CN105420221B

CN105420221B - 蜡梅脱腺苷酸酶基因CpCAF1及其编码的蛋白和应用

Info

Publication number: CN105420221B
Application number: CN201610019112.0A
Authority: CN
Inventors: 眭顺照; 周仕清; 李志能; 马婧; 刘道凤; 李名扬
Original assignee: Southwest University
Current assignee: Southwest University
Priority date: 2016-01-13
Filing date: 2016-01-13
Publication date: 2018-09-25
Anticipated expiration: 2036-01-13
Also published as: CN105420221A

Abstract

本发明公开了蜡梅脱腺苷酸酶基因CpCAF1及其编码的蛋白和应用。本发明提供的蜡梅脱腺苷酸酶，其为：1)由SEQ ID No.2所示的氨基酸组成的蛋白质；或2)在SEQ ID No.2所示的氨基酸序列中经取代、缺失或添加一个或几个氨基酸且具有同等活性的由1)衍生的蛋白质。本发明的蜡梅CpCAF1基因具有花器官优势表达特征和花发育延迟功能，在拟南芥中超量表达，可以延迟拟南芥开花，增加叶面积、角果数和分枝数，延迟衰老，表明本发明的蜡梅CpCAF1基因可促进植物生长发育。

Description

蜡梅脱腺苷酸酶基因CpCAF1及其编码的蛋白和应用

技术领域

本发明涉及基因工程领域，具体地说，涉及蜡梅脱腺苷酸酶基因CpCAF1的克隆及其应用。

背景技术

蜡梅(Chimonanthus praecox)，蜡梅科(Calycanthaceae)，蜡梅属(Chimonanthus)，别名金梅、蜡花、蜡木、黄梅花。落叶灌木，常丛生。花期11月至翌年3月。蜡梅是我国传统的名贵花木。蜡梅原产我国，以鄂西、川东、陕南为分布中心。北京以南、衡阳以北、上海以西、成都以东各地普遍栽培，而以南京、湖北保康、河北鄢陵、重庆栽培较多。蜡梅花冬春冒寒怒放，风姿独特，芳香馥郁，韵味奇异，园艺造型颇多，加之象征着幸福吉祥，不仅为历代宫廷权贵所爱，也是诗人、画家的钟情之物。蜡梅园林用途和经济用途十分广泛，不仅是理想的花灌木，还可做切花、桩景，其花可泡茶、酿酒、入药、提取香精，根茎可作止咳、活血药用。尤其近20年来在种质资源、形态分类、栽培繁殖、园林应用、基因文库等方面取得了大量成果，人们对蜡梅的应用也愈加广泛。

CCR4/POP2，又名CCR4/CAF1(Tucker et al.,2001)，POP2系早期相关关研究使用的名称，现多用CAF1(CCR4-associated factor1)。CCR4和CAF1单体也是脱腺苷酸酶，具备相应的活性位点和酶切活性(Martine A et al.,2012)。CAF1是参与mRNA降解的主要脱腺苷酸酶之一，在调控基因表达和影响生物学性状方面起着重要作用(Cui Y et al,2008；Liang W et al,2009；Martine A et al.,2012)。

发明内容

为了解决上述问题，本发明提供一种蜡梅脱腺苷酸酶及其应用。

蜡梅脱腺苷酸酶为，1)由SEQ ID No.2所示氨基酸组成的蛋白质；或2)在SEQ IDNo.2所示的氨基酸序列经取代、缺失或添加一个或几个氨基酸且具有同等活性的由1)衍生的蛋白质。

本发明还提供编码上述蛋白的基因，核苷酸序列如SEQ ID No.1所示。本发明提供的蜡梅脱腺苷酸酶基因是通过随机克隆测序的方法从蜡梅花cDNA文库获得的，其开放阅读框序列807bp。蜡梅脱腺苷酸酶基因编码蛋白与拟南芥(Arabidopsis thaliana)、梅(Prunus mume)、葡萄(Vitis viifera)、可可(Theobroma cacao)、油棕(Elaeisguineensis)、荷花(Nelumbo nucifera)、蓖麻(Ricinus communis)的脱腺苷酸酶基因编码蛋白的相似度高达98％，与其他物种的同源性也在95％～97％之间，结构比较保守。

应当理解，本领域技术人员可根据本发明公开的氨基酸序列，在不影响其活性的前提下，取代、缺失和/或增加一个或几个氨基酸，得到所述蛋白的突变序列。

因此，本发明的蜡梅脱腺苷酸酶还包括SEQ ID No.2所示氨基酸序列经取代、缺失或添加一个或几个氨基酸，具有蜡梅脱腺苷酸酶同等活性的由蜡梅脱腺苷酸酶衍生得到的蛋白质。本发明蜡梅脱腺苷酸酶基因包括编码所述蛋白的核苷酸序列。此外，应理解，考虑到密码子的简并性以及不同物种密码子的偏爱性，本领域技术人员可以根据需要使用适合特定物种表达的密码子。

本发明还提供含有上述蜡梅脱腺苷酸酶基因或其片段的载体，以及含有该载体的宿主细胞；所述载体为所述蜡梅脱腺苷酸酶基因的克隆载体或各类表达载体。

本发明的蜡梅CpCAF1基因具有花器官优势表达特征和花发育延迟功能，在拟南芥中超量表达，可以延迟拟南芥开花，增加叶面积、角果数和分枝数，延迟衰老，表明本发明的蜡梅CpCAF1基因可促进植物生长发育。

附图说明

图1所示为转基因拟南芥的GUS染色。A：野生型拟南芥；B：转基因拟南芥。

图2所示为转基因拟南芥中CpCAF1基因的PCR检测。M：DNA分子量标准，DL2000；1：野生型拟南芥；2-9：转基因拟南芥中CpCAF1基因的PCR检测；10：阴性对照(ddH₂O)

图3转CpCAF1基因拟南芥叶片中CpCAF1基因的相对表达分析。1:野生型拟南芥；2,4,6,7,10：转CpCAF1基因拟南芥不同单株系。

具体实施方式

以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。

实施例1蜡梅CpCAF1基因的分离

随机挑选蜡梅花cDNA文库克隆，提取质粒DNA，以5′pTripl Ex-Sequence primer为测序引物，进行正向序列测定得到EST序列，然后运用DNAStar软件包的SeqMan进行EST聚类，对获得的EST序列通过NCBI(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)BLAST程序的BlastN(Nucleotide-nucleotide BLAST)和BlastX(Translated query vs.protein database)进行比对分析，获得目标克隆子，并初步确认其功能属性。

以SP5和T7为测序引物进行两次正反向序列测定，得到蜡梅GTP结合蛋白基因CAF1的cDNA序列。根据获得的蜡梅CAF1基因cDNA序列，用软件Primer primer 5.0设计1对跨最大ORF框的特异引物进行PCR扩增，引物序列如下：

CpCAF1-F：5‘-GAATTCATGGGGAGTTTTCCCAAAGGTG-3’SEQ ID No.3

CpCAF1-R：5‘-GGATCCTTACCACCGAGACCATTCCAAGACAC-3’SEQ ID No.4

分别以蜡梅文库质粒DNA和蜡梅cDNA为模板，扩增蜡梅CpCAF1基因，PCR反应体系及反应条件如下：

将PCR产物回收后连接到T载体，转化大肠杆菌感受态细胞，或者重组子，挑取重组子进行测序，蜡梅CAF1基因cDNA序列如SEQ ID No.1所示。

在NCBI数据库进行Blastp对比，结果显示蜡梅CpCAF1基因编码蛋白(SEQ IDNo.2)与其他物种CAF1基因编码蛋白的相似性较高，与拟南芥(Arabidopsis thaliana)、梅(Prunus mume)、葡萄(Vitis viifera)、可可(Theobroma cacao)、油棕(Elaeisguineensis)、荷花(Nelumbo nucifera)、蓖麻(Ricinus communis)，相似度高达98％，与其他物种的同源性也在95％～97％之间，结构比较保守。CpCAF1蛋白属于DEDD核酸酶家族的DEDDh亚族，其活性区由3个天门冬甘酸(D)、1个谷氨酸(E)以及邻近的组氨酸(h)组成。与拟南芥比较，存在约50个氨基酸的位点变异。

实施例2蜡梅CpCAF1基因植物超表达载体的构建

结合CpCAF1基因ORF框序列自身限制性酶切位点的分布特点及所用植物超表达载体pCAMBIA2301G的多克隆位点特征，设计一对基因特异引物，并分别在引物上下游加入酶切位点BamH I和EcoR I及相应的保护碱基，用于扩增携带适宜酶切位点的CpCAF1基因编码区并将其克隆到植物表达载体的多克隆位点。引物名称及序列如下：

CAF1-F GAATTCATGGGGAGTTTTCCCAAAGGTG SEQ ID No.5

CAF1-R GGATCCTTACCACCGAGACCATTCCAAGACAC SEQ ID No.6

PCR扩增体系和反应程序如下：

取5μLPCR产物经1％琼脂糖凝胶电泳后，回收目的片段，连接到克隆载体pMD19-T后转化到大肠杆菌感受态细胞TOP10中，涂布在Amp的LB平板上37℃倒置过夜培养，挑取单克隆进行PCR鉴定，鉴定为阳性的质粒送至华大基因测序。将测序正确的阳性质粒命名为pT-CpCAF1。用BamH I和EcoR I分别酶切pT-CpCAF1质粒和植物表达载体pCAMBIA2301G质粒，反应体系如下：

37℃恒温箱酶切2-3h，80℃灭活5min。琼脂糖凝胶电泳回收酶切产物中pCAMBIA2301G载体大片段及CpCAF1小片段。将回收的CpCAF1基因片段与表达载体pCAMBIA2301G片段按照Fermentas公司T4连接酶说明书进行连接。22℃水浴过夜连接6h以上。连接体系如下：

将连接产物转化大肠杆菌TOP10，涂布在含50mg/L Kan的LB平板上37℃倒置过夜培养，挑取单克隆进行PCR检测，将电泳检测为阳性的菌液活化后提取质粒进行双酶切验证。将PCR鉴定和双酶切验证均正确的阳性质粒进行测序，确定无碱基突变后，命名为pCAMBIA2301G-CpCAF1，即为CpCAF1基因植物超表达重组载体。

将重组质粒pCAMBIA2301G-CpCAF1冻融法转化农杆菌EHA105感受态细胞，挑取单菌落，置于650ul含有YEB+Kan+Chl无菌的1.5mL离心管中(50mg/L Kan和34mg/L Chl)中，28℃振荡培养36-48h，以菌液为模板进行PCR检测。并进一步提取农杆菌转化子质粒，反转入大肠杆菌感受态细胞TOP10中，涂布在含Kan的LB平板上37℃倒置过夜培养，挑取单克隆进行PCR检测，将检测为阳性的菌液再提取质粒进行双酶切鉴定。验证正确的农杆菌菌液即为含有植物表达载体pCAMBIA2301G-CpCAF1重组质粒的工程菌。

实施例3蜡梅CpCAF1转化拟南芥

花序侵染法转化拟南芥

(1)拟南芥的培养

将适量拟南芥种子收集于1.5mL离心管中，加入浓度为17％的次氯酸钠(NaClO)充分振荡消毒10min，然后用无菌水冲洗5-6次后用移液枪均匀列播或散播在MS培养基平板上，于4℃冰箱春化2-3d后将培养平板置于光照16h/黑暗8h的光周期、2000Lux照明条件和22℃、70％湿度的环境下培养，约2周后移栽至培养基质中(蚯蚓土：蛭石＝1:1)。在培养过程中剪掉最初的顶生花序以促进侧枝的生长。在基质中培养3周左右，至花葶长度5cm左右时，对拟南芥花序进行农杆菌侵染。

(2)花序侵染法转化拟南芥

在含有抗生素(Chl：34mg/L,Kan：50mg/L)的YEB固体培养基上划单线活化含有植物表达载体pCAMBIA2301G-CpCAF1重组质粒的农杆菌EHA105，28℃暗培养36-48h；

用无菌牙签挑取单菌落，接种至650ul含有抗生素(Chl：34mg/L,Kan：50mg/L)的YEB液体培养基中，28℃，200rpm振荡培养36-48h；

对培养的农杆菌菌液用特异引物进行PCR鉴定，验证正确后取500ul上述菌液接种于25mL无抗的YEB液体培养基中，28℃，200rpm摇菌至OD₆₀₀在1-1.2之间备用；

用10mL的无菌离心管收集上述菌液，28℃，5000rpm离心15min，弃上清液，收集沉淀，沉淀用现配侵染液(无菌水+5％蔗糖+0.5‰L-77)重悬，稀释至OD₆₀₀≈0.8

初次侵染剪去拟南芥花葶上已开放的花朵，仅保留刚露白的花蕾，并提前一天浇水保持基质湿润。侵染前用喷水壶将纸箱内壁喷湿以作暗培养备用，将花葶头浸入侵染液(0.5cm)，3-5秒后取出放入纸箱中，纸箱外面外蒙上黑布(遮光)，置于22℃温度条件下培养24h后取出，保持在光线较暗的环境中过夜，再转到正常的生长环境中。

拟南芥侵染1周后根据拟南芥的生长状态可再次侵染以提高转化效率。

转基因拟南芥的筛选鉴定

(1)转基因拟南芥的Kan抗性筛选

转化约1个月后，收集成熟、开裂的果荚，即为T₀代种子。将种子在37℃恒温烘箱中烘干后再放在低温干燥的环境1周以上播种，进行抗生素筛选。

T₀代转基因种子用前述方法消毒后播种于含50mg/L Kan的MS培养基平板上进行筛选，转化成功的拟南芥能在含有Kan抗生素的培养基上正常生长。

得到若干不同株系，对各株系的T₁、T₂代种子继续进行Kan抗性筛选，直至所有株系收获的种子播种后全为绿色抗性苗，一般得到的T₃代种子即为转基因纯合株系。

(2)转基因拟南芥GUS组织化学染色检测

将抗性筛选所得的T4代转基因拟南芥株系播种，取2周左右大小的植株进行GUS染色鉴定，以野生型拟南芥作为对照。结果表明，筛选获得的8个转基因拟南芥株系均能被染成蓝色，而野生型拟南芥则不能被染成蓝色(图1)。

(3)转基因拟南芥的PCR检测

提取8个转基因拟南芥株系和野生型拟南芥植株的叶片基因组DNA，用CpCAF1基因的特异引物进行PCR鉴定，所用引物对为CpCAF1-F和CpCAF1-R。结果表明，所得的转基因拟南芥株系均能扩增出与阳性对照大小一致的目的条带，而野生型拟南芥未扩增出目的条带，表明目的基因CpCAF1已成功插入到拟南芥基因组中(图2)。

实施例4转基因拟南芥的实时荧光定量PCR检测

为进一步验证CpCAF1基因在转基因拟南芥中的表达情况，提取转基因拟南芥和野生型拟南芥幼嫩叶片的总RNA，以反转录后的cDNA第一链为模板，拟南芥Actin基因作为内参基因，对转基因拟南芥中CpCAF1基因进行荧光定量PCR分析表达情况，所用引物如下表1所示，结果如图3所示。

表1转基因植株RT-PCR所用引物

在检测的6个转基因拟南芥株系中，CpCAF1基因的表达差异较大(图3)。在后期对转基因拟南芥进行分析时，根据实时荧光定量结果，选取表达量最高和表达量稍低株系代表转基因不同表达量的株系进行表型观察和相关处理。

实施例5转基因拟南芥表型观察

对鉴定为阳性的T4代转基因拟南芥株系进行表达量分析，选取2个转基因株系(1个强表达+1个稍弱表达)，并以野生型拟南芥(WT)为对照，每个转基因株系和WT各选择5-10株为表型观察记录植株，每天定时观察比较从苗期到抽葶结实期再到衰败时期的表型，并进行相关数据统计。

对T4代转基因拟南芥株系和野生型拟南芥进行表型观察及相关指标测定，结果发现，转基因拟南芥株系的抽薹时间、莲座叶侧枝、和茎生叶侧枝形成时间、第一个花序、第一朵花和第一个果荚出现时间都稍晚于野生型植株(表2)，在生长30天时，转基因拟南芥株系CpCAF1-3、CpCAF1-5的高度分别为野生型植株的1.08倍、1.19倍，转基因拟南芥株系CpCAF1-3、CpCAF1-5的莲座叶叶面积分别为野生型植株的1.02倍、1.46倍。在60天时，转基因拟南芥株系CpCAF1-3、CpCAF1-5的莲座叶侧枝数分别为野生型植株的1.33倍、1.75倍；茎生叶数分别为野生型植株的1.32倍、1.79倍；荚果数分别为野生型植株的1.28倍、1.83倍。另外转基因拟南芥株系CpCAF1-3、CpCAF1-5的第一片黄叶出现时间明显晚于野生型植株，在55天时叶片黄化程度没有野生型严重，在65天时转基因株系仍能大部分保持绿色，而野生型植株出现大面积的黄化干枯。说明，CpCAF1基因的过表达能调控转基因拟南芥的生长发育，使开花推迟，促进生长发育，延迟衰老。

表2 T4代转CpCAF1基因拟南芥株系相关指标观察

观察的指标/株系	WT	CpCAF1-3	CpCAF1-5
				出现第一莲座叶侧枝(d)	38.00±1.58^a	39.00±1.61^a	34.33±1.15^a
出现第一茎生叶侧枝(d)	32.67±0.58^b	35.67±0.68^bc	33.00±1.00^b
				第一个花序出现(d)	28.00±0.50^c	29.00±0.10^c	29.00±0.30^c
第一朵花开放(d)	33.33±2.31^bc	36.00±1.00^c	33.00±1.73^bc
				第一个荚果出现(d)	36.00±2.00^b	37.00±1.20^c	35.67±1.15^b
第一片黄叶(d)	36.67±2.08^ab	40.00±1.00^c	38.67±1.53^bc

每组数为平均值±标准差；a、b、c、d表示P<0.05水平上差异显著

该发明专利受到国家自然科学基金(脱腺苷酸酶基因CpCAF1对蜡梅花发育和非生物胁迫响应的调控，项目号：31370698)资助。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明技术原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims

1.一种蜡梅脱腺苷酸酶，其为由SEQ ID No. 2所示的氨基酸组成的蛋白质。

2.编码权利要求1所述蛋白的蜡梅脱腺苷酸酶基因。

3.根据权利要求2所述的基因，其特征在于，核苷酸序列如SEQ ID No. 1所示。

4.含有权利要求2或3所述基因的载体。

5.制备权利要求1所述蜡梅脱腺苷酸酶的方法，其特征在于，将权利要求2或3所述的蜡梅脱腺苷酸酶基因构建到原核表达载体中，通过在大肠杆菌中发酵制备。

6.权利要求2或3所述的基因在调控转基因植物生长发育中的应用。

7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，所述基因在转基因植物中超量表达，使转基因植物推迟开花，促进植物生长发育。