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CN105420152B - 植物乳杆菌n3117、其筛选方法及应用 - Google Patents

植物乳杆菌n3117、其筛选方法及应用 Download PDF

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CN105420152B CN201510936243.0A CN201510936243A CN105420152B CN 105420152 B CN105420152 B CN 105420152B CN 201510936243 A CN201510936243 A CN 201510936243A CN 105420152 B CN105420152 B CN 105420152B
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Abstract

本发明公开了一种植物乳杆菌N3117，它是从内蒙古发酵乳制品中分离出的耐酸和耐胆盐的益生菌；该菌菌株已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物菌种保藏中心，保藏编号：CGMCC NO.10133；筛选出的植物乳杆菌N3117依次通过样品的富集、分离、纯化等实验，最终筛选出植物乳杆菌N3117。筛选出的植物乳杆菌N3117可以制备含有植物乳杆菌N3117的酸牛奶、乳酸菌饮料、菌粉制剂。本发明适用于植物乳杆菌N3117的筛选，及含植物乳杆菌N3117功能性乳制品和益生菌菌粉的制备。

Description

植物乳杆菌N3117、其筛选方法及应用
技术领域
本发明属于微生物工程领域，涉及一种植物乳杆菌，具体地说是一种植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)N3117、其筛选方法及应用。
背景技术
乳酸杆菌是动物肠道正常菌群中的主要有益菌之一，是动物机体重要的健康促进因子，能够调节肠道内菌群平衡，提高机体免疫力，缓解乳糖不耐症及抑制肿瘤细胞的形成，促进营养物质的消化吸收，降低胆固醇水平等。但其发挥生理功能的前提是能够耐受上消化道的酸性和高胆盐环境，以及具有良好的粘附性能等。
植物乳杆菌是人体胃肠道的益生菌群,代谢可以产生有机酸、细菌素、过氧化氢、双乙酰等多种天然抑菌物质,具有促进营养物质吸收等多种功能。植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)是人体胃肠道的益生菌群，代谢可以产生多种抑菌物质，具有调节肠道微生物菌群的平衡，增强机体的免疫力，降低胆固醇水平，缓解乳糖不耐症及抑制肿瘤细胞的形成等作用。但是，未见到通过植物乳杆菌调节免疫功能实现减肥的报道。通常，对于乳酸菌减肥作用的研究，是通过菌株降低胆固醇的等作用，以实现减肥作用，例如《植物乳杆菌ST-Ⅲ的减肥用途》 (专利号：ZL 200410066891.7)公开了植物乳杆菌ST-ⅢCGMCCNo.0847的减肥功能。
乳杆菌是人和动物肠道正常菌群中的优势菌,它能代谢产生有机酸、双乙酰、过氧化氢和细菌素等物质,这些物质能够抑制病原菌和腐败菌,是微生态制剂具有特殊保健功能的原因之一。其次，乳杆菌所产生胞外多肽，具有生物抑菌活性。乳杆菌在酸奶和其它发酵乳制品中的微生态群系存在，竞争于其他有害菌的生长。
发明内容
本发明要解决的技术问题，是提供一种植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)N3117，它是从内蒙古传统的发酵乳制品中分离出来的。
本发明的植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)N3117，已于2014年12 月05日，在位于北京市朝阳区北辰西路1号院3号的中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(国家专利局指定专利微生物保藏中心)进行保藏，保藏号为CGMCC NO.10133。
本发明的另一个目的，即提供了植物乳杆菌N3117的筛选方法，筛选出的植物乳杆菌N3117依次通过样品的富集、分离、纯化等实验，最终筛选出植物乳杆菌N3117。
本发明还有一个目的，即提供了植物乳杆菌N3117的应用，筛选出的植物乳杆菌N3117可以制备含有植物乳杆菌N3117的酸牛奶、乳酸菌饮料，可以将抑制病原菌侵袭。
为解决上述技术问题，本发明所采取的技术方案是：
一种植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)N3117，它是从内蒙古发酵乳制品中分离出的耐酸和耐胆盐的益生菌；该菌菌株已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物菌种保藏中心，保藏编号：CGMCC NO.10133。
本发明的另一个发明目的是筛选出的N3117，依次通过分离、纯化、糖发酵特性实验、分子生物学鉴定、耐酸耐胆盐特性实验、肠细胞粘附特性实验、抑制有害菌特性实验和菌株发酵特性实验，最终筛选出植物乳杆菌N3117。
本发明还有一个发明目的是植物乳杆菌N3117的应用，制备了含有植物乳杆菌N3117的酸牛奶、乳酸菌饮料。与已有乳杆菌相比，植物乳杆菌N3117 对低pH值和高胆汁酸盐具有更强的抗性，具有更好的耐受人消化道不良环境的能力，可以更好地发挥其益生作用。
作为本发明的一种限定，其16SrRNA的基因序列如下：
GCCTATACATGCAAGTCGAACGAACTCTGGTATTGATTGGTGCTTGCATCA TGATTTACATTTGAGTGAGTGGCGAACTGGTGAGTAACACGTGGGAAACC TGCCCAGAAGCGGGGGATAACACCTGGAAACAGATGCTAATACCGCATA ACAACTTGGACCGCATGGTCCGAGTTTGAAAGATGGCTTCGGCTATCACT TTTGGATGGTCCCGCGGCGTATTAGCTAGATGGTGGGGTAACGGCTCACC ATGGCAATGATACGTAGCCGACCTGAGAGGGTAATCGGCCACATTGGGAC TGAGACACGGCCCAAACTCCTACGGGAGGCAGCAGTAGGGAATCTTCCAC AATGGACGAAAGTCTGATGGAGCAACGCCGCGTGAGTGAAGAAGGGTTT CGGCTCGTAAAACTCTGTTGTTAAAGAAGAACATATCTGAGAGTAACTGT TCAGGTATTGACGGTATTTAACCAGAAAGCCACGGCTAACTACGTGCCAG CAGCCGCGGTAATACGTAGGTGGCAAGCGTTGTCCGGATTTATTGGGCGT AAAGCGAGCGCAGGCGGTTTTTTAAGTCTGATGTGAAAGCCTTCGGCTCA ACCGAAGAAGTGCATCGGAAACTGGGAAACTTGAGTGCAGAAGAGGACA GTGGAACTCCATGTGTAGCGGTGAAATGCGTAGATATATGGAAGAACACC AGTGGCGAAGGCGGCTGTCTGGTCTGTAACTGACGCTGAGGCTCGAAAGT ATGGGTAGCAAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCATACCGTAAACGAT GAATGCTAAGTGTTGGAGGGTTTCCGCCCTTCAGTGCTGCAGCTAACGCA TTAAGCATTCCGCCTGGGGAGTACGGCCGCAAGGCTGAAACTCAAAGGAA TTGACGGGGGCCCGCACAAGCGGTGGAGCATGTGGTTTAATTCGAAGCTA CGCGAAGAACCTTACCAGGTCTTGACATACTATGCAAATCTAAGAGATTA GACGTTCCCTTCGGGGACATGGATACAGGTGGTGCATGGTTGTCGTCAGC TCGTGTCGTGAGATGTTGGGTTAAGTCCCGCAACGAGCGCAACCCTTATT ATCAGTTGCCAGCATTAAGTTGGGCACTCTGGTGAGACTGCCGGTGACAA ACCGGAGGAAGGTGGGGATGACGTCAAATCATCATGCCCCTTATGACCTG GGCTACACACGTGCTACAATGGATGGTACAACGAGTTGCGAACTCGCGAG AGTAAGCTAATCTCTTAAAGCCATTCTCAGTTCGGATTGTAGGCTGCAACT CGCCTACATGAAGTCGGAATCGCTAGTAATCGCGGATCAGCATGCCGCGG TGAATACGTTCCCGGGCCTTGTACACACCGCCCGTCACACCATGAGAGTTT GTAACACCCAAAGTCGGTGGGGTAACCTTTTAGGAACCAGCCGCCTAAGG 。
作为本发明的另一种限定，其pheS基因序列测定结果如下：
CTTGTCGCCAATTACTAAGACGTGCTACTACGCACGCAGACGTCTGCTGAT CAGCCGCGGTCACTTGAAAATCACGATTTTTCTAAAGGACCGCTGAAGGT CTTGTCACCTGGCCGCGTTTATCGGCGTGATACGGATGATGCAACCCATTC CCATCAATTTCATCAAATTGAAGGGTTAGTCGTGGACAAGCATATTACGA TGGCTGATTTGAAGGGCACCTTAATTCTGGTTGCCAAGACTTTGTTTGGCG ATCAATTCGATGTTCGGCTACGGCCAAGCTTCTTTCCATTCACGGAACCAT CCGTAGAAGCTGATGTAACTTGCTTTAATTGCAATGGCAAGGGCTGTGCA ATCTGTAAGCAAACGGGTTGGATCGAAGTACTGGGTGCCGGCATGGTTCA CCCCCACGTGTTAGAAATGTCTGGCATTGATCCAGAAGAATATGGTGGTT TTGCTTTCGGTTTAGG。
本发明还提供了植物乳杆菌N3117的筛选方法，按照以下步骤顺序进行：
(1)发酵酸奶来源
所选用的发酵酸奶源自内蒙古传统的发酵乳制品；
(2)样品的富集
取样品2mL，加入到100mL的MRS液体培养基中，35℃培养72h，得到培养液；
(3)菌株的分离、纯化
a、取培养液1mL，用重量与体积比为0.9％的无菌的生理盐水稀释100000倍，分别为梯度稀释10-1，10-2，10-3，10-4，10-5，得到菌悬液；
b、取MRS琼脂培养基融化后，倒入培养皿，待其冷却、完全凝固后，吸取0.1mL 菌悬液涂布到培养基上。置37℃环境下厌氧培养72h；
C、挑取选中的单菌落，将菌落培养物划线接种到MRS琼脂培养基上，37℃有氧环境培养72h；然后，再将培养皿上长出的单菌落，继续划线接种到MRS琼脂培养基上，37℃有氧环境培养72h，重复三次；最后，将挑取的单菌落，进行革兰氏染色，显微镜下观察为革兰氏阳性、短杆、无芽孢的纯化菌株，即为获得的纯培养物，然后，将纯培养物置于无菌的20％甘油中在-80℃保存，同时接种 MRS琼脂培养基试管斜面用于临时保存。
作为本发明的一种限定，所述步骤(3)中的b中的厌氧环境为体积比为 5：10：85的H2：CO2：N2。
本发明还提供了植物乳杆菌N3117的应用，该植物乳杆菌应用于制备功能性乳制品。
本发明的植物乳杆菌N3117的细菌学特征如下：
1、菌株基本特性
植物乳杆菌N3117的基本特性，如下表所示：
试验项目 结果 试验项目 结果 试验项目 结果
革兰氏染色 + 空气中生长 + 10℃发酵 +
细胞形态 杆状 6.5％NaCl生长 + 15℃发酵 +
形成芽孢 - pH9.6生长 - 37℃发酵 +
接触酶 - pH4.5生长 + 45℃发酵 -
氧化酶 - 发酵葡萄糖产气 - 10％牛奶发酵 +
2、糖发酵特性实验
将上述分离纯化的菌株进行平板划线，37℃培养48h，挑取一接种环菌株接入糖发酵管中进行37℃培养48h，观察颜色变化，最终根据糖发酵实验颜色变化不同，初步对菌株进行鉴定。
3、分子生物学鉴定
将上述纯化后菌株进行分子生物学鉴定，通过DNA提取、PCR扩增，16SrRNA 基因序列、pheS基因序列等实验数据综合分析，菌株N3117经中国科学院微生物研究所鉴定，鉴定结果为:Lactobacillus plantarum植物乳杆菌。
4、耐酸耐胆盐特性实验
将Lactobacillus plantarum植物乳杆菌挑取1接种环纯化菌株接种到MRS培养基中，37℃培养48h，取出计数；同时，各取1mL该培养基，分别加入到pH为 2.5的磷酸盐缓冲液和3‰含猪胆盐的MRS培养溶液中37℃孵育，于0h、3h进行菌数的测定，并计算其存活率。
5、肠细胞粘附特性实验
将提前活化好的菌株N3117、保加利亚乳杆菌标准菌株在MRS液体培养基中37 ℃活化2次，活化后的菌株用PBS清洗两次，用含10％胎牛血清的DMEM培养基(不含抗生素)悬浮，调整菌数为108cfu/ml，将制备好菌悬液2ml加入6孔板中，CO2培养箱内于37℃下孵育2h。再用无菌PBS洗涤三次以除去未结合的乳酸菌，用甲醇固定30分钟，革兰氏染色(0.5％结晶紫)，油镜下(1000×倍)随机观察视野。
6、抑制霉菌、酵母菌特性实验
按照配方制作样品，经过60-65℃均质、95℃杀菌5min，分别接入菌种和稀释后的霉菌液或者酵母菌悬液摇匀，在42℃培养箱发酵6h至凝乳，摇匀破乳，放入 4-6℃24h后转入30℃放置，5h后观察并检测各样品霉菌或酵母菌数量。
7、抑制有害菌特性实验
植物乳杆菌N3117用MRS液体培养基于37℃好氧培养24h,再将此活菌液点于 MRS固体平板上,每板平行3个点,于37℃好氧培养24h。将常见的肠道有害菌分别培养过夜。取200ul指示菌液与7ml软琼脂混匀,倒在点有植物乳杆菌N3117 的MRS平板上,好氧或厌氧(根据指示菌)37℃培养24h(好氧)或48h(厌氧)。测量指示菌斑点周围抑菌圈的大小。结果表明,植物乳杆菌N3117菌体对大部分肠道有害菌均有抑制作用；其中对枯草芽胞杆菌、蜡样芽胞杆菌、单核细胞增生李斯特菌和伤寒沙门菌的抑制作用最强；对大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌、粪肠球菌和志贺痢疾杆菌、产气荚膜梭菌的抑制作用略弱；而对潜在的益生菌如干酪乳杆菌和青春双歧杆菌均无抑制作用。
由于采用了上述的技术方案，本发明与现有技术相比，所取得的技术进步在于：
1)本发明采用的植物乳杆菌N3117，该菌株具有很好的耐酸耐胆盐特性，即通过人体胃和肠道时能够很好的存活，从而可以很好的在人体中发挥益生作用。
2)本发明采用的菌株具有很好的黏附肠道的作用，因此可以很好的调节肠道。
3)本发明采用的菌株具有良好的抑制有害菌的作用，因此，可以将抑制病原菌侵袭应用于功能性乳制品的开发。
本发明适用于植物杆菌N3117的筛选，及含植物乳杆菌N3117功能性乳制品的制备。
本发明下面将结合具体实施例作进一步详细说明。
具体实施方式
实施例1一种植物乳杆菌N3117及其筛选方法
一种植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)N3117，它是从内蒙古发酵乳制品中分离出的耐酸和耐胆盐的益生菌；该菌菌株已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物菌种保藏中心，保藏编号：CGMCC NO.10133。
植物乳杆菌N3117的筛选方法，按照以下步骤顺序进行：
(1)发酵酸奶来源
所选用的发酵酸奶源自内蒙古传统的发酵乳制品；
(2)样品的富集
取样品2mL，加入到100mL的MRS液体培养基中，35℃培养72h，得到培养液；
(3)菌株的分离、纯化
a、取培养液1mL，用重量与体积比为0.9％的无菌的生理盐水稀释100000倍，分别为梯度稀释10-1，10-2，10-3，10-4，10-5，得到菌悬液；
b、取MRS琼脂培养基融化后，倒入培养皿，待其冷却、完全凝固后，吸取0.1mL 菌悬液涂布到培养基上。置35℃环境下厌氧培养72h；其中，厌氧环境为体积比为5：10：85的H2：CO2：N2。
C、挑取选中的单菌落，将菌落培养物划线接种到MRS琼脂培养基上， 35℃有氧环境培养72h；然后，再将培养皿上长出的单菌落，继续划线接种到 MRS琼脂培养基上，35℃有氧环境培养72h，重复三次；最后，将挑取的单菌落，进行革兰氏染色，显微镜下观察为革兰氏阳性、短杆、无芽孢的纯化菌株，即为获得的纯培养物，然后，将纯培养物置于无菌的20％甘油中在-70℃保存，同时接种MRS琼脂培养基试管斜面用于临时保存。
本发明的植物乳杆菌N3117的细菌学特征如下：
1)基本特性
植物乳杆菌N3117的基本特性，如下表所示：
试验项目 结果 试验项目 结果 试验项目 结果
革兰氏染色 + 空气中生长 + 10℃发酵 +
细胞形态 杆状 6.5％NaCl生长 + 15℃发酵 +
形成芽孢 - pH9.6生长 - 37℃发酵 +
接触酶 - pH4.5生长 + 45℃发酵 -
氧化酶 - 发酵葡萄糖产气 - 10％牛奶发酵 +
2、糖发酵特性实验
将上述菌株挑取单菌落进行平板划线，37℃培养48h，分别挑取一接种环菌株接入糖发酵管中进行37℃培养48h，其中，糖发酵管中包括：水杨苷、核糖、阿拉伯糖、麦芽糖、甘露醇、纤维二塘、蔗糖、棉子糖、山梨醇等。观察颜色变化，最终根据糖发酵实验颜色变化判断菌株类别，结果如下表所示：
注：“+”表示发酵利用；“-”表示不发酵利用。
3、分子生物学鉴定
将上述纯化后菌株进行分子生物学鉴定，通过DNA提取、PCR扩增，16SrRNA 基因序列、pheS基因序列等实验数据综合分析，菌株N3117经中国科学院微生物研究所鉴定，鉴定结果为:Lactobacillus plantarum植物乳杆菌。
植物乳杆菌N3117的16SrRNA的基因序列如下：
GCCTATACATGCAAGTCGAACGAACTCTGGTATTGATTGGTGCTTGCATCA TGATTTACATTTGAGTGAGTGGCGAACTGGTGAGTAACACGTGGGAAACC TGCCCAGAAGCGGGGGATAACACCTGGAAACAGATGCTAATACCGCATA ACAACTTGGACCGCATGGTCCGAGTTTGAAAGATGGCTTCGGCTATCACT TTTGGATGGTCCCGCGGCGTATTAGCTAGATGGTGGGGTAACGGCTCACC ATGGCAATGATACGTAGCCGACCTGAGAGGGTAATCGGCCACATTGGGAC TGAGACACGGCCCAAACTCCTACGGGAGGCAGCAGTAGGGAATCTTCCAC AATGGACGAAAGTCTGATGGAGCAACGCCGCGTGAGTGAAGAAGGGTTT CGGCTCGTAAAACTCTGTTGTTAAAGAAGAACATATCTGAGAGTAACTGT TCAGGTATTGACGGTATTTAACCAGAAAGCCACGGCTAACTACGTGCCAG CAGCCGCGGTAATACGTAGGTGGCAAGCGTTGTCCGGATTTATTGGGCGT AAAGCGAGCGCAGGCGGTTTTTTAAGTCTGATGTGAAAGCCTTCGGCTCA ACCGAAGAAGTGCATCGGAAACTGGGAAACTTGAGTGCAGAAGAGGACA GTGGAACTCCATGTGTAGCGGTGAAATGCGTAGATATATGGAAGAACACC AGTGGCGAAGGCGGCTGTCTGGTCTGTAACTGACGCTGAGGCTCGAAAGT ATGGGTAGCAAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCATACCGTAAACGAT GAATGCTAAGTGTTGGAGGGTTTCCGCCCTTCAGTGCTGCAGCTAACGCA TTAAGCATTCCGCCTGGGGAGTACGGCCGCAAGGCTGAAACTCAAAGGAA TTGACGGGGGCCCGCACAAGCGGTGGAGCATGTGGTTTAATTCGAAGCTA CGCGAAGAACCTTACCAGGTCTTGACATACTATGCAAATCTAAGAGATTA GACGTTCCCTTCGGGGACATGGATACAGGTGGTGCATGGTTGTCGTCAGC TCGTGTCGTGAGATGTTGGGTTAAGTCCCGCAACGAGCGCAACCCTTATT ATCAGTTGCCAGCATTAAGTTGGGCACTCTGGTGAGACTGCCGGTGACAA ACCGGAGGAAGGTGGGGATGACGTCAAATCATCATGCCCCTTATGACCTG GGCTACACACGTGCTACAATGGATGGTACAACGAGTTGCGAACTCGCGAG AGTAAGCTAATCTCTTAAAGCCATTCTCAGTTCGGATTGTAGGCTGCAACT CGCCTACATGAAGTCGGAATCGCTAGTAATCGCGGATCAGCATGCCGCGG TGAATACGTTCCCGGGCCTTGTACACACCGCCCGTCACACCATGAGAGTTT GTAACACCCAAAGTCGGTGGGGTAACCTTTTAGGAACCAGCCGCCTAAGG 。
植物乳杆菌N3117的pheS基因序列测定结果如下：
CTTGTCGCCAATTACTAAGACGTGCTACTACGCACGCAGACGTCTGCTGAT CAGCCGCGGTCACTTGAAAATCACGATTTTTCTAAAGGACCGCTGAAGGT CTTGTCACCTGGCCGCGTTTATCGGCGTGATACGGATGATGCAACCCATTC CCATCAATTTCATCAAATTGAAGGGTTAGTCGTGGACAAGCATATTACGA TGGCTGATTTGAAGGGCACCTTAATTCTGGTTGCCAAGACTTTGTTTGGCG ATCAATTCGATGTTCGGCTACGGCCAAGCTTCTTTCCATTCACGGAACCAT CCGTAGAAGCTGATGTAACTTGCTTTAATTGCAATGGCAAGGGCTGTGCA ATCTGTAAGCAAACGGGTTGGATCGAAGTACTGGGTGCCGGCATGGTTCA CCCCCACGTGTTAGAAATGTCTGGCATTGATCCAGAAGAATATGGTGGTT TTGCTTTCGGTTTAGG。
4、耐酸耐胆盐特性实验
将上述植物乳杆菌N3117及其他菌株各挑取1接种环纯化菌株接种到液体MRS 培养基中增菌，37℃培养48h，取出计数；同时，吸取1mL含该菌株的增菌液，分别加入到pH为2.5的磷酸盐缓冲液和3‰含猪胆盐的MRS培养溶液中37℃孵育，于0h、3h进行菌数的测定，并计算其存活率；最终得出植物乳杆菌N3117 耐酸耐胆盐实验结果如下表所示：
由上表可知，植物乳杆菌N3117在酸液和胆液中的存活率较高，具有较好的耐酸耐胆盐特性。
5、肠细胞粘附特性实验
(1)菌株的培养
将菌株N3117、保加利亚乳杆菌标准菌株在MRS培养基中，37℃，有氧培养48h，进行 重复活化2次，活化后的菌株用PBS清洗两次，用含10％胎牛血清的DMEM 培养基(不含抗生 素)悬浮，调整菌数为108cfu/ml，将制备好菌悬液2ml加入6 孔板中，CO2培养箱内于37℃下 孵育2h。再用无菌PBS洗涤三次以除去未结合的乳酸菌，用甲醇固定30分钟，革兰氏染色 (0.5％结晶紫)，油镜下放大1000倍随机观察视野。对活化后的乳酸菌进行活菌计数，实验 结果如下表所示：
菌株名称 保加利亚乳杆菌(BG) N3117
活菌数 7.4×10<sup>8</sup> 1.8×10<sup>8</sup>
从上表可以看出，以上菌株的活菌数均在108cfu/ml。
(2)乳酸菌与细胞黏附：
黏附是定植的必要条件，益生菌通过黏附素与肠黏膜上皮细胞受体黏附，然后占位定植，以阻止病原菌与肠黏膜受体结合产生黏附。黏附在肠道的益生菌可以通过空间占位，产生抑菌物质等对肠道病原菌发挥抑制作用，调整肠道菌群平衡。
实验结果显示，植物乳杆菌N3117、保加利亚乳杆菌与Caco2细胞均存在一定的黏 附，但是黏附的数量存在显著的差异性，保加利亚乳杆菌黏附较少， N3117黏附较多。说明 N3117能够更好的定植于肠黏膜上，发挥其益生作用。
菌株名称 保加利亚乳杆菌(BG) N3117
黏附数量(<u>个</u>/细胞) 48±3.0 181±2.8
6、抑制霉菌、酵母菌特性实验
杆菌是人和动物肠道正常菌群中的优势菌，它能代谢产生有机酸、双乙酰、过氧化氢和细菌素等物质，这些物质能够抑制病原菌和腐败菌，是微生态制剂具有特殊保健功能的原因之一。其次，乳杆菌所产生胞外多肽，具有生物抑菌活性。乳杆菌在酸奶和其它发酵乳制品中的微生态群系存在，竞争于其他有害菌的生长。
(1)酸奶样品的配制：
a、普通酸奶：920g鲜奶、80g白砂糖、普通发酵剂；
b、N3117酸奶：920g鲜奶、80g白砂糖、普通发酵剂、N3117发酵剂按照以上配方制作样品，经过60-65℃均质、95℃杀菌5min，分别接入菌种和稀释后的霉菌液或者酵母菌悬液摇匀，在42℃培养箱发酵6h至凝乳，摇匀破乳，放入4-6℃24h后转入30℃放置，5d后观察并检测各样品霉菌或酵母菌数量。
(2)抑菌结果：
A、抑制霉菌结果
由上表可以看出，添加不同数量的霉菌，含有植物乳杆菌N3117菌株的样品，未见大量霉菌的形成，说明其抑制了大量霉菌的繁殖，对酸奶样品起到了一定的保护作用。
B、抑制酵母菌结果
由上表可以看出，添加不同数量的酵母菌，含有植物乳杆菌N3117菌株的样品，未见酵母菌的大量繁殖，说明其抑制了大量酵母菌的繁殖，对酸奶样品起到了一定的保护作用。
7、抑制有害菌特性实验
(1)菌体制备
植物乳杆菌N3117用MRS液体培养基于37℃好氧培养24h,再将此活菌液点于 MRS固体平板上,每板平行3个点,于37℃好氧培养24h。将常见的肠道有害菌分别培养过夜。取200ul指示菌液与7ml软琼脂混匀,倒在点有植物乳杆菌N3117 的MRS平板上,好氧或厌氧(根据指示菌)37℃培养24h(好氧)或48h(厌氧)。测量指示菌斑点周围抑菌圈的大小。
(2)菌体抑菌性能
植物乳杆菌N3117菌体对大部分肠道有害菌均有抑制作用；其中对枯草芽胞杆菌、蜡样芽胞杆菌、单核细胞增生李斯特菌和伤寒沙门菌的抑制作用最强；对大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌、粪肠球菌和志贺痢疾杆菌、产气荚膜梭菌的抑制作用略弱；而对潜在的益生菌如干酪乳杆菌和青春双歧杆菌均无抑制作用，如下表所示：
注：“—”表示没有抑制作用。
实施例2含植物乳杆菌N3117的乳酸菌饮料的制备
将纯牛奶48g，水32g，蔗糖5g，混合均匀于110℃下灭菌15min制备培养基液；将106cfu/ml的植物乳杆菌N3117、106cfu/ml的保加利亚乳杆菌和106cfu/ml的嗜热链球菌接入培养基液中混匀，37℃发酵至pH至4.4-4.6，终止发酵，冷却灌装，冷藏保存，该产品在30d保质期内，产品的感官、风味等不会发生明显变化，菌数保持在106cfu/ml变化不明显。
以上所述，仅是本发明的较佳实施例而已，并非是对本发明作其它形式的限制，任何熟悉本专业的技术人员可能利用上述技术内容作为启示加以变更或改型为等同变化的等效实施例。但是凡是未脱离本发明技术方案内容，依据本发明的技术实质对以上实施例所作出的简单修改，等同变化与改型，仍属于本发明权利要求的保护范围。
Organization Applicant
----------------------
Street : 鹿泉区石铜路36号
City : 河北省
State : 石家庄市
Country : 中国
PostalCode :
PhoneNumber : 0311-80813256
FaxNumber :
EmailAddress :
<110> OrganizationName : 石家庄君乐宝乳业有限公司
Application Project
-------------------
<120> Title : 植物乳杆菌N3117、其筛选方法及应用
<160> 2
<170> PatentIn version 3.3
Sequence
--------
<210> 1
<213> OrganismName : Lactobacillus plantarum
<400> PreSequenceString :
gcctatacat gcaagtcgaa cgaactctgg tattgattgg tgcttgcatc atgatttaca 60
tttgagtgag tggcgaactg gtgagtaaca cgtgggaaac ctgcccagaa gcgggggata 120
acacctggaa acagatgcta ataccgcata acaacttgga ccgcatggtc cgagtttgaa 180
agatggcttc ggctatcact tttggatggt cccgcggcgt attagctaga tggtggggta 240
acggctcacc atggcaatga tacgtagccg acctgagagg gtaatcggcc acattgggac 300
tgagacacgg cccaaactcc tacgggaggc agcagtaggg aatcttccac aatggacgaa 360
agtctgatgg agcaacgccg cgtgagtgaa gaagggtttc ggctcgtaaa actctgttgt 420
taaagaagaa catatctgag agtaactgtt caggtattga cggtatttaa ccagaaagcc 480
acggctaact acgtgccagc agccgcggta atacgtaggt ggcaagcgtt gtccggattt 540
attgggcgta aagcgagcgc aggcggtttt ttaagtctga tgtgaaagcc ttcggctcaa 600
ccgaagaagt gcatcggaaa ctgggaaact tgagtgcaga agaggacagt ggaactccat 660
gtgtagcggt gaaatgcgta gatatatgga agaacaccag tggcgaaggc ggctgtctgg 720
tctgtaactg acgctgaggc tcgaaagtat gggtagcaaa caggattaga taccctggta 780
gtccataccg taaacgatga atgctaagtg ttggagggtt tccgcccttc agtgctgcag 840
ctaacgcatt aagcattccg cctggggagt acggccgcaa ggctgaaact caaaggaatt 900
gacgggggcc cgcacaagcg gtggagcatg tggtttaatt cgaagctacg cgaagaacct 960
taccaggtct tgacatacta tgcaaatcta agagattaga cgttcccttc ggggacatgg 1020
atacaggtgg tgcatggttg tcgtcagctc gtgtcgtgag atgttgggtt aagtcccgca 1080
acgagcgcaa cccttattat cagttgccag cattaagttg ggcactctgg tgagactgcc 1140
ggtgacaaac cggaggaagg tggggatgac gtcaaatcat catgcccctt atgacctggg 1200
ctacacacgt gctacaatgg atggtacaac gagttgcgaa ctcgcgagag taagctaatc 1260
tcttaaagcc attctcagtt cggattgtag gctgcaactc gcctacatga agtcggaatc 1320
gctagtaatc gcggatcagc atgccgcggt gaatacgttc ccgggccttg tacacaccgc 1380
ccgtcacacc atgagagttt gtaacaccca aagtcggtgg ggtaaccttt taggaaccag 1440
ccgcctaagg 1450
<212> Type : RNA
<211> Length : 1450
SequenceName : N3117的16sRNA
SequenceDescription :
Sequence
--------
<210> 2
<213> OrganismName : Lactobacillus plantarum
<400> PreSequenceString :
cttgtcgcca attactaaga cgtgctacta cgcacgcaga cgtctgctga tcagccgcgg 60
tcacttgaaa atcacgattt ttctaaagga ccgctgaagg tcttgtcacc tggccgcgtt 120
tatcggcgtg atacggatga tgcaacccat tcccatcaat ttcatcaaat tgaagggtta 180
gtcgtggaca agcatattac gatggctgat ttgaagggca ccttaattct ggttgccaag 240
actttgtttg gcgatcaatt cgatgttcgg ctacggccaa gcttctttcc attcacggaa 300
ccatccgtag aagctgatgt aacttgcttt aattgcaatg gcaagggctg tgcaatctgt 360
aagcaaacgg gttggatcga agtactgggt gccggcatgg ttcaccccca cgtgttagaa 420
atgtctggca ttgatccaga agaatatggt ggttttgctt tcggtttagg 470
<212> Type : RNA
<211> Length : 470
SequenceName : N3117的pheS基因
SequenceDescription :

Claims (5)

1.一种植物乳杆菌（Lactobacillus plantarum）N3117，其特征在于：它是耐酸和耐胆盐的益生菌；该菌菌株已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物菌种保藏中心，保藏编号：CGMCC NO.10133。
2.根据权利要求1所述的植物乳杆菌N3117，其特征在于其16SrRNA的基因序列如下：
GCCTATACATGCAAGTCGAACGAACTCTGGTATTGATTGGTGCTTGCATCATGATTTACATTTGAGTGAGTGGCGAACTGGTGAGTAACACGTGGGAAACCTGCCCAGAAGCGGGGGATAACACCTGGAAACAGATGCTAATACCGCATAACAACTTGGACCGCATGGTCCGAGTTTGAAAGATGGCTTCGGCTATCACTTTTGGATGGTCCCGCGGCGTATTAGCTAGATGGTGGGGTAACGGCTCACCATGGCAATGATACGTAGCCGACCTGAGAGGGTAATCGGCCACATTGGGACTGAGACACGGCCCAAACTCCTACGGGAGGCAGCAGTAGGGAATCTTCCACAATGGACGAAAGTCTGATGGAGCAACGCCGCGTGAGTGAAGAAGGGTTTCGGCTCGTAAAACTCTGTTGTTAAAGAAGAACATATCTGAGAGTAACTGTTCAGGTATTGACGGTATTTAACCAGAAAGCCACGGCTAACTACGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGTAGGTGGCAAGCGTTGTCCGGATTTATTGGGCGTAAAGCGAGCGCAGGCGGTTTTTTAAGTCTGATGTGAAAGCCTTCGGCTCAACCGAAGAAGTGCATCGGAAACTGGGAAACTTGAGTGCAGAAGAGGACAGTGGAACTCCATGTGTAGCGGTGAAATGCGTAGATATATGGAAGAACACCAGTGGCGAAGGCGGCTGTCTGGTCTGTAACTGACGCTGAGGCTCGAAAGTATGGGTAGCAAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCATACCGTAAACGATGAATGCTAAGTGTTGGAGGGTTTCCGCCCTTCAGTGCTGCAGCTAACGCATTAAGCATTCCGCCTGGGGAGTACGGCCGCAAGGCTGAAACTCAAAGGAATTGACGGGGGCCCGCACAAGCGGTGGAGCATGTGGTTTAATTCGAAGCTACGCGAAGAACCTTACCAGGTCTTGACATACTATGCAAATCTAAGAGATTAGACGTTCCCTTCGGGGACATGGATACAGGTGGTGCATGGTTGTCGTCAGCTCGTGTCGTGAGATGTTGGGTTAAGTCCCGCAACGAGCGCAACCCTTATTATCAGTTGCCAGCATTAAGTTGGGCACTCTGGTGAGACTGCCGGTGACAAACCGGAGGAAGGTGGGGATGACGTCAAATCATCATGCCCCTTATGACCTGGGCTACACACGTGCTACAATGGATGGTACAACGAGTTGCGAACTCGCGAGAGTAAGCTAATCTCTTAAAGCCATTCTCAGTTCGGATTGTAGGCTGCAACTCGCCTACATGAAGTCGGAATCGCTAGTAATCGCGGATCAGCATGCCGCGGTGAATACGTTCCCGGGCCTTGTACACACCGCCCGTCACACCATGAGAGTTTGTAACACCCAAAGTCGGTGGGGTAACCTTTTAGGAACCAGCCGCCTAAGG。
3.根据权利要求1所述的植物乳杆菌N3117，其特征在于：其pheS基因序列测定结果如下：
CTTGTCGCCAATTACTAAGACGTGCTACTACGCACGCAGACGTCTGCTGATCAGCCGCGGTCACTTGAAAATCACGATTTTTCTAAAGGACCGCTGAAGGTCTTGTCACCTGGCCGCGTTTATCGGCGTGATACGGATGATGCAACCCATTCCCATCAATTTCATCAAATTGAAGGGTTAGTCGTGGACAAGCATATTACGATGGCTGATTTGAAGGGCACCTTAATTCTGGTTGCCAAGACTTTGTTTGGCGATCAATTCGATGTTCGGCTACGGCCAAGCTTCTTTCCATTCACGGAACCATCCGTAGAAGCTGATGTAACTTGCTTTAATTGCAATGGCAAGGGCTGTGCAATCTGTAAGCAAACGGGTTGGATCGAAGTACTGGGTGCCGGCATGGTTCACCCCCACGTGTTAGAAATGTCTGGCATTGATCCAGAAGAATATGGTGGTTTTGCTTTCGGTTTAGG。
4.如权利要求1所述的植物乳杆菌N3117的纯化方法，其特征在于它按照以下步骤顺序进行：
取菌株划线接种到MRS琼脂培养基上，37℃有氧环境培养72h；然后，再将培养皿上长出的单菌落，继续划线接种到MRS琼脂培养基上，37℃有氧环境培养72h，重复三次；最后，将挑取的单菌落，进行革兰氏染色，显微镜下观察为革兰氏阳性、短杆、无芽孢的纯化菌株，即为获得的纯培养物，然后，将纯培养物置于无菌的20%甘油中在-80℃保存，同时接种MRS琼脂培养基试管斜面用于临时保存。
5.一种如权利要求1所述的植物乳杆菌N3117的应用，其特征在于：该植物乳杆菌应用于制备乳酸菌饮料，它的制备方法如下：
将纯牛奶 48g、水32g、蔗糖5g，混合均匀于110℃下灭菌15min制备培养基液；
将10 6 cfu/ml的植物乳杆菌N3117、106 cfu/ml的保加利亚乳杆菌和106 cfu/ml 的嗜热链球菌接入培养基液中混匀，37℃发酵至pH至4.4-4.6，终止发酵，冷却，即得。
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