放的葡萄糖。作为底物，使用1g纤维素。一些木糖从半纤维素释放，所述半纤维素源自所用的培养液。
图11是每蛋白质在水解试验中所释放的葡萄糖。作为底物，使用1g纤维素。一些木糖从半纤维素释放，所述半纤维素源自所用的培养液。
图12是每体积培养液在水解试验中所释放的木糖。作为底物，使用200mg桦木木聚糖。
图13是每蛋白质在水解试验中所释放的木糖。作为底物，使用200mg桦木木聚糖。
图14是每体积培养液在水解试验中所释放的葡萄糖。作为底物，使用1g纤维素。一些木糖从半纤维素释放，所述半纤维素源自所用的培养液。
图15是每蛋白质在水解试验中所释放的葡萄糖。作为底物，使用1g纤维素。一些木糖从半纤维素释放，所述半纤维素源自所用的培养液。
发明描述
“单细胞油生产过程”在本文中指一种过程，其包括以下步骤：形成脂质合成微生物或允许其形成并允许如此获得的生物物质产生和/或贮存(积累)脂质，从液相回收细胞，和从细胞提取或回收脂质。如本文稍后所述，在各种微生物群体中(如多种细菌、古细菌、真菌(丝状真菌)、酵母和藻类中)为产生单细胞油的微生物。
如本文所述，本发明优选地使用能够同时产生脂质和酶的微生物。在本发明的一些实施方案中，“微生物”指两种或更多种微生物。在一些实施方案中，酶由一种微生物产生而单细胞油(脂质)由另一种微生物产生。
术语“单细胞油”指脂肪性物质，其分子通常含有脂族烃链作为部分，其溶解于非极性有机溶剂中但是在水中溶解不良。脂质是活细胞中重要的一组大分子。单细胞油例如是脂质、脂肪、蜡、蜡酯、固醇、类萜、类异戊二烯、类胡萝卜素、聚羟基链烷酸酯、核酸、脂肪酸、脂肪醇、脂肪醛、脂肪酸酯、磷脂、糖脂、鞘脂和酰基甘油如三酰甘油、二酰甘油或单酰甘油。
本发明中，优选的单细胞油是脂质、脂肪、蜡、酰基甘油和脂肪酸和它们的衍生物，尤其三酰甘油和蜡酯。
与本发明相关，“脂质”作为单细胞油的同义词使用。
在一个方面，本发明提供一种用于生产酶的方法，所述方法包括在单细胞油生产过程中在适于单细胞油产生和酶产生的条件下培育能够同时产生脂质和酶的微生物。允许所述微生物产生脂质和酶。单细胞油(脂质)从微生物细胞和微生物培养物和/或培养基或其部分回收，或使用微生物培养物和/或培养基的各种级分作为酶制备物或作为酶的来源。
在本发明的一个实施方案中，使用至少部分的包含微生物细胞和使用过的培养基的微生物培养物作为酶制备物或作为酶的来源。
在本发明的一个实施方案中，微生物培养物或其部分或上清液或其部分在单细胞油过程中再循环。一般地，10％至90％、优选地20％至80％，在一些实施方案中30％至70％，在一些实施方案中40％至60％、在一些实施方案中20％至50％所述微生物培养物或所述上清液在所述过程中再循环，优选地再循环返回单细胞油生产过程或返回原料处理。
在另一个实施方案中，上清液和/或微生物细胞与微生物培养物分离并且作为酶制备物或作为酶的来源使用。
上清液代表基本上无细胞的级分，其包含使用过的培养基或培养液。上清液也可以称作“发酵液”或“液相”。
上清液和细胞不需要完全分开。在一些实施方案中，上清液包含原始微生物培养物的1％至50％的细胞。在一些实施方案中，上清液包含原始微生物培养物的5％至40％的细胞，在一些实施方案中5至30％的细胞，在一些实施方案中10至40％、或20至30％或40至50％的细胞。
在一些实施方案中，细胞级分包含原始微生物培养物的1％至50％的细胞。在一些实施方案中，细胞级分包含原始微生物培养物的5％至40％的细胞，在一些实施方案中5至30％的细胞，在一些实施方案中10至40％、或20至30％或40至50％的细胞。
可以通过维持酶催化活性的任何适合方法进行上清液与细胞的分离。
用于回收酶的优选方法是这种方法，通过所述方法，可以由本领域技术人员处理微生物培养物、上清液或其任意组合以实现酶的回收，同时维持它们的催化活性。
所述酶可以从微生物培养物、使用过的培养基、上清液和微生物细胞通过任何已知且合适的方法或通过未来开发的任何合适方法回收。这同样也适用于可以将酶借以分离成具有所需酶活性的级分的方法。
借以回收包含催化活性酶的微生物培养物或上清液或蛋白质富集级分的方法可以基于它们的分子大小，离子行为、在水中的溶解度、在不同溶质中的溶解度或在含有缓冲因子或表面活性因子或表面活性化合物或盐的混合物溶质中的溶解度。
可以通过各种方法从培养基回收酶，所述方法包括但不限于以下方法，如离心、过滤、提取、喷雾干燥、蒸发或沉淀。
如果需要，可以通过各种方法纯化或分离酶，所述方法包括但不限于色谱、电泳方法、差异性溶解度、SDS-PAGE或提取。
酶可以例如用盐、糖或甘油稳定。
另外，可以为所述应用配制酶。
从微生物细胞回收酶时，可以应用相应方法。
在一个实施方案中，蛋白质级分从微生物细胞回收。可以通过维持酶催化活性的任何适合方法进行这种回收。
“脂质回收”指一个过程，其中通过机械、化学、生物化学、热力学或自催化方法或通过这些方法的组合从微生物细胞中回收脂质(胞内脂质)。
单细胞油一般代表已经由微生物以胞内方式合成的胞内脂质、由细胞分泌的脂质以及在细胞结构部分中(如在膜系统中)存在的脂质。在某些情况下，单细胞油也可以是胞外的，如在培养期间或之后从培养基中的细胞分泌或释放。
“残余细胞物质”代表固体、半固体或流动物质部分，其含有经处理以回收胞内脂质和/或胞内酶的微生物。
“含有脂质的单细胞物质”代表以自养、异养性和/或混合营养方式形成的脂质含量为微生物干物质的至少3％、优选地至少10％、优选地至少15％(w/w)或更多的单细胞物质和细胞菌丝体。
如本文所述那样获得的酶制备物是包含催化活性酶的微生物培养物或上清液或富集的蛋白质级分。一般，酶制备物是单细胞油生产过程的工艺水(processwater)(水相、培养液、上清液)，或从工艺水(水相、培养液、上清液)富集的蛋白质级分。可以通过用于富集或浓缩生物活性形式的蛋白质的任何适合方法实施富集。
在本发明的一个实施方案中，培养基是固态或半固态的并且将酶在回收之前导入水相。
“富集蛋白质级分”在本文中指从单细胞油生产过程的任何级分富蛋白质并维持所述蛋白质的催化活性的任何方法。更具体地，该方法包括来自单细胞油生产过程的微生物培养物或上清液的液相由富集液相中蛋白质的至少一种方法处理。在本发明的一些实施方案中，不需要富集过程。
与原始液相相比，在一些实施方案中，将蛋白质级分富集至少10％、一般至少20％、在多种实施方案中富集至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％。合适方法的例子是基于蛋白质的离子特性、分子大小，溶解度、表面活性特性或疏水相互作用的方法。优选地，在其中温度为70℃或更低的条件下实施酶级分的回收。
在本发明的一个实施方案中，在微生物培养物的水相中或在上清液中富集蛋白质级分。可以单纯例如通过浓缩微生物培养物的水相或上清液实施富集。
在本发明的一个实施方案中，按照每体积酶活性和/或每总蛋白活性所计算，将微生物培养物的水相中或上清液中的蛋白质部分富集至少1倍(1x)、一般至少2倍(2x)、优选地至少3倍(3x)。在一些实施方案中，按照每体积和/或每总蛋白的酶活性所计算，将微生物培养物的水相中或上清液中的蛋白质级分富集至少5倍，在一些实施方案中富集至少10x、或20x或30x、或40x、或50x、或60x、或70x、或80x、或90x、或100x。
根据本发明的一个优选实施方案，酶从上清液回收。“胞外酶”是分泌至培养介质或因细胞溶解从细胞释放至培养介质的酶。可以从上清液回收胞外酶。
从单细胞油过程释放的“工艺水”意指酶回收后从该过程中释放的水。可以使部分的工艺水循环返回该过程并且可以使部分的工艺水循环或引至另一个过程并且部分可以释放至环境。也可以将工艺水在释放至环境之前引至废水处理过程。
在本发明的一个实施方案中，一般10％至90％、优选地20％至80％、在一些实施方案中30％至70％、在一些实施方案中40％至60％、在一些实施方案中20％至50％的所述工艺水在所述过程中再循环，优选地再循环返回单细胞油生产过程或返回原料处理。
在本发明的一个实施方案中，从所述过程释放的工艺水含有比没有酶回收情况下单细胞油过程的工艺水低至少5％、至少10％、优选地至少20％、一般至少30％、更优选地至少40％、仍更优选地至少50％、仍更优选地至少60％、仍更优选地至少70％、仍更优选地至少80％、仍更优选地至少90％的蛋白质。
在本发明的一个实施方案中，从所述过程释放的工艺水具有比没有酶回收情况下单细胞油过程的工艺水的生物需氧量低至少5％、至少10％、优选地至少20％、一般至少30％、更优选地至少40％、仍更优选地至少50％、仍更优选地至少60％、仍更优选地至少70％、仍更优选地至少80％、仍更优选地至少90％的生物需氧量。
在本发明的一个实施方案中，酶是胞内的并且从微生物细胞获得。
在本发明的一个实施方案中，酶回收后的细胞残余物含有比不从细胞回收酶的情况下单细胞油过程的细胞残余物低至少1％、至少5％、至少10％、优选地至少20％的蛋白质。
在本发明的一个实施方案中，酶回收后的细胞残余物含有比不从细胞回收酶的情况下单细胞油过程的细胞残余物低至少30％、优选地至少40％、优选地至少50％、优选地至少60％、优选地至少70％、优选地至少80％、优选地至少90％的蛋白质。
在本发明的一个实施方案中，酶生产和单细胞油生产同时或以任何顺序依次地发生。一般更早启动酶产生。产生的酶降解培养介质中的聚合物生物质，因而产生用于微生物生长的组分。
“酶”在本文中指任何酶并且不限于任何特定的酶或酶类。在一个实施方案中，酶指对复杂碳水化合物和蛋白质具有作用的酶。“酶”优选地指水解酶(EC3.x.x.)、氧化还原酶(EC1.x.x.)、裂解酶(EC4.x.x.)、异构酶(EC5.x.x.)、转移酶(EC2.x.x.)和连接酶(EC6.x.x.)。第一个数字意指酶类，第一个x意指键的类型，第二个x指具体反应。
“酶”在本发明中尤其意指能够降解复杂碳水化合物、蛋白质和脂质的胞外酶。更具体地，酶是向反应产物的官能团引入水并因而降解糖苷键、肽键、酯键或醚键或在氮和碳或氮和氧之间键的水解酶。酶优选地是纤维素酶、木聚糖酶、葡糖苷酶、甘露聚糖酶、半乳糖酶、阿拉伯糖酶、果胶酶、蛋白酶、脂肪酶、磷脂酶、异构酶或酯酶。水解酶在本文中指能够进行水解反应即能够将官能团转移至水的酶。优选地，酶选自纤维素酶、半纤维素酶、木聚糖酶、葡糖苷酶、半乳糖苷酶或甘露聚糖酶。
在一些实施方案中，酶是催化氧化-还原反应的氧化还原酶、催化添加或移除基团以形成双键的裂解酶、催化分子内基团转移的异构酶或以ATP水解为代价催化两个底物连接的连接酶。
“纤维素酶”或“纤维素裂解酶”指主要由真菌(如丝状真菌或酵母)、细菌、植物或由动物产生的一组酶，它们催化纤维素的水解，也称作纤维素水解。已知几个不同种类的纤维素酶，它们在结构和机制上不同。基于催化的反应类型，纤维素酶总体上包括纤维素内切酶、纤维素外切酶、纤维二糖酶或β-葡糖苷酶、氧化性纤维素酶和纤维素磷酸化酶。这些酶可以按以下EC编号找到，如EC3.2.1.4、EC3.2.1.91、EC3.2.1.21。
“半纤维素酶”指主要由真菌(如丝状真菌或酵母)、细菌、植物或由动物产生的一组酶，它们催化半纤维素的水解。例如，这些酶参与木聚糖的水解，它们包括内切木聚糖酶、乙酰基-木聚糖酯酶、α-D-葡糖醛酸糖苷酶、α-L-阿拉伯呋喃糖苷酶、阿魏酸酯酶和β-木糖苷酶。此外，这些酶参与半乳葡甘露聚糖的水解，它们包括内切甘露聚糖酶、乙酰基-甘露聚糖酯酶、a-半乳糖苷酶、β-葡糖苷酶、β-甘露糖苷酶。另外，参与水解阿拉伯半乳聚糖的酶包括β-半乳糖苷酶和内切a-L-阿拉伯聚糖酶(Endo-a-L-arabinanase)。这些酶可以按以下EC编号找到，如EC3.2.1.8、EC3.2.1.37、EC3.2.1.55、EC3.2.1.99、EC3.2.1.139、EC3.2.1.78、EC3.2.1.25、EC3.2.1.22、EC3.2.1.21、EC3.2.1.89、EC3.1.1.72、EC3.1.1.6、EC3.1.1.73。
“半纤维素”指木质纤维素材料中存在的一组复杂碳水化合物，其中与其他碳水化合物(例如，果胶)一起，围绕植物细胞的纤维素纤维。半纤维素的组成取决于植物类型。最常见类型的半纤维素包括木聚糖、葡萄糖醛酸木聚糖、葡糖甘露聚糖、半乳葡甘露聚糖、阿糖基木聚糖、木葡聚糖和阿拉伯半乳聚糖。
微生物培养基中补充的养分指使微生物生长和/或脂质产生或促进生长和脂质产生成为可能的化合物和组分。这些一般包括各种碳源、氮源和磷源、无机盐和微量元素。培养基可以补充有天然部分或人造部分，它们含有糖、优选地具有含有己糖、戊糖或者这两种糖之一或二者的碳水化合物聚合物，或级分，其含有纤维素、淀粉、非淀粉多糖、壳多糖，或木质纤维素。在培养基中补充养分不是绝对必需的，但是在某些情况下可以是建议性的。
适合于产生脂质的培养条件指这样的条件，在所述条件下脂质的形成和/或积累与培养基组成、培养条件、外部因子或二者相对应地发生。
适合于生产酶的培养条件指这样的条件，在所述条件下酶的形成和积累与培养基组成、培养条件、外部因子或二者相对应地发生。
在本发明的一个实施方案中，通过添加酶诱导物至微生物培养物中启动和/或维持酶生产。总体上，这种导致产生的酶量增加。尤其在连续培养下，重要的是维持诱导物的量处于维持胞外酶产生的足够水平。
如本文所述的酶可以是诱导型或组成型的。
酶诱导(酶的诱导性)指因存在诱导因子，酶从头合成增加。
根据本发明的一个优选实施方案，能够使用胞外聚合物化合物或低聚物化合物(如糖)作为其营养(如碳源和/或能量源)的微生物在包含具有这些化合物的聚合物生物质的培养介质上培育。允许微生物产生脂质和酶。
“培养介质”在本文中指用于培育微生物的介质。培养介质在本文中例如包含聚合物生物质，其至少部分地含有聚合物化合物或低聚物化合物，如聚合物糖。培养介质可以补充有矿物质、小分子养分、大分子养分和缓冲剂。
在本发明的一些实施方案中，优选的原料是聚合物生物质，其包含木质纤维素、纤维素、半纤维素或木质素、或木质纤维素淀粉的其他组分(本身或其组合)，或以化学或物理方式或以其组合方式处理过以便改善酶对糖聚合物可及性的生物质。聚合物生物质也包含一般存在于单细胞生物中的组分。
预处理的生物质例如是包含己糖和/或戊糖或其衍生物的生物质。这些生物质可以在酶处理之前或之后由化学、物理、热机械或生物手段或由其任意组合处理并且随后用于单细胞油生产。
“聚合物生物质”指天然有机物质或由不同化学方法或物理方法或由其组合处理过的有机物质。聚合物生物质在本文中例如意指作为生物技术过程中如单细胞油过程中的原料使用的生物质。聚合物生物质也可以是工业产品或工业过程的侧流，如含有半纤维素或纤维素的级分、淀粉、含有淀粉的生物质、非淀粉多糖、壳多糖、聚半乳糖醛酸、果胶、蛋白质、微生物或微生物残余物。
在本发明的一个实施方案中，生物质是微生物，如酵母、细菌、霉菌或藻类或其组分或包含这些微生物的工业过程的侧流。
更具体地，在本发明中，已经发现单细胞油生产过程可以涉及酶(例如水解酶)的产生或增强的产生。
在本发明的一个实施方案中，聚合物生物质由所述过程中获得的酶处理，并且产物包括诱导或维持酶产生的单体糖、二聚糖、低聚糖和/或未降解组分。
“木质纤维素材料”或“木质纤维素生物质”指由纤维素、半纤维素和/或木质素或其任何部分组成的生物质。木质纤维素材料包括但不限于木本植物或非木本、草本植物或含有纤维素和/或半纤维素的其他材料：材料可以是农业残留物(如麦秆、稻糠、碎干草、麸、玉米秸秆、甘蔗渣)、专用能源作物(如柳枝稷、芒草(Miscanthus)、草芦、柳、水葫芦)、木质材料或残余物(包括锯木厂和纸浆和/或造纸厂残余物或部分，如半纤维素、耗尽的纸浆废液、废弃纤维和/或初沉污泥)、苔藓或泥炭、微生物或城镇废纸。另外，可以使用低木质素材料，如巨藻或微藻生物质之类的材料。此外，材料也可以是来自工业活动的半纤维素级分或纤维素级分。本发明可以利用任何种类的纤维素级分。来自不同来源、植物物种或工业过程的原料或原料的某些级分(如半纤维素和/或纤维素)可以混合在一起并且用作本发明生物加工过程的原料。
“糖化”指聚合物糖水解成糖低聚物和单体。一般通过使用能够水解聚合物糖的酶实现糖化。
“碳水化合物”代表并入醛、酸或酮基团和除这些之外几个羟基的有机分子。因此，烃的范围包括由术语如单糖、低聚糖、糖、纤维素、半纤维素、淀粉和非淀粉烃描述的化合物。
“纤维素”是长链多糖，具有由β-1-4葡萄糖键产生的聚合物组成的一级结构。
“淀粉”是长链多糖，主要由a-1-4和a-1-6葡萄糖单位组成。
单糖是碳水化合物的单体单位，(C-H2O)n，一般由3-9个碳原子组成并且在一个或多个碳原子中具有立体化学不一致性。这些由具有6个碳原子的己糖如葡萄糖、半乳糖、甘露糖、果糖和具有5个碳原子的戊糖如木糖、核糖和阿拉伯糖代表。
纤维素在自然界中一般不溶于水中。纤维素酶包括葡聚糖内切酶、葡聚糖外切酶和β-葡糖苷酶。例如主要作用于纤维素非晶态部分的葡聚糖内切酶(EC3.2.1.4)随机攻击纤维素大分子的内部键。外切葡聚糖酶或纤维二糖水解酶(EC3.2.1.91)攻击纤维素链的末端，一次主要地水解一个纤维二糖单元。葡聚糖外切酶也能够水解晶态纤维素聚合物。最后，纤维二糖至葡萄糖单体的水解由β-葡糖苷酶(EC3.2.1.21)完成。
能够水解半纤维素的酶是例如木聚糖内切酶、阿拉伯糖内切酶和甘露聚糖内切酶。在半纤维素内切酶作用后攻击低聚物的半纤维素酶是例如β-木糖苷酶、β-阿拉伯糖苷酶、β-甘露糖苷酶和β-葡糖苷酶。低聚物中的残余侧键可以由分解酶如a-葡糖醛酸糖苷酶、a-阿拉伯糖苷酶和a-D-半乳糖苷酶。乙酰基成分可以由酯酶移除。
另外，木质素的酶促水解需要氧化酶如木质素过氧化物酶(LiPEC1.11.1.14)、锰过氧化物酶(MnPEC1.11.1.13)和漆酶(EC1.10.3.2)的活性。木质素的化学结构及其与纤维素和半纤维素的附接比木质素的量更重要。
侧流或侧流级分代表从细胞生产、酶生产、单细胞油生产、细胞回收或油提取、胞内酶回收中释放的任何水溶液或上清液以及破损程度各异的细胞和完整细胞(即残余细胞物质或细胞悬液或细胞物质)的脂质提取后混合物。
如本文所述的单细胞油生产过程可以是连续、分批或补料分批过程或旨在生产单细胞油的任何其他过程组合体。
单细胞油生产过程可以也在其中自由水的量少或其中在固态或半固态表面上进行生产的反应器中实施。不溶解于水中的细胞物质或其他生物质可以用水溶液提取，以使得酶变成可溶性形式。
所述酶可以从微生物培养物、上清液和微生物细胞通过任何已知且合适的方法或通过未来开发的任何合适方法回收。这同样也适用于可以将酶分离成具有所需酶活性的级分的方法。
回收包含催化活性酶的微生物培养物或上清液或蛋白质富集级分的方法基于它们的分子大小、离子行为、在水中的溶解度、在不同溶质中的溶解度或在含有缓冲因子或表面活性因子或表面活性化合物或盐的混合物溶质中的溶解度。
能够进行脂质生产的微生物在本说明书中指能够产生脂质的微生物，如细菌、古细菌、藻类或真菌，一般为丝状真菌或酵母。
“含油微生物(oleaginousmicroorganism)”在本文中一般指在适宜或最佳培养条件培养时将它们至少15％(w/w)的生物质积累为脂质的微生物。
“能够产生脂质和酶两者的微生物”一般是真菌，尤其是丝状真菌(霉菌)或酵母、微藻或细菌。产生脂质的霉菌、双态性霉菌和丝状真菌例如包括以下属中的那些：犁头霉属(Absidia)、曲霉属(Aspergillus)、布拉霉属(Blakeslea)、毛壳霉属(Chaetomium)、分枝孢子菌属(Cladosporium)、麦角菌属(Claviceps)、枝孢霉属(Clodosporidium)、小克银汉霉属(Cunninghamella)、翘孢霉属(Emericella)、虫霉属(Entomophthora)、镰刀菌属(Fusarium)、赤霉属(Gibberella)、球囊霉属(Glomus)、腐质霉属(Humicola)、毛霉属(Mucor)、被孢霉属(Mortierella)、拟青霉属(Paecilomyces)、青霉属(Penicillium)、柄锈菌属(Puccinia)、腐霉属(Pythium)、根霉属(Rhizopus)、水属属(Saprolegnia)、木霉属(Trichoderma)、黑粉菌属(Ustilago)和接合霉属(Zygorhynchus)、如以下霉菌：刺柄犁头霉(Absidiaspinosa)、曲霉属霉菌，例如费氏曲霉(A.ficheri)、黄曲霉(A.flavus)、构巢曲霉(A.nidulans)、黑曲霉(A.niger)、赭曲霉(A.ochraceus)、米曲霉(A.oryzae)、酱油曲霉(A.sojae)和土曲霉(A.terreus)、三孢布拉霉(Blakesleatrispora)、球毛壳霉(Chaetomiumglobosum)、多主枝孢霉(Cladosporidiumherbarum)、麦角菌(Clavicepspurpurea)、小克银汉霉属霉菌，例如刺孢小克银汉霉(C.echinulata)、C.japonica和雅致小克银汉霉(C.elegans)、花冠虫霉(Entomophthoracoronata)、百合镰刀菌(Fusariumbulbigenum)、禾谷镰刀菌(Fusariumgraminearum)、镰刀菌属物种(Fusariumsp.)、藤仓赤霉(Gibberellafujikuroi)、Glomuscaledonius、柔毛腐质霉(Humicolalanuginosa)、灰腐质霉(Humicolagrisea)、毛霉属属霉菌，例如卷枝毛霉(M.circinelloides)、密丛毛霉(M.plumbeus)和鲁氏毛霉(M.rouxii)、被孢霉属霉菌，例如深黄被孢霉(M.isabellina)、高山被孢霉(M.alpina)和拉曼被孢霉(M.ramanniana)、青霉属霉菌，例如爪哇青霉(P.javanicum)、淡紫青霉(P.lilacinum)、小刺青霉(P.spinulosum)和P.soppii、淡紫拟青霉(Paecilomyceslilacinus)、禾冠柄锈菌(Pucciacoronata)、终极腐霉(Pythiumultimum)、畸雌腐霉(Pythiumirregulare)、少根根霉(Rhizopusarrhizus)、德氏根霉(Rhizopusdelemar)、米根霉(Rhizopusoryzae)、玉蜀黍黑粉菌(Ustilagozeae)、玉米黑粉菌(Ustilagomaydis)、莫勒接合霉(Zygorhynchusmoelleri)，以及Malbrancheapulchella、漆斑菌属物种(Myrotheciumsp.)、甘薯小核菌(Sclerotiumbataticola)、Pelliculariapracticola、黍轴黑粉菌(Sphacelotheareiliana)、Tyloposporidiumehrenbergii、美洲绵霉(Achylaamericana)、紫丁香蘑(Lepistanuda)、小麦矮腥黑穗病菌(Tilletiacontroversa)、松梭形柱锈菌(Cronartiumfusiform)。
本发明中有益的是使用来自接合菌门(Zycomycota)或子囊菌门(Ascomycota)的霉菌。特别有益的是使用来自曲霉属、根霉属、毛霉属或被孢霉属的霉菌。
在本发明的另一个实施方案中，可以使用来自以下属的细菌，但不限于此，如链霉菌属(Streptomyces)、放线菌属(Actinomyces)、节杆菌属(Arthrobacter)、诺卡菌属(Nocardia)、红球菌属(Rhodococcus)或芽孢杆菌属(Bacillus)。
此外，在本发明的另一个实施方案中，可以使用来自以下属的酵母，但不限于此：隐球酵母属(Cryptococcus)、丝孢酵母属(Trichosporon)、Apiotrichum、汉逊酵母属(Hansenula)、油脂酵母属(Lipomyces)、红冬孢酵母属(Rhodosporidium)、假丝酵母属(Candida)、耶罗维亚酵母属(Yarrowia)、红酵母属(Rhodotorula)、掷孢酵母属(Sporobolomyces)、锁掷酵母属(Sporidiobolus)、丝孢酵母属(Trichosporon)、球拟酵母属(Torulopsis)、Waltomyces、Endomyces、耐碱酵母属(Galactomyces)、毕赤酵母属(Pichia)或隐球酵母属(Cryptococcus)，如浅白隐球酵母(Cryptococcusalbidus)、土生隐球酵母(C.terricolus)、皮状丝孢酵母(Trichosproroncutaneum)、斯达氏油脂酵母(Lipomycesstarkeyi)、产油油脂酵母(L.lipofera)、圆红冬孢酵母(Rhodosporidiumtoruloides)、弯假丝酵母(Candidacurvata)、解脂耶罗维亚酵母(Yarrowialipolytica)、粘红酵母(Rhodotorulaglutinis)、假丝酵母属物种107(Candidasp.107)、油脂酵母属物种33(Lipomycessp.33)、瘦弱红酵母(Rhodotorulagracilis)、茁芽丝孢酵母(Trichosporonpullulans)或发酵性丝孢酵母(T.fermentans)。
优选的微生物属于真菌，更优选地属于选自曲霉属、木霉属、根霉属和腐质霉属或来自隐球酵母属的属。最优选地，微生物属于曲霉属。
经基因修饰以能够利用半纤维素中聚合物糖的含油微生物也是本发明的部分。另外，本发明中也包括能够利用纤维素或半纤维素中聚合物糖的经基因修饰以改善脂质产生的生物。
在本发明的一个实施方案中，将酶制备物导入使用不能够产生水解酶的微生物的生物技术过程中。在另一个实施方案中，所述过程中使用的生物质用酶制备物预处理，所述酶制备物优选地是包含有催化活性的水解酶的上清液或蛋白质级分。该生物技术过程一般使用微生物，如酵母、细菌、藻类、古细菌、丝状真菌(霉菌)或其组分。
在取出生物活性蛋白后，将发酵液导入另一个生物技术过程中，或再循环返回相同的过程，或可以将它释放至环境或引至废水处理过程。发酵液可以原样使用或在使用之前或在前释放至环境之中以微生物学、化学和/或物理方式处理。
根据本发明的一个优选实施方案，使工艺水、残余生物质和酶在过程内部以如此方式再循环，从而残余生物质用回收的酶预处理，并且将所得到的生物质和工艺水导入相同或后续的单细胞油生产过程。
如本文所述，将本发明过程产生的基本上无蛋白质的水导入其他过程或应用中或引至环境。在其他应用之前，可以移除或减少水中的其他组分，如有机质、无机盐或基于非蛋白质的组分。
在本发明的一个实施方案中，聚合物生物质或聚合物糖用如本文所述那样回收的酶以如此方式处理，从而生物质的酶降解产物包含可发酵糖并且优选地还包含低聚碳水化合物，当导入新发酵过程时，所述碳水化合物引起并维持胞外酶产生。
本发明中回收的酶级分或酶可以用来将木质纤维素水解成亚级分，如纤维素级分、半纤维素级分或木质素级分。
在本发明的一个优选实施方案中，本发明中回收脂质、蛋白质、尤其水解酶。
在一个方面，本发明也提供通过根据本发明多种实施方案的过程所获得的酶制备物。按照每体积和/或每干燥总蛋白的酶活性所计算，酶制备物一般包含微生物培养物的水相中或上清液中的蛋白质部分并且被富集至少1倍(1x)、优选地至少2倍(2x)、更优选地至少3倍(3x)。
在本发明的一些实施方案中，按照每体积和/或每总蛋白的酶活性所计算，酶制备物可以从微生物培养物的水相或从上清液中富集至少5倍，在一些实施方案中富集至少10x、或20x或30x、或40x、或50x、或60x、或70x、或80x、或90x、或100x。
在一个方面，本发明也提供根据本发明多种实施方案产生的酶或酶制备物的应用，用于另一个工业过程中或相同或另一个单细胞油生产过程中或用于处理所述过程中用作原料的聚合物生物质。
在一个方面，本发明也提供根据本发明多种实施方案产生的脂质的应用，用作生物燃料、用作生物燃料组分或用作生物燃料生产的原料。
根据本发明的一个优选实施方案，使用如本文所述那样产生的脂质作为生物柴油或可再生柴油、汽油或喷气式发动机燃料。
从脂质生产生物燃料
“生物燃料”指主要源自生物质或生物废弃物的固态、液态或气态燃料并且与源自史前植物和动物的有机残留物的化石燃料不同。
根据EU法令2003/30/EU，“生物柴油”指从植物油或动物油中产生的甲基酯，其具有用作生物燃料的柴油品质。最广泛地，生物柴油指来自植物油或动物油的具有柴油品质的长链烷基酯，如甲基酯、乙基酯或丙基酯。生物柴油也可以从微生物脂质产生，因而微生物脂质可以源自细菌、真菌(酵母或霉菌)、藻类或另一种微生物。
“可再生柴油”指通过氢处理动物源、植物源或微生物源脂质或其混合物产生的燃料，因而微生物脂质可以源自细菌、真菌(酵母或霉菌)、藻类或另一种微生物。可再生柴油也可以通过气化和Fischer-Tropsch合成从源自生物质的蜡产生。任选地，除氢处理之外，可以进行异构化或其他加工步骤。可再生柴油工艺也可以用来产生喷气式发动机燃料和/或汽油。可再生柴油的生产已经在专利出版物EP1396531、EP1398364、EP1741767和EP1741768中描述。
生物柴油或可再生柴油可以与化石燃料掺合。可以将合适的添加剂如防腐剂和抗氧化剂添加至燃料产品。
“润滑剂”指当作为表面涂层施加至运动部件时减少摩擦的物质，如润滑脂、脂质或油。润滑剂的其他两种主要功能是散热和溶解杂质。润滑剂的应用包括但不限于作为发动机油用于内燃发动机中、燃料中的添加剂、用于油驱动装置如泵和液压设备，或用于不同类型的轴承中。一般，润滑剂含有75-100％基础油并且其余是添加剂。合适的添加剂是例如洗涤剂、储存稳定剂、抗氧化剂、腐蚀抑制剂、去雾剂、破乳剂、消泡剂、共溶剂和润滑性添加剂(见例如US7,691,792)。润滑剂的基础油可以源自矿物油、植物油、动物油或来自细菌、真菌(酵母或霉菌)、藻类或另一种微生物。基础油也可以通过气化和Fischer-Tropsch合成源自从生物质衍生的蜡。粘度指数用来表征基础油。一般高粘度指数是优选的。
根据本发明中所述方法产生的脂质可以用作产生生物柴油、可再生柴油、喷气式发动机燃料或汽油的原料。生物柴油由脂肪酸甲酯组成并且一般通过酯交换产生。在酯交换时，酰基甘油转化成长链脂肪酸烷基(甲基、乙基或丙基)酯。可再生柴油指通过脂质的氢处理(加氢脱氧、氢化或氢化加工)生产的燃料。在氢处理时，酰基甘油转化成相应的烷烃(石蜡)。烷烃(石蜡)可以通过异构化或通过其他工艺变体进一步修饰。可再生柴油工艺也可以用来产生喷气式发动机燃料和/或汽油。此外，可以进行脂质的裂化以产生生物燃料。另外，脂质可以在某些应用中直接用作生物燃料。
采用所述方法产生的脂质可以用作润滑剂(润滑油)的基础油或用作生产润滑剂基础油的原料。
术语“酰基甘油”指甘油和脂肪酸的酯。酰基甘油天然地作为脂肪和脂肪油存在。酰基甘油的例子包括三酰甘油(TAG，甘油三酯)、二酰甘油(二脂酰甘油酯)和单酰甘油(单酸甘油酯)。
油的回收
可以通过任何已知的方法，如使用过滤或滗析技术从培养基中分离含有脂质的微生物。可选地，用大体积容量工业规模商用离心机离心可以用来分离所需的产物。
在本发明的多种实施方案中，可以使用本领域已知或未来开发的任何方法方法，从细胞生物质或培养液回收油或油的前体。这类方法，包括但不限于用有机溶剂提取。在本发明的多种实施方案中，可以破坏微生物细胞以促进油与其他组分的分离。可以使用已知用于细胞破碎的任何方法，如超声波、渗透休克、机械剪切力、冷榨、热休克、酶催化或自我定向自溶。
提取过油的细胞残余物可以用于能量生产，例如燃烧或用无氧消化过程处理，或用作动物饲料。也可以使提取过油的细胞残余物或细胞残余物级分再循环返回至生物加工过程，以便用作养分源。
除回收脂质和酶之外，从单细胞油过程侧流回收其他经济上可利用的组分或多种组分也属于本发明的范围。
图1中提出本发明的一个实施方案。
可以将聚合物生物质按机械、热力学、化学方式或通过这些方法的组合预处理。
将被处理的材料引至酶处理。酶至少部分源自多种级分，其一般来自单细胞油生产过程的工艺水。酶处理之后任选地是物理处理或化学处理或其组合。这些处理和酶促处理可以重复一次或多次。
将被处理的生物质导入允许微生物产生脂质的单细胞油生产过程中。
将细胞和固相与液相(上清液)分离。通过使用维持大量酶活性的方法从液相回收大分子组分。可以将有酶活性的组分导入以处理单细胞油生产过程中所用的生物质或可以将它们导入单细胞油生产过程。任选地，酶制备物可以由酶活性的组分制备，并且将如此获得的酶制备物出售或用于其他过程中。将释放的水任选地导入单细胞油过程中或用于其他应用，或者可以将它从系统中释放出去。
处理从单细胞油生产过程释放的固体物质级分以分离并且回收所需的组分，尤其脂质，在一些实施方案中也是酶。
总之，在下文借助以下编号的条目1-22描述本发明的多种实施方案：
条目
1.一种用于生产酶的方法，其包括
-在单细胞油生产过程中在适于单细胞油产生和酶产生的条件下培育能够产生单细胞油和酶两者的微生物，并且通过所述微生物产生单细胞油和酶；
-获得包含单细胞油和酶的微生物培养物，并且回收至少部分的(i)所述微生物培养物、(ii)从所述微生物培养物分离的上清液和/或微生物细胞，(iii)从上清液富集的蛋白质级分、和/或(iv)来自细胞的蛋白质级分，作为酶制备物或作为酶的来源使用，以及
-从微生物细胞回收单细胞油。
2.根据条目1的方法，其中所述酶是细胞外的并且从上清液可回收。
3.根据条目1或2的方法，其中培养基是固态或半固态的并且将酶在回收之前导入水相。
4.根据条目1至3中任一项的方法，其中所述微生物培养物或其部分或所述上清液或其部分在所述方法中再循环。
5.根据条目1至4中任一项的方法，其中从所述方法释放的工艺水包含比无酶回收情况下单细胞油过程低至少5％、优选地至少10％的蛋白质。
6.根据条目1至5中任一项的方法，其中与无酶回收情况下单细胞油过程的工艺水的生物需氧量相比，从所述方法释放的工艺水包含低至少5％、优选地至少10％的生物需氧量。
7.根据条目1至6中任一项的方法，其中浓缩所述微生物培养物或所述上清液的水相。
8.根据条目1的方法，其中所述酶是胞内的并且从所述微生物细胞可获得。
9.根据条目8的方法，其中酶回收后的细胞残余物包含比不从细胞回收酶的情况下单细胞油过程的细胞残余物低至少1％、优选地至少10％的蛋白质。
10.根据条目1-9中任一项的方法，其中通过添加酶诱导物至微生物培养物中启动和/或维持所述酶产生或所述酶产生以组成型方式发生。
11.根据条目1-10中任一项的方法，其中酶产生和单细胞油产生同时或以任何顺序依次地发生。
12.根据条目1-11中任一项的方法，其中微生物在包含聚合物生物质如木质纤维素或其部分作为碳源的培养基上培育。
13.根据条目1-12中任一项的方法，其中酶包括水解酶、氧化还原酶、裂解酶、异构酶、转移酶或连接酶或其任何混合物。
14.根据条目1-13中任一项的方法，其中酶水解糖苷键。
15.根据条目1-14中任一项的方法，其中所述微生物是真菌或酵母，所述真菌优选地属于选自曲霉属、木霉属、根霉属和腐质霉属，或所述酵母属于隐球酵母属，所述真菌更优选地是曲霉属。
16.一种酶制备物，通过根据条目1至15中任一项的方法获得。
17.根据条目16的酶制备物，其中将所述微生物培养物的水相中或所述上清液中的蛋白质级分富集并任选地纯化、稳定、干燥和/或配制。
18.根据条目1-15中任一项所述的方法产生的酶或根据条目16或17的酶制备物在相同或另一个工业过程中的应用。
19.根据条目1-15中任一项所述的方法产生的脂质或根据条目16或17所述的酶制备物的应用，用作生物燃料、用作生物燃料组分或用作生物燃料生产的原料。
20.根据条目19的应用，其中生物燃料是生物柴油或可再生柴油、汽油和/或喷气式发动机燃料。
以下实施例的目的是说明本发明，并且不应当以任何方式将它们解释为限制本发明。
实施例
以纯纤维素和木聚糖作为底物，通过水解试验确定来自培养产脂肪丝状真菌的使用过的培养液中的酶活性。
方法
糖确定(Sugardefinition)：
为了确定溶液的糖浓度，将该溶液制成合适稀释物，所述稀释物在HPLC分析之前经0.2μm过滤。
糖确定中所用的柱是铅形式(固定相)的ShodexSugarSP0810离子交换物。柱尺寸是8.0mm(ID)x300mm。洗脱剂是水(流速0.6ml/分钟)并且柱温是60℃。检测器是RIShimatzuRID10A，泵是A6，自动采样器是ShimatzuSIL20A。用Class-VP软件实施结果的处理。
脂肪酸分析：
如Suutari等人,(1990)中所述的方法那样确定样品的脂肪酸组成。样品中的脂质首先水解成游离脂肪酸，所述游离脂肪酸皂化成其钠盐并随后甲基化成甲酯。以气体色谱方式分析脂肪酸甲酯。
蛋白质浓度分析：
在培养液经Whatman3滤纸过滤后，分析培养液的蛋白质浓度。根据Bio-Rad蛋白质测定法(基于Bradford法)分析蛋白质浓度。
水解试验：
在水解试验之前，使用过的培养液经Whatman3滤纸过滤。
木聚糖酶活性如下测定。使用100ml锥形瓶作为反应容器。将其填充磷酸盐缓冲液(0.02M，pH5)中的20ml1％桦木木聚糖(Sigma)溶液作为底物、10ml过滤的培养液和20ml磷酸盐缓冲液(0.02M，pH5)。水解反应在50℃在搅拌的(140转/分钟)水浴中进行。在添加培养液后立即和在1、3、5、21/23小时后，从反应容器取出1ml样品。通过添加50μl1.33M硫酸降低pH，终止1ml样品中的水解反应。处理样品，以移除盐和聚合物糖，以便适于HPLC-分析。以甘露醇作为标准物，通过HPLC(见糖确定)分析释放的糖。
以1gWhatman滤纸作为纤维素底物替代木聚糖，确定纤维素酶活性。反应体积是50ml，其含有等尺寸圆圈(直径约5mm)的1gWhatman滤纸作为底物、10ml过滤的培养液和40ml磷酸盐缓冲液(0.02M，pH5)。如同采用木聚糖那样进行实验。
微生物菌株：
产生脂质的微生物通常是公众从多个认可的微生物培养物(菌株)保藏中心如ATCC、DSM等可获得的。在以下实施例中通过使用如下微生物菌株讨论本发明的多种实施方案。米曲霉DSM1861、米曲霉DSM1864和土曲霉DSM1958。
实施例1
本实施例显示在采用基于半纤维素的材料作为产生脂质的碳源培养米曲霉期间培养液中形成的酶活性。
在具有用加压热水提取法提取作为碳源的纯化桦木聚糖(Sigma)和云杉和桦半纤维素的瓶培养物中培育米曲霉。在含有50ml培养基的250ml锥形瓶中进行培养。生长培养基体含有每升水1g(NH4)2SO4、1gMgSO4·7H2O、0.5gK2HPO4、1gKH2PO4和0.2gCaCl2·2H2O并且补充有碳源、酵母提取物和任选地支撑材料。培养基用1％(v/v)真菌孢子悬液接种并且将培养物在28℃温度孵育。
在纯化的木聚糖情况下，培养基基体补充有每升40g纯化的桦木聚糖(Sigma)和1g酵母提取物。将两份培养物在回转摇床(160转/分钟)中孵育6日。
在云杉和桦半纤维素的情况下，培养基基体补充有每升通过热水提取法产生的44g干燥云杉或桦半纤维素、0.5g酵母提取物和为真菌菌丝体产生机械支撑的2g纤维素。将三份培养物在回转摇床(180转/分钟)中孵育7日。
在孵育后，培养液经Whatman3滤纸过滤。从滤液测定蛋白质浓度和酶活性。截留物质用蒸馏水洗涤并干燥。从干燥的样品测定生物质浓度和脂质含量。
在纯化的桦木聚糖上培养6日后，米曲霉真菌产生16g/l生物质(干重)并且所述生物质含有10.5％脂质/干重。在水提取的桦半纤维素上培育的米曲霉在7日孵育期间产生14g/l干生物质。含有真菌菌丝体、残余半纤维素和纤维素的生物质含有等同于每升培养基1.26脂质的8.9％脂质/干重。对于脂质产生，桦木聚糖和半纤维素均好于云杉半纤维素，因为在云杉半纤维素上，产生含有3.7％脂质/干重的8.7g/l干生物质。
培养液的蛋白质浓度对于云杉半纤维素培养和桦半纤维素培养是0.06mg/ml和0.02mg/ml，并且对于桦木聚糖培养是0.05mg/ml。
图2和图3中提供从水解试验期中，随时间变化而变化的反应中每毫升培养液和每毫克蛋白质释放的木糖。图2显示每体积培养液在水解试验中所释放的木糖。作为底物，使用200mg桦木木聚糖。图3显示每蛋白质在水解试验中所释放的木糖。作为底物，使用200mg桦木木聚糖。
1毫升来自云杉半纤维素培养的培养液在21小时内释放1.2mg木糖和20.1mg/mg蛋白质。1毫升来自桦半纤维素培养的培养液在21小时内释放5.2mg木糖和234.6mg/mg蛋白质。1毫升来自桦木聚糖培养的培养液在23小时内释放5.0mg木糖和101.4mg/mg蛋白质。
来自具有半纤维素或木聚糖碳源的米曲霉培养的培养液显示显著的木聚糖酶活性。培养液不具有可检测的纤维素酶活性，因为没有在纤维素水解试验检测到游离葡萄糖。
实施例2
本实施例显示在采用基于纤维素的材料作为产生脂质的碳源培养米曲霉期间培养液中形成的酶活性。
在基于纤维素的不同木质纤维素材料上培养米曲霉用于脂质生产。生长培养基基体每升水含有40g木质纤维素材料作为碳源、0.5g酵母提取物、1gMgSO4·7H2O、0.5gK2HPO4、1gKH2PO4和0.2gCaCl2·2H2O并且补充有氮源和痕量金属。
将实验1-4作为瓶培养物进行。在实验1-3中，培养基基体补充有每升3gNaNO3和0.02gFeSO4·7H2O，并且在实验4中，培养基基体补充有每升1g1g(NH4)2SO4。在含有50-100ml培养基的250ml锥形瓶中进行平行培养。培养基用1％(v/v)米曲霉孢子悬液接种。将培养物在28℃温度于回转摇床(160转/分钟)中孵育6日。
将实验5-6作为生物反应器发酵进行。
在实验5中，生长培养基基体补充有每升1.46g蛋白胨、0.00015gZnSO4·7H2O、0.0001gCuCl·2H2O和0.00625gMnCl2·4H2O。碳源是添加至培养物以形成50g/l终浓度的纤维素。培养介质用50ml48小时预培养的米曲霉悬液接种。发酵以1L培养基体积在28℃温度进行，伴以0.8l/分钟通气和350-450转/分钟搅拌。培养物pH是5.7并且在培养期间用3MNaOH调节。在188小时孵育后测定酶活性。
在实验6中，培养基基体补充有每升生长培养基基体6.5g蛋白胨、0.00015gZnSO4·7H2O、0.0001gCuCl·2H2O和0.00625gMnCl2·4H2O。碳源是添加至培养物以形成55g/l终浓度的纤维素。为接种，通过向两个正在形成孢子的米曲霉PDA平皿培养物施加总计24ml无菌水制备孢子悬液。用散布器悬浮孢子并且用悬液接种1L培养基。发酵在温度28℃进行，伴以0.6l/分钟通气和350-450转/分钟搅拌。培养物pH是5.7并且在培养期间用3MNaOH调节。在233小时孵育后测定酶活性。
如上文所述，分离培养液并测定蛋白质浓度及木聚糖酶和纤维素酶活性。
表1.氮源和碳源、培养物体积以及测定的蛋白质浓度和测定的酶活性.
1纤维原料:再循环的纤维
2桦硫酸盐桨，漂白，半纤维素大约10％
3培养液由超滤(在来自Millipore的AmiconUltra8200搅拌式超滤室中10000Da滤器)浓缩3倍
在实验6中，测量脂质含量为4％。
图4-7中提供水解试验期间随时间变化而变化释放的糖，单位毫克/毫升培养液和毫克/毫克蛋白质。图4显示每体积培养液在水解试验中所释放的木糖。作为底物，使用200mg桦木木聚糖。图5显示每蛋白质在水解试验中所释放的木糖。作为底物，使用200mg桦木木聚糖。图6示每体积培养液在水解试验中所释放的葡萄糖。作为底物，使用1g纤维素。图7显示每蛋白质在水解试验中所释放的葡萄糖。作为底物，使用1g纤维素。
来自培养的所测试的全部6份培养液显示显著的木聚糖酶活性。6份培养液中仅2份显示纤维素酶活性迹象，表民在特定条件下产生这些酶的微弱能力。
本实施例显示米曲霉可以向培养液产生木质素纤维素分解酶。该实施例显示米曲霉具有木聚糖和纤维素降解活性。
实施例3
本实施例显示在采用基于半纤维素的材料作为产生脂质的碳源培养土曲霉期间培养液中形成的酶活性。
在作为碳底物的麦秆半纤维素上以2升容积在生物反应器中培育土曲霉用于脂质生产。培养基由50ml无氨基酸和硫酸铵的酵母氮源基础(Difco)10x母液组成，所述母液悬浮于2L水中并每升补充有：1.0g酵母提取物、1g(NH4)2SO4、1gMgSO4·7H2O、0.5gK2HPO4、1gKH2PO4、0.2gCaCl2·2H2O和2g纤维素。培养基用150ml24小时预培养的土曲霉培养物接种。发酵在温度35℃进行，伴以3.0l/分钟通气和200-430转/分钟搅拌。培养物pH是5.7并且在培养期间用3MNaOH调节。在培养期间，将半纤维素溶液供给至发酵罐。在165小时孵育后测定酶活性。
分离培养液，并通过在Amicon搅拌式超滤室中用10000Da滤器(Millipore)超滤，部分地浓缩它。如上文，测定蛋白质和脂质浓度及木聚糖酶和纤维素酶活性。
在含有真菌菌丝体、残余半纤维素和纤维素的生物质中，脂质含量是15％每干重。蛋白质浓度在未浓缩培养液中是0.72mg/ml，而在浓缩的培养液中是2.15mg/ml。
图8至图11中提供水解试验期间随时间变化而变化释放的糖，单位毫克/毫升培养液和毫克/毫克蛋白质。
图8显示每体积培养液在水解试验中所释放的木糖。作为底物，使用200mg桦木木聚糖。图9显示每蛋白质在水解试验中所释放的木糖。作为底物，使用200mg桦木木聚糖。图10示每体积培养液在水解试验中所释放的葡萄糖。作为底物，使用1g纤维素。一些木糖从半纤维素释放，所述半纤维素源自所用的培养液。图11显示每蛋白质在水解试验中所释放的葡萄糖。作为底物，使用1g纤维素。一些木糖从半纤维素释放，所述半纤维素源自所用的培养液。
本实施例表明土曲霉可以向培养液产生胞内脂质和胞外水解酶。该实施例显示土曲霉产生同时具有木聚糖降解活性及纤维素降解活性的酶并将它们分泌至生长培养基。可以将这些酶分离、浓缩并且用于水解木质纤维素材料。
实施例4
本实施例显示在采用基于半纤维素的材料作为产生脂质的碳源培养米曲霉期间培养液中形成的酶活性。
在作为碳底物的麦秆半纤维素上以2升容积在生物反应器中培育米曲霉用于脂质生产。培养基由50ml无氨基酸和硫酸铵的酵母氮源基础(Difco)10x母液组成，所述母液悬浮于2L水中并每升补充有：1.0g酵母提取物、1g(NH4)2SO4、1gMgSO4·7H2O、0.5gK2HPO4、1gKH2PO4和0.2gCaCl2·2H2O。
培养基用200ml72小时预培养的米曲霉培养物接种。发酵以2L培养基体积在在30℃温度进行，伴以3.0l/分钟通气和200-410转/分钟搅拌。培养物pH是5.7并且在培养期间用3MNaOH调节。在培养期间，将半纤维素溶液供给至发酵罐。在144小时孵育后测定酶活性。
如上文所述，分离培养液并测定蛋白质浓度及木聚糖酶和纤维素酶活性。在含有真菌菌丝体和残余半纤维素的生物质中，脂质含量是21％每干重。蛋白质浓度在未浓缩培养液中是0.61mg/ml，而在浓缩的培养液中是1.65mg/ml。
图12至图15中提供水解试验期间随时间变化而变化释放的糖，单位毫克/毫升培养液和毫克/毫克蛋白质。图12显示每体积培养液在水解试验中所释放的木糖。作为底物，使用200mg桦木木聚糖。图13显示每蛋白质在水解试验中所释放的木糖。作为底物，使用200mg桦木木聚糖。图14示每体积培养液在水解试验中所释放的葡萄糖。作为底物，使用1g纤维素。一些木糖从半纤维素释放，所述半纤维素源自所用的培养液。图15显示每蛋白质在水解试验中所释放的葡萄糖。作为底物，使用1g纤维素。一些木糖从半纤维素释放，所述半纤维素源自所用的培养液。
本实施例显示米曲霉可以产生脂质和作为副产物的具有水解活性的培养液，所述培养液可以用于木质纤维素材料的水解。
参考文献
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Claims (19)

1.一种用于生产酶的方法，其包括
-在单细胞油生产过程中在适于单细胞油产生和胞外酶产生的条件下培育能够产生单细胞油和胞外酶两者的微生物，并且通过所述微生物产生单细胞油和酶；
-获得包含单细胞油和胞外酶的微生物培养物，以及回收至少部分的从上清液富集的蛋白质级分，作为酶制备物或作为酶的来源使用，以及
-从所述微生物细胞回收单细胞油。
2.根据权利要求1所述的方法，其中所述上清液或其部分在所述方法中再循环。
3.根据权利要求1所述的方法，其中从所述方法释放的工艺水包含比无酶回收情况下单细胞油过程的工艺水低至少5％的蛋白质。
4.根据权利要求1所述的方法，其中从所述方法释放的工艺水包含比无酶回收情况下单细胞油过程的工艺水低至少10％的蛋白质。
5.根据权利要求1至4中任一项所述的方法，其中浓缩所述上清液。
6.根据权利要求1-4中任一项所述的方法，其中通过添加酶诱导物至微生物培养物中启动和/或维持所述胞外酶产生或所述胞外酶产生以组成型方式发生。
7.根据权利要求1-4中任一项所述的方法，其中所述微生物在包含聚合物生物质作为碳源的培养基上培养。
8.根据权利要求7所述的方法，其中所述聚合物生物质是木质纤维素或其部分。
9.根据权利要求1-4中任一项所述的方法，其中所述胞外酶包括水解酶、氧化还原酶、裂解酶、异构酶、转移酶或连接酶或其任何混合物。
10.根据权利要求1-4中任一项所述的方法，其中所述胞外酶水解糖苷键。
11.根据权利要求1-4中任一项所述的方法，其中所述微生物是真菌或酵母。
12.根据权利要求11所述的方法，其中所述真菌属于选自曲霉属(Aspergillus)、木霉属(Trichoderma)、根霉属(Rhizopus)和腐质霉属(Humicola)的属。
13.根据权利要求11所述的方法，其中所述真菌属于曲霉属。
14.根据权利要求11所述的方法，其中所述酵母属于隐球酵母属(Cryptococcus)。
15.通过权利要求1至14中任一项所述的方法获得的酶制备物。
16.根据权利要求15所述的酶制备物，其中将所述上清液中的蛋白质级分富集并任选地纯化、稳定、干燥和/或配制。
17.根据权利要求1-14中任一项所述的方法产生的酶或根据权利要求15或16所述的酶制备物在相同工业过程或另一工业过程中的应用。
18.根据权利要求1-14中任一项所述的方法产生的脂质或根据权利要求15或16所述的酶制备物的应用，其用作生物燃料、用作生物燃料组分或用作生物燃料生产的原料。
19.根据权利要求18所述的应用，其中所述生物燃料是生物柴油或可再生柴油、汽油和/或喷气式发动机燃料。
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