CN105385654A - 人工模拟骨髓微环境培养骨髓间充质干细胞的方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种人工模拟骨髓微环境培养骨髓间充质干细胞的方法，包括以下步骤：获取骨髓间充质干细胞，采用三维细胞培养支架于培养基中进行体外培养；其中，所述三维细胞培养支架是由胶原支架、纳米晶胶原基骨和脱细胞软骨三者中的至少两种组合制成的。采用两种及以上的三维细胞培养支架以人工模拟骨髓微环境进行培养骨髓间充质干细胞的方法，避免了单一的三维细胞培养支架生物相容性较低、细胞黏附性能弱等问题，从而可真正实现骨髓间充质干细胞的三维培养，不仅能够提高骨髓间充质干细胞的活性，而且还能够提高骨髓间充质干细胞的扩增率。

Description

人工模拟骨髓微环境培养骨髓间充质干细胞的方法

技术领域

本发明涉及细胞工程技术领域，特别涉及一种人工模拟骨髓微环境培养骨髓间充质干细胞的方法。

背景技术

骨髓间充质干细胞(Mesenchymaistemcells，MSCs)，是在骨髓中的一种类似成纤维细胞的一类细胞，具有多方向分化潜能，可以向骨组织、软骨组织、皮肤、造血干细胞支持介质、骨骼肌细胞及心肌细胞转化。自体骨髓间充质干细胞还具有取材方便、无免疫原性、具有多向分化潜能、合乎伦理学要求并且无致瘤性，具有其它干细胞不可比拟的优势，因此，探讨MSCs体外大量扩增具有深远意义。

目前骨髓间充质干细胞的体外扩增多采用二维培养方式进行的，也有部分采用三维细胞培养支架进行培养，但均是采用单一的三维细胞培养支架，由于单一的三维细胞培养支架存在机械性能弱，不稳固，且生物相容性差等问题，因此，在培养过程中，容易从三维细胞培养支架的三维培养方式转变成二维培养方式，使得骨髓间充质干细胞黏附性差，细胞活性差，且扩增不明显。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是，针对现有技术中采用单一的三维支架培养骨髓间充质干细胞存在生物相容性较低、细胞黏附性能弱等造成骨髓间充质干细胞扩增率不高、细胞活性差等缺陷，提供一种能够采用两种及以上的三维支架组合来模拟骨髓微环境进行骨髓间充质干细胞的培养方法。

本发明解决其技术问题所采用的技术方案是：提供一种人工模拟骨髓微环境培养骨髓间充质干细胞的方法，包括以下步骤：

获取骨髓间充质干细胞，采用三维细胞培养支架于培养基中进行体外培养；

其中，所述三维细胞培养支架是由胶原支架、纳米晶胶原基骨和脱细胞软骨三者中的至少两种组合制成的。

在本发明提供的人工模拟骨髓微环境培养骨髓间充质干细胞的方法中，获取骨髓间充质干细胞的步骤包括：采集骨髓，肝素抗凝，在percoll分离液中离心，取中层单核细胞，PBS缓冲液离心洗涤，弃上清液，即收获原代骨髓间充质干细胞。

在本发明提供的人工模拟骨髓微环境培养骨髓间充质干细胞的方法中，获取骨髓间充质干细胞的步骤还包括对原代骨髓间充质干细胞进行传代培养的过程，包括以下步骤：将原代骨髓间充质干细胞浓度调整至1×10⁶～1×10⁸个/25ml，加入所述培养基进行培养；当细胞生长到融合时，PBS漂洗，加入胰蛋白酶，见胞质回缩，细胞间隙增大后，加入含胎牛血清的DMEM培养基终止消化，按1：2～1：3比例接种进行传代培养至细胞生长到融合，继续传代至获得第三代骨髓间充质干细胞。

在本发明提供的人工模拟骨髓微环境培养骨髓间充质干细胞的方法中，采用三维细胞培养支架进行体外培养的步骤为：取三维细胞培养支架复溶，取第三代骨髓间充质干细胞，PBS清洗，胰酶-EDTA消化，以1×10⁸～1×10¹⁰L^-1细胞浓度与复溶后三维细胞培养支架共同接种于所述培养基中进行培养。

在本发明提供的人工模拟骨髓微环境培养骨髓间充质干细胞的方法中，三维细胞培养支架复溶过程中，还添加有助溶剂。

在本发明提供的人工模拟骨髓微环境培养骨髓间充质干细胞的方法中，所述助溶剂为乙酸或乙醇，且所述助溶剂的质量分数为5％-15％。

在本发明提供的人工模拟骨髓微环境培养骨髓间充质干细胞的方法中，所述培养基为血清培养基，且所述血清培养基中添加有10^-6～10^-8mol/L的氢化可的松、80-120U/ml的青霉素及80-120mg/ml的链霉素。

在本发明提供的人工模拟骨髓微环境培养骨髓间充质干细胞的方法中，所述胶原支架的制备过程，包括以下步骤：

取胶原溶于乙酸溶液中，获得胶原溶胀液；所述胶原溶胀液经真空脱泡处理后，于-5℃～-198℃温度下冷冻0.5～2小时，然后再进行冻干即可。

在本发明提供的人工模拟骨髓微环境培养骨髓间充质干细胞的方法中，所述纳米晶胶原基骨的制备过程，包括以下步骤：

制备钙磷比为1.0～2.5的溶液，加入Ⅰ型胶原溶液中，离心去上清，冷冻干燥，再加入聚乳酸即复合形成纳米晶胶原基骨三维框架材料。

在本发明提供的人工模拟骨髓微环境培养骨髓间充质干细胞的方法中，所述脱细胞软骨的制备过程，包括以下步骤：

取关节软骨浸泡于含有蛋白酶抑制剂的PBS缓冲液中，经粉碎、梯度离心制成软骨微丝，经脱细胞处理后，离心冲洗，加入DNA酶和RNA酶消化后，重复离心，收获沉淀物即脱细胞软骨。

实施本发明提供的人工模拟骨髓微环境培养骨髓间充质干细胞的方法，可以达到以下有益效果：通过采用胶原支架、纳米晶胶原基骨和脱细胞软骨中的两种或两种以上的组合作为三维细胞培养支架，不仅能够维持模拟骨髓微环境的三维多孔结构，而且提高了三维细胞培养支架的生物相容性，提高了骨髓间充质干细胞的吸附能力及生长增殖能力等，且本发明提供的三维细胞培养支架还能够释放出有利于骨髓间充质干细胞生长的细胞因子及营养物等，从而提高了骨髓间充质干细胞的增殖率及细胞活性，解决了现有技术中，采用单一三维细胞培养支架培养骨髓间充质干细胞存在支架机械性能弱等缺陷造成细胞增殖率低、易死亡等问题。

具体实施方式

为解决现有技术中采用单一的三维细胞培养支架培养骨髓间充质干细胞存在细胞活性差，增殖率低等缺陷，本发明的创新点在于提供一种采用两种及以上的三维细胞培养支架以人工模拟骨髓微环境进行培养骨髓间充质干细胞的方法，避免了单一的三维细胞培养支架生物相容性差、细胞黏附性弱等问题，从而可真正实现骨髓间充质干细胞的三维培养，不仅能够提高骨髓间充质干细胞的活性，而且还能够提高骨髓间充质干细胞的扩增率。

具体地，本发明提供的人工模拟骨髓微环境培养骨髓间充质干细胞的方法，包括以下步骤：

S1、获取骨髓间充质干细胞；

S2、采用三维细胞培养支架于培养基中进行骨髓间充质干细胞的体外培养；其中，三维细胞培养支架是由胶原支架、纳米晶胶原基骨和脱细胞软骨三者中的至少两种组合制成；胶原支架、纳米晶胶原基骨和脱细胞软骨均具有良好的机械性能，在体外培养过程中降解率较低或无降解变形，能够保留培养前的结构；但三者在单独使用时，存在生物相容性较低，细胞黏附率较低，生长增殖较缓慢，增值率较低的缺陷；本发明通过长期大量实验证明，将胶原支架、纳米晶胶原基骨和脱细胞软骨任意组合制成三维细胞培养支架，能够促进三维细胞培养支架的生物相容性，促进细胞黏附，增加细胞生长面积，从而提高了细胞生长增殖速率，提高了细胞增值率。

进一步地，步骤S1中还包括原代骨髓间充质干细胞的获取，及原代骨髓间充质干细胞的传代培养，具体为：

S11、原代骨髓间充质干细胞的获取：

采集骨髓，肝素抗凝，在percoll分离液中离心，取中层单核细胞，加入PBS缓冲液，离心洗涤，弃上清液，即收获原代骨髓间充质干细胞。

S12、对原代骨髓间充质干细胞进行传代培养至第三代骨髓间充质干细胞：

将原代骨髓间充质干细胞调整至1×10⁶～1×10⁸个/25ml，加入培养基进行培养，优选地，该培养基为血清培养基，且血清培养基中添加有10^-6～10^-8mol/L的氢化可的松、80-120U/ml的青霉素及80-120mg/ml的链霉素。当细胞生长到融合时，PBS漂洗2～3次，加入胰蛋白酶，见胞质回缩，细胞间隙增大后，加入含胎牛血清的DMEM培养基终止消化，按1：2～1：3比例传代接种培养至细胞生长到融合，重复上述操作继续传代，即PBS漂洗2～3次，加入胰蛋白酶，见胞质回缩，细胞间隙增大后，加入含胎牛血清的DMEM培养基终止消化，按1：2～1：3比例传代接种培养至细胞生长到融合，即获得第三代骨髓间充质干细胞。

步骤S2的具体过程为：

取三维细胞培养支架于蒸馏水中复溶，复溶过程中可添加助溶剂如乙酸或乙醇促进三维细胞培养支架溶解，优选地，助溶剂为乙酸，且乙酸的质量分数为5％-15％。取第三代骨髓间充质干细胞，PBS清洗，胰酶-EDTA消化，以1×10⁸～1×10¹⁰个/L细胞浓度与复溶后的三维细胞培养支架共同接种于培养基中进行培养。

优选地，该培养基为血清培养基，且血清培养基中添加有10^-6～10^-8mol/L的氢化可的松、80-120U/ml的青霉素及80-120mg/ml的链霉素。其中，氢化可的松能够参与细胞的糖代谢、脂类代谢等，调节骨髓间充质干细胞的增值，促进骨髓间充质干细胞功能表达。青霉素能够阻碍细菌的细胞壁合成，导致细胞泄漏死亡，从而抑制细菌的生长；链霉素能够作用于细菌的核糖体，阻碍蛋白翻译，从而抑制细菌生长；自然环境下，不考虑人为产生的抗药性，对青霉素不敏感的绝大多数微生物对链霉素敏感，反之亦然；因此，最为优选地是将青霉素和链霉素搭配使用能够控制几乎全部常见的细菌，从而能够尽量避免细菌对骨髓间充质干细胞的生长及活性造成的不良影响。因此，采用该血清培养基培养间充质干细胞不仅可以促进骨髓间充质干细胞生长和增殖，而且可避免培养过程中产生的细菌对细胞活性造成的影响。

另外，该步骤中所采用的三维细胞培养支架可以是胶原支架与纳米晶胶原基骨的混合物、也可以是胶原支架与脱细胞软骨的混合物、纳米晶胶原基骨和脱细胞软骨的混合物，亦或是胶原支架、纳米晶胶原基骨和脱细胞软骨的混合物。

其中，胶原是具有三螺旋结构的蛋白质，不能被蛋白酶利用，不易被降解，而通过胶原制备的胶原支架不仅机械性能较好，而且具有一定的生物活性、生物相容性以及三维多孔结构。

纳米晶胶原基骨具有三维孔洞网络结构，机械强度较好，具有一定的生物相容性，但其生物相容性低于胶原支架。

因此，将胶原支架和纳米晶胶原基骨组合在一起作为三维细胞培养支架，能够提高三维细胞培养支架整体的机械性能和生物相容性及生物活性，以更好地模拟骨髓微环境，并维持骨髓间充质干细胞生长的三维空间，促进骨髓间充质干细胞的生长和增殖，并提高骨髓间充质干细胞的细胞活性。优选地，三维细胞培养支架中含有的胶原支架的质量为0.2～1g，纳米晶胶原基骨的质量为0.2～1g。

脱细胞软骨是生物新鲜组织经过物理方法处理，脱去组织中的所有细胞、抗原等物质后所得到的产物，主要包括大量对细胞黏附、增殖有利的蛋白多糖和Ⅱ型胶原等，具有良好的生物相容性、柔韧性、低抗原性，在体外培养过程中无降解变形，保留了培养前的结构，其力学性质与天然的软骨很相近，还具有能提供对细胞黏附有益的信号分子，但脱细胞软骨不具有三维孔隙结构，细胞黏附面积较少，且造成细胞分布不均匀，接触培养基的面积较少等缺陷，因此，将脱细胞软骨配合具有三维多孔结构的纳米晶胶原基骨和/或胶原支架共同作为三维细胞培养支架可解决单独使用脱细胞软骨所存在的缺陷；而脱细胞软骨能够释放有利于细胞生长和增殖的营养因子，能够进一步提高三维细胞培养支架整体的生物相容性，从而可实现人工模拟骨髓三维微环境进行体外培养骨髓间充质干细胞，不仅可增加骨髓间充质干细胞的生长面积，使得骨髓间充质干细胞在三维细胞培养支架上分布均匀，提高骨髓间充质干细胞与培养基的接触面积，而且可促进骨髓间充质干细胞与三维细胞培养支架的黏附性，从而更有利于骨髓间充质干细胞的生长和增殖，并能够促进骨髓间充质干细胞保持其细胞活性及干细胞特性，不易分化。优选地，三维细胞培养支架中含有的胶原支架或纳米晶胶原基骨的质量为0.2～1g和脱细胞软骨匀浆的浓度为15-50g/L。

在本发明中，胶原支架的制备过程为：取胶原溶于乙酸溶液中，获得胶原溶胀液；胶原溶胀液经真空脱泡处理后，于-5℃～-198℃温度下冷冻0.5～2小时，然后再进行冻干即可。

纳米晶胶原基骨的制备过程为：制备钙磷质量分数比为1.0～2.5的溶液，加入Ⅰ型胶原溶液中，离心去上清，冷冻干燥，再加入聚乳酸即复合形成纳米晶胶原基骨三维框架材料；其中，钙磷质量分数比为1.0～2.5的溶液是由可溶性钙盐和可溶性磷酸盐的混合而成。

脱细胞软骨的制备过程为：取关节软骨浸泡于含有蛋白酶抑制剂的PBS缓冲液中，经粉碎、梯度离心制成软骨微丝，经脱细胞处理后，离心冲洗，加入DNA酶和RNA酶消化后，重复离心，收获沉淀物即脱细胞软骨。

为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合具体实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。

本发明中提供的胶原支架、纳米晶胶原基骨和脱细胞软骨的制备过程如下：

1、胶原支架的制备，包括以下步骤：

1)取新鲜牛腱，去除肌肉、脂肪，并尽可能去除筋膜；用三蒸水反复清洗后，装于PE自封袋中-30℃保存；

2)于冷冻状态下，用手术刀将牛腱削为薄片，然后于组织捣碎机中捣碎；

3)称取60克左右牛腱粉碎物，用0.05％(w/v)的醋酸洗必泰浸泡5min消毒，然后用0.9％的生理盐水多次洗涤，纱布过滤，尽可能洗去残留的醋酸洗必泰；

4)将消毒后的牛腱于含有0.25％胰酶的PBS消化液(pH＝7.4)中，37℃下消化24小时；

5)消化结束后，加入几滴H₂O₂，浸泡10-15分钟，去除残留的胰酶；然后用三蒸水反复清洗，洗去H₂O₂；

6)在消化好的牛腱中加入少量3％的乙酸溶液，用组织捣碎机搅拌为粘稠状混合物，再加入1000毫升3％的乙酸溶液，于4℃溶胀72小时；

7)用布氏漏斗将未溶胀的牛腱颗粒分离，溶胀物于离心机中离心(2000r/15min)，以分离不溶物；

8)用5％NaCl溶液盐析离心上清液；

9)沉淀物再经3％的乙酸溶胀后，重复步骤7)和8)；

10)然后于三蒸水中，用截留分子量为3000的透析袋4℃透析72h，每12h换水；

11)透析后的胶原经冷冻干燥后，于-20℃条件下保存。

将牛腱胶原溶于3％(w/v)(pH＝2.78)的乙酸溶液中，搅拌均匀形成浓度为0.5％(w/v)的胶原溶胀液。经过真空脱泡处理后，以每孔0.4ml注入24孔培养板中，于-20℃温度下冷冻1小时。然后于冷冻干燥机中冻干24小时，即获得胶原多孔支架。

2、纳米晶胶原基骨的制备，包括以下步骤：

将一定比例的磷酸钠溶液和氯化钙溶液(Ca/P＝1.66)添加入0.67g/L的Ⅰ型胶原溶液中，缓慢搅拌，调节溶液pH在7.4左右，48小时后离心去除上清，冷冻干燥。冻干后得到的粉末再与聚乳酸复合成形即得最终的纳米晶胶原基骨三维框架材料；纳米晶胶原基骨三维框架材料在PBS中漂洗30min共3次，在体积分数为95％的乙醇中浸泡2h，用无菌滤纸吸去多余液体，后研碎，γ射线照射消毒，备用。

3、脱细胞软骨的制备，包括以下步骤：

取牛股骨，将股骨头关节面软骨用手术刀切下，蒸馏水冲洗2遍，室温下将关节软骨浸泡于含0.035mmol/L蛋白酶抑制剂PMSF(Phenylmethanesulfonylfluoride，花絮物质苯甲基磺酰氟)的PBS缓冲液(pH7.5)中，经粉碎机粉碎、梯度离心制成软骨微丝；软骨微丝经脱细胞液脱细胞处理，其中，脱细胞液为：0.035mmol/LPMSF、l％TritonX-100(聚乙二醇辛基苯基醚)及pH7.5的Tris-HCl(Tris(hydroxymethyl)aminomethane，氨丁三醇)缓冲液；持续震荡48h，7000r/min×5min离心，PBS缓冲液冲洗，然后37℃下加入50U/mlDNA酶和1U/mlRNA酶消化2h，重复7000r/min5min离心，沉淀物用超纯水冲洗3遍后再配成浓度为30g/L的乳糜状悬液，-20℃冰箱中保存备用。

实施例1

本发明提供的人工模拟骨髓微环境培养骨髓间充质干细胞的方法，包括以下步骤：

S1a、制备三维细胞培养支架，本实施例中，三维细胞培养支架为胶原支架与纳米晶胶原基骨的混合物，其中，胶原支架与纳米晶胶原基骨的制备过程如上所述，在此不再赘述；

S2a、获取原代骨髓间充质干细胞；

采集骨髓标本，肝素抗凝。每份标本按1：2的比例加在密度为1.073g/ml的percoll分离液上，2300rpm转速下离心30min，取中层单核细胞，加入PBS缓冲液，1000rpm离心10min，洗涤3次，弃上清液，即获得原代骨髓间充质干细胞。

S3a、原代骨髓间充质干细胞的传代培养；

将步骤S2a中所获得的骨髓间充质干细胞调整至1×10⁷个/培养瓶(25ml)密度，并添加血清培养基进行培养，其中，血清培养基为含有10％胎牛血清、10^-6mol/L的氢化可的松、100U/ml的青霉素及100mg/ml链霉素的低糖DMEM培养基，葡萄糖的浓度为1500-4500mg/l。当细胞生长到95％以上完全融合时，倾去旧培养基，用PBS液漂洗2～3次，倾去PBS液，加入含0.02％EDTA的0.25％的胰蛋白酶，加入量以使胰蛋白酶可以完全覆盖瓶底的细胞为准。将培养瓶置于倒置显微镜下观察，见胞质回缩，细胞间隙增大后，立即加入含10％胎牛血清的低糖DMEM培养终止消化，吸管顺序轻轻吹打瓶底，倒置显微镜下观察细胞完全脱壁后，按1：2～1：3比例传代接种于25ml培养瓶，放置于37℃、5％CO₂、95％湿度的培养箱中培养，直至细胞生长到几乎完全融合时，再次进行传代，获得第三代骨髓间充质干细胞，继续培养3天。

S4a、取步骤S3a中获得的第三代骨髓间充质干细胞于三维细胞培养支架中进行培养；

分别取研碎后的纳米晶胶原基骨和胶原支架各0.25g于10ml3％乙酸和20ml蒸馏水中复溶后接种于培养板中；然后取第3代培养72h的骨髓间充质干细胞，吸除旧培养液，用PBS冲洗2次，0.25％胰酶-EDTA常规消化并收集细胞，以1×10⁹个/L细胞浓度接种于含有三维细胞培养支架的培养板中。第一天半量换培养液一次，之后的两天全部更换。

其中，该步骤所采用的培养液为含有10％胎牛血清、10^-6mol/L的氢化可的松、80U/ml的青霉素及80mg/ml链霉素的低糖DMEM培养液。

实施例2

与实施例1的不同之处在于，在本实施例中，三维细胞培养支架为胶原支架与脱细胞软骨的混合物，其中，胶原支架与脱细胞软骨的制备过程如上所述，在此不再赘述；

在该实施例中，采用三维细胞培养支架培养骨髓间充质干细胞的过程为：

取10ml30g/L的脱细胞软骨、0.5g研碎后的胶原支架于10ml3％乙酸和20ml蒸馏水中复溶后接种于细胞培养板中，取第3代培养72h的骨髓间充质干细胞，吸除旧培养液，用PBS冲洗2次，0.25％胰酶-EDTA常规消化并收集细胞，以1×10⁹L^-1浓度接种。第一天半量换培养液一次，之后的两天全部更换。

其中，该步骤所采用的培养液为含有10％胎牛血清、10^-7mol/L的氢化可的松、100U/ml的青霉素及100mg/ml链霉素的低糖DMEM培养液。

实施例3

与实施例1的不同之处在于，在本实施例中，三维细胞培养支架为纳米晶胶原基骨和脱细胞软骨的组合，其中，纳米晶胶原基骨和脱细胞软骨的制备过程如上所述，在此不再赘述；

在该实施例中，采用三维细胞培养支架培养骨髓间充质干细胞的过程为：

取10ml30g/L的脱细胞软骨和研碎后的纳米晶胶原基骨0.25g于10ml3％乙酸和20ml蒸馏水中复溶后接种于细胞培养板中，取第3代培养72h的骨髓间充质干细胞，吸除旧培养液，用PBS冲洗2次，0.25％胰酶-EDTA常规消化并收集细胞，以1×10⁹L^-1浓度接种。第一天半量换培养液一次，之后的两天全部更换。

其中，该步骤所采用的培养液为含有10％胎牛血清、10^-8mol/L的氢化可的松、120U/ml的青霉素及120mg/ml链霉素的低糖DMEM培养液。

实施例4

与实施例1的不同之处在于，在本实施例中，三维细胞培养支架为胶原支架、纳米晶胶原基骨和脱细胞软骨三者的混合物，其中，胶原支架、纳米晶胶原基骨和脱细胞软骨的制备过程如上所述，在此不再赘述；

在该实施例中，采用三维细胞培养支架培养骨髓间充质干细胞的过程为：

取10ml30g/L的脱细胞软骨、研碎后的胶原支架和纳米晶胶原基骨各0.25g于10ml3％乙酸和20ml蒸馏水中复溶后接种于细胞培养板中，取第3代培养72h的骨髓间充质干细胞，吸除旧培养液，用PBS冲洗2次，0.25％胰酶-EDTA常规消化并收集细胞，以1×10⁹L^-1浓度接种。第一天半量换培养液一次，之后的两天全部更换。

其中，该步骤所采用的培养液为含有10％胎牛血清、10^-6mol/L的氢化可的松、100U/ml的青霉素及100mg/ml链霉素的低糖DMEM培养液。

为进一步验证本发明提供的人工模拟骨髓微环境培养骨髓间充质干细胞的方法的显著效果，通过以下实验及实验数据进行具体说明。

检测对象

检测组1-4分别对应本发明实施例1-4骨髓间充质干细胞与三维细胞培养支架共培养第3天所获得的细胞；

对照组1-3—分别对应单独采用胶原支架、纳米晶胶原基骨和脱细胞软骨4支架中任意一种培养骨髓间充质干细胞第3天所获得的细胞；

检测一、台盼蓝法进行细胞计数

取检测组1-4及对照组1-3的细胞，分别执行以下操作：

用75％酒精清洗计数板和盖玻片，用吸水纸擦干；在每次细胞补液前取10ul细胞悬液和10ul的0.4％苔盼蓝充分混合，再加80ul的PBS缓冲液稀释细胞悬液；吸取少量细胞悬液，加入在计数板上的盖玻片内，一定注意不要溢出至计数板上的小槽内，也不要过少或带气泡，在倒置显微镜下观察血球计数板上计数4个大方格内的细胞总数，并根据以下公式计算出细胞密度：细胞悬液密度计算公式—细胞密度＝(4个大格细胞总数/4)×10⁴×10(稀释倍数)个/ml。

表1：

检测结果：由表1中的数据可知，检测组1-4中的细胞密度均远大于对照组1-3中的细胞密度，由此说明，本发明提供的人工模拟骨髓微环境培养骨髓间充质干细胞的方法提高了骨髓间充质干细胞的增殖率。

检测二、流式细胞仪检测细胞表型CD44，CD90，CD105的阳性率

组别	CD44阳性率	CD90阳性率	CD105阳性率	CD34阳性率	CD45阳性率
						检测组1	99.75％	99.45％	99.39％	1.38％	1.41％
检测组2	99.67％	99.74％	99.44％	1.40％	1.31％
						检测组3	99.81％	99.30％	99.77％	1.39％	1.19％
检测组4	99.89％	99.70％	99.87％	1.59％	1.99％
						对照组1	88.37％	87.23％	89.93％	8.91％	8.68％
对照组2	89.32％	88.91％	90.03％	9.01％	9.08％
						对照组3	89.43％	86.65％	90.27％	9.01％	9.18％

检测结果：由表2中的数据可知，检测组1-4均大于对照组1-3中的数据，由此说明，检测组1-4所获得的骨髓间充质干细胞的活性较强。

综上所述，本发明提供的人工模拟骨髓微环境培养骨髓间充质干细胞的方法，通过采用骨基质明胶、壳聚糖水凝胶和脱细胞软骨中的两种或两种以上的组合作为三维细胞培养支架，不仅能够维持模拟骨髓微环境的三维多孔结构，而且提高了三维细胞培养支架的生物相容性，提高了骨髓间充质干细胞的吸附能力，并能够释放出有利于骨髓间充质干细胞生长的细胞因子及营养物等，从而提高了骨髓间充质干细胞的增殖率及细胞活性，解决了现有技术中，采用单一三维细胞培养支架培养骨髓间充质干细胞存在支架机械性能弱等缺陷造成细胞增殖率低、易死亡等问题。

以上结合对本发明的实施例进行了描述，但是本发明并不局限于上述的具体实施方式，上述的具体实施方式仅仅是示意性的，而不是限制性的，本领域的普通技术人员在本发明的启示下，在不脱离本发明宗旨和权利要求所保护的范围情况下，还可做出很多形式，这些均属于本发明的保护之内。

Claims (10)

1.一种人工模拟骨髓微环境培养骨髓间充质干细胞的方法，其特征在于，包括以下步骤：

获取骨髓间充质干细胞，采用三维细胞培养支架于培养基中进行体外培养；

其中，所述三维细胞培养支架是由胶原支架、纳米晶胶原基骨和脱细胞软骨三者中的至少两种组合制成的。

2.根据权利要求1所述的人工模拟骨髓微环境培养骨髓间充质干细胞的方法，其特征在于，获取骨髓间充质干细胞的步骤包括：采集骨髓，肝素抗凝，在percoll分离液中离心，取中层单核细胞，PBS缓冲液离心洗涤，弃上清液，即收获原代骨髓间充质干细胞。

3.根据权利要求2所述的人工模拟骨髓微环境培养骨髓间充质干细胞的方法，其特征在于，获取骨髓间充质干细胞的步骤还包括对原代骨髓间充质干细胞进行传代培养的过程，包括以下步骤：将原代骨髓间充质干细胞浓度调整至1×10⁶～1×10⁸个/25ml，加入所述培养基进行培养；当细胞生长到融合时，PBS漂洗，加入胰蛋白酶，见胞质回缩，细胞间隙增大后，加入含胎牛血清的DMEM培养基终止消化，按1：2～1：3比例接种进行传代培养至细胞生长到融合，继续传代至获得第三代骨髓间充质干细胞。

4.根据权利要求3所述的人工模拟骨髓微环境培养骨髓间充质干细胞的方法，其特征在于，采用三维细胞培养支架进行体外培养的步骤为：取三维细胞培养支架复溶，取第三代骨髓间充质干细胞，PBS清洗，胰酶-EDTA消化，以1×10⁸～1×10¹⁰L^-1细胞浓度与复溶后的三维细胞培养支架共同接种于所述培养基中进行培养。

5.根据权利要求4所述的人工模拟骨髓微环境培养骨髓间充质干细胞的方法，其特征在于，三维细胞培养支架复溶过程中，还添加有助溶剂。

6.根据权利要求5所述的人工模拟骨髓微环境培养骨髓间充质干细胞的方法，其特征在于，所述助溶剂为乙酸或乙醇，且所述助溶剂的质量分数为5％-15％。

7.根据权利要求3或4所述的人工模拟骨髓微环境培养骨髓间充质干细胞的方法，其特征在于，所述培养基为血清培养基，且所述血清培养基中添加有10^-6～10^-8mol/L的氢化可的松、80-120U/ml的青霉素及80-120mg/ml的链霉素。

8.根据权利要求1所述的人工模拟骨髓微环境培养骨髓间充质干细胞的方法，其特征在于，所述胶原支架的制备过程，包括以下步骤：

取胶原溶于乙酸溶液中，获得胶原溶胀液；所述胶原溶胀液经真空脱泡处理后，于-5℃～-198℃温度下冷冻0.5～2小时，然后再进行冻干即可。

9.根据权利要求1所述的人工模拟骨髓微环境培养骨髓间充质干细胞的方法，其特征在于，所述纳米晶胶原基骨的制备过程，包括以下步骤：

制备钙磷比为1.0～2.5的溶液，加入Ⅰ型胶原溶液中，离心去上清，冷冻干燥，再加入聚乳酸即复合形成纳米晶胶原基骨三维框架材料。

10.根据权利要求1所述的人工模拟骨髓微环境培养骨髓间充质干细胞的方法，其特征在于，所述脱细胞软骨的制备过程，包括以下步骤：

取关节软骨浸泡于含有蛋白酶抑制剂的PBS缓冲液中，经粉碎、梯度离心制成软骨微丝，经脱细胞处理后，离心冲洗，加入DNA酶和RNA酶消化后，重复离心，收获沉淀物即脱细胞软骨。