CN105403704A - Her-2的荧光免疫层析检测方法及试剂盒 - Google Patents

Abstract

本发明涉及HER-2的荧光免疫层析检测方法及其检测试剂盒。该方法步骤为探针固定垫制备、免疫层析试纸条制备、样品稀释液制备和样品检验，其中，将HER-2单克隆抗体荧光胶乳微粒与羊抗兔IgG荧光胶乳微粒混合后经金稀释液稀释喷在玻璃纤维上制得探针固定垫，并将HER-2单克隆抗体包被在检测线上，将羊抗兔IgG包被在控制线上进而制得免疫层析试纸条。本发明检测试剂盒包括免疫层析检测卡，其包括PVC衬板、样品垫、探针固定垫、硝酸纤维素膜和吸水纸，该探针固定垫由HER-2单克隆抗体荧光胶乳微粒和羊抗兔IgG荧光胶乳微粒混合干燥制得。因此，本发明具有检测灵敏度高、准确度高、操作简单、成本低的优点。

Description

HER-2的荧光免疫层析检测方法及试剂盒

技术领域

本发明涉及一种HER-2的检测方法及试剂盒，尤其涉及HER-2的荧光免疫层析检测方法及其检测试剂盒。

背景技术

HER-2基因，人类表皮生长因子受体2基因，也称为nen、C-erbB-2、Her-2/neu基因，其表达的蛋白产物为人表皮生长因子受体2，HER-2基因通过表达HER-2蛋白发挥作用。HER-2原癌基因位于17号染色体长臂，最早Shih等人用3-甲基胆蒽诱导鼠NIH3T3培养细胞系，并在转变出的神经母细胞瘤瘤细胞中将其检测到。在人类，20％～30％乳腺癌患者癌细胞有过度表达，其原因主要是HER-2基因扩增(95％)或转录增多(5％)。HER-2是表皮生长因子受体(EGFR)家族的一员，当细胞外相应片段与HER-2结合后可激活细胞内酪氨酸激酶，从而活化其它一系列细胞内信息传递途径，最终信号到达核内，导致调控细胞复制和分化的基因发生转录。

正常人体细胞一般较少表达或适度表达HER-2蛋白，起到调控正常细胞生长和发育的作用。而在肿瘤组织中，HER-2基因大量扩增，导致HER-2蛋白过度表达，引起细胞增殖迅速、生长失控、促进乳腺癌进展。临床资料分析显示，HER-2基因扩增或蛋白过表达的早期乳腺癌患者10年生存率显著低于HER-2低表达组，HER-2基因扩增或蛋白过表达的复发转移乳腺癌患者的中位生存期仅为3年，而HER-2阴性患者的中位生存期为6-7年。因此，HER-2过表达是提示乳腺癌预后较差的指标之一，其在乳腺癌中过度表达的意义及其检测方法一直是人们关注的热点。

目前对HER-2基因的研究取得了突破性进展，1987年，Slamon等人首先报道了HER-2扩增和临床预后不良之间的显著关系，其显著性高于雌激素(ER)、孕激素(PR)等指标，并在以后的研究中得到大量证实。之后人们发现HER-2高表达乳腺癌患者对三苯氧胺治疗、单独的激素疗法、以及环磷酰胺、甲氨喋呤、5-氟脲嘧啶联合化疗产生耐受，而对泰素、阿霉素治疗变的更敏感。近年来，一种针对HER-2的单克隆抗体类药物研制成功，并已得到美国食品及药物管理局许可用于临床治疗三期乳腺癌，它只针对HER-2高表达的肿瘤细胞产生作用，可有效延长患者生存期并使其生活质量得到改善，是一种极有前途的疗法。因此，乳腺癌患者有无HER-2高表达，如何客观准确地对其加以检测，对患者治疗方法的选择以及预后具有极为重要的意义。

目前国内国外开发的HER-2检测方法有免疫组化或FISH检测，这些方法检测步骤多，检测过程影响因素较多，检测结果易造成偏差。现有技术荧光层析免疫分析方法是一种微量分析方法，根据荧光强度，对物质进行定性或定量分析，具有高灵敏度、选择性强、需样量少和操作简便等优点。

中国专利公布号为CN104195246A的发明专利，公布了一种基于HER-2基因快速FISH检测的HER-2试剂盒，通过碱基互补配对的原则，特定的DNA序列与细胞内的目标序列互补结合，探针带有荧光，在合适的激发光照射下，杂交探针及目标DNA能够被检测出来，采用优化的短序列荧光探针，使得所需要的杂交时间缩短，可以将FISH的检测时间缩短至1～2h。然而该方法检测步骤有洗涤、除菌、杂交、孵育、检测等，检测过程复杂，繁琐，消耗时间长，需要专业人员进行操作，特别是对检测环境有严格要求，不利于大批量的样本检测。

中国专利公布号为CN104122394A的发明专利，公布了一种酶促化学发光法检测HER-2定量测定试剂盒，采用含有小鼠抗人HER-2的单克隆抗体复合物的纳米磁性微球固定HER-2，然后与含有碱性磷酸酶标记的抗HER-2单克隆抗体结合，通过与酶促化学发光底物的反应产生信号。该方法需要将不同的HER-2抗体与纳米磁珠和磷酸酶结合，成本较高；操作步骤有HER-2的固定、温浴、去上清、清洗、化学发光反应和发光检测仪检测，操作复杂，容易带来误差，需专业人员，检测时间较长。

因此，如何开发检测时长短、操作方便、检测结果精确的HER-2检测方法和检测产品成为亟待解决的问题。

发明内容

为解决上述技术问题，本发明的目的是提供一种灵敏度高、准确度高、操作简单、成本低的HER-2的检测方法及试剂盒。

本发明一种HER-2的荧光免疫层析检测方法，包括以下步骤：

步骤1)探针固定垫制备：将HER-2单克隆抗体按比例与活化白蛋白荧光胶乳微粒偶联反应制得HER-2单克隆抗体荧光胶乳微粒，再将所述HER-2单克隆抗体荧光胶乳微粒与羊抗兔IgG荧光胶乳微粒按一定比例混合得到混合荧光胶乳微粒，所述混合荧光胶乳微粒用荧光探针微球稀释液稀释后喷在玻璃纤维上制得探针固定垫；

步骤2)免疫层析试纸条制备：将样品垫、探针固定垫、层析膜、吸水纸依次贴在PVC衬板上，将所述HER-2单克隆抗体包被在层析膜的检测线上，将羊抗兔IgG包被在层析膜控制线上，进而制得免疫层析试纸条，所述层析膜优选硝酸纤维素膜；

步骤3)样品稀释液制备：将包括有牛血清白蛋白、表面活性剂、分散剂和防腐剂的混合物与缓冲液混合均匀制得样品稀释液；

步骤4)样品检验：取血清样品混合至所述样品稀释液，加入免疫层析试纸条进行免疫层析反应，层析反应结束后经荧光检测器荧光检测。

本发明进一步地，步骤1)中，所述活化白蛋白荧光胶乳微粒的制备是先将荧光胶乳微粒与活化剂反应制得活化荧光胶乳微粒，再与白蛋白按比例偶联反应得白蛋白荧光胶乳微粒，所述白蛋白与活化荧光胶乳微粒的比例为0.05:100～0.2:100，所述白蛋白荧光胶乳微粒进一步与活化剂反应制得所述活化白蛋白荧光胶乳微粒。

本发明更进一步地，所述白蛋白的种属包括人、牛、羊或鼠。

本发明更进一步地，步骤1)中，所述羊抗兔IgG荧光胶乳微粒的制备是将羊抗兔IgG按比例与活化荧光胶乳微粒偶联反应制得，所述羊抗兔IgG与活化荧光胶乳微粒的混合比例为0.05:100～0.2:100。

本发明更进一步地，步骤1)中，所述活化剂包括1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐和N-羟基硫代琥珀酰亚胺，二者重量比为1:6～1:1，所述1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐与荧光胶乳微粒的重量比为1:100～5:100。三者混合后可在室温下反应0.5～1h。

本发明进一步地，步骤1)中，所述HER-2单克隆抗体与活化荧光胶乳微粒的混合比例为0.05:100～0.2:100，混合后可在室温下偶联反应1～5h；所述HER-2单克隆抗体荧光胶乳微粒和羊抗兔IgG荧光胶乳微粒相混合的比例2:1～6:1，混合后室温下偶联反应1～5h。

本发明进一步地，步骤1)中，将混合荧光胶乳微粒用荧光探针微球稀释液稀释2～6倍，以2～6ul/cm的速度均匀喷在宽度为0.7～1.3cm的玻璃纤维上，在30～55℃下干燥2～24h后制得探针固定垫。

本发明进一步地，所述荧光探针微球稀释液为含有蔗糖、牛血清白蛋白和表面活性剂的缓冲液，所述缓冲液包括PBS缓冲液、Tris缓冲液、MES缓冲液、HEPES缓冲液中的一种或几种，所述表面活性剂为吐温20或吐温80。

本发明进一步地，步骤3)中，所述缓冲液包括PBS缓冲液、Tris缓冲液、甘氨酸缓冲液、MES缓冲液、HEPES缓冲液中的一种或几种，所述表面活性剂为吐温20、吐温80、曲拉通X-100或聚乙二醇，所述防腐剂为叠氮钠或proclin，所述分散剂为聚乙烯吡咯烷酮10K、聚乙烯吡咯烷酮40K或聚乙烯醇。

另一方面，本发明一种HER-2的荧光免疫层析检测试剂盒，包括试剂盒体以及稀释液瓶，所述试剂盒体包括，所述免疫层析检测卡包括PVC衬板以及固定在PVC衬板上的样品垫、探针固定垫、硝酸纤维素膜和吸水纸，所述样品垫搭接在探针固定垫上，所述探针固定垫和吸水纸分别搭接在所述硝酸纤维素膜两侧，所述硝酸纤维素膜上设置有检测线和控制线，所述检测线内包被有HER-2单克隆抗体，所述控制线内包被有羊抗兔IgG；所述探针固定垫为由HER-2单克隆抗体荧光胶乳微粒和羊抗兔IgG荧光胶乳微粒的混合荧光胶乳微粒干燥制得，在所述稀释液瓶中存放有样品稀释液。

本发明进一步地，所述免疫层析检测卡还包括壳体，所述壳体上设置有加样孔、检测窗口、编码区域和把手，所述加样孔位于所述样品垫处，所述检测窗口位于所述检测线和控制线处，所述编码区域位于检测窗口和把手之间，所述把手位于所述壳体上位于靠近吸水纸的一侧。

借由上述方案，本发明至少具有以下优点：

①采用本发明荧光免疫层析方法，实现HER-2体外灵敏度高、准确度高、操作简单、成本低的定量检测。

②本发明荧光免疫层析方法，检测线区域采用能与HER-2形成复合物的HER-2单克隆抗体，配套探针则使用荧光胶乳微粒标记的HER-2单克隆抗体；控制线区域包被有兔IgG抗体，配套探针使用羊抗兔IgG抗体标记的荧光胶乳微粒。该控制线与检测线独立反应，互不影响和干扰。利用控制线信号可以准确判定探针分散在混合液体中的质量，用于校正检测线信号。

③本发明荧光免疫层析方法，荧光乳胶微粒需要先与白蛋白进行偶联，然后再与HER-2单克隆抗体进行偶联，减少检测过程中双夹心结构的空间阻力，使其能检测更低浓度的HER-2。

④本发明制备的HER-2检测试剂盒，储存方便、检测灵敏度高，可检测血液样本中浓度低至10pg/ml的HER-2，使用的检测仪器简单，操作简单，无需专业操作人员，同时具有检测快速的优点，10～20分钟即可得到检测结果。

⑤本发明制备的HER-2检测试剂盒，由于预先对样品垫的特殊处理和样品稀释液的改进，适用范围广，对血清、血浆和全血都能进行检测。

上述说明仅是本发明技术方案的概述，为了能够更清楚了解本发明的技术手段，并可依照说明书的内容予以实施，以下以本发明的较佳实施例并配合附图详细说明如后。

附图说明

图1是本发明中免疫层析试纸条的结构示意图；

图2是本发明中试剂卡的结构示意图。

图中各附图标记的含义如下。

1PVC衬板2样品垫

3探针固定垫4硝酸纤维素膜

5检测线6控制线

7吸水纸8加样孔

9壳体10检测窗口

11编码区域12把手

具体实施方式

下面对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整的描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例，不用来限制本发明的范围。基于本发明的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

本发明的HER-2的荧光免疫层析检测方法，包括以下步骤：

步骤1)探针固定垫制备：将发射光波长为500～590nm的带有羧基或氨基的荧光胶乳微粒溶液加入活化剂1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC)和N-羟基硫代琥珀酰亚胺(Sulfo-NHS)室温下反应0.5～1h，其中，N-羟基硫代琥珀酰亚胺(Sulfo-NHS)与1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC)的重量比为1:1～6:1，1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC)与荧光胶乳微粒的重量比为1:100～5:100，离心、洗涤后得到活化荧光胶乳微粒。

应当说明的是⑴本发明上述发射光波长为500～590nm荧光胶乳在市面上容易获得，因而在保证检测精度的前提下，经济性和适用性较高；⑵EDC与荧光胶乳微粒的重量比小于1:100时，胶乳微粒的活化率很低，偶联微球上抗体的结合很少，检测时的灵敏度低；EDC与荧光胶乳微粒的重量比大于5:100时，胶乳微粒的活化率随EDC量增加而增加的幅度有限，成本升高，最佳比例为1:100；⑶EDC与Sulfo-NHS的重量比小于1:1，活化的胶乳微粒易水解，降低了活化效率；EDC与Sulfo-NHS的重量比大于6:1，胶乳微粒的活化率已达到饱和，成本上升，最佳比例为1:3；⑷活化时间小于0.5h，活化的效率不高，浪费原材料；活化时间大于2h，活化的速度小于活化物质水解的速度，降低了活化效率，最佳活化时间1h。

本发明将白蛋白与活化荧光胶乳微粒的按比例0.05:100～0.2:100混合，室温下偶联反应2～5h，得到白蛋白荧光胶乳微粒。将羊抗兔IgG与活化荧光胶乳微粒按比例0.05:100～0.2:100混合，室温下偶联反应2～5h，得到羊抗兔IgG荧光胶乳微粒。HER-2单克隆抗体与活化的白蛋白荧光胶乳微粒的混合比例为0.05:100～0.2:100，混合后室温下偶联反应1～5h。

应当说明的是⑴HER-2单克隆抗体与荧光胶乳微粒的重量比小于0.05:100时，偶联效率高，但是浪费胶乳微粒，胶乳微粒的大部分活化点未结合抗体，而大于0.2:100时，胶乳微粒的大部分的活化点已被结合，继续增加HER-2单克隆抗体的量对偶联效率无明显影响，原料浪费，最佳比例为0.12：100；⑵反应时间与偶联率有关，时间过短小于1小时，则抗体与胶乳微粒的结合较少，不经济，时间过长大于5小时，则偶联率增加有限，浪费时间，最佳反应时间3h。

本发明按2:1～6:1的比例混合HER-2单克隆抗体荧光胶乳微粒和羊抗兔IgG荧光胶乳微粒，得到混合荧光胶乳微粒，将混合荧光胶乳微粒用荧光探针微球稀释液稀释2～6倍，以2～6ul/cm的速度均匀喷在宽度为0.7～1.3cm的玻璃纤维上，在30～55℃下干燥2～24h。荧光探针微球稀释液为含有蔗糖、牛血清白蛋白和表面活性剂的缓冲液，所述缓冲液包括PBS缓冲液、Tris缓冲液、MES缓冲液、HEPES缓冲液中的一种或几种，所述表面活性剂为吐温20、吐温80。

应当说明的是⑴探针保存在样品稀释液中易团聚，将其用荧光探针微球稀释液稀释喷在玻璃纤维上干燥制成探针固定垫，荧光探针微球稀释液的组分可以使得探针均匀分散，避免探针之间的团聚；探针固定垫上的探针在缓慢释放时，能够减缓免疫反应，让反应时间更长，检测信号更强；⑵喷金速度过慢会导致探针溶液过少，在玻璃纤维上分散不均匀，喷金速度过快会导致玻璃纤维过早饱和，探针溶液渗透到喷金平台上，造成实验误差，放大批内差；⑶探针固定垫的干燥时间不易过长，在制成免疫层析试纸条后还需要继续干燥，本步骤只需要将水分充分干燥。

步骤2)免疫层析试纸条制备：将样品垫、探针固定垫、层析膜、吸水纸依次贴在PVC衬板上，采用划膜喷金机将HER-2单克隆抗体和兔IgG分别包被在层析试纸的检测线(T线)和控制线(C线)上，37℃干燥12～36h后经切条机切割得到3～5mm宽度的免疫层析试纸条，上述层析膜优选硝酸纤维素。

应当说明的是⑴传统的定性免疫层析技术采用包被羊抗鼠抗体作为控制线，随着血清中HER-2或一些抗鼠源抗体阻断剂的增加，控制线上的信号随之降低，其信号值就不能用于计算，测试线的信号的准确性也没有了参考依据。本发明羊抗兔IgG抗体采用兔IgG抗体和羊抗鸡抗体作为控制线配对，C线与T线的反应独立进行，无交叉影响，从而能避免C线与T线彼此竞争探针微粒而产生的重复性偏差；⑵干燥时间小于12h，抗体在硝酸纤维素膜上的结合效率低，产品检测信号会随保存时间的延长产生变化，导致HER-2的检测限升高和检测不稳定，干燥时间大于36h，抗体容易失活，导致检测的灵敏度降低，最佳的干燥时间为24h；⑶免疫层析试纸条的宽度小于3mm时，切割机的精密度对免疫层析试纸条的影响较大，会降低检测结果的重复性，免疫层析试纸条的宽度大于5mm时，会增加检测卡的成本，最优化的免疫层析试纸条为4mm。

步骤3)样品稀释液制备：样品稀释液为含有牛血清白蛋白、表面活性剂和防腐剂的缓冲液。该缓冲液包括PBS缓冲液、Tris缓冲液、甘氨酸缓冲液、MES缓冲液、HEPES缓冲液中的一种或几种，表面活性剂为吐温20、吐温80、曲拉通X-100或聚乙二醇，防腐剂为叠氮钠或proclin，所述分散剂为聚乙烯吡咯烷酮10K、聚乙烯吡咯烷酮40K或聚乙烯醇。

上述proclin防腐剂，其活性成分主要是2-甲基-4-异噻唑啉-3-酮(MCI)和5-氯-2-甲基-4-异噻唑啉-3-酮(CMCI)，是新一代高效生物防腐剂。这两种成分抑制细胞的生长以及促使细胞凋亡的原理相同。活性成分在与细胞膜接触几分钟后，立即可以渗透到膜内并抑制细胞内酶的活性。目标酶处于细胞代谢KREBS循环的中心位置，ProClin防腐剂作用KREBS循环(三羧酸循环)的四个不同位置：丙酮酸脱氢酶，a-酮戊二酸脱氢酶，琥珀酸脱氢酶和NADH脱氢酶。从而抑制细胞生长代谢、大分子的合成、引起细胞内能量水平迅速下降。由于能量体系的崩溃，细胞不能合成日常代谢所需要的化合物。所有的细菌及真菌至少拥有部分KREBS循环，所以ProClin防腐剂的适用的范围非常广泛。其次，ProClin防腐剂具有多标靶作用位点，因此大大降低了因变异产生的微生物的耐药性。随着KREBS循环被阻断，细胞产生能量和合成酶等生物活性物质的能力迅速下降，但其使用剂量却保持比较低的水平对人畜无害，可以有效地控制体外诊断试剂中微生物的生长。因而具有广谱抗菌性、作用速度快、使用剂量少、PH适用范围广(PH2～8.5)、化学稳定性好、毒性较低、与水任意比混合等特点。

应当说明的是⑴牛血清白蛋白有流动封闭的作用，能与人血清或血浆中的杂蛋白结合，封闭硝酸纤维素膜上的空白位点，降低探针在膜上的残留和非特异性结合，减少假阳信号；⑵表面活性剂能够改善待检测样品和探针的亲水性，使得样品和探针在NC膜上的结合和分布更均匀，避免了基底信号波动和免疫反应不均匀对信号的影响；⑶防腐剂延迟或抑制微生物的生长，避免样品稀释液的腐败；d)缓冲液用于调节免疫反应的反应环境，降低不同人血清的差异和血清血浆的差异对反应体系的影响。

步骤4)样品检验：取出一定量的血清或血浆加入样品稀释液中，待混合均匀后滴加至免疫层析免疫层析检测卡上进行免疫层析反应，随后在荧光检测器下采用与荧光胶乳微粒相对应的发射光波长进行荧光检测。如图1和图2所示，混合液体渗透到样品垫2上，混合液体经玻璃纤维过滤杂质和处理后到达探针固定垫3，其中的HER-2与探针上的HER-2单克隆抗体结合成复合物，复合物顺着硝酸纤维素膜4渗透到检测线上5，与固定在检测线5上的HER-2单克隆抗体形成双抗体夹心的新复合物，检测线5上的HER-2单克隆抗体与探针中的HER-2单克隆抗体，其在HER-2上的表位不同。剩余的抗原-荧光标记的抗体复合物、未结合的标记有荧光胶乳微粒的HER-2单克隆抗体沉淀即HER-2单克隆抗体荧光胶乳微粒抗体、以及标记有荧光胶乳微粒的羊抗兔IgG继续渗透到控制线6，标记有荧光胶乳微粒的羊抗兔IgG会与控制线6上固定的兔IgG结合形成抗原-抗体复合物。荧光检测器下荧光检测时，仅在控制线6上检测到信号，才能证明检测结果是有效的。

如图1至2所示，本发明基于上述方法还提供一种HER-2的荧光免疫层析检测试剂盒，包括试剂盒体以及稀释液瓶，试剂盒体包括PVC衬板1以及固定在PVC衬板上的样品垫2、探针固定垫3、硝酸纤维素膜4和吸水纸7，样品垫搭接在探针固定垫上，探针固定垫3和吸水纸7分别搭接在硝酸纤维素膜的两侧，硝酸纤维素膜上设置有检测线5和控制线6，检测线5和控制线6内分别包被有HER-2单克隆抗体和兔IgG；探针固定垫3为由HER-2单克隆抗体和羊抗兔IgG的混合荧光胶乳微粒经喷金干燥制得，稀释液瓶中存放有样品稀释液。免疫层析检测卡还包括壳体9，壳体9上设置有加样孔8、检测窗口10、编码区11和把手12，加样孔8位于样品垫2处，检测窗口10位于检测线5和控制线6处，编码区11位于检测窗口10和把手12之间，把手12位于壳体上位于靠近吸水纸7的一侧。

本发明检测试剂盒使用时，取一定量的血清或血浆样品加入到样品稀释液中，混合均匀后加入到加样孔8中即可。随后在荧光检测器下采用与荧光胶乳微粒对应的发射光波长进行荧光检测。混合液体渗透到样品垫2上，经玻璃纤维过滤杂质和处理后到达探针固定垫3，其中的HER-2与探针上的HER-2单克隆抗体结合成复合物，复合物顺着硝酸纤维素膜4渗透到检测线5上，与固定在检测线5上的HER-2单克隆抗体形成双抗体夹心的新复合物，检测线5上的HER-2单克隆抗体与探针中的HER-2单克隆抗体，其在HER-2上的表位不同。剩余的抗原-荧光标记的抗体复合物、未结合的标记有荧光胶乳微粒的HER-2单克隆抗体沉淀即HER-2单克隆抗体荧光胶乳微粒抗体、以及标记有荧光胶乳微粒的羊抗兔IgG继续渗透到控制线6，标记有荧光胶乳微粒的羊抗兔IgG会与控制线6上固定的兔IgG结合形成抗原-抗体复合物。荧光检测器下荧光检测时，仅在控制线6上检测到信号，才能证明检测结果是有效的。

上述本发明的检测用荧光检测器，包含激发检测模块、前置放大模块、控制分析模块以及软件系统。其中激发检测模块的光源为发射波长为400～600nm的发光二极管，前置放大模块为一前置放大电路。

〖实施例〗HER-2的荧光免疫层析检测

第一步：探针固定垫的制备

1)取200μl发射光波长为590nm的荧光胶乳微粒溶液(含羧基)用pH6.0MES缓冲液洗涤离心分离三次后，沉淀用pH6.0MES缓冲液稀释，加入5mgEDC和15mgSulfo-NHS混匀后，在室温下反应活化30min，离心分离后，沉淀继续用pH6.5MES缓冲液洗涤三遍，随后沉淀用pH6.5MES缓冲液稀释，加入100μg鼠血清白蛋白，室温下反应3h，加入含牛血清白蛋白的乙醇胺溶液封闭，继续反应1h，离心后沉淀用pH7.4PBS缓冲液洗涤四次，得到标记有荧光胶乳微粒的鼠血清白蛋白沉淀即鼠血清白蛋白荧光胶乳微粒，同理可以得到标记有荧光胶乳微粒的羊抗兔IgG沉淀即羊抗兔IgG荧光胶乳微粒，将沉淀重悬在200μlpH7.4PBS缓冲液中，加入0.6μlproclin，在4℃下保存；按同样的方法将标记有荧光胶乳微粒的鼠血清白蛋白活化偶联HER-2单克隆抗体得到标记有荧光胶乳微粒的HER-2单克隆抗体沉淀，将沉淀重悬在200μlpH7.4PBS缓冲液中，加入0.6μlproclin，在4℃下保存。

2)将HER-2单克隆抗体荧光胶乳微粒与羊抗兔IgG荧光胶乳微粒按体积比6:1混合，将混合得到的混合胶乳微粒与2倍体积的荧光探针微球稀释液漩涡混合，得到探针溶液，以4ul/cm的速度均匀喷在宽度为1cm的玻璃纤维上，在37℃下干燥4h。

第二步：免疫层析检测卡的制备

在衬板上依次粘贴硝酸纤维素膜4、探针固定垫3、样品垫2和吸水纸7，样品垫2搭接在探针固定垫3上，探针固定垫3和吸水纸7搭接在硝酸纤维素膜4上，并且紧密相连。分别将与荧光胶乳微粒标记的HER-2单克隆抗体位于不同表位另一株HER-2单克隆抗体(包被抗体)和羊抗兔IgG用包被液分别配制成1mg/ml和1mg/ml的抗体包被液。将HER-2单克隆抗体包被液和兔IgG包被液以1μl/cm的线速包被在硝酸纤维素膜4上对应的检测线5和控制线6上，检测线5和控制线6间隔6mm，在湿度<30％条件下37℃烘干24h后，制成荧光免疫层析试纸板。

用切条机将制备好的荧光免疫层析试纸板纵向切成4mm宽的荧光免疫层析试纸条，将其放入卡壳内经压壳机处理得到免疫层析检测卡。

第三步：样品稀释液的配制

取0.02MpH7.0的PBS缓冲液1L，加入8ml吐温20，5.1g牛血清白蛋白和0.19g叠氮钠，超声直至固体全部溶解混合均匀。

第四步：样本检测

1)线性、检测限和精密度评估：

采用阴性牛血清作为稀释液，将HER-2标准品配制成浓度为2000、1800、1600、1400、1200、1000、800、600、400、200和0pg/ml的标准品溶液，取标准品100μl加入100μl样品稀释液，吹打15次后取100μl加入到加样孔8中，15分钟后采用荧光检测器检测。结果表明，线性的相关系数r^2大于0.99，检测限为10pg/ml，各浓度的检测变异系数均小于8％。

2)线性参数的验证：

采用低值人血清和高值人血清，配制浓度为2000、1600、1200、800和400pg/ml的HER-2人血清溶液，每个样本重复4次，结果表明，r^2大于0.99，最高检测范围可达到2000pg/ml。

3)准确度的评估：

采用HER-2浓度为40pg/ml的人血清样本作为基础样本，加入同体积不同浓度的HER-2标准物人血清，配制成浓度为1400、1000、600和500pg/ml的HER-2人血清溶液。另一份样本加入相同体积的阴性人血清，对回收样本和基础样本进行4次重复检测分析，并进行计算。结果表明，回收率在95％～105％范围内。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，并不用于限制本发明，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明技术原理的前提下，还可以做出若干改进和变型，这些改进和变型也应视为本发明的保护。

Claims (10)

1.一种HER-2的荧光免疫层析检测方法，其特征在于，包括以下步骤：

步骤1)探针固定垫制备：将HER-2单克隆抗体按比例与活化白蛋白荧光胶乳微粒偶联反应制得HER-2单克隆抗体荧光胶乳微粒，再将所述HER-2单克隆抗体荧光胶乳微粒与羊抗兔IgG荧光胶乳微粒按一定比例混合得到混合荧光胶乳微粒，所述混合荧光胶乳微粒用荧光探针微球稀释液稀释后喷在玻璃纤维上制得探针固定垫；

步骤2)免疫层析试纸条制备：将样品垫、探针固定垫、层析膜、吸水纸依次贴在PVC衬板上，将所述HER-2单克隆抗体包被在层析膜的检测线上，将羊抗兔IgG包被在层析膜控制线上，进而制得免疫层析试纸条；

步骤3)样品稀释液制备：将包括有牛血清白蛋白、表面活性剂、分散剂和防腐剂的混合物与缓冲液混合均匀制得样品稀释液；

步骤4)样品检验：取血清、血浆或全血样品混合至所述样品稀释液，加入免疫层析试纸条进行免疫层析反应，层析反应结束后经荧光检测器荧光检测。

2.根据权利要求1所述的HER-2的荧光免疫层析检测方法，其特征在于：步骤1)中，所述活化白蛋白荧光胶乳微粒的制备是先将荧光胶乳微粒与活化剂反应制得活化荧光胶乳微粒，再与白蛋白按比例偶联反应得白蛋白荧光胶乳微粒，所述白蛋白与活化荧光胶乳微粒的比例为0.05:100～0.2:100，所述白蛋白荧光胶乳微粒进一步与活化剂反应制得所述活化白蛋白荧光胶乳微粒，其中，所述白蛋白的种属包括人、牛、羊或鼠。

3.根据权利要求2所述的HER-2的荧光免疫层析检测方法，其特征在于：步骤1)中，所述羊抗兔IgG荧光胶乳微粒的制备是将羊抗兔IgG按比例与活化荧光胶乳微粒偶联反应制得，所述羊抗兔IgG与活化荧光胶乳微粒的混合比例为0.05:100～0.2:100。

4.根据权利要求2所述的HER-2的荧光免疫层析检测方法，其特征在于：步骤1)中，所述活化剂包括1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐和N-羟基硫代琥珀酰亚胺，二者重量比为1:6～1:1，所述1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐与荧光胶乳微粒的重量比为1:100～5:100。

5.根据权利要求1所述的HER-2的荧光免疫层析检测方法，其特征在于：步骤1)中，所述HER-2单克隆抗体与活化白蛋白荧光胶乳微粒的混合比例为0.05:100～0.2:100，所述羊抗兔IgG与活化荧光胶乳微粒的混合比例为0.05:100～0.2:100，所述HER-2单克隆抗体荧光胶乳微粒和羊抗兔IgG荧光胶乳微粒相混合的比例2:1～6:1。

6.根据权利要求1所述的HER-2的荧光免疫层析检测方法，其特征在于：步骤1)中，将混合荧光胶乳微粒用荧光探针微球稀释液稀释2～6倍，以2～6ul/cm的速度均匀喷在宽度为0.7～1.3cm的玻璃纤维上，在30～55℃下干燥2～24h后制得探针固定垫。

7.根据权利要求1所述的HER-2的荧光免疫层析检测方法，其特征在于：所述荧光探针微球稀释液为含有蔗糖、牛血清白蛋白和表面活性剂的缓冲液，所述缓冲液包括PBS缓冲液、Tris缓冲液、MES缓冲液、HEPES缓冲液中的一种或几种，所述表面活性剂为吐温20或吐温80。

8.根据权利要求1所述的HER-2的荧光免疫层析检测方法，其特征在于：步骤3)中，所述缓冲液包括PBS缓冲液、Tris缓冲液、甘氨酸缓冲液、MES缓冲液、HEPES缓冲液中的一种或几种，所述表面活性剂为吐温20、吐温80、曲拉通X-100或聚乙二醇，所述防腐剂为叠氮钠或proclin，所述分散剂为聚乙烯吡咯烷酮10K、聚乙烯吡咯烷酮40K或聚乙烯醇。

9.一种HER-2的荧光免疫层析检测试剂盒，包括试剂盒体以及稀释液瓶，所述试剂盒体包括免疫层析检测卡，所述免疫层析检测卡包括PVC衬板以及固定在PVC衬板上的样品垫、探针固定垫、硝酸纤维素膜和吸水纸，其特征在于：

所述样品垫搭接在探针固定垫上，所述探针固定垫和吸水纸分别搭接在所述硝酸纤维素膜两侧，所述硝酸纤维素膜上设置有检测线和控制线，所述检测线内包被有HER-2单克隆抗体，所述控制线内包被有羊抗兔IgG；

所述探针固定垫由HER-2单克隆抗体荧光胶乳微粒和羊抗兔IgG荧光胶乳微粒组成的混合荧光胶乳微粒干燥制得。

10.根据权利要求9所述的HER-2的荧光免疫层析检测试剂盒，其特征在于：所述免疫层析检测卡还包括壳体，所述壳体上设置有加样孔、检测窗口、编码区域和把手，所述加样孔位于所述样品垫处，所述检测窗口位于所述检测线和控制线处，所述编码区域位于检测窗口和把手之间，所述把手位于所述壳体上位于靠近吸水纸的一侧。