CN105381506A - 用于鼓膜或外耳道再生的试剂 - Google Patents

Abstract

提供鼓膜或耳道再生试剂，其包括明胶海绵和被覆材料的组合，所述明胶海绵载有碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)。被覆材料不仅用于将所述明胶海绵固定至患处，而且用于防止干燥和感染的目的，以提供与外部隔离的适于再生组织的培养环境。为促进组织再生，鼓膜或耳道缺陷的边缘优选被预先新鲜化。

Description

用于鼓膜或外耳道再生的试剂

本申请是基于申请日为2009年6月26日、申请号为200980133310.8、发明名称为“用于鼓膜或外耳道再生的试剂”的申请所提交的分案申请。

技术领域

本发明涉及鼓膜或耳道再生试剂，其包括明胶海棉和被覆材料的组合，所述明胶海棉载有碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)。

背景技术

鼓膜穿孔是造成诸如鼓膜中破裂和穿孔的缺陷的症状；其存在多种原因，在鼓室中肉眼可见干燥而无活动性炎症的情况下，似乎可期望尽可能早地闭合穿孔。鼓膜闭合的最大优点是听力的提高。只要内耳没有失调且中耳不存在特别的病变，则在所有情况下，在鼓膜闭合之后通常都实现了听力的改善，这显著地有助于患者QOL的提高。

鼓膜中存在穿孔时，不仅鼓膜不能够捕捉足够的声音，而且听觉（听单词）也会由于消除效应而被进一步干扰，其中直接进入鼓室的声音会穿过圆窗进入耳蜗，并与经由正常路线进入耳蜗的声音冲突。另外，中耳直接暴露于耳道侧，结果这导致对感染耐受性减弱并可能造成中耳炎。长期持续的感染状态会由于内耳机能减退而造成感觉神经的听觉损失和受损的迷路功能。由于这些原因，优选尽量闭合鼓膜。

对于鼓膜闭合，多种治疗根据穿孔的尺寸进行，目前可利用的大部分疗法基本上是基于外科手术的。通常，进行鼓膜成形术和鼓室成形术。在前者中，耳后部的皮肤切口与自体组织的收集/移植是必要的；在后者中，除这些程序之外，耳道磨损也是必要的。当鼓膜的穿孔尺寸增加时，作为鼓膜替代品的自体组织(颞筋膜)的移植作为外科技术变得更难进行。因此，甚至在进行了外科手术的情况下，听力并不总是得到改善。可能出现许多后遗症，如术后鼓膜再穿孔、耳周部异感以及耳鸣。此外，在术后，鼓膜由于潜伏化作用、肥大等而与完整鼓膜相距甚远，并且听力降低。这些手术通常伴随住院护理约一天至几个星期，而造成缺点，如患者的心理、生理和经济负担的增加。

同样地，对于伴随骨露出的耳道软组织缺陷，外科手术治疗已经成为唯一常规疗法；处置如耳后部外切开和自体组织采集已必不可少。

近年来，提出了使用载有生长因子的生物相容性支架材料的再生医学性鼓膜再生方法(例如，参见专利文献1)。特别地，已报道了一些治疗案例，其中碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)用作生长因子，片状薄膜如胶原蛋白膜或几丁质膜用作支架材料(非专利文献1-3)。此外，还记载了由含bFGF的胶原蛋白的圆柱状元件制成的用于耳道重建的成型品(专利文献2)。

作为另一个不依赖于外科手术的鼓膜再生方法，已报道了下述方法，其中鼓膜的穿孔部分用羊膜被覆并与纤维蛋白胶粘合(非专利文献2)。

然而，常规再生医学性疗法的效力限于相对小的鼓膜穿孔与耳道缺陷；这些疗法不适于大于一定尺寸的鼓膜缺陷，以及耳小骨相关的缺陷，因为不能修复。

同时，明胶海绵在耳病的治疗中用作外科手术止血剂，并且还用作药物的持续释放载体(专利文献3)。

[现有技术文献]

[专利文献]

专利文献1:国际专利公开No.2006/007417的小册子

专利文献2:JP-A-2007-125252

专利文献3:美国专利申请公开No.2007/0160648的说明书

[非专利文献]

非专利文献1:Hakubaetal.,JournalofOtolaryngologyofJapan,Vol.110,No.4,p.261,2007

非专利文献2:Hakubaetal.,HeadandNeckSurgery,Vol.16,No.1,p.9-13,2006

非专利文献3:Futaietal.,JournalofOtolaryngologyofJapan,Vol.110,No.4,p.299,2007。

发明内容

发明所要解决的问题

对于基于再生医疗技术的鼓膜和耳道再生方法的开发存在强烈需求，其甚至能够修复传统上不可避免地依赖于外科手术的大的鼓膜穿孔与耳道软组织缺陷。因此，本发明的目的是提供不管缺陷部分的尺寸与位置如何均能够修复缺陷的新型鼓膜/耳道再生试剂。

解决问题的手段

本发明人进行了广泛的研究以完成上述的目的，并注意到下述事实，即全部传统方法都意图通过允许周围组织沿着结合至鼓膜穿孔或耳道软组织缺陷的板状支架材料的基底延伸来修复缺陷部分。因为旨在本质上再生膜组织，所以使用片状材料作为支架的想法似乎显得合理。然而，只有鼓膜穿孔或耳道软组织缺陷仅位于平坦的部分，修复才会是可能的；然而，鼓膜在形状上复杂并具有附着其上的小骨，因此随着鼓膜缺陷尺寸的增加，将愈加难于用平坦的片状材料被覆整个表面。不能完全被覆缺陷部分将无法修复鼓膜，或者将导致与周围组织粘连，留下后遗症。耳道软组织的情况也如此。

基于以上原因，本发明人改变了使用片状材料的常规想法，随着集中于使用能够立体地被覆整个缺陷部分的材料，而采用明胶海绵作为支架材料。具体地，以海绵被覆鼓膜或耳道的缺陷部分的方式留置浸渍了bFGF溶液的明胶海绵。因为明胶海绵是通过分解胶原蛋白获得的材料，与胶原蛋白相比具有更大数目的间隙与更高的自由度，因此它的特征在于，尽管作为细胞生长用支架发挥作用，但它不会妨碍细胞延伸的方向。因此，明胶海绵旨在使再生组织进入明胶海绵并在其中延伸，而不是如常规那样使再生组织沿片状材料的基底延伸。

此外，在该操作中，纤维蛋白胶或海藻酸或它们的盐被施加于海绵表面，且将该海绵被覆并固定在缺陷部分上。尽管已知使用生物粘附材料将组织再生用基材固定于周围组织的技术，但是本发明人用被覆材料被覆海绵表面，不仅是作为粘合剂，还是为了使再生部分与外部隔绝以形成适于体内培养环境的目的。出于相同观点，当鼓膜穿孔与耳道软组织缺陷的边缘老旧时，则使用手术刀或蛋白质变性剂等使其新鲜化。

其结果，即使是常规方法不适用的、缺陷涉及大于膜的2/3的鼓膜穿孔和伤口直径超过2cm的耳道软组织缺陷，在所有病例中也都观察到缺陷的闭合与听力的改善，而没有观察到后遗症。

由上可知，本发明人证实通过组合使用载有bFGF的明胶海绵与被覆材料，即使是对于常规不可避免地依赖于外科手术的、具有严重鼓膜穿孔或耳道软组织缺陷的患者，也可以廉价、便利且安全地再生鼓膜与耳道，从而开发了本发明。

因此，本发明如下所述：

[1]鼓膜或耳道再生试剂，其包括明胶海棉和被覆材料的组合，其中所述明胶海棉载有碱性成纤维细胞生长因子。

[2][1]所述的试剂，其中所述被覆材料是纤维蛋白胶或者水溶性高分子多糖或它们的衍生物。

[3][2]所述的试剂，其中所述水溶性高分子多糖是几丁质、壳聚糖或海藻酸或它们的盐。

[4][1]-[3]中任一项所述的试剂，其中鼓膜穿孔和耳道软组织缺陷的边缘已被新鲜化。

[5]鼓膜或耳道的再生方法，其包括将载有治疗有效量的碱性成纤维细胞生长因子的明胶海绵留置在患有鼓膜穿孔或耳道软组织缺陷的患者的鼓膜穿孔或耳道软组织缺陷部分中，并用被覆材料被覆所述海绵。

[6][5]所述的再生方法，其中所述被覆材料是纤维蛋白胶或者水溶性高分子多糖或它们的衍生物。

[7][6]所述的再生方法，其中所述水溶性高分子多糖是几丁质、壳聚糖或海藻酸或它们的盐。

[8][5]-[7]中任一项所述的再生方法，其中所述鼓膜穿孔和耳道软组织缺陷的边缘被预先新鲜化。

[9]被覆材料和明胶海绵所载有的碱性成纤维细胞生长因子用于制备鼓膜或耳道再生试剂的用途。

[10][9]所述的用途，其中所述被覆材料是纤维蛋白胶或者水溶性高分子多糖或它们的衍生物。

[11][10]所述的用途，其中所述水溶性高分子多糖是几丁质、壳聚糖或海藻酸或它们的盐。

[12][9]-[11]中任一项所述的用途，其中鼓膜穿孔和耳道软组织缺陷的边缘已被新鲜化。

发明效果

通过使用明胶海绵作为支架材料，可以立体地被覆鼓膜或耳道的整个缺陷部分以实现缺陷部分的完全被覆。另外，鼓膜组织在明胶海绵中前进的同时再生其本身。因此，根据本发明，鼓膜或耳道的修复即使在大的或者复杂缺陷的情况下也是可能的。

用被覆材料被覆明胶海绵表面防止干燥与感染，使得可以形成与外部隔离的良好培养环境。

此外，明胶海绵在1个月内在体内经历水解并消失，有利于鼓膜与耳道软组织的再生。

附图简述

[图1]显示使用本发明鼓膜再生试剂的鼓膜再生治疗的实例的图。A.指出了涉及鼓膜的约2/3的大穿孔。B.使用鼓膜切开刀擦伤鼓膜穿孔的边缘以在周围形成新鲜伤口。C.将载有bFGF的明胶海绵留置在穿孔部分中并用纤维蛋白胶固定。D.在治疗后3周，鼓膜穿孔被上皮完全闭合。E.在治疗后6周，该上皮稍微变薄，变得更像鼓膜。F.在治疗后12周，该上皮变得进一步像正常的鼓膜。

[图2]显示使用本发明耳道再生试剂的耳道再生治疗的实例的图。A.指出除去了胆脂瘤的伤口中的软组织缺陷与骨露出。B.将明胶海绵物质浸渍bFGF，并留置bFGF明胶海绵以使该伤口被完全被覆。C.用海藻酸或其盐（或纤维蛋白胶）固定该海绵物质。D.在治疗后2周，除去残留于表面的海藻酸或其盐等；证实伤口已完全闭合，且以几乎与正常组织相同的状态实现了再生。

具体实施方式

用于本发明鼓膜/耳道再生试剂中的生长因子bFGF对细胞具有直接增殖作用和新血管形成能力。鼓膜具有三层结构；为了保证充分发挥基本的声音传导功能，重要的是维持该三层结构。然而，鼓膜破损和自发修复的情形经常发生，其中，鼓膜薄且只有上皮层再生而三层结构未被维持。

对于其再生，作为支架的成纤维细胞增殖与维持足以支持三层结构的血流都是必不可少的。从该观点出发，bFGF具有理想的特性。具体地，如其命名所示，bFGF具有刺激成纤维细胞增殖的直接作用，并且还具有诱导血管并供应营养物至周围组织的作用。

作为本发明中的bFGF，可以使用其同源物。本发明中的bFGF和/或其同源物是作为天然产品，或者通过使用微生物或培养细胞通过基因重组技术分离和纯化的，或通过对其进行化学修饰或者生物修饰获得的。作为本发明中使用的bFGF，特别优选人bFGF或其同源物。

bFGF的同源物是指以下多肽[I]或[II]。

[I]由与哺乳动物中产生的bFGF基本相同的氨基酸序列构成的多肽。这里"基本相同的氨基酸序列"是指1-6个氨基酸被其它种类的氨基酸置换，并且具有bFGF的生物活性的氨基酸序列。[II]其中附加氨基酸片断被附加至哺乳动物中产生的bFGF的N-末端和/或C-末端，或附加至上述多肽[I]的N-末端和/或C-末端的多肽。附加氨基酸片断是指由1-12个氨基酸构成，且不影响bFGF的生物活性或上述多肽[I]的生物活性的片断。

人bFGF是146个氨基酸的多肽；在本发明的制备中，作为人bFGF的同源物(上述同源物[I])，例如，可以使用日本特表平2-504468中记载的146个氨基酸的多肽。该多肽中，构成人bFGF的氨基酸序列的69位半胱氨酸(Cys)和87位半胱氨酸(Cys)被丝氨酸(Ser)置换。

作为上述同源物[II]，例如可以使用日本特表昭63-500843中公开的155个的多肽。该多肽中，9个氨基酸的片断被添加至人bFGF的N-末端。

同时，可以使用日本特表昭63–501953中公开的Met-被添加至N-末端的147个氨基酸的多肽，以及11个氨基酸构成的片断被添加至N-末端的157个氨基酸的多肽。

特别优选的bFGF是曲弗明(基因重组)。

在本发明的制备中，可以单独使用一种bFGF，或者可以组合使用多种。此外，如上所述，存在多种bFGF的同源物，并且这些同源物可以单独使用或者组合使用。

因为在活生物体内bFGF的丰度非常低，因此为了商业上稳定供应本发明的制剂，特别优选使用通过基因重组技术、利用微生物如大肠杆菌或培养细胞产生的bFGF或其同源物。当用于产生bFGF或其同源物的基因（在该情况下，通常为上述多肽(I)）被插入到微生物或培养细胞中，由该微生物或培养细胞产生的产品通常为具有添加至bFGF的N-末端和/或C-末端、或者添加至上述多肽[I]的N-末端和/或C-末端的附加氨基酸片断的，即上述多肽[II]。

用作本发明中明胶海绵的原材料的明胶的选择不受特别限制；可以使用任何通常可使用的。例如，可以提及通过用酸或碱处理牛、猪、鸡、鲑鱼等的骨、韧带、腱或皮肤，用水加热萃取获得的粗胶原蛋白等。不仅可以使用一种明胶，还可以以适当的共混物使用具有不同材料和不同物理性质如溶解性、分子量和等电点的明胶。

用于本发明中的明胶海绵可被交联以提高其耐水性，以便使之用作支架用于再生组织以足以闭合鼓膜或耳道中的缺陷的时期，只要其不丧失能够完全被覆形状复杂的鼓膜穿孔边缘和耳道缺陷的边缘的柔软性。交联的方法不受特别限制；实例包括涉及使用交联剂、真空热脱水、干燥加热、γ-射线辐照、紫外线辐照、电子射线辐照、X射线辐照等的方法。

本发明的明胶海绵具有许多细孔，并且提供比胶原蛋白更高的自由度。通过具有大量细孔，当用作支架材料时，明胶海绵使得周围细胞容易进入海绵，使得可以以良好的方式再生鼓膜和耳道。这与使用片状支架材料制备的常规再生试剂明显不同。具体地，对于如片状胶原蛋白膜的支架，组织不会在支架中前进时将自身再生，而是会向上或向下地将自身再生。这不能完全被覆大于一定尺寸的鼓膜缺陷的缺陷部分，因此不能修复鼓膜，或出现与周围组织的粘连并留下后遗症。

考虑到细胞容易进入海绵而确保良好的细胞粘附的事实，优选本发明的明胶海绵的细孔平均孔径为大约10微米或更大，为防止低细胞密度所致的鼓膜或耳道再生速率的降低，优选平均直径为约500微米或更小。更优选的范围为约100-约400微米。

本发明的明胶海绵可以含有其他生物可吸收高分子材料，只要其功能不受负面影响。这类生物可吸收高分子材料例如包括：合成高分子，如聚乳酸、聚乙醇酸、聚-ε-己内酯、乳酸-乙醇酸共聚物、乙醇酸-ε-己内酯共聚物、乳酸-ε-己内酯共聚物、聚柠檬酸、聚苹果酸、聚-α-氰基丙烯酸酯、聚-β-羟基酸、聚乙二酸三亚甲基酯、聚乙二酸四亚甲基酯、聚-邻-酯、聚-邻-碳酸酯、聚碳酸亚乙酯、聚-γ-苯甲基-L-谷氨酸酯、聚-γ-甲基-L-谷氨酸酯和聚L-丙氨酸；天然高分子，如多糖比如淀粉、海藻酸、透明质酸、几丁质、果胶酸和它们的衍生物；以及蛋白质比如明胶、胶原、白蛋白、和纤维蛋白等。

本发明的明胶海绵可以通过例如下列制备：利用均化器以大约3000-大约10000rpm的转速将明胶水溶液搅拌并起泡大约10秒至大约5分钟，然后将明胶水溶液浇注至适当大小的模具中，并在大约-40至大约-80℃下冷冻大约30-大约120分钟，之后，在例如大约0.1托的条件下冷冻干燥该冷冻物质。如果明胶水溶液的浓度过高，则获得的明胶海绵的柔软度降低，因此优选将浓度调节至例如大约3w/w%或更少。如果需要进一步交联，则可以酌情施行交联。

作为本发明的明胶海绵，可以使用市售的止血剂(例如Spongel(注册商标)(AstellasPharma)、Gelfoam(注册商标)(Pharmacia&Upjohn)等)。

本发明的明胶海绵的形状和大小不受特别限制，只要足够大至被覆病人鼓膜或者耳道的缺陷部分。

使这样制备的明胶海绵载有bFGF的方法不受特别限定，例如可以将bFGF的水溶液逐滴添加至明胶海绵，或者可以通过添加bFGF的水溶液使明胶海绵膨胀。

明胶海绵载有bFGF的量不受特别限定，只要它的量足以再生鼓膜或者耳道，例如其可以是每个给药位置大约0.1-大约1000μg，优选大约1-大约100μg。

这样获得的载有bFGF的明胶海绵制品还可以被冷冻干燥。如果需要，可以通过例如在液氮中冷冻制品30分钟或更久，或者在-80℃下冷冻制品1小时或更久，然后利用冷冻干燥设备干燥所述制品1-3天来进行冷冻干燥。

本发明的鼓膜/耳道再生试剂适用于所有情况，只要病人的鼓膜穿孔或者耳道缺陷不伴随中耳/外耳的活动性感染/炎症。例如，鼓膜穿孔的情形包括慢性中耳炎，鼓膜闭合外科手术或者鼓室成形术之后再穿孔，陈旧外伤鼓膜穿孔，渗出性中耳炎的鼓膜切开或鼓膜管留置后的穿孔残留等。耳道软组织缺陷的症例包括在耳道胆脂瘤切除、鼓室成形术或者耳道肿瘤切除之后具有耳道软组织缺陷和耳道骨露出的那些。

本发明的鼓膜/耳道再生试剂可特别优选用于利用常规再生医学技术的疗法不适用的、患有大的鼓膜穿孔或耳道软组织缺陷的患者。特别地,对于鼓膜的大于1/3特别是大于2/3是缺陷的患有鼓膜穿孔的患者，鼓膜修复是可能的。对于患有最大直径为1cm或更大、特别是2cm或更大的耳道软组织缺陷的患者，耳道修复是可能的。

将载有bFGF的明胶海绵调节至比鼓膜或耳道缺陷部分大的尺寸，并以被覆整个缺陷部分的方式留置。这里，在缺陷部分的老旧边缘情形中，期望该边缘被新鲜化以促进组织再生。新鲜化的方法包括，例如，通过利用手术刀等磨伤边缘，或通过利用具有蛋白质变性效果的药物如乙酸铝或高浓度局部麻醉剂的处理来除去边缘的上皮的方法。

该基于药物的方法在耳道形状狭窄造成鼓膜穿孔的边缘难以新鲜化的情形中特别有效；首先，将含有乙酸铝的明胶海绵留置于缺陷部分，并在大约30分钟后将其除去。之后，用4%盐酸利多卡因进行麻醉，之后将边缘的变性组织（变色为白色）最大可能程度地除去，由此实现新鲜化。

本发明的进一步特征在于下列事实：将留置于缺陷中的载有bFGF的明胶海绵的表面用被覆材料被覆。作为本发明中使用的被覆材料，可以使用任何生物相容性材料，只要其具有足以将载有bFGF的明胶海绵保持固定在鼓膜或者耳道的缺陷部分上的粘性，并且能够通过与外部环境隔离而为该海绵的表面和内部提供适于再生组织的细胞的培养环境；实例包括纤维蛋白胶(血液纤维蛋白原和凝血酶提取物；可作为Bolheal(注册商标)(AstellasPharma)、TISSEEL(注册商标)(Baxter)或者Beriplast(注册商标)(CSLBehring)而商业地获得）、海藻酸或其盐(例如海藻酸钙、海藻酸钠）和水溶性高分子多糖如几丁质和壳聚糖。

作为制备海藻酸盐(海藻酸钙）并将其形成为膜状的方法，例如，将3.3ml的2%海藻酸钠水溶液均匀地浇铸，以使10ml容量的皮氏培养皿的整个底面与该水溶液接触。之后，将5ml的3%氯化钙水溶液均匀地铺展在同一皮式培养皿以使海藻酸钠的水溶液和氯化钙的水溶液彼此充分接触，之后等待数分钟。在除去剩余的液体后，用蒸馏水清洗培养皿并使之自然干燥，由此制备出海藻酸钙膜。干燥后将膜剥离，形成适当尺寸，并用EO气体灭菌，由此海藻酸盐可被制备为被覆材料。

当被覆材料是液体时，可以通过将数滴被覆材料滴在留置于缺陷部分中的载有bFGF的明胶海绵的表面上，或者通过利用本来已知的喷雾器喷雾被覆材料来进行给予。当被覆材料是片状物质时，可以将其以被覆留置于缺陷部分中的载有bFGF的明胶海绵的表面的方式放置。

以下，借助下述实施例更具体地说明本发明，但并不以任何方式限制本发明。

实施例

实施例1鼓膜的再生

1)患者选择

研究对象包括各种被证实患有鼓膜穿孔且在中耳/外耳中没有活动性感染或炎症的患者，包括慢性中耳炎症例（n=9），鼓膜闭合外科手术或鼓室成形术后再穿孔症例(n=7)，陈旧外伤性鼓膜穿孔症例（n=5），渗出性中耳炎的鼓膜切开或鼓膜管留置后残留穿孔症例(n=10)等。鼓膜穿孔尺寸不重要。

根据鼓膜穿孔的尺寸将患者分成三组。具体地，涉及整个鼓膜的小于1/3、1/3-2/3以及大于2/3的鼓膜穿孔患者分别分类为I级、II级和III级。

2)治疗方法和跟进检查

在证实存在鼓膜穿孔和没有活动性感染和炎症之后，将浸有4%盐酸利多卡因的棉花插入耳道中，以使之与鼓膜的穿孔部分接触。大约15分钟后，在显微镜下，使用鼓膜切开刀等磨伤鼓膜穿孔边缘，并除去周围穿孔边缘的上皮（图1B)。随后，将大于鼓膜穿孔的明胶海绵(Spongel(注册商标):Astellas)块浸渍bFGF(Fiblast(注册商标):KakenPharmaceutical)，并将载有bFGF的明胶海绵留置，以使鼓膜的穿孔部分被完全被覆(图1C)。此后，用数滴纤维蛋白胶(Beriplast注册商标)CSLBehring)将其固定。

在治疗后，指导患者不要进行任何对他们的耳朵施加压力的事情，如剧烈吸鼻子和鼻子呼气，并且不可在洗头和洗澡时让水进入他们的耳朵。

三周后的检查显示残留于表面的被覆材料和明胶海绵的牢固粘附；当使用Rosen探针等将其小心除去时，在其下观察到了再生的鼓膜(图1D)。通过单次治疗不能闭合穿孔时，重复相同的治疗。

此时，再生的鼓膜作为厚的、富含血管的组织出现，但它们会随着时间经过而变薄（图1E），并在2个月后变得与正常鼓膜难以分辨(图1F)。

3)结果

对于26个对象的31只耳朵通过该方法进行鼓膜再生治疗。结果示于表1。将结果按照完成闭合所需的治疗次数、闭合率、听力改善程度、除去麻醉时间的治疗时间和后遗症的有无，通过穿孔尺寸（I级-III级）进行总结。将仅浸渍生理盐水而未使用bFGF的明胶海绵留置于鼓膜穿孔部分的5个患者的结果示于表2。

甚至在仅浸渍生理盐水而未使用bFGF的明胶海绵的情况下，也观察到稍微的鼓膜闭合趋势。这显示了即使仅留置支架也能促进鼓膜的再生；闭合对于非常小的鼓膜穿孔似乎可能，然而，当鼓膜穿孔大时，即使提高治疗次数也不能闭合。

同时，添加bFGF时，在所有情况中鼓膜穿孔都闭合，而与鼓膜穿孔尺寸无关。这显示了细胞再生在仅使用支架时受到限制，认为在鼓膜穿孔大于一定尺寸时，添加生长因子如bFGF似乎是必要和不可缺少的。关于听力改善的程度，恢复到了正常水平，而与鼓膜穿孔尺寸无关；观察到了功能正常化的鼓膜的再生。

实施例2耳道软组织的再生

1)患者选择

研究对象包括耳道胆脂瘤切除后的患者(n=7)、鼓室成形术后的患者(n=2)、和耳道肿瘤切除后的患者(n=1)，所有这些患者都有耳道软组织缺陷和耳道骨露出。缺陷的尺寸不重要。

2)治疗方法和跟进检查

在确认伤口中没有活动性感染和炎症之后，进行局部麻醉。在显微镜下，对耳道胆脂瘤或耳道肿瘤患者从耳道内部切除胆脂瘤或肿瘤，并对鼓室成形术后耳道骨露出的患者利用手术刀等形成新鲜创伤，之后，将大于伤口的明胶海绵块浸渍bFGF，并将载有bFGF的明胶海绵块留置，以使明胶海绵块完全被覆缺陷部分(图2B)。此后，用数滴纤维蛋白胶或海藻酸钙膜将其被覆(图2C)。

指导患者克制使用耳朵，并且不可在洗澡、洗头和洗脸过程中让水进入耳道。

2或3周后的检查显示，残留于表面的被覆材料和明胶海绵的牢固粘附；在使用Rosen探针将其小心除去时，在其下观察到了完全再生的耳道上皮和软组织(图2D)。如果单次治疗再生不充分，则重复相同的治疗。

3)结果

对10名患者通过该方法进行耳道再生治疗。结果示于表3，将结果按照完成闭合所需治疗次数、闭合率、除去麻醉时间的治疗时间和后遗症的有无，通过缺陷尺寸（I级-III级）进行总结。

工业实用性

根据本发明，鼓膜穿孔和耳道软组织缺陷可只在门诊基础上进行治疗大约10分钟，而不用完整的外科手术治疗，因而消除了对住院和来医院的需要。因为鼓膜/耳道的再生与缺陷尺寸和原因无关均是可能的，因而本发明适用于常规再生医学技术治疗不适用的患者。而且，所涉及的外科技术简单，重复治疗不会产生后遗症，并可以再生完全正常的鼓膜/耳道。另外，治疗之后即可使听力正常化，对于日常生活不造成妨碍。因此，病人的心理、生理、时间上的和经济上的负担得到缓解，因此从医学经济学观点出发，本发明高度有利。

本申请基于在日本提交的专利申请No.2008-167744(申请日：2008年6月26日），将其内容完全并入本文。

Claims (12)

1.鼓膜或耳道再生试剂，其包括明胶海棉和被覆材料的组合，所述明胶海棉载有碱性成纤维细胞生长因子。

2.根据权利要求1的试剂，其中，所述被覆材料是纤维蛋白胶或水溶性高分子多糖或其衍生物。

3.根据权利要求2的试剂，其中，所述水溶性高分子多糖是几丁质、壳聚糖或海藻酸或其盐。

4.根据权利要求1-3中任一项的试剂，其中鼓膜穿孔和耳道软组织缺陷的边缘已被新鲜化。

5.鼓膜或耳道的再生方法，其包括将载有治疗有效量碱性成纤维细胞生长因子的明胶海绵留置于患有鼓膜穿孔或耳道软组织缺陷的患者的鼓膜穿孔或耳道软组织缺陷部分中，并用被覆材料被覆所述海绵。

6.根据权利要求5的再生方法，其中，所述被覆材料是纤维蛋白胶或水溶性高分子多糖或其衍生物。

7.根据权利要求6的再生方法，其中，所述水溶性高分子多糖是几丁质、壳聚糖或海藻酸或其盐。

8.根据权利要求5-7中任一项的再生方法，其中，所述鼓膜穿孔和耳道软组织缺陷的边缘被预先新鲜化。

9.被覆材料和由明胶海绵所载有的碱性成纤维细胞生长因子用于制备鼓膜或耳道再生试剂的用途。

10.根据权利要求9的用途，其中，所述被覆材料是纤维蛋白胶或者水溶性高分子多糖或其衍生物。

11.根据权利要求10的用途，其中，所述水溶性高分子多糖是几丁质、壳聚糖或海藻酸或其盐。

12.根据权利要求9-11中任一项的用途，其中，鼓膜穿孔和耳道软组织缺陷的边缘已被新鲜化。