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CN105384803A - 一种日本血吸虫重组蛋白SjSAPLP4及其编码基因与应用 - Google Patents

一种日本血吸虫重组蛋白SjSAPLP4及其编码基因与应用 Download PDF

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CN105384803A CN201510818639.5A CN201510818639A CN105384803A CN 105384803 A CN105384803 A CN 105384803A CN 201510818639 A CN201510818639 A CN 201510818639A CN 105384803 A CN105384803 A CN 105384803A
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Abstract

本发明提供了一种日本血吸虫重组蛋白SjSAPLP4及其编码基因与应用。本发明的蛋白具有如SEQ？ID？No.2所示的氨基酸序列，或该序列经替换、缺失和/或添加一个或几个氨基酸残基形成的具有同等功能的氨基酸序列。本发明还提供了编码上述蛋白的基因序列。本发明的重组蛋白SjSAPLP4免疫原性好，可作为优良的诊断抗原，用于制备高灵敏度、高特异性的日本血吸虫诊断试剂盒，还可用于制备抗血吸虫疫苗以及作为潜在的药物作用靶点，筛选治疗日本血吸虫病的药物。

Description

一种日本血吸虫重组蛋白SjSAPLP4及其编码基因与应用
技术领域
本发明涉及生物技术领域，具体的说，涉及一种日本血吸虫重组蛋白SjSAPLP4及其编码基因与应用。
背景技术
血吸虫病是一种严重威胁人类健康的传染性寄生虫疾病，主要流行于亚非拉的76个国家和地区，全球有2亿多人受到感染，另有近8亿人受其感染威胁。我国流行的是日本血吸虫病，经过几十年的不懈努力，我国血吸虫病防治工作取得了举世瞩目的成就，血吸虫病在流行地区得到了控制，但实现最终消除血吸虫病的目标依然任重而道远。
诊断是血吸虫病防治领域的中心环节。精确的诊断技术不仅对血吸虫病患者的早发现早治疗具有重要临床意义，还可为血吸虫病流行区等级提供判断标准、为评估流行态势和考核防控效果提供必不可少的信息和科学依据。缺乏高效精确的诊断技术是血吸虫病无法彻底消除的一个重要原因。随着我国血吸虫防治工作力度的加大，血吸虫病在我国趋于一种低度感染的流行趋势。这些轻度感染的血吸虫病患者如果不能及时得到确诊和治疗，其排泄物中所含的虫卵将引起血吸虫病的持续流行传播。因此，研发新的具有高灵敏性和特异性的血吸虫病诊断方法势在必行。
目前，血吸虫病的诊断多依赖于寄生虫形态学检测方法，例如世界卫生组织(WHO)推荐的改良加藤法(Kato-Katz)。这种方法主要通过检查病人粪便或尿液中的血吸虫虫卵来诊断疾病，不但费时费力，而且对轻度血吸虫感染诊断的敏感性较低，不适合用于大规模的血吸虫病现场监测。相比于传统的形态学诊断方法，酶联免疫吸附试验(Enzyme-linkedimmunesorbentassay,ELISA)诊断方法具有操作简便快捷和更高的灵敏性，且可用于大规模现场监测。目前，用于血吸虫病免疫诊断的最常用的抗原是提取血吸虫虫体的成虫抗原组分(Adultwormantigen,AWA)和虫卵抗原组分(Solubleeggantigen,SEA)，由于这两种粗提抗原的成分复杂(由上千种血吸虫蛋白组成)，且与其他寄生虫感染血清存在着较严重的交叉反应，血吸虫病诊断的特异性不高，生产的试剂不宜标准化。
依靠基因工程技术生产的血吸虫重组抗原分子具有成分简明、交叉反应少、可大规模批量生产等优点，被认为是理想的血吸虫病诊断和防治的靶标抗原分子。2014年，我国科学家报道了一个日本血吸虫病免疫诊断标识分子(SjSP-13)，并将其研制为rSP13-ELISA试剂盒，其诊断敏感性比传统形态学方法提高了6倍，该研究成果在国际顶级学术期刊《柳叶刀·传染病》杂志以论著形式在线发表。然而，该诊断试剂盒的敏感性(90％)尚存进一步提升的空间。
本发明利用生物信息学方法对日本血吸虫全基因组编码基因预测分析发现其基因组中存在一个鞘脂激活蛋白样蛋白(SchistosomajaponicumSaposin-likeprotein，SjSAPLP)家族，该基因家族共有15SjSAPLP基因组成，而SjSP-13即为其中一员。本发明通过序列比对分析发现SjSAPLP家族成员之间的序列同源性极低，其中SjSAPLP4与已报道的SjSP-13之间的氨基酸序列同源性低于30％。在本发明之前，还没有出现涉及本发明日本血吸虫SjSAPLP4重组抗原蛋白及其用于日本血吸虫病诊断的公开报道。本发明将SjSAPLP4和SjSP-13经基因克隆并在大肠杆菌中重组表达，ELISA试验比较分析了两个重组蛋白用于日本血吸虫病的诊断具有高敏感性和特异性，以期寻找敏感度更高、特异性更好的血吸虫病免疫诊断抗原。
发明内容
本发明的一个目的在于提供一种敏感度高、特异性好的日本血吸虫重组蛋白。
本发明的另一目的在于提供该重组蛋白在日本血吸虫血清学诊断、疫苗研制和治疗药物筛选中的应用。
本发明的技术方案为：首先利用分子生物学技术对日本血吸虫SjSAPLP4基因进行PCR扩增并克隆至表达质粒载体pET-28a(+)构建成日本血吸虫SjSAPLP4基因原核表达的重组质粒pET-28a(+)-SjSAPLP4，通过转化筛选，质粒测序鉴定确认后，转化至大肠肝菌宿主细胞中进行重组蛋白诱导表达；包涵体蛋白经变性和镍柱亲和层析纯化，最终得到纯化的重组蛋白SjSAPLP4，完成了SjSAPLP4基因的体外克隆表达及纯化。利用Westernblotting技术验证了纯化的SjSAPLP4重组蛋白可被感染日本血吸虫的实验动物血清及血吸虫病人血清识别。进而以纯化的SjSAPLP4重组蛋白为诊断抗原进行血吸虫病诊断试剂和试剂盒的制备，通过ELISA技术分析评价了其在血吸虫病免疫诊断中的应用价值并分析了抗SjSAPLP4抗体在感染动物血清中的变化规律。最后利用荧光实时定量PCR技术分析了SjSAPLP4基因在日本血吸虫不同发育阶段的基因表达规律。
由此，本发明提供一种日本血吸虫重组蛋白SjSAPLP4，其氨基酸序列为：
a)SEQIDNo.2所示的氨基酸序列；或
b)SEQIDNo.2所示的氨基酸序列经替换、缺失和/或添加一个或几个氨基酸残基形成的具有同等功能的氨基酸序列。
应当理解，本领域技术人员可根据本发明公开的蛋白SjSAPLP4的氨基酸序列(SEQIDNo.2)，取代、缺失和/或增加一个或几个氨基酸，得到所述蛋白的突变序列。因此，本发明的日本血吸虫重组蛋白SjSAPLP4还包括SEQIDNo.2所示氨基酸序列经取代、缺失或增加一个或几个氨基酸，具有与重组蛋白SjSAPLP4同等活性的由SjSAPLP4衍生得到的蛋白质。
进一步地，本发明提供了编码上述日本血吸虫重组蛋白SjSAPLP4的基因，是如下a)或b)：
a)其核苷酸序列如序列表中SEQIDNo.1所示；或
b)由SEQIDNo.1所示核苷酸序列经取代一个或几个核苷酸，得到编码SjSAPLP4的核苷酸序列。
更进一步地，本发明提供一种重组表达载体，其为含有上述基因的表达盒或细胞系或重组菌。
本发明还提供了用于扩增上述编码日本血吸虫重组蛋白SjSAPLP4基因的特异性引物对，其核苷酸序列分别如SEQIDNO.3、4所示。
在本发明的一个实施例中，提供了日本血吸虫SjSAPLP4基因ORF的扩增方法，包括：以日本血吸虫42天雌雄成虫cDNA为模板，进行PCR反应，扩增SjSAPLP4基因ORF片段；
所述PCR反应采用的引物序列为：
PF：5’- GGATCCAACCACACTGAGTTGGACAT-3’(如SEQIDNO.3所示，斜体部分表示的是上游引物的保护性碱基，下划线部分是上游引物的BamHI酶切位点)；
PR：5’- CTCGAGTGGGCATAACTGTATTGTCT-3’(如SEQIDNO.4所示，斜体部分表示的是下游引物的保护性碱基，下划线部分是下游引物的XhoI酶切位点)；
所述PCR反应的体系和PCR反应程序分别为：
反应体系：高保真DNA聚合酶Mix12.5μl，cDNA模板1μl，上游引物0.5μl，下游引物0.5μl，ddH2O10.5μl，总体积25μl。
PCR扩增程序：98℃1min，98℃变性10sec，55℃退火30sec，72℃延伸1min，共35个循环；最后72℃延伸10min。
本发明还提供了一种制备日本血吸虫重组蛋白SjSAPLP4的方法，包括以下步骤：
(1)将含有日本血吸虫重组蛋白SjSAPLP4编码基因的重组表达载体转化入感受态细胞，制得日本血吸虫重组蛋白SjSAPLP4表达工程菌；
(2)将日本血吸虫重组蛋白SjSAPLP4表达工程菌经IPTG诱导表达；收集包涵体沉淀，并充分溶解包涵体，离心，收集上清液，将鉴定正确的表达产物过镍离子螯合胶柱纯化后，洗脱得到纯化的日本血吸虫重组蛋白SjSAPLP4。
含有本发明所述日本血吸虫重组蛋白SjSAPLP4的检测试剂盒或诊断试剂属于本发明的保护范围。
含有本发明所述日本血吸虫重组蛋白SjSAPLP4的生物制品属于本发明的保护范围。
优选地，所述生物制品为抗日本血吸虫疫苗。
本发明对日本血吸虫SjSAPLP4基因表达规律进行了研究，发现在虫卵阶段SjSAPLP4基因不表达，从尾蚴阶段到进入宿主体内阶段(童虫和成虫阶段)呈上调表达，说明SjSAPLP4基因功能与虫体的生长发育密切相关，是潜在的抗血吸虫药物靶点和疫苗候选抗原。以本发明所述日本血吸虫重组蛋白SjSAPLP4为潜在作用靶点的药物也属于本发明的保护范围。
本发明提供了上述日本血吸虫重组蛋白SjSAPLP4或其编码基因或含有该基因的重组表达载体在制备日本血吸虫血清学诊断试剂盒或诊断试剂中的应用。
本发明提供了上述日本血吸虫重组蛋白SjSAPLP4或其编码基因或含有该基因的重组表达载体在制备抗日本血吸虫疫苗中的应用。
本发明提供了上述日本血吸虫重组蛋白SjSAPLP4或其编码基因或含有该基因的重组表达载体在筛选治疗日本血吸虫病药物中的应用。
本发明获得的日本血吸虫重组蛋白SjSAPLP4具有良好的免疫原性和抗原性，能够识别感染日本血吸虫的BALB/c小鼠血清、新西兰大白兔血清及日本血吸虫病人血清，特异性为100％；用SjSAPLP4蛋白检测日本血吸虫病人血清，对轻度感染的血吸虫病人(EPG＜100)依然能够检出，检测敏感度达到98％；通过ELISA方法检测抗SjSAPLP4蛋白抗体在感染动物血清中的动力学变化，3周后便可通过SjSAPLP4-ELISA试剂盒检测到血清中的抗SjSAPLP4蛋白抗体，可用于日本血吸虫病早期感染的诊断，本发明发现SjSAPLP4基因功能与虫体的生长发育密切相关，为今后基因方法治疗日本血吸虫病提供依据。
附图说明
图1是实施例1中日本血吸虫SjSAPLP4基因序列的PCR扩增结果示意图，其中M为DNA分子量标准，1为SjSAPLP4基因的PCR扩增产物。
图2是实施例2中SjSAPLP4重组蛋白的SDS-PAGE分析结果示意图。泳道M为蛋白分子量标准，泳道1为未诱导全菌对照，泳道2为诱导后4小时全菌，泳道3为诱导后菌体裂解后上清，4为诱导后菌体裂解后沉淀，5为纯化的SjSAPLP4重组蛋白。
图3是实施例3中SjSAPLP4重组蛋白抗原与不同血吸虫感染动物血清及血吸虫病人血清的Westernblotting分析结果示意图。图中M为蛋白分子量标准、1为小鼠抗His标签抗体阳性对照、2为正常小鼠血清阴性对照、3为感染日本血吸虫42天的小鼠血清、4为感染日本血吸虫42天的兔血清、5为日本血吸虫病人血清。
图4是实施例5中rSP13-ELISA试剂盒与SjSAPLP4-ELISA试剂盒用于日本血吸虫病诊断评价比较的结果示意图。A图为rSP13-ELISA试剂盒的结果，B图为SjSAPLP4-ELISA试剂盒结果。
图5是实施例6中抗SjSAPLP4蛋白抗体与抗SjSP-13蛋白抗体在感染新西兰大白兔血清中的动力学比较分析结果示意图。A图为抗SjSP-13蛋白抗体在感染新西兰大白兔血清中的动力学分析结果，B图为抗SjSAPLP5蛋白抗体在感染新西兰大白兔血清中的动力学分析结果。
图6是实施例7中日本血吸虫SjSAPLP4基因在虫卵、尾蚴、肝期童虫及雌雄成虫中的荧光实时定量PCR分析结果示意图。E为虫卵、C为尾蚴、S为童虫、M为雄性成虫、F为雌性成虫。
具体实施方式
以下实施例进一步说明本发明的内容，但不应理解为对本发明的限制。在不背离本发明精神和实质的情况下，对本发明方法、步骤或条件所作的修改或替换，均属于本发明的范围。
若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。若未特别指明，实施例中所用的试剂为市售。
实施例1日本血吸虫SjSAPLP4基因的克隆
根据SjSAPLP4基因(GenBankFN315317.1)的序列(如SEQIDNO.1所示序列)设计引物并引入酶切位点，如下：
PF：5’- GGATCCAACCACACTGAGTTGGACAT-3’(如SEQIDNO.3所示，斜体部分表示的是上游引物的保护性碱基，下划线部分是上游引物的BamHI酶切位点)；
PR：5’- CTCGAGTGGGCATAACTGTATTGTCT-3’(如SEQIDNO.4所示，斜体部分表示的是下游引物的保护性碱基，下划线部分是下游引物的XhoI酶切位点)；
特异性引物由苏州金唯智生物科技有限公司合成。
以日本血吸虫42天雌雄成虫cDNA为模板，进行PCR反应，扩增SjSAPLP4基因ORF片段，反应体系如下：高保真DNA聚合酶Mix12.5μl，cDNA模板1μl，上游引物0.5μl，下游引物0.5μl，ddH2O10.5μl，总体积25μl。PCR扩增程序：98℃1min，98℃变性10sec，55℃退火30sec，72℃延伸1min，共35个循环；最后72℃延伸10min。
用1.2％琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物，观察是否存在目的条带，结果如图1所示，M：DNA分子量标准，1：SjSAPLP4。琼脂糖凝胶电泳结果显示，约在531bp处有一条清晰的条带，与预期目的片段去除信号肽序列后的大小相符，表明成功从cDNA中扩增出SjSAPLP4基因的ORF片段。
使用AxyPrepDNA凝胶回收试剂盒(AXYGEN公司)纯化回收PCR产物。将回收的PCR目的片段及pET28a空载体质粒分别于37℃水浴双酶切过夜，酶切反应体系如下：DNA片段或pET28a表达载体(溶于ddH2O)40μl，BamHI内切酶2.5μl，XhoI内切酶2.5μl，酶切buffer5μl，总体积50μl。
将酶切后的PCR产物及pET28a表达载体进行1.2％琼脂糖凝胶电泳鉴定及胶回收纯化。按照1：7(摩尔比)的比例将回收后的表达载体片段和外源目的基因片段使用T4DNA连接酶进行连接，反应条件为16℃，连接6h。将连接产物转化至大肠杆菌Trans1-T1感受态细胞(北京全式金生物技术有限公司)，将转化后的感受态细胞涂至LB培养基平板(含50μg/ml卡那霉素)，37℃培养过夜。挑取单菌落进行PCR鉴定，将PCR鉴定为阳性的克隆送苏州金唯智生物科技有限公司进行DNA测序确认序列是否正确。测序分析结果表明插入的外源基因片段序列正确，重组质粒pET28a(+)-SjSAPLP4构建成功。
实施例2日本血吸虫SjSAPLP4重组蛋白的表达和纯化
将测序正确的pET28a(+)-SjSAPLP4重组质粒转化至表达感受态细胞Transetta(DE3)(北京全式金生物技术有限公司)；将经PCR鉴定为阳性的克隆接种到LB液体培养基(含50μg/ml卡那霉素)15mL，37℃培养过夜，第二天取10mL培养基转接入LB培养基(含50μg/ml卡那霉素)1L，继续培养至OD600nm值为0.8，再加入终浓度为1mM的IPTG进行诱导表达4小时，离心收集菌体，-80℃冻存备用。
取少量诱导前和诱导后的菌体重悬于PBS缓冲液中，加入SDS-PAGE上样缓冲液，混匀后于沸水浴中煮5min使蛋白变性。每个上样孔中分别加入诱导前和诱导后的样品各10μl，进行SDS-PAGE分析(浓缩胶为5％，分离胶为12％)。如图2所示，将pET28a(+)-SjSAPLP4重组质粒转化表达感受态细胞，经IPTG诱导表达后较诱导前的菌体出现了分子量约为23kDa的明显表达条带，其分子量大小与目的重组蛋白的理论相对分子量相符。
将诱导后的菌体重悬于40mL细菌裂解液中，超声破碎，4℃，12,000rpm离心30min，分别收集包涵体沉淀和上清液。将包涵体沉淀和上清液进行SDS-PAGE分析，鉴定重组蛋白的溶解性。结果显示，重组蛋白主要存在于包涵体沉淀中。将包涵体重悬于含1％Triton-X100的PBS溶液超声洗涤5min，12,000rpm离心15min收集包涵体沉淀；将包涵体重悬于8M尿素，4℃旋转混匀过夜，充分溶解包涵体，12,000rpm离心30min收集上清液；将上清液过镍离子螯合胶柱(QIAGEN公司)使带有6个组氨酸标签的重组SjSAPLP4蛋白结合在胶柱上，用50mM咪唑冲洗杂蛋白，再用250mM咪唑洗脱重组蛋白，收集洗脱液；纯化所得重组蛋白经SDS-PAGE分析检测蛋白纯度。电泳结果如图2所示，表明经镍离子螯合胶柱纯化后获得了纯度较高的重组SjSAPLP4蛋白。使用BCA蛋白质定量试剂盒(ThermoFisherScientific公司)测定重组蛋白的浓度，按照说明书进行操作。经测定纯化所得的重组蛋白质浓度为2.1mg/mL。
实施例3日本血吸虫SjSAPLP4重组蛋白的抗原性检测
SDS-PAGE电泳：取实施例2获得的SjSAPLP4重组蛋白100ng上样，电泳条件为：100V20min，120V1h。
转膜：采用湿转法将PAGE胶中的蛋白转移至PVDF膜，电转条件为：冰浴，100V1h。
封闭：将PVDF膜用5％脱脂奶粉室温封闭2h,TBST缓冲液洗涤3次。
加一抗孵育：分别加入感染日本血吸虫42天BALB/c小鼠血清、感染日本血吸虫42天新西兰大白兔血清及日本血吸虫病人血清，以小鼠抗His-Tag抗体(艾比玛特生物医药有限公司)为阳性对照、以健康小鼠血清为阴性对照(用封闭液1:500稀释)，4℃孵育过夜，TBST缓冲液洗涤3次。加二抗孵育：分别加入荧光标记的抗小鼠IgG抗体、抗兔IgG抗体以及抗人IgG抗体(用封闭液1:10,000稀释)，37℃避光孵育1h，TBST缓冲液洗涤3次。
扫膜：使用Odyssey红外激光成像系统扫描成像。
结果如图3所示，以小鼠抗His-tag抗体为阳性对照，在约23kDa处有一明显的识别条带，以健康小鼠血清为阴性对照，23kDa处没有明显条带，感染日本血吸虫的BALB/c小鼠血清、新西兰大白兔血清及日本血吸虫病人血清均可识别目的蛋白，表明重组蛋白SjSAPLP4有很好的免疫原性和抗原性。
实施例4制备日本血吸虫病SjSAPLP4-ELISA免疫诊断试剂盒
(1)试剂盒的主要组分包括：
包被抗原的固相载体：用碳酸盐包被缓冲液(pH9.6)稀释实施例2获得的SjSAPLP4重组蛋白至1μg/mL，包被于聚苯乙烯反应孔中，100μL/孔。
酶标抗体：碱性磷酸酶标记的羊抗人免疫球蛋白(α,γ和μ-chainspecific)抗体(sigma公司)
底物：pNPP(sigma公司)
洗涤缓冲液：PBST
稀释液：5g脱脂奶粉溶于PBST缓冲液100mL。
底物缓冲液：二乙醇胺0.1mol/L(9.7ml)，MgCl21mmol/L(10mg),浓盐酸调pH至9.8，蒸馏水定容至100mL。
反应终止液：12gNaOH溶于蒸馏水中，最后定容至100mL。
(2)试剂盒的操作程序及检测方法：
封闭：甩干孔内液体，加稀释液200μL/孔，37℃，封闭2h，用PBST洗涤三次，200μL/孔，2min/次，最后一次拍干。
加待检样品：待检样品血清和稀释液按1:100比例稀释，同时设阳性、阴性和空白对照(仅加样本稀释液)，按100μL/孔加各样品，每个样本平行检测3个复孔，37℃，孵育1h。
洗涤：甩干孔内液体，用PBST洗涤四次，200μL/孔，2min/次，最后一次拍干。
加酶标抗体：加入碱性磷酸酶标记的羊抗人免疫球蛋白(α,γ和μ-chainspecific)抗体，100μL/孔，37℃，孵育1h，如上洗涤，拍干。
显色：加入酶底物显色液，100μL/孔，37℃避光孵育30min，加入终止液，25μL/孔。
数据读取及处理：用酶标仪读取OD405nm数值，以阴性对照样品的OD均值的2.1倍作为判断阴阳性的临界值(cut-off)。
实施例5SjSAPLP4-ELISA试剂盒对日本血吸虫病免疫诊断特性评价
(1)试剂盒敏感性
利用改良加藤法(Kato-Katz)收集湖南省粪检虫卵阳性日本血吸虫病人血清50份，其中轻度感染者样本46份(EPG<100)，中度感染者样本4份(400>EPG≥100)，评价实施例4的试剂盒的敏感性，并与rSP13-ELISA试剂盒，即采用文献(XuX,ZhangY,LinD,etal.SerodiagnosisofSchistosomajaponicuminfection:genome-wideidentificationofaproteinmarker,andassessmentofitsdiagnosticvalidityinafieldstudyinChina.LancetInfectDis,2014,S1473-3099(14)70067-2)公开的SjSP-13蛋白制得的试剂盒进行比较，ELISA实验操作同实施例3。
结果如表1和图4所示，50份日本血吸虫病人血清中，44份被rSP13-ELISA试剂盒诊断为阳性，rSP13-ELISA试剂盒诊断日本血吸虫病的敏感度为88％(95％置信区间，75.0％-95.0％)，该结果接近文献(LancetInfectDis,2014,S1473-3099(14)70067-2.)报道的rSP13-ELISA试剂盒敏感度90.4％(95％置信区间，86.5％-93.5％)。
50份日本血吸虫病人血清中，49份被实施例4制得的SjSAPLP4-ELISA试剂盒诊断为阳性，SjSAPLP4-ELISA试剂盒的敏感度为98.0％(95％置信区间，88.0％-99.9％)；SjSAPLP4-ELISA试剂盒的敏感性显著高于rSP13-ELISA试剂盒，p<0.05。
表1rSP13-ELISA与SjSAPLP4-ELISA试剂盒敏感性的比较分析
*SjSAPLP4-ELISA试剂盒的敏感性显著高于rSP13-ELISA试剂盒，p<0.05。
(2)试剂盒特异性
收集黑龙江省正常人血清样本50份，新疆地区肝包虫病人血清20份，云南省旋毛虫病人血清18份，评价本发明实施例4的试剂盒在正常人群中的假阳性率，以及与其它寄生虫病人血清的交叉反应情况，并与rSP13-ELISA试剂盒进行比较，ELISA实验操作同实施例4。
结果如表2和图4所示，50份正常人血清均被rSP13-ELISA与SjSAPLP4-ELISA试剂盒诊断为阴性，两种试剂盒的特异度为100％(95％置信区间，91.1％-100％)，该结果接近文献(LancetInfectDis,2014,S1473-3099(14)70067-2.)报道的rSP13-ELISA试剂盒特异度98.9％(95％置信区间，95.9％-99.9％)；20份肝包虫病人血清和18份旋毛虫病人血清均被两种试剂盒诊断为阴性，无交叉反应。
表2rSP13-ELISA与SjSAPLP4-ELISA试剂盒特异性的比较分析
实施例6抗SjSAPLP4蛋白抗体在感染动物血清中的动力学分析
利用耳静脉采血法分别收集5只新西兰白兔日本血吸虫感染前、感染(感染方式相同，感染剂量为每只兔感染1000条尾蚴)后第1-6周的血清，通过ELISA方法检测抗SjSAPLP4蛋白抗体在感染动物血清中的动力学变化，并与抗SjSP-13蛋白抗体在感染动物血清中的动力学变化进行比较，ELISA实验操作同实施例4。
结果如图5所示，5只新西兰白兔在感染日本血吸虫3周后便可通过本发明SjSAPLP4-ELISA试剂盒检测到血清中的抗SjSAPLP4蛋白抗体，而rSP13-ELISA试剂盒在新西兰白兔感染日本血吸虫4周后才可检测到血清中的抗SjSP-13蛋白抗体。该试验结果表明SjSAPLP4-ELISA试剂盒具有潜在的诊断血吸虫病早期感染的价值。同时，由于SjSAPLP4蛋白抗原在血吸虫感染的早期阶段便可被宿主的免疫系统识别并产生抗体，因此SjSAPLP4蛋白是潜在的抗血吸虫病疫苗候选抗原。
实施例7日本血吸虫SjSAPLP4基因表达规律分析
利用RNeasy试剂盒(QIAGEN公司)提取日本血吸虫虫卵、尾蚴、肝期童虫和42天雌雄成虫的总RNA，经DNA酶消化去除DNA后，用SuperScriptTMIII反转录试剂盒(Invitrogen公司)合成cDNA，利用7300Real-TimePCR(AppliedBiosystems)检测SjSAPLP4基因在日本血吸虫不同发育阶段的转录水平。SjSAPLP4基因上游引物为5’-CGATAAAGTGTGCTCACTAACTGG-3’(SEQIDNO.5)，下游引物为5’-GCTGAATTTGATGACATTTGGGT-3’(SEQIDNO.6)；采用蛋白酶体调节亚基基因PSMD4作为内参，其上游引物为5’-CCTCACCAACAATTTCCACATCT-3’(SEQIDNO.7)，下游引物为5’-GATCACTTATAGCCTTGCGAACAT-3’(SEQIDNO.8)。
反应体系如下：SYBRGreenMix(Agilent公司)12.5μl，cDNA模板1μl，上游引物0.5μl，下游引物0.5μl，ddH2O10.5μl，总体积25μl。
PCR扩增程序：95℃，10min；95℃，30sec，60℃，1min(循环40次)。
利用SDS1.4软件(AppliedBiosystems)进行数据分析。结果如图6所示，日本血吸虫SjSAPLP4基因在虫卵阶段不表达，从尾蚴阶段到进入宿主体内阶段(童虫和成虫阶段)呈上调表达，说明SjSAPLP4基因功能与虫体的生长发育密切相关，干扰该基因在虫体内的表达或抑制其生物学活性可能影响虫体的生长发育甚至杀伤虫体。因此，该基因是潜在的抗血吸虫药物靶点。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明技术原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims (10)

1.一种日本血吸虫重组蛋白SjSAPLP4，其氨基酸序列为：
a)SEQIDNo.2所示的氨基酸序列；或
b)SEQIDNo.2所示的氨基酸序列经替换、缺失和/或添加一个或几个氨基酸残基形成的具有同等功能的氨基酸序列。
2.编码权利要求1所述日本血吸虫重组蛋白SjSAPLP4的基因，是如下a)或b)：
a)其核苷酸序列如序列表中SEQIDNo.1所示；或
b)由SEQIDNo.1所示核苷酸序列经取代一个或几个核苷酸，得到编码SjSAPLP4的核苷酸序列。
3.一种重组表达载体，其为含有权利要求2所述基因的表达盒或细胞系或重组菌。
4.用于扩增权利要求2所述基因的特异性引物对，其特征在于，其核苷酸序列分别如SEQIDNO.3、4所示。
5.含有权利要求1所述日本血吸虫重组蛋白SjSAPLP4的检测试剂盒或诊断试剂。
6.含有权利要求1所述日本血吸虫重组蛋白SjSAPLP4的生物制品。
7.以权利要求1所述日本血吸虫重组蛋白SjSAPLP4为潜在作用靶点的药物。
8.权利要求1所述日本血吸虫重组蛋白SjSAPLP4或权利要求2所述的基因或权利要求3所述重组表达载体在制备日本血吸虫血清学诊断试剂盒或诊断试剂中的应用。
9.权利要求1所述日本血吸虫重组蛋白SjSAPLP4或权利要求2所述的基因或权利要求3所述重组表达载体在制备抗日本血吸虫疫苗中的应用。
10.权利要求1所述日本血吸虫重组蛋白SjSAPLP4或权利要求2所述的基因或权利要求3所述重组表达载体在筛选治疗日本血吸虫病药物中的应用。
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