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CN105378113B - 实时电子测序 - Google Patents

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CN105378113B
CN105378113B CN201480038761.4A CN201480038761A CN105378113B CN 105378113 B CN105378113 B CN 105378113B CN 201480038761 A CN201480038761 A CN 201480038761A CN 105378113 B CN105378113 B CN 105378113B
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Abstract

描述了实时电子测序方法、装置和系统。使用包含具有一个或两个电极的电容装置的纳米电子元件的阵列或纳米FET装置的阵列来提供聚合酶‑模板复合物中模板核酸的序列信息，所述聚合酶‑模板复合物结合至纳米级电子元件附近或结合至纳米级电子元件附近的基材。在聚合酶介导的核酸合成的条件下将包含具有阻抗标记物、电容标记物或电导标记物的核苷酸类似物的测序反应混合物导入包含电容装置或纳米FET的纳米级电子元件的阵列。使用测量的阻抗、电导或电容通过鉴定掺入生长链的核苷酸类似物的标记物的类型来确定核苷酸类似物掺入的时间顺序。

Description

实时电子测序
相关申请的交叉参考
本申请要求2013年9月20日提交的临时专利申请号61/880,293和2013年5月6日提交的临时专利申请号61/820,066的权益，其通过引用纳入本文用于所有目的。
关于联邦资助研究/开发的声明
不适用。
背景技术
核酸序列数据在生物学研究和分子医疗中的许多应用中是有价值的，包括测定疾病中的遗传性因素，开发新方法以检测疾病并指导治疗(van de Vijver等(2002)"A gene-expression signature as a predictor of survival in breast cancer,(作为乳腺癌中存活预测的基因表达特征)"New England Journal of Medicine 347:1999-2009)，以及提供个性化医疗的合理基础。获得并验证用于这类分析的序列数据促使测序技术需要经历进步以扩大通量、减少试剂和劳动成本并提高精确性(参见例如，Chan等，(2005)"Advancesin Sequencing Technology(测序技术中的进步)"(综述)Mutation Research 573:13-40，其全文纳入本文用于所要目的)。
使用了多种测序方法且各自具有其优势和劣势。单分子实时测序优于其他测序方法，包括提供较长读取长度的能力。许多目前的测序方法使用光学标记物。需要使用非光学读取的改进的测序仪器和方法，且尤其是具有这些特性的实时单分子测序方法。
已阐述了单分子和单颗粒的电子检测，包括通过电容、阻抗和电导方法。本发明提供了用于非光学实时单分子测序的仪器、装置和方法。
发明内容
在一些方面中，本发明提供了一种核酸测序的方法，包括：提供包含可测量阻抗的纳米级电子元件的阵列的基材，其中多个纳米级元件包含与纳米级电子元件接合或靠近的单个聚合酶复合物(包含聚合酶和模板核酸)；将该基材暴露于多种类型的核苷酸类似物，各类型包含与核苷酸类似物的磷酸部分相连的不同的阻抗标记物，暴露的条件为发生聚合酶介导的核酸合成，导致掺入核苷酸类似物和切割相应的阻抗标记物，并导致新生核酸链的生长；测量多个纳米级电子元件中每一个处的阻抗，当核苷酸类似物存在于酶的活性位点中时，核苷酸类似物上的阻抗标记物生成纳米级电子元件处可测量的阻抗变化；随时间监测多个纳米级元件处的阻抗，阻抗的变化表示某一类型的核苷酸类似物的掺入事件；以及使用随时间测量的阻抗鉴定掺入的核苷酸类似物的类型以确定模板核酸的序列。
在一些情况中，这些纳米级电子元件测量电容、电导或电容和电导的组合。在一些情况中，这些纳米级电子元件包括纳米FET装置。在一些情况中，纳米FET的栅包含纳米线。在一些情况中，纳米FET的栅包含掺杂硅。
在一些情况中，该基材暴露于四种类型的核苷酸类似物，其对应于A、G、C、T或A、G、C、U，这四种类型的核苷酸类似物各自具有不同的阻抗标记物。在一些情况中，该阻抗标记物与聚磷酸部分通过接头相连。在一些情况中，该阻抗标记物包含电容标记物或电导标记物。
在一些方面中，本发明提供了用于测序多种单核酸模板分子的芯片，包含：一种基材，其包含；多个纳米级电子元件，各纳米级电子元件包含与纳米级电子元件结合或与纳米级电子元件最近的基材结合的单个聚合酶复合物，各聚合酶复合物包含聚合酶和模板核酸；各基材设置成使得纳米级电子元件接触包含多种类型的核苷酸类似物的测序反应混合物，这些核苷酸类似物各自具有不同的阻抗标记物；以及多个电连接位点，其用于向纳米级电子元件提供电流和电压，并用于接收来自纳米级电子元件的电信号。
在一些情况中，这些纳米级电子元件包含纳米级电容装置或纳米FET装置。在一些情况中，这些纳米级电子元件包含纳米FET且各纳米FET的栅包含纳米线。在一些情况中，这些纳米级电子元件包含纳米FET且纳米FET的栅包含掺杂硅。在一些情况中，该基材包含超过1000个纳米级电子元件。
在一些情况中，该基材包含超过10000个纳米级电子元件。在一些情况中，该基材包含约1000个纳米级电子元件至约1000万个纳米级电子元件。在一些情况中，该基材包含约10000个纳米级电子元件至约100万个纳米级电子元件。
在一些情况中，该基材包含电子件用于以下一个或多个目的：向纳米级电子元件提供电信号，测量纳米级电子元件处的电信号，模拟数字转化，信号处理，以及数据储存。在一些情况中，这些电子件包含CMOS元件。
在一些方面中，本发明提供了一种用于模板核酸测序的系统，包括：具有外壳电连接位点的外壳；与外壳可逆配合的包含基材的芯片，其包含；与外壳电连接位点可逆连接的芯片电连接位点；多个纳米级电子元件，各纳米级电子元件包含与纳米级电子元件结合或与纳米级电子元件附近的基材结合的单个聚合酶复合物，其中该聚合酶复合物包含聚合酶和模板核酸；用于使测序反应混合物接触纳米级电子元件的流体储器，该测序反应混合物包含多种类型的核苷酸类似物，各类型具有不同的阻抗标记物，在类似物与聚合酶复合物相联系的同时这些阻抗标记物被纳米级电子元件感知；电子控制系统，其通过电连接与纳米级电子元件连接以向纳米级电子元件施加所需电信号并接收来自纳米级电子元件电信号；以及计算机，其随时间接收纳米级电子元件处电信号上的信息并使用这类信息鉴定模板核酸的序列。
在一些方面中，本发明提供了一种核酸测序的方法，包括：提供包含纳米级电极的基材，该基材包含含有聚合酶和模板核酸的聚合酶复合物，该复合物与纳米级电极接合或与靠近纳米级电极的基材接合；将该聚合酶暴露于多种类型的核苷酸类似物，其各自包含与核苷酸类似物的磷酸部分接合的不同的电容标记物，暴露的条件为发生聚合酶介导的核酸合成，导致切割电容标记物和新生核酸链的生长；向纳米级电极随时间施加包含交流电的电信号，当核苷酸类似物存在于酶的活性位点中时，核苷酸类似物上的电容标记物生成纳米级电极处电容的可测量变化；随时间监测纳米级电极处的电信号，该电信号显示具有特定电容标记物的某一类型的核苷酸类似物的掺入事件；以及使用电极处随时间监测的电信号确定模板核酸的序列。
在一些实施方式中，以不同频率重复访问纳米级电极，其中，各频率处测得的电容被用于鉴定特定的电容标记物。在一些实施方式中，该聚合酶暴露于四种类型的核苷酸类似物，其对应于A、G、C、T或A、G、C、U，以至少8种不同频率重复访问纳米级电极。在一些实施方式中，施加于电极的电信号包括正弦波、三角波或锯齿波。
在一些实施方式中，随时间变化的电容变化量被用于鉴定掺入了何种类型的核苷酸。在一些实施方式中，电容关联频率的特征被用于鉴定掺入了何种类型的核苷酸。在一些实施方式中，随时间变化的电容特征被用于鉴定掺入了何种类型的核苷酸。
在一些实施方式中，酶与纳米级电容电极接合。在一些实施方式中，该电容标记物与聚磷酸部分通过接头接合。在一些方面中，本发明提供了一种核酸测序的方法，包括：提供包含至少两个纳米级电极的基材，该基材包含含有聚合酶和模板核酸的聚合酶复合物，该复合物与靠近纳米级电极的基材接合；将该聚合酶暴露于多种类型的核苷酸类似物，其各自包含与核苷酸类似物的磷酸部分接合的不同的电容标记物，暴露的条件为发生聚合酶介导的核酸合成，导致切割电容标记物和新生核酸链的生长；在纳米级电极处随时间施加包含交流电的电信号，当核苷酸类似物存在于酶的活性位点中时，核苷酸类似物上的电容标记物生成纳米级电极处电容的可测量变化；随时间监测纳米级电极处的电信号，该电信号显示具有特定电容标记物的某一类型的核苷酸类似物的掺入事件；以及使用电极处随时间监测的电信号确定模板核酸的序列。
在一些实施方式中，纳米级电极处交流电的频率被反复调至不同的频率水平，其中，特征性电容关联频率特性被用于鉴定特定的电容标记物。在一些实施方式中，施加于电极的交流电包括正弦波、三角波或锯齿波。在一些实施方式中，该聚合酶暴露于四种类型的核苷酸类似物，其对应于A、G、C、T或A、G、C、U，纳米级电极处的交流电重复生成至少4种不同频率水平。
在一些实施方式中，随时间变化的电容水平被用于鉴定掺入了何种类型的核苷酸。在一些实施方式中，随时间变化的电容特征被用于鉴定掺入了何种类型的核苷酸。在一些实施方式中，随时间变化的电容特征包括电容振荡颜色。在一些实施方式中，酶与电极之间的基材接合。
在一些实施方式中，多种类型的核苷酸类似物包含四种不同标记的核苷酸类似物1、2、3和4，核苷酸类似物1和2各自包含具有第一电容部分类型的电容标记物，且核苷酸类似物3和4各自包含具有第二电容部分类型的电容标记物，核苷酸1与核苷酸类似物2具有不同数目的电容部分，且核苷酸3与核苷酸类似物4具有不同数目的电容部分。在一些实施方式中，该电容标记物与聚磷酸部分通过接头接合。
在一些方面中，本发明提供了用于测序多种单核酸模板分子的芯片，包含：一种基材，其包含；多个电容装置，各电容装置包含至少一个纳米级电极和与纳米级电极附近的基材结合的单个聚合酶复合物，各聚合酶复合物包含聚合酶和模板核酸；各基材设置成使得电容装置接触包含多种类型的核苷酸类似物的反应混合物，这些核苷酸类似物各自具有不同的电容标记物；以及多个电连接位点，其用于向电容装置提供电流和电压，并用于接收来自这些装置的电信号。
在一些实施方式中，该基材包含超过1000个电容装置。在一些实施方式中，该基材包含超过10000个电容装置。在一些实施方式中，该基材包含约1000个电容装置至约1000万个电容装置。在一些实施方式中，该基材包含约10000个电容装置至约100万个电容装置。
在一些实施方式中，各纳米级电极电连接至电互连元件，通过电互连元件向电极施加频率并测量电容。在一些实施方式中，该基材包含电子元件用于以下一个或多个目的：向纳米级电极提供交流电，测量纳米级电极处的电容，模拟数字转化，信号处理，以及数据储存。在一些实施方式中，这些电元件是CMOS元件。在一些实施方式中，该基材包含多个反电极。在一些实施方式中，对各纳米级电容装置存在一个反电极。
在一些方面中，本发明提供了一种用于模板核酸测序的系统，包括：具有外壳电连接位点的外壳；与外壳可逆配合的包含基材的芯片，其包含；与外壳电连接位点可逆连接的芯片电连接位点；多个电容装置，各电容装置包含至少一个纳米级电极和与至少一个纳米级电极相连或与至少一个纳米级电极附近的基材结合的单个聚合酶复合物，该聚合酶复合物包含聚合酶和模板核酸；用于使测序反应混合物接触电容装置的流体储器，该测序反应混合物包含多种类型的核苷酸类似物，各类型具有不同的阻抗标记物，在类似物与聚合酶复合物相联系的同时这些阻抗标记物被纳米级电子元件感知；电子控制系统，其通过电连接与纳米级电极连接以向纳米级电极施加所需交流电并测定出入纳米级电极的电流；以及计算机，其随时间接收纳米级电极处电容上的信息并使用这类信息鉴定模板核酸的序列。
在一些实施方式中，该基材包含超过1000个电容装置。在一些实施方式中，该基材包含超过10000个电容装置。在一些实施方式中，该基材包含约1000个电容装置至约1000万个电容装置。在一些实施方式中，该基材包含约10000个电容装置至约100万个电容装置。
在一些实施方式中，各纳米级电极电连接至电互连元件，通过电互连元件向电极施加适当频率并测量电容。在一些实施方式中，该基材包含电子元件用于以下一个或多个目的：向纳米级电极提供交流电，测量纳米级电极处的电容，模拟数字转化，信号处理，以及数据储存。在一些实施方式中，这些电元件是CMOS元件。在一些实施方式中，该基材包含多个反电极。在一些实施方式中，对各纳米级电容装置存在一个反电极。
在一些方面中，本发明提供了一种核酸测序的方法，包括：提供包含纳米FET的阵列的基材，其各自包含源、漏区和栅，多个纳米FET包含含有聚合酶和模板核酸的单个聚合酶复合物，该复合物与纳米FET的栅接合或与靠近纳米FET的栅的基材接合；将该基材暴露于多种类型的核苷酸类似物，其各自包含与核苷酸类似物的磷酸部分接合的不同的电导标记物，暴露的条件为发生聚合酶介导的核酸合成，导致切割电导标记物和新生核酸链的生长；在源和漏区之间施加电压，当核苷酸类似物存在于酶的活性位点中时，核苷酸类似物上的电导标记物生成栅的电导的可测量变化；随时间监测纳米FET处包含电流和电压的电信号，该电信号表示具有特定电导标记物的某一类型的核苷酸类似物的掺入事件；以及使用该电信号确定模板核酸的序列。
在一些实施方式中，用于确定模板核酸序列的电信号包括信号的持续时间，其表示聚合酶的活性位点中核苷酸类似物的停留时间。在一些实施方式中，纳米FET的栅包含纳米线。在一些实施方式中，纳米FET的栅包含掺杂硅。
在一些实施方式中，跨源和漏区的电压是DC。在一些实施方式中，跨源和漏区的电压是AC，且AC电压的频率随时间变化。在一些实施方式中，该基材暴露于四种类型的核苷酸类似物，其对应于A、G、C、T或A、G、C、U，这四种类型的核苷酸类似物各自具有不同的电导标记物。
在一些实施方式中，该电容标记物与聚磷酸部分通过接头接合。
在一些方面中，本发明提供了用于测序多种单核酸模板分子的芯片，包含：一种基材，其包含；多个纳米FET装置，各纳米FET装置包含源、漏区和栅以及与纳米FET的栅或栅附近的基材结合的单个聚合酶复合物，该聚合酶复合物包含聚合酶和模板核酸；各基材设置成使得纳米FET装置接触包含多种类型的核苷酸类似物的测序反应混合物，这些核苷酸类似物各自具有不同的电导标记物；以及多个电连接位点，其用于向纳米FET装置提供电流和电压，并用于接收来自纳米FET的电信号。
在一些实施方式中，纳米FET的栅包含纳米线。在一些实施方式中，纳米FET的栅包含掺杂硅。
在一些实施方式中，该基材包含超过1000个纳米FET装置。在一些实施方式中，该基材包含超过10000个纳米FET装置。在一些实施方式中，该基材包含约1000个纳米FET装置至约1000万个纳米FET装置。在一些实施方式中，该基材包含约10000个纳米FET装置至约100万个纳米FET装置。
在一些实施方式中，该基材包含电子元件用于以下一个或多个目的：向纳米FET提供电信号，测量纳米FET处的电信号，模拟数字转化，信号处理，以及数据储存。在一些实施方式中，这些电元件是CMOS元件。
在一些方面中，本发明提供了一种用于模板核酸测序的系统，包括：具有外壳电连接位点的外壳；与外壳可逆配合的包含基材的芯片，其包含；与外壳电连接位点可逆连接的芯片电连接位点；多个纳米FET装置，各纳米FET装置包含源、漏区和栅以及与栅或栅附近的基材结合的单个聚合酶复合物，该聚合酶复合物包含聚合酶和模板核酸；用于使测序反应混合物接触纳米FET装置的流体储器，该测序反应混合物包含多种类型的核苷酸类似物，各类型具有不同的电导标记物，在类似物与聚合酶复合物相联系的同时这些电导标记物被纳米FET感知；电子控制系统，其通过电连接与纳米FET装置连接以向纳米级电极施加所需电信号并用于接收来自纳米FET装置处的电信号；以及计算机，其随时间接收纳米级电极处的电信号并使用这类信息鉴定模板核酸的序列。
在一些实施方式中，纳米FET的栅包含纳米线。在一些实施方式中，纳米FET的栅包含掺杂硅。
在一些实施方式中，该基材包含超过1,000个纳米FET装置。在一些实施方式中，该基材包含超过10000个纳米FET装置。在一些实施方式中，该基材包含约1000个纳米FET装置至约1000万个纳米FET装置。在一些实施方式中，该基材包含约10000个纳米FET装置至约100万个纳米FET装置。
在一些实施方式中，该基材包含电子元件用于以下一个或多个目的：向纳米FET装置提供电信号，测量纳米FET装置处的电信号，模拟数字转化，信号处理，以及数据储存。在一些实施方式中，这些电元件是CMOS元件。
附图简要说明
图1(A)-(F)显示本发明的一个实施方式，其中使用具有单个纳米级电极的纳米级电容装置进行单分子测序。
图2(A)-(F)显示本发明的一个实施方式，其中使用具有两个纳米级电极的纳米级电容装置进行单分子测序。
图3显示测序方法，显示如何使用电容关联时间的变化来鉴定掺入的核苷酸类似物。
图4(A)-(F)显示一些潜在的实施方式，其用于电容装置的双电极和单电极配置。
图5(A)和(B)显示如何制造芯片上的纳米级装置的阵列以同时测序多个模板。
图6(A)-(C)显示用于形成本发明的单电极电容装置的三种可能的结构。
图7(A)-(E)显示生产本发明的双电极电容装置的示例性方法且图7(F)显示替代性实施方式。
图8显示使用纳米FET进行测序的本发明的方法。
图9显示如何使用来自纳米FET的随时间变化的电导对模板核酸进行测序。
图10显示一组示例性核苷酸类似物，其提供四种可区分的电容标记物。
发明详述
在一些方面中，本发明提供了涉及单分子实时电子测序的方法、装置、系统和组合物。可使用阻抗、电容或电导进行电子检测。在一些方面中，单个聚合酶-模板复合物固定于靠近一个或两个纳米级电极，并通过测量核苷酸类似物上标记物生成的一个或多个纳米级电极处阻抗、电容或电导的变化来监测聚合酶掺入的核苷酸，同时核苷酸类似物在掺入期间维持在活性位点中。本发明利用能够以单分子水平检测信号的纳米级电子元件的阵列。在一些方面中，单个聚合酶-模板复合物固定于靠近纳米FET装置的栅，且来自纳米FET的电信号被用于确定核酸序列。在一些方面中，纳米级电极被用于以单分子水平测量电容的变化。使电极处于纳米级别允许以单分子水平获得适当信噪比。
通常存在四种核苷酸类似物，其各自具有不同的可区分电容或电导标记物。该电容或电导标记物通过核苷酸类似物的磷酸部分与该类似物相连，从而在通过聚合酶将核苷酸类似物掺入生长的链中时释放该标记物。该电容或电导标记物通常通过接头与该类似物的核苷酸部分相连。当核苷酸类似物位于聚合酶活性位点中时，电容标记物在纳米级电极处生成电容变化，或电导标记物生成纳米FET的栅的电导的变化。电容或电导的变化可用于确定活性位点中是否存在核苷酸类似物和核苷酸类似物的性质。核苷酸处于活性位点中时电容的特性可不同于在电极附近游离扩散的核苷酸的特性。由于核苷酸在酶催化的掺入过程期间靠近电极或栅，其被固定足够长的时间以测定其特征性电容变化，从而鉴定掺入的核苷酸的类型。
本发明涉及不需要核苷酸或核苷酸类似物上标记物的还原或氧化(氧化还原)的单分子测序。使用电容、阻抗或电导变化相对于使用氧化还原标记物具有多个优势。一个优势是，与基于氧化还原的方法中的标记物相比，本发明中的标记物可具有较低反应性。为使基于氧化还原的方法感知标记物，必须在标记物和电极之间交换一个或多个电子，导致标记物的还原或氧化。这些类型的反应可生成诸如自由基、自由基阴离子或自由基阳离子的产物或中间体，其可以是反应性且不稳定的。在本申请中，电容、阻抗或电导标记物可影响芯片上组分的电性质而不交换电子。此外，与使用氧化还原化学相比，其可更直接地提供多个(例如四个)不同的使用电容、阻抗或电导的标记物，所述氧化还原化学例如用不同的氧化或还原电势区分四种标记物。
当电容装置被用作纳米级电子元件时，可通过在向电极施加AC电流的同时测量电极处的阻抗来确定电容。施加于单个纳米电极或纳米电极对的电流的频率通常随时间变化，变化方式允许使用电容标记物(例如具有不同阻抗关联频率特性的电容标记物)鉴定活性位点中的核苷酸类似物。随后使用碱基读出软件以通过关联相关电压处随时间变化的阻抗或电容与电容标记物的预期特性来读出碱基。读出的碱基可用于鉴定模板核酸的序列，其序列与所加入的碱基互补。本发明的方法利用以下特性：与不掺入的非关联核苷酸或从电极附近通过的游离扩散的核苷酸相比，掺入生长的核酸链的核苷酸类似物在酶的活性位点中花费更长的时间且因此靠近电极花费更长的时间。因此，停留时间可用作区分掺入的核苷酸与溶液中游离扩散的核苷酸的特性。
描述了具有纳米级电子元件的阵列的芯片，所述纳米级电子元件包含纳米级电极电容装置和纳米FET装置。各装置实时进行测序反应，允许同时监测数百、数千、数百万或更多的测序反应。用于电容装置的纳米级电极通常构造为具有小尺寸，且因此生成低水平的电容噪音。这允许用于通常以毫秒至微秒时间尺度所发生事件的电容测量的电流实现迅速转移。这些芯片可使用已知的半导体加工技术制备，例如在硅基材上。阵列中的纳米级电极具有与电极接合或接合于电极附近的聚合酶-模板复合物。该聚合酶-模板复合物与纳米级电极足够接近，从而当核苷酸类似物与复合物中的聚合酶相关联时可检测核苷酸类似物上的电容标记物。
描述了用于进行测序的系统。本发明的电容或纳米FET测序芯片紧密配合固定芯片的插座且提供与芯片上互连的电连接用于将电信号转移至和转移出纳米级电极。电流/电压源提供电流和电压以向纳米级电极给予电势并在一些情况中给予所需AC频率(时间函数的形式)。使用阻抗测量装置或纳米FET来测定与存在电容或电导标记物相关的电信号变化。
该系统包含用于使测序试剂接触芯片上纳米级电极的流体储器。该流体储器可以是例如微流体腔或孔。该系统还将具有与流体接触的反电极、参比电极或上述两者。该反电极和或参比电极可掺入芯片或可与芯片隔开，且接触液体样品。在流体储器中是测序反应混合物，其允许单个聚合酶接近纳米级电极以进行核酸合成。该测序反应混合物具有含电容标记物或电导标记物的核苷酸类似物，其当核苷酸掺入生长的核酸链时被切割。该酶接近一个或多个纳米级电极或栅，从而当核苷酸类似物与聚合酶以掺入生长链的形式相关联时，核苷酸类似物上的电容或电导标记物改变纳米级电极或栅的区域中的电容或电导。电压/电流源可用于随时间改变纳米级电极处的AC信号。电流计可用于测量电流和阻抗的水平。电容、阻抗或电导变化的测量值表示核苷酸类似物上的电容标记物处于酶中。计算机在电流计处随时间监测测得的电流，并使用该信息确定核苷酸掺入的序列。电容信号或电导信号表示对应于该标记物的核苷酸正被掺入生长链。通过测量掺入的时间顺序，可确定生长链的序列并从而确定相应模板核酸的序列。
在一些情况中，纳米级电子元件包含单个纳米级电极，其用于通过测量酶复合物内是否存在电容标记的核苷酸类似物来进行核酸测序。图1提供了使用一个纳米级电极和结合或接近该纳米级电极的聚合酶-模板复合物进行实时核酸测序的方法的示意图。基材100在其表面上具有包含纳米级电极102的区域。电极102上接合有包含聚合酶110和核酸模板130的聚合酶复合物。该复合物通常是带引物的，例如具有寡核苷酸引物。该复合物通过接合部分120与电极102接合。在一些情况中，该复合物不与电极102接合，而是与电极附近的基材接合或与电极顶部上的绝缘区域接合。该接合必须足够接近电极，使得当核苷酸类似物与酶相关时，可检测电容标记物。如图1所示，聚合酶与电极表面接合。在一些情况中，模板核酸与表面接合，其直接接合或通过与引物杂交来与表面接合。
使包含纳米级电极的基材接触包含测序反应混合物的流体。该序列反应混合物具有进行聚合酶介导的核酸合成所需的试剂。该测序反应混合物将通常包含Mn++或Mg++盐用于激活酶，以及其他盐(如Na+或K+)用于提供适当离子强度。这些盐还可用于调节电极处的背景阻抗。在一些情况中，调节溶液中离子的类型和含量以实现最优溶液阻抗。该测序反应混合物还含有电容标记的核苷酸类似物，如标记的核苷酸类似物140。在图1中，核苷酸类似物140是具有与模板核酸130中下一位置互补的碱基的关联核苷酸。核苷酸类似物140具有包含核碱基、糖和聚磷酸部分的核苷酸部分144。核苷酸类似物140具有通过接头146与核苷酸部分144的聚磷酸部分接合的电容标记物142。
在图1(B)中，核苷酸类似物140位于聚合酶110的活性位点中。因为其是关联核苷酸，其被同样的酶识别并在酶中停留比非关联核苷酸更长的时间。在核苷酸类似物140相关时，使用交流电访问电极102。在一些情况中，通过一系列频率连续或逐步循环电极。标记物142导致电极处测量的电容变化，允许检测其是否存在及其性质。
如图1(C)所示，当核苷酸类似物140掺入生长的链时，酶切割核苷酸类似物的聚磷酸部分。该切割发生在α和β磷酸之间，释放包含标记物142的那部分核苷酸类似物，其从基材中扩散出去。标记物的切割和扩散终止了电极处电容受标记物存在影响的时间段。电容的变化随后提供掺入前活性位点中核苷酸类似物停留时间的测量值，其可用于确定发生核苷酸掺入。
在一些情况中，使用两个纳米级电极来通过测量酶复合物内是否存在标记的核苷酸类似物来进行核酸测序。图2提供了使用两个纳米级电极和与该纳米级电极靠近结合的聚合酶-模板复合物进行实时核酸测序的方法的示意图。基材200在其表面上具有以纳米的数量级分隔的两个纳米级电极202和206。该分隔可以是1nm至100nm，或2nm至20nm。本发明中，电极之间的绝缘区域204提供分隔。电极之间的绝缘区域204上接合有包含聚合酶210和核酸模板230的聚合酶复合物。该复合物通过接合部分220与绝缘区域204接合。如图2所示，聚合酶与表面相连。在一些情况中，模板核酸可与表面接合，其直接接合或通过与表面接合的引物杂交来接合。在该图中，纳米级电极显示为置于水平表面上。在一些情况中，电极垂直放置，例如层的堆叠物的形式。垂直构造可用于生成电极之间的所需纳米级绝缘区域204。
使包含纳米级电极的基材接触包含测序反应混合物的流体。该序列反应混合物具有进行聚合酶介导的核酸合成所需的试剂。该测序反应混合物将通常包含Mn++或Mg++盐用于激活酶，以及其他盐(如Na+或K+)用于提供适当离子强度。这些盐可用于调节电极处的背景电容。该测序反应混合物还含有电容标记的核苷酸类似物，如标记的核苷酸类似物240。在图2中，核苷酸类似物240是具有与模板核酸230中下一位置互补的碱基的关联核苷酸。核苷酸类似物240具有包含核碱基、糖和聚磷酸部分的核苷酸部分244。核苷酸类似物240具有通过接头246与核苷酸部分244的聚磷酸部分接合的电容标记物242。
在图2(B)中，核苷酸类似物240位于聚合酶210的活性位点中。因为其是关联核苷酸，其被同样的酶识别并在酶中停留比非关联核苷酸更长的时间。当核苷酸类似物240相关时，将在电极202和206处检测其是否存在。使用交流电访问电极202和206，在一些情况中，通过一系列频率连续或逐步循环电极。标记物242导致电极处测量的电容变化，允许确定其是否存在及其性质。
如图2(C)所示，当核苷酸类似物240掺入生长的链时，聚合酶切割核苷酸类似物的聚磷酸部分。该切割发生在聚磷酸部分的α和β磷酸之间，释放包含标记物242的那部分核苷酸类似物，其从基材中扩散出去。标记物的切割和扩散终止了电极处电容受标记物存在影响的时间段。电容的变化随后提供掺入前活性位点中核苷酸类似物停留时间的测量值，其可用于确定发生核苷酸掺入。
上文描述了一种类型的核苷酸类似物的检测。该方法也用于测量超过一种类型的类似物(例如2、3、4、5或更多种类型的类似物)的掺入。例如，通常使用对应于A、G、C、T(DNA)或A、G、C、U(RNA)的四种不同类型的核苷酸类似物。这四种类型的核苷酸类似物各自具有不同且可区分的电容特性，例如四种不同的电容标记物。不同类型的核苷酸类似物可具有不同的电容，不同的电容关联频率特性，或可具有其他可区分的电特性，例如不同的电流振荡颜色，或可具有上述特性的组合。
图3显示如何使用本发明来读出一系列碱基以使用阻抗变化进行测序。显示了经检测的阻抗信号。使用了上文所述的一个单电极的系统。同一本发明所述方法可用于使用双电极构造进行测序，所述双电极构造针对电容或具有另一纳米级电子元件(如纳米FET装置)。虽然根据电容描述本方法，但本方法可类似地使用电导或更通常地使用阻抗进行。在图3中存在四种类型的核苷酸类似物，其各自具有不同的电容标记物，例如在电极附近时各自具有不同程度的电容变化。对于此处所示方法，电极处的电流频率在整个实验中保持相同，并随时间变化监测该频率处的阻抗。
通过参考5种不同的时间框在图3中描述该方法。在时间框1期间，四种核苷酸类似物中无一与聚合酶相关，且因此四种电压状态无一检测到与基线相比可感知量的阻抗变化。在时间框2中，对应于核碱基A的核苷酸类似物位于活性位点中，持续对掺入具有特征性的时间(例如约10毫秒至约500毫秒)。核苷酸类似物位于活性位点内期间，测得的阻抗上升至该核苷酸类似物上标记物的特征性水平。这一对应于掺入的停留时间的阻抗水平显示A的掺入。当核苷酸掺入时，电容标记物被切割且阻抗信号回到基线。在时间框3中，再次四个通道中无一检测到阻抗的可感知变化，表明聚合酶的活性位点中不存在核苷酸类似物。在时间框4期间，对应于T的核苷酸类似物掺入且在活性位点中停留掺入特征性时间段。在这一时间期间，其位于酶内，观察到对应于T的核苷酸类似物上标记物的阻抗特征。
当类似物掺入时，标记物被切割并扩散且阻抗再次回到基线。在时间框5中持续短时间，检测到阻抗增加(增加至符合对应于G的标记物的水平)。增加的阻抗的时间太短以至于无法对应于掺入事件。例如，在非关联核苷酸尝试进入活性位点时可观察到这一类型的特征，之后其从酶中扩散。在图3所示的那部分实验的时间期间，数据显示掺入了一个A和一个T，因此表明在模板的互补序列中存在一个T和一个A。虽然该说明涉及两个核苷酸的掺入，但该方法可用于对数百碱基至数万碱基或更长的核酸的长延伸体(stretch)进行测序。
图3的实施例使用四种核苷酸进行，其各自具有显示不同阻抗幅度的电容标记物。应理解，与图3所述方法相同的方法可应用于以下情况中：其中阻抗关联时间(介电光谱)或电流振荡颜色或这三种的任意组合被用于鉴定掺入的碱基。
在一些方面中，本发明提供了一种用于模板核酸测序的方法，包括：将包含聚合酶、模板和引物的聚合酶复合物置于靠近纳米级电极处；将聚合酶暴露于包含进行聚合酶介导的核酸合成所需组分的溶液，该溶液包含多种核苷酸类似物，各核苷酸类似物具有不同的电容标记物，各电容标记物与核苷酸类似物的磷酸部分接合从而使核苷酸类似物在掺入生长的核酸链后被切割和释放；测量来自阻抗测量系统的电信号，该阻抗测量系统包含纳米级电极、任选的反电极和任选的参比电极以通过其电容标记物测定酶的活性位点中是否存在核苷酸类似物及其性质；以及随时间监测该电信号以确定模板核酸的序列。
纳米级电极电容装置的阵列
本发明的一些方面提供了用于进行实时电容测序的装置的阵列。这些装置的阵列包含具有多个纳米级电极电容区域的芯片，其各自为本发明所述的单电极或双电极构造。对于单电极或双电极构造，我们指芯片具有一个或两个电极，在所述电极处测量阻抗和/或电容。在一些情况中，包含装置的阵列的芯片还可包含反电极或反电极的阵列，参比电极的阵列或参比电极。在一些情况中，这些芯片将同时具有反电极和参比电极或同时具有反电极和参比电极的阵列。
本发明的芯片可使用已知的半导体加工技术生产。这些技术允许不昂贵地生产具有大量电容装置的阵列。这些芯片具有例如2至100万或更多个电容装置。在一些情况中，这些芯片具有9至100个、100至10000个，或10000至100万个或100000至1000万个电容装置。芯片上装置的数目将取决于使用该芯片的应用的类型。在一些情况中，具有少于100个电容装置是有用的，例如在诊断应用中，其中需要在短时间框内获得所选核酸组的具体答案。对于其中需要高通量的应用，例如全人基因组测序，使用具有100万至1000万个装置的芯片。本领域技术人员应理解，随着电容装置数目的增加，对于使用芯片的系统存在更高的要求，例如更复杂的驱动和传感电子件和更高通量的数据分析。当前的高通量测序技术已证明这些问题可通过适当的工程水平来解决。
在一些情况中，这些芯片具有包含一个或两个纳米级电极的纳米级电容装置，以及连接这些电容装置与芯片上电子输出的电互连。此外，在一些情况中，芯片上存在针对各电容装置的一个反电极。在一些情况中，芯片上存在针对多个电容装置的一个反电极。例如，芯片上存在针对各1至各1000个装置的一个反电极，针对各10至100个装置的一个反电极，或针对芯片上所有装置的一个反电极。
通常，使用参比电极时，该参比电极将与芯片隔开，但在一些情况中，该参比电极可以位于芯片上。如同反电极那样，在一些情况中，芯片上存在针对各电容装置的一个参比电极。在一些情况中，芯片上存在针对多个电容装置的一个参比电极。例如，芯片上存在针对各1至各1000个装置的一个参比电极，针对各10至100个装置的一个参比电极，或针对芯片上所有装置的一个参比电极。
这些芯片还可具有相应的对照电极的阵列。对照电极用于改进信噪比，其凭借具有与纳米级电极类似的特性但不具有结合在其附近的聚合酶。从纳米级电极处的信号中扣除对照电极处的信号可去除两种电极共有的噪音，且因此改进纳米级电极处的信噪比。在一些情况中，芯片上存在针对各电容装置的一个对照电极。在一些情况中，芯片上存在针对多个电容装置的一个对照电极。例如，芯片上存在针对各1至各1000个装置的一个对照电极，针对各10至100个装置的一个对照电极，或针对芯片上所有装置的一个对照电极。在一些情况中，该对照电极可构成对照电容装置，例如对照双电极电容装置，其有意不具有结合在电极附近的聚合酶。
这些芯片还可具有其他整合的组件。由于各装置通过半导体加工技术制备，其直接包含其他组件，例如电阻、电容、放大器、记忆电路、A/D转换器、逻辑电路等。这些电路可提供放大、模拟数字转换、信号处理、记忆和数据输出的功能。通过在装置中包含诸如CMOS处理器的组件解决了同时监测多个事件的问题。纳入这些组件允许多重输出或可访问输出(如同在DRAM芯片中使用的那样)，而非具有至少一对将信号带出芯片的线。当装置的数目很多时，倾向于更需要在芯片上建立额外的电路。这允许在芯片进行部分分析，该分析方式能够显著降低对必须出入芯片的电信号的量的需要。
这些电极可由任何合适的导电材料制成。其通常由可进行半导体处理的导电金属制成。金属包括铝、银、金和铂。这些电极可制造为在至少一个维度、至少两个维度或三个维度上是纳米级。电极的尺寸取决于多种设计参数。在本申请中讨论电极尺寸时，我们通常指接触流体测序混合物的那部分电极。在许多情况中，不接触溶液的导电部分的尺寸较大以提高导电性。该电极应足够大，使得当具有电容标记物的核苷酸类似物位于活性位点中时，可通过该电极有效地检测是否存在电容标记物。在一些情况中，该电容标记物与电极物理接触。
图4显示本发明的电极的几何形状的一些方式。图4(A)显示双电极构造，其具有绝缘基材上的线性电极。图4(B)显示双电极构造，其中酶与电极壁之间的绝缘层接合。应注意对于(B)而言，可制备电极使得仅电极的内壁可有效地测量电容反应。图4(C)显示在与酶接合的中部具有绝缘带的开口环状电极。图4(D)显示环状对称单电极构造，其中酶复合物与电极接合。图4(E)显示环状对称单电极构造，其中酶复合物与中间绝缘区域接合。该构造可用于提供化学上不同的区域以促进聚合酶复合物的选择性结合。图4(F)显示平坦绝缘表面上的单电极线性单极构造。这些电极可具有任何合适的几何形状。
图5(A)显示线性双电极构造电容装置的阵列。可图案化半导体表面以生成电容装置的阵列。可通过渠道滴加至下面层来提供连接纳米级电极与电输入和输出的互连。与芯片的电连接通常连接至芯片的侧面或底部。图5(B)显示环形对称的单电极构造电容装置的阵列。
图6显示装置的截面图，其显示使用标准半导体工艺的单电极构造电容装置的示例性方式。这些构成了相对直接的半导体装置结构，其通过标准半导体制造技术以阵列形式制备于芯片上。在图6(A)中，基材600(通常是硅)具有跨基材600延伸的电轨迹620。电轨迹620通过渠道690连接电极610，渠道690延伸通过层650。绝缘层640沉积在电极610的顶部上以建立以电极610作为其基部的绝缘材料孔。酶复合物630结合至绝缘孔内电极顶部。在图6(B)中，电互连622跨基材602延伸，且渠道692延伸通过层652至电极612。平面化层662经沉积和任选的抛光以生成具有齐平的接合酶复合物632的表面的电极构造。在图6(C)中，电互连624跨基材604延伸。渠道694延伸通过层654并连接电互连624与电极614。聚合物-模板复合物634接合电极614。
对于双电极构造，可例如相对于基材顶部水平或垂直放置两个电极。垂直构造可用于生产薄层，例如两个纳米级电极之间绝缘层的厚度为1nm至约100nm，2nm至50nm，或10nm至100nm。图7显示生产半导体基材上双电极电容装置的阵列的示例性方法。在图7(A)至(F)中，各图都显示了装置的俯视图和侧视图。图7(A)显示基材(如硅基材)上的图案化金属电极。该图案建立较低的电极极板和互连，所述互连可突出以建立与芯片的电连接。在步骤I中，沉积、图案化和蚀刻绝缘层(如SiO2)，从而覆盖底部电极(图7(B))。该层将成为电容装置中两个纳米级电极之间的绝缘层。该绝缘层通常以2nm至20nm的厚度沉积。虽然图7中的绝缘层显示为平坦状，但在一些情况中，该绝缘层沉积为朝最终暴露的边缘的方向厚度递增以形成电极装置。厚度的变化可允许在SiO2层暴露处厚度较薄(如1-10nm)，但在装置的其他部分中具有较厚的层，从而使装置的总体电容较低。在步骤II中，顶部电极层沉积在绝缘层的顶部上，其中电极延长以生成电互连(图7(C))。在步骤III中，第二绝缘层沉积在顶部电极层上。该第二绝缘层通常不同于第一绝缘层，且可以是例如氮化硅或氧化铝。使第一绝缘层(如SiO2)由不同材料制得可用于选择性结合酶与电极之间的层(图7(D))。在步骤IV中，将缺口蚀刻入电极绝缘物推叠中以暴露一部分顶部和底部电极和绝缘层(图7(E))。图7(F)显示最终装置的替代物，其中电极层彼此之间具有一定角度。该角度允许暴露的电极部分相互接近(即电极之间的SiO2层较薄)，且其还允许电极的大块部分彼此远离，这降低了电容装置的电容，允许更快的充电和放电。该方法允许小且良好控制的双电极电容装置。
实时电导测序–纳米线–纳米FET
本发明的一个方面提供实时测序，其中使用纳米级场效应晶体管(纳米FET)检测生长的链中核苷酸的掺入。可通过例如纳米FET的栅的电导的变化检测掺入。在一些情况中，该FET包含纳米线，且通过检测纳米线的电导的变化检测掺入。包含聚合酶和模板核酸的聚合酶复合物固定在纳米线上或靠近纳米线处。该聚合酶复合物接触支持核酸合成的反应混合物。该反应混合物包含核苷酸或核苷酸类似物，其中至少一种类型的核苷酸类似物具有标记物，所述标记物将在本文中称作电导标记物、导电标记物。该标记物与核苷酸类似物的聚磷酸部分连接，从而当掺入核苷酸类似物时，该标记物随着聚磷酸链被切割而被释放。
选择电导标记物，使得当其接合的核苷酸类似物位于酶的活性位点内时，该标记物生成纳米线电导的变化，聚合酶接合或靠近所述纳米线。核苷酸类似物的掺入导致电导标记物的释放，将纳米线的电导恢复至基线值。虽然四种类型的核苷酸各自都可尝试进入活性位点，与未掺入的核苷酸或核苷酸类似物相比，掺入的核苷酸或核苷酸类似物(关联核苷酸)将在活性位点中花费更长的时间。因此，纳米线的电导检测标记的核苷酸类似物何时存在于聚合酶的活性位点中。
纳米线中电导变化的特性对于不同的电导标记物而言是不同的。因此，除了检测是否存在掺入的核苷酸外，本发明的方法还允许区分反应混合物中的两种或更多种核苷酸类似物。通常使用四种类型的核苷酸类似物，对应于DNA的A、G、T或C以及RNA的A、G、U或C，其各自具有不同的电导标记物。通过观察随时间变化的核苷酸的掺入，可确定聚合酶复合物中模板核酸的序列。该聚合酶将核苷酸特异性添加至与模板链中核苷酸互补的生长链，例如A<->T和G<->C。通过确定向生长链中添加了哪种核苷酸，可确定模板链的序列。
该纳米线可用作纳米场效应晶体管或纳米FET中的栅，其中电极接合纳米线的各侧以作为源和漏区。该纳米线可以是例如碳纳米管或半导体如掺杂硅。有许多材料可制备纳米线或栅，其示例详述于下文。
在一些情况中，纳米线或纳米FET用于进行核酸测序，测序方法为随着酶将核苷酸添加至生长链中实时测量酶复合物内是否存在标记的核苷酸类似物。图8提供了实时核酸测序的方法的示意图，其中两个纳米级电极作为源和漏区且纳米线或栅将其连接。聚合酶-模拟复合物结合在纳米线或栅附近。在图8中，聚合酶与纳米线直接接合。在一些情况中，聚合酶与纳米线附近一定距离的基材接合而非直接接合，从而通过纳米线电导的变化检测是否存在与酶相关的核苷酸类似物所接合的电导标记物。基材800在其表面上具有以纳米的数量级分隔的两个电极802和806。例如，分隔距离可以是1nm至400nm或2nm至100nm。纳米线804跨间隙延伸，连接电极802和806(FET的源和漏区)。在一些情况中，该源和漏区覆盖有绝缘材料，使得该源和漏区不直接接触溶液。纳米线或栅804上接合包含聚合酶810和核酸模板830的聚合酶复合物。该复合物通过接合部分820与纳米线或栅804接合。如图8所示，聚合酶与纳米线接合。在一些情况中，模板核酸可与纳米线接合，其直接接合或例如通过与纳米线接合的引物杂交。在该图中，纳米级电极和纳米线显示为置于水平表面上。在一些情况中，电极和纳米线垂直放置，例如层的堆叠物的形式。
使包含纳米FET的基材接触包含测序反应混合物的流体。该序列反应混合物具有进行聚合酶介导的核酸合成所需的试剂。该测序反应混合物将通常包含二价催化阳离子如Mn++或Mg++盐用于激活酶，以及其他盐(如Na+或K+)用于提供适当离子强度。这些盐可用于调节电极处的背景电容。该测序反应混合物还含有电导标记的核苷酸类似物，如标记的核苷酸类似物840。在图8中，核苷酸类似物840是具有与模板核酸830中下一位置互补的碱基的关联核苷酸。核苷酸类似物840具有包含核碱基、糖和聚磷酸部分的核苷酸部分844。核苷酸类似物840具有通过接头846与核苷酸部分844的聚磷酸部分接合的电导标记物842。
在图8(B)中，核苷酸类似物840位于聚合酶810的活性位点中。因为其是关联核苷酸，核苷酸类似物840被同样的酶识别并在酶中停留比非关联核苷酸更长的时间。在核苷酸类似物840被关联时，其是否存在将通过纳米线或栅的电导变化检测，导致栅和漏区(如电极)802和806处电流和/或电压的变化。使用直流电或交流电访问电极802和806，在一些情况中，通过一系列频率连续或逐步循环电极。标记物842导致电极处测量的电导或阻抗特征变化，允许确定其是否存在及其性质。
如图8(C)所示，当类似物的核苷酸部分840掺入生长的链时，聚合酶切割核苷酸类似物的聚磷酸部分。该切割发生在聚磷酸部分的α和β磷酸之间，释放包含标记物842的那部分核苷酸类似物，其从基材中扩散出去。标记物的切割和扩散终止了纳米线或栅处电导受标记物存在影响的时间段。电导的变化随后提供掺入前活性位点中核苷酸类似物停留时间的测量值，其可用于确定发生核苷酸掺入。
上文描述了一种类型的核苷酸类似物的检测。相同的方法也用于测量超过一种类型的类似物(例如2、3、4、5或更多种类型的类似物)的掺入。例如，通常使用对应于A、G、C、T(DNA)或A、G、C、U(RNA)的四种不同类型的核苷酸类似物。这四种类型的核苷酸类似物各自具有纳米线处不同且可区分的电导特性，例如四种不同的电导标记物。不同类型的核酸类似物可具有不同的电导，不同的电导关联频率特性，或可具有其他可区分的电特性，例如不同的电流振荡颜色，或可具有上述特性的组合。
上文和图8描述了检测核苷酸类似物。描述的方法也用于测量超过一种类型的类似物(例如2、3、4、5或更多种类型的类似物)的掺入。例如，通常使用对应于A、G、C、T(DNA)或A、G、C、U(RNA)的四种不同类型的核苷酸类似物来进行测序。这四种类型的核苷酸类似物各自具有不同且可区分的电导特性，例如四种不同的电导标记物。不同类型的核苷酸类似物可具有不同的电导变化幅度，不同的电流关联时间性质，或可具有其他可区分的电特性，例如不同的电流振荡颜色，或可具有上述特性的任意组合。
图9显示本发明的纳米线或栅如何可用于读出一系列碱基以进行测序。显示的图表明通过检测的纳米线或栅的电导信号。存在四种类型的核苷酸类似物，其各自具有不同的电导标记物，例如靠近纳米线或栅时各自具有不同的纳米线或栅中电流变化幅度。例如，可在整个实验期间将跨两个电极、源和漏区的电压保持恒定，并随时间监测通过纳米线或栅的电流。
通过参考5种不同的时间框在图9中描述该方法。在时间框1期间，四种核苷酸类似物无一与聚合酶相关联。在时间框2中，对应于核碱基A的核苷酸类似物位于活性位点中，持续对掺入具有特征性的时间(例如约10毫秒至约500毫秒)。其位于活性位点内期间，测得的电导上升至该核苷酸类似物上标记物的特征性水平。这一对应于掺入的停留时间的电导水平显示A的掺入。当核苷酸掺入时，电导标记物被切割且电导信号回到基线。在时间框3中，如时间框1那样，聚合酶的活性位点中没有核苷酸类似物且电导处于基线水平。在时间框4期间，对应于T的核苷酸类似物被掺入生长链。对应于T的核苷酸类似物在活性位点中持续对掺入具有特异性的一段时间。在这一时间期间，其位于酶内，观察到T核苷酸类似物上标记物的电导特征。当类似物掺入时，标记物被切割并扩散且电导再次回到基线。在时间框5中持续短时间，检测到电导增加(增加至符合对应于G的标记物的水平)。增加的电导的时间太短以至于无法与掺入事件关联。例如当非关联核苷酸(如G)试图进入活性位点时可观察到这一类型的特征，之后其从酶中扩散，其中非关联核苷酸扩散至与纳米线足够接近以改变其电导，或G核苷酸短时间的非特异性结合。在图3所示的那部分实验的时间期间，数据显示掺入了一个A和一个T，因此表明在模板核酸中存在一个T和之后的一个A。虽然该说明涉及两个核苷酸的掺入，但该方法可用于对数百碱基至数万碱基或更长的核酸的长延伸体进行测序。
图9的实施例使用四种核苷酸进行，其各自具有显示不同的纳米线或栅的电导幅度的电导标记物。应理解，与图9所述方法相同的方法可应用于以下情况中：其中电导关联时间(介电光谱)或电流振荡颜色或这三种的任意组合被用于鉴定掺入的碱基。
因此，本发明在一些方面中提供了一种核酸测序的方法，包括提供包含纳米FET的阵列的基材。各纳米FET具有源、漏区和栅。该源和漏区通常是纳米电极，且该栅通常是纳米线或连接源和漏区的其他纳米结构。该栅可以是掺杂的半导体，例如掺杂硅。该栅可以是碳纳米管，其可以是单壁或多壁的。碳纳米管栅可以是改性的或掺杂的。纳米FET的子集可具有单个聚合酶复合物，其与纳米FET的栅接合或与靠近纳米FET的栅的基材接合。使单个复合物接合栅或靠近栅的基材区域的一种方法是使结合聚合酶复合物的结合试剂与所述栅或所述区域接合，并使基材接触一定浓度的聚合酶复合物溶液，从而纳米FET的一部分使聚合酶复合物以单分子水平结合栅或附近区域。通过选择正确的稀释水平，泊松统计允许最多36％的栅接合单个复合物，剩余的栅不具有复合物或具有多个复合物。其他方法包括使用空间相互作用和在栅上提供高度特异性结合区域，其可提供比泊松统计预测值更高的单复合物水平。
随后使基材接触包含多种类型核苷酸类似物的反应混合物，其各自包含与核苷酸类似物的磷酸部分接合的不同电导标记物。标记物与磷酸部分的接合允许在核苷酸类似物的核苷酸部分掺入生长链时，随着标记物打断聚磷酸链，由聚合酶切割标记物。该标记物可通过接头连接聚磷酸链。
在纳米FET的源和漏区之间施加电压，使得当核苷酸类似物位于酶的活性位点中时，核苷酸类似物上的电导标记物产生栅的电导中可测量的变化。该电压可以是DC、伪DC(其中基本使用DC测量进行测量，但替代极性以避免腐蚀)或AC。在一些情况中，跨源和漏区的频率可随时间变化以辅助区分不同标记物的性质。该电导标记物通常是带电的物质，其与栅的相互作用导致栅处电导的变化。在一些情况中，该电导标记物直接接触(例如重复直接接触)栅，且在其他情况中该电导标记物可通过其距离接近程度影响栅的电导。栅和电导标记物都可以一定方式制备以改进标记物对栅处电导的变化。例如，如下文详细描述的那样，该栅可以不同水平掺杂，例如p掺杂或n掺杂，以调节其应答。电导标记物通常是水溶性的带电物质。这些电导标记物可具有多种电荷，例如约2至约2000电荷。这些标记物可包含枝状聚合物或纳米颗粒。可使用多种标记物，其各自具有不同水平的电荷，在一些情况中，一些标记物带正电且一些标记物带负电。
在聚合酶反应期间，且在施加电压的同时，随时间监测纳米FET处包含电流和电压的电信号。该电信号可显示发生了特定类型的核苷酸类似物的掺入事件。掺入事件的一个指示是信号的长度，因为取决于所用聚合酶的动力学，掺入事件将在一定时间范围中发生，其不同于扩散事件、非关联尝试进入事件或标记物与基材粘连。可使用电信号的多种特征来确定特定核苷酸类似物位于活性位点中且正被掺入。一个特征是电导的振幅。例如，各自具有不同水平的相同类型电荷的四种带电标记物可生成四种不同的电导水平。电导水平可设计为在给定电导标记物存在时升高或降低，例如使用带正电和带负电的标记物。除电荷数目外，标记物上电荷的密度也可影响信号且可控制电导标记物的电荷密度以控制纳米FET处的信号。这些电信号特征还可通过控制核苷酸类似物的结构以改变其电流振荡颜色特征来控制。
该电信号可因此提供确定聚合酶复合物中模板核酸序列所需的信息。算法，如2011年10月20日提交的美国专利申请号2011/0256631和美国专利号8,370,079所述。通过引用全文纳入本文用于所有目的。
通常，使用四种类型的核苷酸类似物进行本发明的方法，其对应于天然核苷酸A、G、C、T或A、G、C、U，这四种类型的核苷酸类似物各自具有不同的电导标记物。核苷酸类似物上的核碱基通常是天然核碱基，但也可使用修饰的核碱基，前提是使用的聚合酶可有效地将其掺入生长链。
在一些方面中，本发明提供了用于测序多种单核酸模板分子的芯片。该芯片的基材具有多个纳米FET装置，通常位于其顶部表面。各纳米FET装置都具有源、漏区和栅。基材上的一些纳米FET的栅上是单个聚合酶复合物，其与栅结合或与靠近纳米FET的栅的基材结合。该聚合酶复合物包含聚合酶和模板核酸。该模板核酸通常是带引物的，且准备作为核酸合成的模板。该基材设置成使得纳米FET与测序反应混合物接触。该基材将通常具有孔，其中分散有反应混合物，或将具有流体导管或流体腔以使反应混合物接触表面上的纳米FET装置。该反应混合物具有进行核酸合成所需的试剂，包括多种类型的核苷酸类似物。两种或更多种核苷酸类似物具有不同的电导标记物。这些电导标记物与栅相互作用以改变其电导，如本发明所述。该芯片还具有电连接位点以向纳米FET提供电流和电压并接收来自纳米FET的电信号。
芯片上的纳米FET可以是任何类型的纳米FET，包括本发明所述的纳米FET类型，例如包括纳米线和/或包括掺杂硅。
该芯片通常具有多个纳米FET装置，例如超过1000个纳米FET装置，或超过10000个纳米FET装置。该芯片可具有例如约1000个纳米FET装置至约1000万个纳米FET装置或约10000个纳米FET装置至约100万个纳米FET装置。
该芯片通常使用半导体加工技术制备，允许在包含电子元件的芯片上纳入其他功能，用于以下一种或多种目的：向纳米FET提供电信号，测量纳米FET处的电信号，模拟数字转化，信号处理，以及数据储存。这些电子元件可以是例如CMOS元件。
在一些方面中，本发明提供了一种用于测序模板核酸的系统，其具有外壳，所述外壳具有外壳电连接位点。这些外壳电连接位点制备为与芯片上的电连接相连以向芯片提供电信号并接收来自芯片的电信号。存在与外壳可逆配合的芯片。该芯片是本发明所述的纳米FET芯片。该系统包括通过电连接与纳米FET装置电连接的电子控制系统，其向纳米级电极施加所需的电信号并接收来自纳米FET装置的电信号。该系统通常具有随时间在纳米级电极处接收电信号上信息并使用这类信息鉴定模板核酸序列的计算机。该计算机还可控制芯片的性能，例如通过向芯片上的纳米FET提供一系列电信号。
包含电导标记物的核苷酸类似物将通常较大，即分子量大于天然核苷酸。这些类似物可包括例如以下文献所述的核苷酸类似物：2013年2月14日提交的标题为PolymeraseEnzyme Substrates with Protein Shield(具有蛋白质护罩的聚合酶基材)的美国专利申请13/767,619和标题为Protected Fluorescent Reagent Compounds(受保护的荧光试剂化合物)的美国专利申请61/862,502，其通过引用纳入本文用于所有目的。
在一些情况中，这些电导标记物包含珠，例如包含通过其聚磷酸部分接合的多个核苷酸的珠。这类类似物描述于例如美国专利8,367,813，其通过引用全文纳入本文用于所有目的。这些珠可包被官能团、阴离子、阳离子，或阴离子和阳离子基团的组合。可控制珠上的电荷量以控制纳米FET的栅处的电信号。这些珠可具有任何可用的尺寸范围，例如尺寸为约2nm至约50nm。珠的形状可以是球形、长形或用于控制纳米FET的栅处电流的其他有效形状。
制造和解决包含纳米线的纳米FET的方法是本领域已知的。参见例如Choi等“Single-Molecule Lysozyme Dynamics Monitored by an Electronic Circuit(电子电路监测的单分子溶菌酶动力学)”Science 335,39(2012)，以及Patolsky等“ElectricalDetection of Viruses(病毒的电检测)”PNAS,101(39),14017,2004，其通过引用全文纳入本文用于所有目的。
测量的信号可来自纳米线的任何合适电性质的变化，例如电压、电流、电导、电阻、电感、阻抗、电变化、电磁变化等。
因此，该聚合酶复合物可相对于纳米级线定位以导致纳米级线的可检测的变化。在一些情况中，该聚合酶复合物可定位于纳米级线的约100nm内，纳米级线的约75nm内，纳米级线的约50nm内，纳米级线的约20nm内，纳米级线的约15nm内，或纳米级线的约10nm内。实际的接近程度可由本领域普通技术人员确定。在一些情况中，该聚合酶复合物定位为与纳米级线的距离小于约5nm。在其他情况中，该聚合酶复合物定位于纳米级线的约4nm内、约3nm内、约2nm内或约1nm内。
在一些实施方式中，该聚合酶复合物可固定至或直接结合(例如共价结合)纳米线(纳米级线)或栅，例如如本发明进一步描述的那样。然而，在其他实施方式中，该聚合酶复合物不直接结合纳米级线，而是相对于纳米线固定，例如聚合酶复合物相对于纳米线间接固定。例如，该聚合酶复合物可通过接头与纳米线接合，所述接头即将聚合酶复合物和纳米级线相对于彼此固定(例如共价或非共价结合)的物质(或多种物质)。作为示例，接头可直接结合纳米级线，且聚合酶复合物可直接结合接头，或聚合酶复合物可不直接结合接头，而是相对于接头固定，例如通过使用非共价键如氢键(例如在互补核酸-核酸相互作用中那样)、疏水相互作用(例如在烃链之间)、熵作用等。该接头可直接(如共价)或不直接结合纳米级线。
根据本发明使用的许多纳米线是单个纳米线。本文中，“单个纳米线”指不接触另一纳米线的纳米线(但不排除接触单个纳米线之间所需类型，例如在交叉阵列中)。例如，“单个”或“独立的”制品可在其寿命中的一些点处与另一制品接合，例如使用另一纳米线，或独立的制品可以在溶液中。“单个”或“独立的”制品指能够(但不需要)从其制备位置处以单个制品的形式移开，并转移至不同的位置并与其他组件合并生成功能性装置的制品，例如本发明所述的那些和本领域普通技术人员在阅读本发明后考虑的那些。
在另一组实施方式中，纳米线(或其他纳米结构的材料)可包括其他材料，例如半导体材料、掺杂剂、有机化合物、无机化合物等。以下是可用作纳米线内掺杂剂的材料的非限制性示例。该掺杂剂可以是元素半导体，例如硅、锗、锡、硒、碲、硼、金刚石或磷。该掺杂剂还可以是多种元素半导体的固溶体。示例包括硼和碳的混合物、硼和P(BP6)的混合物、硼和硅的混合物、硅和碳的混合物、硅和锗的混合物、硅和锡的混合物、锗和锡的混合物等。在一些实施方式中，该掺杂剂可包括IV族元素的混合物，例如硅和碳的混合物或硅和锗的混合物。在其他实施方式中，该掺杂剂可包括III族和V族元素的混合物，例如BN、BP、BAs、A1N、A1P、AlAs、AlSb、GaN、GaP、GaAs、GaSb、InN、InP、InAs或InSb。还可使用这些组合的混合物，例如BN/A1P或BN/BP/BAs的混合物。在其他实施方式中，这些掺杂剂可包括III族和V族元素的混合物。例如，这些混合物可包括AlGaN、GaPAs、InPAs、GalnN、AlGalnN、GalnAsP等。在其他实施方式中，这些掺杂剂还可包括II族和VI族元素的混合物。例如，该掺杂剂可包括ZnO、ZnS、ZnSe、ZnTe、CdS、CdSe、CdTe、HgS、HgSe、HgTe、BeS、BeSe、BeTe、MgS、MgSe等的混合物。这些掺杂剂的合金或混合物也是可行的，例如ZnCdSe或ZnSSe等。此外，不同族的半导体的混合物也是可行的，例如II族-VI族和III族-V族元素的组合，例如(GaAs)x(ZnS)1-x。掺杂剂的其他非限制性示例可包括IV族和VI族元素的混合物，例如GeS、GeSe、GeTe、SnS、SnSe、SnTe、PbO、PbS、PbSe、PbTe等。其他掺杂剂混合物可包括I族元素和VII族元素的混合物，例如CuF、CuCl、CuBr、Cul、AgF、AgCl、AgBr、Agl等。其他掺杂剂混合物可包括这些元素的不同混合物，例如BeSiN2、CaCN2、ZnGeP2、CdSnAs2、ZnSnSb2、CuGeP3、CuSi2P3、Si3N4、Ge3N4、Al2O3、(Al、Ga、In)2(S、Se、Te)3、Al2CO、(Cu、Ag)(Al、Ga、In、Tl、Fe)(S、Se、Te)2等。
作为非限制性示例，p型掺杂剂可选自III族且n型掺杂剂可选自V族。例如，p型掺杂剂可包括B、Al和In中至少一种，且n型掺杂剂可包括P、As和Sb中至少一种。对于III族-V族混合物，p型掺杂剂可选自II族，包括Mg、Zn、Cd和Hg中一种或多种，或IV族，包括C和Si中一种或多种。n型掺杂剂可选自Si、Ge、Sn、S、Se和Te中至少一种。应理解，本发明不限于这些掺杂剂，而是也可包括其他元素、合金或混合物。
本文中，术语“族”参考元素周期表，其含义为本领域普通技术人员所理解的通用定义。例如，II族元素包括Mg和Ca以及II族过渡元素，如Zn、Cd和Hg。类似地，III族元素包括B、Al、Ga、In和Tl；IV族元素包括C、Si、Ge、Sn和Pb；V族元素包括N、P、As、Sb和Bi；且VI族元素包括O、S、Se、Te和Po。涉及来自各族的超过一种元素的组合也使可行的。例如，II-VI族材料包含至少一种来自II族的元素和至少一种来自VI族的元素，例如ZnS、ZnSe、ZnSSe、ZnCdS、CdS或CdSe。类似地，III-V族材料包含至少一种来自III族的元素和至少一种来自V族的元素，例如GaAs、GaP、GaAsP、InAs、InP、AlGaAs或InAsP。其他掺杂剂也可包含这些材料及其组合，例如过渡金属(如Fe、Co、Te、Au等)。在一些情况中，本发明的纳米级线还可包含任何有机或无机分子。在一些情况中，这些有机或无机分子是可极化的和/或具有多种带电状态。
在一些实施方式中，至少一部分纳米线可以是加厚掺杂的半导体。本文中，“加厚掺杂”的制品(例如制品或制品的部分或区域)是其中掺杂剂基本在整个制品晶体晶格中掺入的制品。例如，一些制品(如碳纳米管)通常在基底材料生长后进行掺杂，且因此掺杂剂仅从表面向晶体晶格内部延伸有限距离。在一些实施方式中，加厚掺杂的半导体可包含两个或多个加厚掺杂的区域。因此，用于描述纳米线时，“掺杂的”指加厚掺杂的纳米线，且因此“掺杂的纳米观(或纳米级)线”是加厚掺杂的纳米线。“重度掺杂”和“轻度掺杂”是本领域普通技术人员能够理解的术语。
在一组实施方式中，本发明提供了单晶形式的纳米级线(或其他纳米结构的材料)。本文中，“单晶”物品(如半导体)是在整个物品中具有共价结合、离子结合或其组合的物品。这类单晶物品可包括晶体中的缺陷。
在另一组实施方式中，纳米级线(或其他纳米结构的材料)可包含两个或多个具有不同组成的区域。纳米级线的各区域可具有任何形状或尺寸，且这些可以在各区域之间相同或不同。例如，区域的最小尺寸可以是小于1微米、小于100nm、小于10nm，或小于1nm。在一些情况中，一个或多个区域可以是单个原子单层(即“△掺杂”)。在一些情况中，该区域可以小于单个单层厚度(例如如果单层内的一些原子不存在)。
在另一组实施方式中，纳米级线可靠近基材的表面，即纳米级线可位于基材的约50nm、约25nm、约10nm或约5nm内。在一些情况中，附近的纳米级线可接触至少一部分基材。在一个实施方式中，该基材包含半导体和/或金属。非限制性示例包括Si、Ge、GaAs等。其他合适的半导体和/或金属描述于上文中纳米级线部分。在某些实施方式中，该基材可包含非金属/非半导体材料，例如玻璃、塑料或聚合物、凝胶、薄膜等。可形成或包含在基材内的合适聚合物的非限制性示例包括聚乙烯、聚丙烯、聚对苯二甲酸乙二脂、聚二甲基硅氧烷等。
纳米线、纳米观线或纳米级线通常是线，其在沿其长度的任意点处具有至少一个截面尺寸且在一些实施方式中具有两个正交截面尺寸，所述截面尺寸小于约200nm、小于约150nm、小于约100nm、小于约70nm、小于约50nm、小于约20nm、小于约10nm，或小于约5nm。在其他实施方式中，该截面尺寸可以是小于2nm或1nm。在一组实施方式中，该纳米级线具有至少一个截面尺寸，其范围是0.5nm至100nm或200nm。在一些情况中，该纳米级线是导电的。当纳米级线描述为具有例如核心和外部区域时，上述尺寸通常涉及核心的那些尺寸。纳米观线的截面可以是任何形状，包括但不限于圆形、方形、矩形、环形、多边形或椭圆形，且可以是规则或不规则形状。该纳米级线可以是实心或中空的。可制备本发明的纳米级线的示例性材料的非限制性列表描述于下文。除非另有说明，任何纳米级线都可用于本发明所述实施方式的任一种，包括碳纳米管、分子线(即由单分子形成的线)、纳米棒、纳米线、纳米须、有机或无机导体或半导体聚合物等。在一些情况中也可使用可能不是分子线但具有多种小纳米观级尺寸的导体或半导体元素，例如无机结构如主族和基于金属原子的线样硅、含过渡金属的线、砷化镓、氮化镓、磷化铟、锗、硒化镉等。
多种这些和其他纳米级线可以对电子装置有用的图案生长于表面上和/或应用于表面，其方式类似于涉及用作示例的特定纳米级线的本发明所述技术，这无需过多的实验。在一些情况中，形成的纳米级线的尺寸为长度至少约1微米、至少约3微米、至少约5微米，至少约10微米或至少约20微米，且厚度可小于约100nm、小于约80nm、小于约60nm、小于约40nm、小于约20nm、小于约10nm，或小于约5nm(高度和宽度)。在一些情况中，这些纳米级线的纵横比(长度比厚度)为大于约2:1、大于约3:1、大于约4:1、大于约5:1、大于约10:1、大于约25:1、大于约50:1、大于约75:1、大于约100:1、大于约150:1、大于约250:1、大于约500:1、大于约750:1，或大于约1000:1或更高。本发明的纳米线包括固体且在一些情况中是延长的纳米线。在一些情况中，纳米线是延长的半导体，即纳米级半导体。
“纳米管”(如碳纳米管)通常是中空的纳米观线，或具有挖空的核心，包括本领域普通技术人员已知的那些纳米管。纳米管用作本发明所用小线的一个示例，且在某些实施方式中，本发明的装置包括级别与纳米管相当的线。可用于本发明的纳米管的示例包括但不限于单壁纳米管(SWNT)。结构上，SWNT由辊压成无缝管的单张石墨烯片材形成。取决于直径和螺旋性，SWNT可作为一维金属和/或半导体SWNT。制造纳米管(包括SWNT)和表征的方法是已知的。在纳米管的端部和/或侧面上选择性官能化的方法也是已知的，且本发明在某些实施方式中将这些能力用于分子电子学。多壁纳米管是熟知的，且也可使用。
区分标记物–读出碱基
在本发明的测序方法中，通常存在两种或更多种不同类型的标记的核苷酸类似物，且通常存在四种不同类型的核苷酸类似物。存在多种方法来区分多种类型的碱基。讨论将通常涉及区分四种碱基，但应理解相同的方法可用于区分两种、三种、五种或更多种类型的核苷酸类似物。
可使用例如阻抗幅度的特征、阻抗关联频率和阻抗电流关联时间特征(电路振荡颜色)来区分核苷酸类型。上述的组合也可以是有用的；例如通过使用两种标记物和两种振幅；两种类型的阻抗关联频率，和两种类型的电路振荡颜色等。虽然电容装置和纳米FET装置的工作原理不同，但可用于其中的标记物的类型是类似的。例如，通过控制电荷的数目、密度和类型，大分子带电标记物可用于任一类型的电检测。
可提供电容或电导中差异的标记物是本领域已知的。在一些情况中，可使用小分子。通常使用颗粒(如纳米颗粒)作为电容或电导标记物。因此，当描述标记物用于电容检测时，该标记物应也被考虑用于纳米FET装置的电导检测。纳米颗粒的特性可变化以生成不同的电容值。纳米颗粒的尺寸可影响颗粒的电容以及化学结构。金属、半导体、玻璃、氧化物、碳、硅、蛋白质、聚合物、离子材料的纳米颗粒可以使用且可生成以具有不同的阻抗幅度和阻抗关联频率特性。颗粒的尺寸可在大范围中变化，例如直径约2纳米至约50纳米。电极附近阻抗变化的一大原因是材料本身的电容特性。然而，应理解，所测量的阻抗是电极附近区域的阻抗，而非仅仅是标记物的阻抗。例如，纳米颗粒标记物将置换电极附近的溶液，使得测量的阻抗将包含该变化。因此，电极附近的电容标记物可导致阻抗与标记物不存在时的阻抗相比上升或下降。
可基于阻抗或电导变化幅度来区分核苷酸类似物，例如通过提供核苷酸类似物上具有多种电容或电导部分的电容或电导标记物。可如以下文献所述制备包含具有多个部分的核苷酸和具有多价支架的核苷酸类似物结构：例如美国专利申请20120058473MolecularAdaptors for Dye Conjugates(染料偶联物的分子适体)和美国专利申请20120077189Scaffold-Based Polymerase Enzyme Substrates(基于支架的聚合酶基材)，其通过引用纳入本文用于所有目的。虽然这些参考文献通常描述荧光标记物，但应理解，结合本申请的教导，本发明所述的由合适接头连接的合适的电容标记物或电导标记物可取代该荧光标记物。
术语阻抗、电导和电容均用于本发明。应理解阻抗是更一般的术语，且阻抗通常具有电容和电阻(电导)组分。例如，对于给定的系统，低频率的电流主要由电导或电阻水平决定，而高频率的电流主要由电容水平决定。对于本发明所述的电容装置，频率通常为数万赫兹或更高的级别。在这些频率下，对于所描述的几何形状和材料，阻抗主要由电容而非电阻组分决定。对于本发明的纳米FET装置，低频率(如DC)可用于电阻(电导)是主要组分的情况下。虽然在各情况中阻抗可主要由一种组分(电容或电阻)决定，但本领域技术人员应理解在一些情况中存在这些组分的组合且本领域技术人员应通过术语在本文中的上下文来理解术语的含义。
还可通过其阻抗关联频率特性来区分核苷酸类似物。所测量的标记物的阻抗还将高度依赖于频率。熟知的是给定系统中促成阻抗的组分可随频率显著变化，例如离子运动在一些频率下占主导而两极贡献可在其他频率下占主导。这一类型的测量有时称作阻抗光谱或介电光谱测量。参见例如Barsoukov等“Impedance Spectroscopy:Theory,Experiment,and Applications(《阻抗光谱：理论、实验和应用》)”，威利公司(Wiley)，2005，和Kremer等“Broadband dielectric spectroscopy(《宽带介电光谱》)”，斯普林格公司(Springer)，2003，其内容通过引用纳入本文用于所有目的。不同的标记物具有不同的阻抗关联频率特性，且这些特性可用于提供不同的标记物和提高碱基读出的置信度。
标记物的阻抗也可随给定频率下施加于纳米级电极的电压振幅变化。可调节施加的电压以获得多种标记物之间最佳的差异。在一些情况中，如上所述，可改变电压以代替或作为改变频率的补充，允许至少部分通过标记物的阻抗关联电极电压特性区分标记物。
电流关联时间特性可指电流振荡颜色。例如，两种核苷酸类似物(其各自具有相同的电容标记物或电导标记物但具有不同长度的接头)可显示不同的电容电流关联时间特性。电流振荡颜色可用于电容装置和纳米FET装置。具有较长接头的核苷酸可以例如差异扩散并因此随时间显示不同于具有较短接头的核苷酸类似物的阻抗特征。这一电流振荡频率的差异可用于确定哪种核苷酸类似物与酶相关。除接头长度以外，接头的其他特性(如其弹簧常数)也会影响电流振荡颜色。电流振荡颜色将取决于测量系统的特性，如电极几何形状和聚合酶复合物接合。这些因素可经选择以控制电流振荡颜色中的差异以增强对掺入了哪种核苷酸的确定。
因此可通过其生成的电振荡光谱来鉴定核苷酸或类似物。在一些情况中，振荡看似噪音，但具有可重复和可鉴定的特性，包括信号的频率和幅度。可使用这些不同类型的振荡，如同使用不同颜色的染料在光学系统中区分不同的核苷酸类似物，因此我们在本文中涉及电流振荡颜色形式的可区分电流振荡类型。
虽然将电容的测量描述为电流阻抗的测量，但本领域技术人员应理解在一些情况中可通过测量电压来测量电流。当我们指测量电流或电压时，应理解相对于测量阻抗或电容，其中之一可用于测量或代表另一种。除电流和电压以外，还可使用电阻或阻抗测量。
本发明的一个方面是使用仅标记物的阻抗变化和阻抗光谱以外的其他参数来分类酶相关的物质。这类参数在脉冲持续期间是可测量的。两种总体测量情况类别是：准平衡测量和非平衡测量。
在准平衡测量中，存在一些事件持续期间维持的静态限制，且这些限制的消失有效地确定了事件终点(终点处可忽略的短间隔除外，此时可检测物质清除电极)。虽然限制是固定的，但该系统的剩余组分可自由移动，且这导致信号波动。例如，扩散(或等效布朗运动)将导致标记物移动。在大多数情况下，该移动将与跨纳米孔的电流变化相关，且因此与可在系统中他处测量的电压相关。基于此，可检测部分的各方面(如亚摩尔扩散常数(确切的那部分分子的可扩散性，即使分子的另一部分被限制))将改变这些移动的速率，因此观察的电压或电流的特征性频率将变化。例如，较快的扩散物将通常具有较白的噪音光谱，而较慢的扩散物将倾向于生成较粉色的电流振荡光谱。
电流振荡颜色可用作鉴别物的基础，例如，通过1)提取感兴趣的区域上的电流振荡特征(例如事件的持续时间中)，2)进行傅立叶转换分析或自相关性分析，并检查可使用的频率范围上电流振荡的光谱(例如，从f＝1/T(其中T是脉冲的持续时间)最高至放大器系统的截止频率，或一定程度上超过该截止频率)。该过程将导致频率的函数形式的数字采样的电流振荡振幅。这可表示为少至两个样品(低频率区域和高频率区域)、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、16、32、64、128、256、512、1024或更多个箱(bin)。这些箱中的数值可以是函数的离散样品或其代表理想化连续函数的感兴趣的区域中的整数。该组离散值可表示为向量，其可由许多机器学习系统(如k均值聚类、SVM、CART或加强型CART、PCA等)之一进行分类。因此，如本发明所述，电流振荡颜色可用于鉴别可检测部分。
基于电流振荡颜色的检测系统可称作“电流振荡颜色鉴定系统”，且当使用经工程改造以生成不同电流振荡颜色的部分时，其称作“电流振荡颜色标签”。在测序系统中，当基于该基础鉴定核苷酸碱基序列时，其可称作电流振荡颜色测序系统(无论该电流振荡颜色对碱基而言是内在的还是电流振荡颜色标签的结果)。
除了扩散常数以外的其他方面可影响信号的电流振荡颜色。例如，在使用具有不同弹性常数的接头的实施方式中，这将影响这些扩散性波动的幅度，其随后将影响电流振荡信号(而不是与事件期间DC电流的振幅混淆——这称作事件持续期间信号的RMS噪音)。类似于具有RGB的颜色系统或HSV，可生成颜色以包括该颜色的“亮度”。在上述光谱分析模型中，这将导致对于能够较大偏移的部分而言向量中的值较大，而对于更局限于原位的部分而言向量中的值较小。所有或一些这类信号可用于上文所述机器学习范例。存在许多可影响偏移大小的方面。
本发明的纳米级电极通常制备为使得这些电极具有低电容以允许快速改变电极上的电压以进行本发明所述的测序方法。通过选择材料并通过电极的几何形状和电极的间距将电阻和电容保持在低位。一个考虑是将各电容装置的RC时间常数保持在足够低的水平以允许改变电极上的电压以进行本发明所述方法。在一些情况中，电极的RC时间常数是小于100毫秒、小于10毫秒、小于1毫秒、小于0.1毫秒，或小于0.01毫秒。在一些情况中，该RC时间常数是0.01毫秒至100毫秒。为将RC时间常数保持得较低，使用导电性大于106S/m的材料制备电极或携带电流进出电极的互连。合适的材料包括铜、银、金、铂和铝。为将电容保持得较低，电极的尺寸也通常较小——纳米级。此外，当两种电极彼此靠近时(如同在双电极构造中那样)，在暴露于表面的电极部分贴近的同时，这些电极设置成不具有大的部分，其中两个电极都是数纳米内。例如，对于图7(F)所示的双电极构造，电极结构在其暴露和测量电容的区域附近贴近，从而使电容对小体积变化敏感，但电极在该结构内逐渐远离彼此以最小化厚结构中的电容。本发明的一个方面还最小化与导电液体接触的电极面积，从而控制系统的电容。类似的，本发明的一个方面使用绝缘层增加至接地层、其他电极或可生成杂散电容的任何其他导体的距离。
基于结构的低RC时间常数快速电访问本发明的小电容装置的能力可用于实现本发明，因为其允许尝试多个频率方案以鉴定存在的不同电容组件的性质。
本发明所述方法提供鉴定掺入生长的核酸链的核苷酸类似物，这些核苷酸类似物同时掺入结合的聚合酶-模板复合物。通过测量与结合的聚合酶-模板复合物靠近的电极中的阻抗或电容来测量碱基是否存在及其性质。如上文所述，在靠近电容电极处存在对应于特定碱基的电容标记物并持续对应于碱基掺入的一段时间表明该碱基已被掺入。该碱基掺入生长链表明模板链中存在互补碱基，提供了关于模板的序列信息。碱基的读出使用软件进行，所述软件提取电流关联时间信息，且在一些情况中提取其他信息以读出已掺入的碱基。
下文是脉冲识别的示例性过程。一旦针对给定电容装置生成一段特定时间的电流脉迹(current trace)，将对这些电流脉迹进行脉冲识别过程。在初始步骤中，针对该脉迹建立基线。通常，该基线可包含来自多个背景源的信号贡献(取决于光谱和脉迹提取步骤的细节)。例如，这类噪音可包括(例如)总体背景(如大规模空间串道(cross-talk))和扩散背景。这些背景通常在脉冲的时间尺度上稳定，但仍在更长的时间尺度上缓慢变化。基线移除包括任何数目的技术，范围是，例如，脉迹的中值、用偏移修正运行最低百分比、多项式和/或指数拟合，或使用FTT进行低通滤波。通常，这些方法将尝试对脉迹中脉冲的存在变得稳健且可实际通过迭代方法衍生，所述迭代方法在鉴定脉冲并将其移除出基线预测的考虑处进行多次操作。在某些优选实施方式中，对各脉迹通道计算基线或背景模型，例如，用于设置基于阈值的事件检测的量度。
其他基线化功能包括校正总体信号水平的偏移或衰减。例如，有时观察到全局性背景衰减。该全局性背景衰减存在于基材的一部分上，其中没有酶结合在纳米级电极(对照电极)附近，因此允许来源于这些位置的脉迹与二维全局性背景图像联用以估计该信号对整个芯片上各脉迹/通道的贡献。随后可从各脉迹中扣除这一可变性组分且其通常能够非常有效地除去该衰减。通常，这在基线化过程之前进行。
建立基线后，可对脉迹进行噪音抑制滤波以最大化脉冲检测。在特别优选的方面中，噪音滤波器是具有感兴趣的脉冲的宽度和形状的‘匹配滤波器’。虽然电流脉冲时间尺度(且因此脉冲宽度)预期在不同的电容标记的核苷酸之间变化，但优选的滤波器将通常寻找具有特征性形状以及变化的总体持续时间的脉冲。例如，寻找延长的持续时间(例如约10ms至100或更多ms)的电流脉冲的矩形滤波器(boxcar filter)提供合适的滤波器。该滤波通常通过卷积或低通频率域滤波在时域中进行。其他滤波技术包括：中值滤波(取决于所用的时间尺度，其具有从脉迹中完全除去短时间尺度脉冲的额外作用)和SG滤波(Savitsky-Golay filtering)(其倾向于保留脉冲的形状——同样取决于滤波器中使用的参数)。
虽然以跨多种脉迹的一般滤波过程的方式进行描述，但应理解不同的脉冲可具有不同的特性，且因此可进行脉迹特异性滤波方案。例如，在一些情况中，给定的电容标记的类似物(如A)对于某一掺入事件可具有不同于另一不同的电容标记的类似物(如T)的脉冲持续时间。同样，对应于A类似物的光谱脉迹滤波过程将在较长持续时间脉冲上具有不同于T类似物掺入的脉迹的滤波指标。通常，这类滤波器(如多尺度滤波器)增强信噪比以增强检测灵敏度。即使在同一通道内也会具有一定范围的脉冲宽度。因此通常使用一堆这类滤波器以最大化同一通道内一定范围时间尺度上的脉冲灵敏度。
在经滤波的脉迹上鉴定脉冲的过程中，可使用多种不同的标准。例如，可使用绝对电流振幅，其经标准化或未经标准化。或者，可以脉冲与扩散背景比作为鉴定脉冲的度量来鉴定脉冲。在其他方法中，可使用统计学显著性测试来鉴定给定分析中存在的背景噪音水平上可能的脉冲。后一种方法是特别优选的，因为其允许潜在脉冲强度的变化，且降低读取自基线中噪音的假阳性水平。
如前文所述，在脉冲鉴定(以及脉冲分类)过程中可使用且通常使用多种信号参数，包括电容变化振幅、阻抗关联频率、停留时间和电流振荡颜色。出于说明的目的，下文的讨论主要针对使用两种脉冲指标，即脉冲强度和脉冲宽度。应理解，该过程可通常包括本文他处列举的多种脉冲度量比较中的任意一种或多种。
同样，滤波后，确定脉冲检测阈值和基线的标准偏差(噪音和电流脉冲)。优选的确定脉迹的标准偏差的方法包括稳健的标准偏差确定，包括例如基于基线的绝对差异中值、对基线化强度直方图的高斯或泊松拟合，或排除极端离群值的迭代西格玛修剪预测(iterative sigma-clip estimate)。一旦对各脉迹进行测定，如果其超过基线预定数目的标准偏差，则鉴定到脉冲。构成显著脉冲的标准偏差数目可根据多种因素变化，包括例如显著脉冲的鉴定或分类过程中所需的置信度、系统的信噪比、其他噪音对系统的贡献量等。在优选的方面中，掺入事件的上阈值(例如在脉迹中脉冲的起始处)设为约5个标准偏差或更大，而下阈值(脉冲测定为终止的点)设为1.25个标准偏差。上阈值可使用低至3.75个标准偏差和高至信噪比所允许的值——最多7、10、20或50个标准偏差。下阈值可设为从负1个标准偏差至最高为上阈值的任何值。或者，可由上信号的平均值和标准偏差计算下阈值，其中其可设为负3个标准偏差至负6个标准偏差。如果信噪比足够高，其可设为负7、10、20或50个标准偏差。随后可从上阈值与下阈值的触发之间的时间确定脉冲宽度。一旦最初鉴定到显著的脉冲，可对其进行进一步处理以确定是否可将该脉冲读出为特定碱基掺入。或者，可提前对信号进行滤波以排除对应于时间尺度而不太可能对应于真掺入事件的频率组分，其中进一步处理步骤是任选的。
在一些情况中，通过脉迹进行多次操作，检查不同时间尺度处的脉冲，从中可建立这类不同时间阈值处检测的非冗余脉冲的列表。这通常包括分析未经滤波的脉迹以最小化时间方面潜在的脉冲重叠，从而最大化对宽度等于或接近相机最高帧频的脉冲的灵敏度。这允许将电流振荡颜色或其他度量应用于固有地在不同时间尺度上运行的电流脉冲。具体而言，较长时间尺度上的分析可建立较短时间尺度处无法鉴定到的趋势，例如，鉴定多个短时间尺度脉冲实际对应于单个较长、离散的脉冲。
此外，一些脉冲可从考虑/评价中去除，其中其已被鉴定为系统性错误的结果，如通过相邻电容装置的空间串道，或检测通道之间的串道(其程度为这类事件未在校准过程中被解析)。通常，校准过程将鉴定各电容装置的串道系数，并因此使这类组分被校正。
在某些实施方式中，脉迹文件包含L-加权和(LWS)脉迹，其中脉迹经优化以具有对反应混合物中单个电容标记物的最大脉冲检测灵敏度。这不是去卷积或多组分脉迹表现，且具有光谱串道的缺点。
随后将提取的脉冲分离为4个(或N个)电容标记物之一，具体方法为比较提取的光谱与校准过程中建立的电容标记物组的光谱。可使用多种比较方法来生成该过程的比较度量。例如，在一些方面中，使用χ2测试来建立比较拟合的良好性。合适的χ2测试描述于例如美国专利申请20120015825，其通过引用纳入本文用于所有目的。
一旦根据特定标记物光谱对脉冲光谱进行分类，则该相关性可随后用于对脉冲进行碱基分类。如上文所述，碱基分类或“读出”可设置成直接鉴定添加至反应中延伸的引物序列的电容标签标记的碱基，或其可设置为读出与添加的碱基互补的碱基(且此时脉冲光谱与标记物光谱的匹配程度最佳)。在任意情况中，输出物都将是将碱基分类分配为各识别和分类的脉冲。例如，碱基分类可以是将特定碱基分配给脉冲，或将脉冲鉴定为插入或缺失事件。
在理想的情况中，一旦将脉冲鉴定为显著并确切鉴定其光谱，则可基于该信息简单地读出碱基。然而，如上文所述，在典型的测序轮次中，信号脉迹可包含信号噪音，例如缺失脉冲(例如没有发现显著脉冲但对应于掺入事件的点)、假阳性脉冲(例如由非特异性吸收的类似物或标记物导致)等。因此，脉冲分类(也称为碱基分类)可在许多情况中涉及更复杂的分析。如同上文所述脉冲鉴定那样，碱基分类通常依赖于多个不同的信号特性，其将碱基分配至具体的经鉴定的显著脉冲。在许多情况中，可比较两种、三种、五种、十种或更多种不同的信号特性以从给定的显著脉冲中读出碱基。这类特性包括上文所述鉴定显著脉冲中使用的那些，例如脉冲宽度及其衍生物(例如平滑脉冲宽度预测值、关联停留时间或非关联停留时间)、脉冲强度、脉冲通道、预测的脉冲平均电流振幅、对应于同一通道的脉迹中所有脉冲的电流振幅中值、与脉冲性质匹配的通道的背景和/或基线水平、信噪比(例如匹配的通道中脉冲的信噪比，和/或各不同的通道中的信噪比)、功率噪音比、脉冲峰的积分计数、跨脉冲的最大信号值、随时间变化的脉冲密度(例如在至少约1、2、5、10、15、20或30秒窗口上)、相邻脉冲的距离/时间和形状(例如脉冲间距离)、相邻脉冲的通道(例如之前1、2、3或4个脉冲的通道和/或之后1、2、3、4个脉冲的通道)、脉冲通道与一个或多个相邻脉冲的通道的相似性、相邻脉冲的信噪比、脉冲的光谱特征、脉冲心迹线(centroid)位置等，及其组合。通常，这类比较将基于与已知碱基分类的模式相比所用度量的标准模式识别，生成显著脉冲和标准碱基概况的模式之间最接近的模式拟合的碱基读出。
脉冲度量与来自与已知碱基性质相关的代表性度量的比较将通常使用预测性或机器学习过程。具体而言，建立包含上文所述多种度量的“N种先前解决的情况”的“培训”数据库。例如，分析各脉冲的特征向量，且测量这些特征的值并用于确定脉冲的分类，例如对应于脉冲的事件，例如掺入、缺失或插入事件。本文中，掺入事件指掺入与模板链互补的核苷酸，缺失事件对应于导致观察的序列读数中的一个位置缺口的缺失的脉冲，且插入事件对应于导致不存在掺入时检测到碱基的额外脉冲。例如，当聚合酶结合关联或非关联核苷酸但该核苷酸被释放而不掺入生长的多核苷酸链时，可检测到额外脉冲。从该数据库中，将学习方法应用于数据以从数据中提取预测功能。多种学习方法是本领域已知的且可容易地应用于脉冲度量的数据库。这些包括，例如，线性/逻辑回归算法、神经网络、核方法、决策树、多元样条(MARS)、多重累计回归树(MARTTM)、支持向量机。
除在鉴定为显著的脉冲处读出碱基外，本发明的方法还允许对缺失的脉冲进行建模。例如，条件随机场(CRF)是可用于脉冲分类的概率模型(参见例如Lafferty等(2001)Proc.Intl.Conf.on Machine Learning 01,第282-289页，其通过引用全文纳入本文用于所有目的)。CRF还可概念化为广义的隐马尔可夫模型(HMM)，其一些示例描述于本文他处且是本领域熟知的。本发明包括将CRF用于对观察的脉冲脉迹中缺失的碱基进行建模。除碱基读出外，一致性序列生成和序列比对的算法也可用于获得来自本发明所述测序方法的其他信息。
读出碱基、一致性生成和序列比对的方法描述于例如以下专利和申请，其纳入本文用于所有目的：US 7995202 Methods and Systems for Simultaneous real-timemonitoring of optical signals from multiple sources(同时实时监测来自多个源的光学信号的方法和系统)；US 7626704 Methods and systems for simultaneous real-time monitoring of optical signals from multiple sources(用于同时实时监测来自多个源的光学信号的方法和系统)；US 8182993 Methods and Processes for CallingBases in Sequence by incorporation Methods(用于通过掺入方法读出序列中碱基的方法和过程)；2012年5月10日提交的US 13/468347 Algorithms for SequenceDetermination(序列测定的算法)；US 20120015825 Analytical Systems and Methodswith Software Mask(使用软件滤镜的分析系统和方法)；US 20110257889 SequenceAssembly and Consensus Sequence Determination(序列组装和一致性序列测定)；US20120052490 Methods and Systems for Monitoring Reactions(监测反应的方法和系统)；US 20100169026 Algorithms for Sequence Determination Processing the data(序列测定加工数据的算法)。虽然上述文献中碱基鉴定和碱基读出算法通常根据光学系统描述，但在本说明书的教导下，本领域普通技术人员应理解如何将这些方法适用于本发明的电容测序系统和方法。
聚合酶-核酸复合物
本发明的聚合酶复合物包含与模板分子相联系的核酸聚合酶。该模板还通常具有与其杂交的引物，而一些聚合酶可在不添加外部引物的条件下起始核酸合成。虽然许多酶-底物相互作用是瞬时性的，但一些聚合酶可与核酸形成较稳定的复合物，其可被操纵、纯化并随后用于进行核酸合成。例如，具有较高的处理能力(processivity)的DNA聚合酶可与模板核酸分子具有强关联。示例性DNA聚合酶是phi-29DNA聚合酶。形成和操纵聚合酶-核酸复合物的方法描述于例如共同在审的2010年9月22日提交的标题为“Purified ExtendedPolymerase/Template Complex for Sequencing(用于测序的纯化的延长的聚合酶/模板复合物)”的美国专利申请61/385376和2012年3月22日提交的标题为“Isolation ofPolymerase-Nucleic Acid Complexes(聚合酶-核酸复合物的分离)”的美国专利申请号13/427,725，其通过引用全文纳入本文用于所有目的。
该聚合酶-核酸复合物将通常包含聚合酶和具有双链区域的核酸。该聚合酶-核酸复合物将通常具有引物，可从所述引物中生成与核酸的模板链互补的新生核酸链。该引物通常是短寡核苷酸，其与模板核酸的一部分互补。本发明的引物可包含天然产生的RNA或DNA寡核苷酸。本发明的引物还可以是合成的类似物。这些引物可具有替代性主链，如同上文关于本发明的核酸所描述的那样。该引物还可具有其他修饰，如纳入杂原子、接合电容标记物或使用官能团取代(所述官能团将仍允许碱基配对并通过酶识别)。引物可选择更紧密结合的引物序列，例如富GC序列，以及使用在其结构中包含非天然核苷酸或核苷酸类似物的引物，例如肽核酸(PNA)或锁核酸(LNA)，其可显示较高的与模板的亲和性配对。在一些情况中，该引物以单独组分形式添加以形成复合物；在其他情况中，该引物可以是所使用的核酸的一部分。例如，在一些情况中，引物启动(priming)可在双链核酸的一条链中的缺刻或缺口处开始。
模板核酸可来源于任何合适的天然或合成的来源。在优选的实施方式中，该模板包含双链DNA，但在一些情况中可使用双链RNA或RNA-DNA异源双链体。该模板核酸可以是来自真核细胞、细菌或古细菌的基因组DNA。该模板核酸可以是来源于任何合适来源(包括信使RNA)的cDNA。该模板核酸可包含DNA的双链区段的文库。该核酸模板可以是线性或环形的。例如，该核酸可以是拓扑学环形的并具有线性双链区域。环形核酸可以是，例如，具有缺刻的质粒。在一些实施方式中，该核酸是在一条链中具有缺口的双链线性DNA。该缺口提供了用于核酸合成的聚合酶的接合位点。可通过钝末端连接或粘性末端连接来连接DNA片段与适体以制备具有双链DNA适体的线性双链DNA。该连接产生一条链或全部两条链的5’端附近具有缺口的线性DNA。该缺口可以是任何合适的宽度。例如，该缺口可以是1-50个碱基、2-30个碱基或3-12个碱基。
术语“核酸”或“寡核苷酸”或本文语法等同形式指至少两个共价连接在一起的核苷酸。本发明的核酸将通常含有磷酸二酯键，但在一些情况中，包含的核苷酸类似物可具有替代性主链，包含例如磷酰胺、硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯和肽核酸主链和连接。其他类似物核酸包括具有正电主链、非离子主链和非核糖主链的那些，包括描述于美国专利号5,235,033和5,034,506中的那些。该模板核酸还可具有其他修饰，如纳入杂原子、接合电容标记物或使用官能团取代(所述官能团将仍允许碱基配对并通过酶识别)。
取决于所需应用，可以多种不同形式中任一种提供模板序列。该模板可以环形或功能性环形构建体的形式提供，其允许通过合成复合物对同一核酸序列进行冗余处理。这类环形构建体的应用已描述于例如美国专利号7,315,019和2008年7月25日提交的美国专利申请号12/220674。替代性功能性环状构建体还描述于2009年3月27日提交的美国专利申请12/383855和美国专利US 8,153,375 Compositions and Methods for Nucleic AcidSequencing(用于核酸测序的组合物和方法)；美国专利8,003,330 Error-FreeAmplification of DNA for Clonal Sequencing(用于克隆测序的DNA的无错误扩增)；以及2012年1月31提交的13/363,066 Methods and Compositions for Nucleic AcidSample Preparation(用于核酸样品制备的方法和组合物)，其全部内容各自通过引用全文纳入本文用于所有目的。
简言之，这类替代性构建体包括具有通过适当连接寡核苷酸连接于各末端处的中心双链部分的模板序列，例如发夹环区段。这类结构不仅提供重复复制单个分子(并因此测序该分子)的能力，还通过复制双链部分的正义和反义部分来提供额外的冗余性。在测序应用中，这类冗余测序在测序精确性方面提供了巨大优势。
这些核酸可包含具有通用序列区的核酸群体，所述通用序列区是该群体的所有核酸共有的，且这些核酸还具有在该群体的不同成员中不同的特异性区域。本发明允许使用这些通用或特异性区域来捕获和分离聚合酶-核酸复合物。
虽然在许多情况中核酸合成在本文中被描述为从引物延伸，但应理解一些聚合酶无需要添加的外部引物并可使用末端蛋白起始。可使用末端蛋白起始的聚合酶包括phi-29聚合酶。
聚合酶
可用于本发明的聚合酶包括经突变以具有所需测序性质的聚合酶。例如，合适的聚合酶包括以下文献中教导的那些：例如，2012年2月1日提交的61/593569 RecombinantPolymerases with Increased Phototolerance(具有增强的光耐受性的重组聚合酶)；US20120034602 Recombinant Polymerases for Improved Single Molecule Sequencing(用于改进的单分子测序的重组聚合酶)；US 20100093555 Enzymes Resistant toPhotodamage(耐受光损伤的酶)；US 20110189659 Generation of Modified Polymerasesfor Improved Accuracy in Single Molecule Sequencing(用于单分子测序中改进的精确性的经修饰聚合酶的生成)；US 20100112645 Generation of Modified Polymerasesfor Improved Accuracy in Single Molecule Sequencing(用于单分子测序中改进的精确性的经修饰聚合酶的生成)；US 2008/0108082 Polymerase enzymes and reagents forenhanced nucleic acid sequencing(用于增强的核酸测序的聚合酶和试剂)；US20110059505 Polymerases for Nucleotide Analogue Incorporation(用于核苷酸类似物掺入的聚合酶)；以及2012年10月1日提交的美国临时专利号61/708469，其全部通过引用纳入本文用于所有目的。修饰的聚合酶可具有修饰的性质，例如降低的分支部分形成、改进的特异性、改进的处理能力、改变的速率、改进的保留时间、改进的闭合复合物稳定性等。
此外，还可出于应用特异性原因修饰聚合酶，例如，提高光稳定性，例如如同2009年3月30日提交的美国专利申请12/384,110(Keith Bjornson等，标题为“EnzymesResistant to Photodamage(耐受光损伤的酶)”)中教导的那样，提高结合于表面时酶的活性，如同例如Hanzel等的WO 2007/075987 ACTIVE SURFACE COUPLED POLYMERASES(活性表面偶联的聚合酶)和Hanzel等的WO 2007/076057PROTEIN ENGINEERING STRATEGIES TOOPTIMIZE ACTIVITY OF SURFACE ATTACHED PROTEINS(优化表面接合的蛋白质的活性的蛋白质工程改造策略)中教导的那样，或包括纯化或处理标签，如同所引用的参考文献和本领域公知常识所教导的那样。类似地，本发明所述修饰的聚合酶可与其他策略联用以改进聚合酶性能，例如，控制聚合酶速率常数的反应条件，例如2009年3月30日提交且标题为“Twoslow-step polymerase enzyme systems and methods(两种慢步骤聚合酶系统和方法)”的美国专利申请12/414,191中教导的那样，其通过引用全文纳入本文用于所有目的。
用于本发明的聚合酶将通常具有链置换活性。许多聚合酶具有这一能力，且其可用于本发明的内容中以打开和暴露核酸样品的区域以通过钩分子进行捕获。在一些情况中，链置换是聚合酶本身的一部分。在其他情况中，可添加其他辅助因子或辅酶以提供链置换能力。
DNA聚合酶
DNA聚合酶有时基于多种进化关系被分类为6个主要类别，例如大肠杆菌Pol I(A类)、大肠杆菌Pol II(B类)、大肠杆菌Pol III(C类)、古菌类Pol II(D类)、人Polβ(X类)以及大肠杆菌UmuC/DinB和真核细胞RAD30/着色性干皮病变体(Y类)，其通过引用纳入本文用于所有目的。对于最新命名方式的综述，参见例如Burgers等(2001)“Eukaryotic DNApolymerases:proposal for a revised nomenclature(真核细胞DNA聚合酶：提出一种改进的命名方式)”J Biol Chem.276(47):43487-90。对于聚合酶的综述，参见例如Hubscher等(2002)“Eukaryotic DNA Polymerases(真核细胞DNA聚合酶)”Annual Review ofBiochemistry卷71:133-163；Alba(2001)“Protein Family Review:Replicative DNAPolymerases(蛋白质家族综述：复制型DNA聚合酶)”Genome Biology 2(l):reviews3002.1-3002.4；以及Steitz(1999)“DNA polymerases:structural diversity andcommon mechanisms(DNA聚合酶：结构多样性和常见机制)”J Biol Chem 274:17395-17398，其通过引用纳入本文用于所有目的。已确定许多聚合酶的基本作用机制。文献中数百种聚合酶的序列是公众可得的，且已确定许多这类聚合酶的晶体结构，或可基于与解析的同源聚合酶的晶体结构的相似性推断得出。例如，可获得Φ29(一种本发明优选的待修饰亲本酶的类型)的晶体结构。
除野生型聚合酶以外，还可使用从各种不同来源的镶嵌制备的嵌合聚合酶。例如，通过使用来自超过一种亲本聚合酶的序列制备的Φ29聚合酶可用作突变以生成本发明的聚合酶的起点。可例如考虑聚合酶之间类似区域来定义用于嵌合体的一致性序列，或使用基因改组技术(其中多个Φ29相关聚合酶经由可用的基因改组技术随机或半随机改组，例如通过“家族基因改组”；参见Crameri等(1998)“DNA shuffling of a family of genesfrom diverse species accelerates directed evolution(来自多种物种的基因家族的DNA改组加速定向进化)”Nature 391:288-291；Clackson等(1991)“Making antibodyfragments using phage display libraries(使用噬菌体展示文库制备抗体片段)”Nature 352:624-628；Gibbs等(2001)“Degenerate oligonucleotide gene shuffling(DOGS):a method for enhancing the frequency of recombination with familyshuffling(简并寡核苷酸基因改组(DOGS)：一种用家族改组增强重组频率的方法)”Gene271:13-20；以及Hiraga和Arnold(2003)“General method for sequence-independentsite-directed chimeragenesis(序列独立的定点突变嵌合体生成的通用方法)”J.Mol.Biol.330:287-296)来生成嵌合体，上述文献通过引用纳入本文用于所有目的。在这些方法中，可预先确定重组点，使得基因片段以正确的顺序组装。然而，可随机形成组合(如嵌合体)。例如，使用Clarkson等所述方法，可生成五基因嵌合体，例如包含Phi29聚合酶、PZA聚合酶、M2聚合酶、B 103聚合酶和GA-1聚合酶的区段。可向嵌合体中导入适当的突变，其改进分支部分，提高闭合复合物稳定性，或改变反应速率常数。
可用的DNA聚合酶还以多种方法中任一种进行修饰以例如降低或消除外切核酸酶活性(许多天然DNA聚合酶具有校正的外切核酸酶功能，其干扰例如测序应用)，通过制备蛋白酶消化的酶片段(如Klenow片段重组)来简化生产等。应注意，聚合酶还经修饰以赋予聚合酶-DNA-核苷酸复合物中标记的核苷酸的特异性、处理能力的改进和改善的停留时间(例如，Hanzel等的WO 2007/076057 POLYMERASES FOR NUCLEOTIDE ANALOGUE INCORPORATION(用于核苷酸类似物掺入的聚合酶)和Rank等的WO 2008/051530 POLYMERASE ENZYMES ANDREAGENTS FOR ENHANCED NUCLEIC ACID SEQUENCING(用于增强的核酸测序的聚合酶和试剂))，以改变分支部分和易位(例如，Pranav Patel等于2009年9月4日提交的美国专利申请号12/584,481，题为“ENGINEERING POLYMERASE AND REACTION CONDITIONS FOR MODIFIEDINCORPORATION PROPERTIES(用于修饰的掺入性质的工程改造的聚合酶和反应条件)”)，以提高光稳定性(例如Keith Bjornson等于2009年3月30日提交的美国专利号12/384,110，标题为“Enzymes Resistant to Photodamage(耐受光损伤的酶)”)，以及改进表面固定的酶活性(例如Hanzel等的WO 2007/075987 ACTIVE SURFACE COUPLED POLYMERASES(活性表面偶联的聚合酶)和Hanzel等的WO 2007/076057PROTEIN ENGINEERING STRATEGIES TOOPTIMIZE ACTIVITY OF SURFACE ATTACHED PROTEINS(优化表面接合的蛋白质活性的蛋白质工程改造策略))，其通过引用纳入本文用于所有目的。这些聚合酶中任一种都可根据本发明进行修饰以减少分支部分形成，改进闭合的聚合酶-DNA复合物的稳定性，和/或改变反应速率常数。
许多这类适用于修饰的聚合酶是可用的，例如用于测序、标记和扩增技术。例如，人DNA聚合酶β可购自RD系统公司(R&D systems)。DNA聚合酶I可购自爱彼森特公司(Epicenter)、GE医疗公司(GE Healthcare)、英杰公司(Invitrogen)、NEB公司(NewEngland Biolabs)、普洛麦格公司(Promega)、罗氏应用科学公司(Roche AppliedScience)、西格玛-奥德里奇公司(Sigma-Aldrich)等。DNA聚合酶I的Klenow片段可以重组和蛋白酶消化形式购自安碧公司(Ambion)、池默科斯公司(Chimerx)、电子酶公司(eEnzymeLLC)、GE医疗公司、英杰公司、NEB公司、普洛麦格公司、罗氏应用科学公司、西格玛-奥德里奇公司等。Φ29DNA聚合酶可购自例如爱彼森特公司。聚A聚合酶、逆转录酶、测序酶(Sequenase)、SP6 DNA聚合酶、T4 DNA聚合酶、T7 DNA聚合酶和多种热稳定DNA聚合酶(Taq、热启动、钛Taq等)可购自多种这些和其他来源。目前市售可得的DNA聚合酶包括PhusionTM高保真DBA聚合酶(可购自NEB公司)；
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Flexi DNA聚合酶(可购自普洛麦格公司)；RepliPHITMΦ29DNA聚合酶(可购自爱彼森特生物科技公司(EpicenterBiotechnologies))；PfuUltraTM热启动DNA聚合酶(可购自司查塔基公司(Stratagene))；KOD HiFi DNA聚合酶(可购自诺瓦基公司(Novagen))；等。Biocompare.com提供了许多不同的市售可得的聚合酶的比较。
作为降低分支分数、提高闭合复合物稳定性或改变反应速率常数的突变的优选底物的DNA聚合酶包括Taq聚合酶、外切核酸酶缺陷型Taq聚合酶、大肠杆菌DNA聚合酶1、Klenow片段、逆转录酶、Φ29相关聚合酶包括野生型Φ29聚合酶和这类聚合酶的衍生物如外切核酸酶缺陷形式、T7 DNA聚合酶、T5 DNA聚合酶、RB69聚合酶等。
在一个方面中，该修饰的聚合酶是Φ29型DNA聚合酶。例如，该修饰的重组DNA聚合酶可与野生型或外切核酸酶缺陷型Φ29型DNA聚合酶同源，例如参见美国专利号5,001,050、5,198,543或5,576,204，其通过引用纳入本文用于所有目的。或者，该修饰的重组DNA聚合酶可与其他Φ29型DNA聚合酶同源，例如B103、GA-1、PZA、Φ15、BS32、M2Y、Nf、Gl、Cp-1、PRD1、PZE、SF5、Cp-5、Cp-7、PR4、PR5、PR722、LI 7、Φ21等。对于命名方式，参见Meijer等(2001)"Φ29Family of Phages(Φ29噬菌体家族)"Microbiology and MolecularBiology Reviews,65(2):261-287。合适的聚合酶描述于，例如，2010年9月30日提交的美国专利申请12/924701和2009年3月30日提交的12/384112，其通过引用纳入本文用于所有目的。
RNA依赖的RNA聚合酶
在一些实施方式中，用于测序的聚合酶是RNA聚合酶。任何合适的RNA聚合酶(RNAP)都可使用，包括来自细菌、真核细胞、病毒或古细菌的RNA聚合酶。合适的RNA聚合酶包括RNA Pol I、RNA Pol II、RNA Pol III、RNA Pol IV、RNA Pol V、T7 RNA聚合酶、T3 RNA聚合酶或SP6 RNA聚合酶。使用RNA聚合酶用于直接测序信使RNA、转移RNA、非编码RNA、核糖体RNA、微小RNA或催化RNA。使用RNA聚合酶时，聚合试剂将通常包括NTP或其类似物而非用于DNA合成的dNTP。此外，RNA聚合酶可与特定辅因子联用。存在许多蛋白质可结合RNAP并修饰其行为。例如，来自大肠杆菌和在大多数其他原核细胞中的GreA和GreB可增强RNAP在链的生长端附近切割切割RNA模板的能力。该切割可拯救停止的聚合酶分子，且可能参与校正RNAP偶然产生的错误。单独的辅因子Mfd参与转录偶联的修复，该过程中RNAP识别DNA模板中受损的碱基并招募酶来恢复该DNA。其他辅因子已知起调控作用；即，其帮助RNAP选择是否表达某些基因。RNA依赖的RNA聚合酶(RNA复制酶)也可使用，包括病毒RNA聚合酶：例如骨髓灰质炎病毒3Dpol、水疱性口炎病毒L和丙型肝炎病毒NS5b蛋白；且真核RNA复制酶已知使用小干扰RNA作为引物扩增微小RNA和小时序RNA并生成双链RNA。
逆转录酶
用于本发明的方法或组合物的聚合酶包括RNA依赖的DNA聚合酶或逆转录酶。合适的逆转录酶包括HIV-1、M-MLV、AMV和端粒逆转录酶。逆转录酶还允许对RNA底物(如信使RNA、转移RNA、非编码RNA、核糖体RNA、微小RNA或催化RNA)进行直接测序。
因此，任何合适的聚合酶都可用于本发明的系统和方法。合适的聚合酶包括DNA依赖的DNA聚合酶、DNA依赖的RNA聚合酶、RNA依赖的DNA聚合酶(逆转录酶)或RNA依赖的RNA聚合酶。
聚合酶-模板复合物的固定
聚合酶-模板复合物可通过结合聚合酶、模板核酸或引物与表面接合。该结合可以是共价的或非共价的。在一些情况中，可选择性官能化表面的SiO2区域以结合聚合酶复合物。可使用例如硅烷化学进行SiO2的选择性官能化。例如，可使用生物素官能化的硅烷处理表面的SiO2部分，并用与链霉亲和素接合的酶复合物处理表面。该链霉亲和素-聚合酶-模板复合物将特异性结合提供选择性结合的表面的SiO2部分上的生物素。参见例如US8193123，其通过引用纳入本文用于所有目的。在一些情况中，可在表面上形成小区域(如球、岛或坑)，其仅允许少量(且在一些情况中仅允许单个)聚合酶结合。建立区域以结合单个聚合酶复合物描述于例如美国专利申请20100009872 Single Molecule LoadingMethods and Compositions(单分子加载方法和组合物)；以及美国专利申请20110257040Nanoscale Apertures Having Islands of Functionality(具有功能性岛的纳米级孔)，其通过引用纳入本文用于所有目的。DNA分子通常具有强负电荷且因此可在水溶液中使用电场导向。因为本发明的装置涉及电极阵列以及施加电势并同时测量来自附近标记物的电流，所以存在以下能力：使用电势设置电容将与DNA分子结合的聚合酶吸引至电极区域随后同时或交替检查以观察聚合酶是否已结合系统。在该方法中，在检测到DNA-聚合酶复合物的结合时，可通过停止引力势来使用单个聚合酶加载各活性装置。
可以多种方式工程改造分析反应的组分的固定。例如，可使酶(例如聚合酶、逆转录酶、激酶等)在反应位点处(例如纳米级电极附近)接合基材。在其他实施方式中，分析反应中的底物(例如核酸模板，如DNA、RNA或其杂交体、类似物和模拟物，或激酶的靶分子)可在反应位点处连接基材。模板固定的某些实施方式提供于例如2009年9月18日提交的美国专利申请号12/562,690并通过引用全文纳入本文以用于所有目的。本领域技术人员应理解，存在许多共价或非共价的固定核酸和蛋白质的方法，通过接头部分，或将其系于固定化的部分。这些方法是固相合成和微阵列领域中熟知的(Beier等，Nucleic Acids Res.27:1970-1-977(1999))。用于接合核酸或聚合酶与固相支持物的非限制性示例性结合部分包括链霉亲和素或亲和素/生物素连接、氨基甲酸酯连接、酯连接、酰胺、硫酯、(N)-官能化的硫脲、官能化的马来酰亚胺、胺、二硫化物、酰胺、腙连接等。特异性结合一种或多种反应组分的抗体也可用作结合部分。此外，可使用本领域已知的方法用甲硅烷基部分直接接合核酸与基材(如玻璃)。
在一些实施方式中，在能够与模板杂交的反应位点处通过接合包含互补区域的引物将核酸模板固定在反应位点上(例如靠近电容电极)，从而将其固定于适合监测的位置。在某些实施方式中，例如通过首先固定酶组分来组装酶复合物。在其他实施方式中，固定前在溶液中组装酶组分。需要时，待固定的酶或其他蛋白质反应组分可经修饰以含有一个或多个表位，针对这些表位的抗体是市售可得的。此外，蛋白质可经修饰以含有异源性结构域如谷胱甘肽S转移酶(GST)、麦芽糖结合蛋白(MBP)、特异性结合肽区域(参见例如美国专利号5,723,584、5,874,239和5,932,433)或免疫球蛋白的Fc部分。这些结构域各自的结合试剂(即谷胱甘肽、麦芽糖和针对免疫球蛋白的Fc部分的抗体)是可获得的并可用于包被本发明的电容装置的表面。其固定的反应组分的结合部分或试剂可通过本领域熟知的常规化学技术应用于支持物。通常，这些方法可涉及支持物的标准化学表面修饰，在包含结合部分或试剂的不同介质中不同温度水平下孵育支持物，和可能的洗涤和清洁的后续步骤。
可选择性处理电容装置的表面的多个组分以使聚合酶-模板复合物结合基材的特定部分。选择性处理和固定描述于例如U.S.5,624,711；U.S.5,919,523；Hong等(2003)Langmuir 2357-2365；U.S.5143,854；U.S.5,424,186；US 8137942；US 7993891 Reactivesurfaces,substrates and methods of producing and using same(反应性表面、基材以及制备和使用这些物质的方法)；US 7935310；US 7932035 US 7931867 Uniform surfacesfor hybrid material substrates and methods of making and using same(用于杂交材料基材的均一表面以及制备和使用这些物质的方法)以及US 8193123 Articles havinglocalized molecules disposed thereon and methods of producing same(具有设置于其上的局部分子的制品以及制备该制品的方法)，所有这些都通过引用纳入本文用于所有目的。
聚合酶复合物接合于电容装置的一个或多个电极附近。该接合足够接近电极，使得存在于酶的活性位点中的核苷酸类似物上的电容标记物可延伸至与电极足够接近以允许电容检测。聚合酶复合物可接合例如距离电容电极约1nm至约100nm，距离电容电极约2nm至约50nm，或距离电容电极约4nm至约20nm。对于双电极电容装置，聚合酶复合物通常结合至两个电极之间的绝缘区域。对于单电极构造，聚合酶模板复合物可结合至例如电极附近的区域，或结合至电极，或结合至电极顶部上方或内部的绝缘区域。
核酸合成的条件
核酸合成所需的条件是本领域熟知的。聚合酶反应条件包括缓冲剂的类型和浓度、反应的pH、温度、盐的类型和浓度、影响酶动力学的特定添加剂的存在、以及多种辅因子(包括金属辅因子)的类型、浓度和相对量。为进行本发明的方法，聚合酶介导的核酸合成的条件还必须与测量纳米电极附近电容的条件相容。在溶液中进行电容测量的一个方面是控制介质的离子强度。已知聚合酶可在一定范围的离子强度上有效地发挥作用，且可通过改变单价离子(如Li+、Na+、K+、Rb+或Cs+)的水平来改变离子强度。如同已证明的那样，一种或多种这类阳离子的量可影响聚合酶的动力学，且可通过改变这些离子的相对量来调节动力学行为。通过使用这些离子的组合，可选择条件使得其中酶的动力学参数和电容检测的离子强度可用于本发明的方法。参见例如美国专利申请20120009567，其通过引用纳入本文用于所有目的。
通常在缓冲剂存在的情况下运行酶促反应，所述缓冲剂部分用于控制反应混合物的pH。适用于本发明的缓冲剂包括，例如，TAPS(3-{[三(羟基甲基)甲基]氨基}丙磺酸)、Bicine(N,N-二(2-羟基乙基)甘氨酸)、TRIS(三(羟基甲基)甲基胺)、ACES(N-(2-乙酰胺基)-2-氨基乙磺酸)、Tricine(N-(三羟甲基)-甲基甘氨酸)、HEPES(4-2-羟基甲基-l-哌嗪乙磺酸)、TES(2-{[三(羟基甲基)甲基]氨基}乙磺酸)、MOPS(3-(N-吗啉代)丙磺酸)、PIPES(哌嗪-N,N'-二(2-乙磺酸))和MES(2-(N-吗啉代)乙磺酸)。
反应的pH可影响聚合酶反应的速率。可调节反应的温度以增强系统的性能。反应温度可取决于所使用的聚合酶的类型。
核苷酸类似物
测序反应混合物的组分包括核苷酸或核苷酸类似物。对于本发明的方法，至少一些核苷酸类似物具有与其接合的电容标记物。这些包含电容标记物的核苷酸类似物通常经构建以在该标记物处于酶活性位点中时增强阻抗信号。
通常，本发明的核苷酸类似物具有以下结构：
碱基-糖-PP-接头-阻抗标记物
其中，碱基是核碱基，糖是诸如核糖或脱氧核糖的糖，PP是聚磷酸部分，接头是连接基团，且阻抗标记物是可通过纳米级电子元件检测的基团。该阻抗标记物可以是例如本发明所述的电容标记物或电导标记物。
通常测序反应混合物中存在四种核苷酸，对应于DNA的A、G、T和C以及RNA的A、G、C、U。在一些情况中，可添加第5种、第6种或更多的碱基。在一些情况中，所有核苷酸类似物都具有电容标记物，在其他情况中，不是所有核苷酸都将具有电容标记物。在其他情况中，所有不同的核苷酸类似物类型都将携带电容标记物，但特定的电容标记物将分配给超过一种碱基类型。通常，各核苷酸类型将具有一个不同的核苷酸且可与其他核苷酸(例如其他三种核苷酸)区分。如本发明所述，不同的核苷酸可具有不同的阻抗强度，不同的阻抗关联频率特性、不同的电流关联时间特性(电流振荡颜色)，或不同的上述两种或更多种的组合。
该碱基是核碱基，其可以是天然碱基、修饰的天然碱基或合成碱基之一。该碱基将选择性与模板核酸上的其互补碱基相联系，使得其将插入于其互补碱基对面。该糖是连接碱基与聚磷酸基团的基团。其通常是核糖或脱氧核糖，但可以是允许核苷酸类似物络合或掺入生长链的任何糖或其他基团。PP是聚磷酸基团，长度通常为2-20个磷酸，通常3-12个磷酸，且在一些优选的实施方式中是4-10个磷酸。该核苷酸类似物可具有例如4、5、6、7或更多个磷酸基团。这类核苷酸已描述于例如美国专利号6,936,702和7,041,812，其通过引用纳入本文用于所有目的。总的来说，核苷酸类似物的碱基、糖和PP部分有时称作核苷酸部分或核苷磷酸部分。
如本发明中使用的那样，术语核苷酸指聚合酶反应中添加至生长的核酸链的核苷三磷酸，或可指单个核酸分子单元，例如DNA和RNA的单元。本发明中，术语核苷酸的用法与其在本领域中的用法一致。术语核苷酸是指添加至生长的核酸的底物分子还是核酸链中的单元可根据该术语使用中的上下文来确定。
接头是连接电容标记物与核苷酸类似物的核苷酸部分的连接基团。接头通常是长线性或分支部分，其长度和挠性用于在其掺入的同时控制存在于聚合酶中的核苷酸类似物的扩散。接头完全延伸时的长度是例如2nm至200nm。应理解，长分子(如聚合物)不会再其完全延伸的构象中花费太多时间(如果有)。接头可由一些基团形成，包括烷烃、醚、醇、胺、酸、硫酸酯、磺酸酯、磷酸酯、膦酸酯、酰胺、酯、肽和糖。接头上的基团可以是中性、带正电荷或带负电荷。在一些情况中，该接头包括聚乙二醇(PEG)。接头需要具有固定的长度(即不是多分散的)，使得群体中任何类似物分子的尺寸都将是相同的。通常需要接头是水相容的。
可针对所使用的电容装置的特定几何形状的性能来选择接头的长度。电容标记物通过核苷酸类似物(包含接头)、酶和接合部分系于基材。该完整系链的长度和聚合酶距离纳米级电子元件(如电容电极)的距离可用于选择适当的接头。
电感、电容或电导标记物通过接头和磷酸接合核苷酸类似物的核苷酸部分。该接头通常接合聚磷酸部分中的末端磷酸，但在一些情况中可连接聚磷酸链中的非末端磷酸。该接头应接合在核苷酸掺入的聚合酶作用下切割的磷酸。该聚合酶切割α和β磷酸之间的聚磷酸，因此，该接头应连接β(第二)或更远的磷酸。
阻抗标记物可由一种或多种阻抗部分形成。可接受的阻抗标记物或部分可包含有机化合物、有机金属化合物、纳米颗粒、金属或其他合适的取代基，在一些情况中是纳米颗粒。
动力学测量–检测修饰的碱基
本发明的方法提供实时测量核苷酸掺入生长链。实时测量允许测定酶动力学，其可对模板性质(如二级结构)和修饰的碱基敏感。检测核酸序列内修饰的能力可用于在多种类型和/或组的核酸序列中绘制这类修饰，例如跨一组mRNA转录本、跨感兴趣的染色体区域或跨整个基因组。如此绘制的修饰可随后与以下方面相关：转录活性、核酸的二级结构、siRNA活性、mRNA翻译动力学、DNA和RNA结合蛋白的动力学和/或亲和性，以及核酸(如DNA和/或RNA)代谢的其他方面。
在本发明的某些方面中，提供了使用实时电容测序鉴定核酸分子的修饰的方法。通常，提供包含修饰的模板核酸以及能够处理模板的酶。该模板核酸与酶接触，随后监测酶对模板的处理。检测处理中的变化，且该变化表示模板中存在修饰。可通过本发明的方法检测的示例性修饰包括但不限于甲基化的碱基(如5-甲基胞嘧啶、N6-甲基腺嘌呤等)、假尿苷碱基、7,8-二氢-8-氧代鸟嘌呤碱基、2'-O-甲基衍生物碱基、缺刻、无嘌呤位点、无嘧啶位点、嘧啶二聚体、顺-压板交联产物(cis-platen crosslinking product)、氧化损伤、水解损伤、大体积碱基添加物、胸腺嘧啶二聚体、光化学反应产物、链间交联产物、错配碱基、二级结构和结合的试剂。在优选的实施方式中，掺入由酶合成的新生链的核苷酸或其类似物被不同地标记以允许鉴定如此掺入的特定核苷酸或核苷酸类似物的序列。标记物通过磷酸基团连接核苷酸或核苷酸类似物，例如除α磷酸基团以外的磷酸基团。同样，在掺入新生链后从核苷酸或核苷酸类似物中移除电容标记物。动力学鉴定修饰的碱基的技术描述于例如美国专利申请20110183320 Classification of Nucleic Acid Templates(核酸模板的分类)，其通过引用纳入本文用于所有目的。
术语“修饰”在本文中不仅指核酸的化学修饰，还指核酸构象或组成的变化、试剂与核酸的相互作用(例如结合至核酸)，以及其他核酸相关的扰动。同样，修饰的位置或位点是核酸中出现这类修饰的基因座(例如单个核苷酸或多个连续或不连续的核苷酸)。对于双链模板，这类修饰可出现在与新生链互补的链中(所述新生链由处理模板的酶合成)或可出现在置换的链中。虽然本发明的某些具体实施方式针对检测5-甲基胞嘧啶进行描述，但也考虑检测其他类型的修饰的核苷酸(例如，N6-甲基腺苷、N3-甲基腺苷、N7-甲基鸟苷、5-羟甲基胞苷、其他甲基化的核苷酸、假尿苷、硫代尿苷、异鸟苷、异胞苷、二氢尿苷、辫苷、怀俄苷、肌苷、三唑、二氨基嘌呤、β-D-吡喃葡萄糖基氧基甲基尿嘧啶(即β-D-葡糖基-HOMedU、β-葡糖基-羟甲基脲嘧啶、“dJ”或“碱基J”)、8-氧代鸟苷，以及腺苷、胞苷、鸟苷和尿苷的2’-O-甲基衍生物)。此外，虽然主要以DNA模板为例描述，但这类修饰的碱基可以是修饰的RNA碱基且可在RNA(或主要是RNA的)模板中检测。这些和其他修饰是本领域普通技术人员已知的且进一步描述于例如Narayan P,等(1987)Mol Cell Biol 7(4):1572-5；Horowitz S,等(1984)Proc Natl Acad Sci U.S.A.81(18):5667-71；“RNA's Outfits:The nucleic acidhas dozens of chemical costumes(RNA的服装：核酸具有数十种化学服饰)”(2009)C&E；87(36):65-68；Kriaucionis,等(2009)Science 324(5929):929-30；以及Tahiliani,等(2009)Science 324(5929):930-35；Matray,等(1999)Nature 399(6737):704-8；Ooi,等2008)Cell 133:1145-8；Petersson,等(2005)J Am Chem Soc.127(5):1424-30；Johnson,等(2004)32(6):1937-41；Kimoto,等(2007)Nucleic Acids Res.35(16):5360-9；Ahle,等(2005)Nucleic Acids Res 33(10):3176；Krueger等，Curr Opinions in Chem Biology2007,11(6):588)；Krueger,等(2009)Chemistry&Biology 16(3):242；McCullough,等(1999)Annual Rev of Biochem 68:255；Liu,等(2003)Science 302(5646):868-71；Limbach,等(1994)Nucl.Acids Res.22(12):2183-2196；Wyatt,等(1953)Biochem.J.55:774-782；Josse,等(1962)J.Biol.Chem.237:1968-1976；Lariviere,等(2004)J.Biol.Chem.279:34715-34720；和国际申请公开号WO/2009/037473，其公开内容通过引用全文纳入本文用于所有目的。修饰还包括模板核酸中存在非天然碱基对，其包括但不限于羟基吡啶酮和吡啶并嘌呤同源和异源碱基对、吡啶-2,6-二羧酸酯和吡啶金属碱基对、吡啶-2,6-二酰亚胺和吡啶金属碱基对、金属介导的嘧啶碱基对T-Hg(II)-T和C-Ag(I)-C，以及2,6-双(乙基硫甲基)吡啶核碱基Spy的金属同源碱基对，以及嘌呤或嘧啶碱基的炔、烯胺、醇、咪唑、胍和吡啶取代物(Wettig,等(2003)J Inorg Biochem 94:94-99；Clever,等(2005)Angew Chem Int Ed 117:7370-7374；Schlegel,等(2009)Org Biomol Chem 7(3):476-82；Zimmerman,等(2004)Bioorg Chem 32(1):13-25；Yanagida,等(2007)NucleicAcids Symp Ser(Oxl)51:179-80；Zimmerman(2002)J Am Chem Soc 124(46):13684-5；Buncel,等(1985)Inorg Biochem 25:61-73；Ono,等(2004)Angew Chem 43:4300-4302；Lee,等(1993)Biochem Cell Biol 71:162-168；Loakes,等(2009),Chem Commun 4619-4631；以及Seo,等(2009)J Am Chem Soc 131:3246-3252，其全部通过引用全文纳入本文用于所有目的)。其他类型的修饰包括，例如，缺口、缺失的碱基(如无嘌呤或无嘧啶位点)、基于脱氧核糖核苷的核酸内的核糖核苷(或修饰的核糖核苷)、基于核糖核苷的核酸内的脱氧核糖核苷(或修饰的脱氧核糖核苷)、嘧啶二聚体(例如胸腺嘧啶二聚体或环丁烷嘧啶二聚体)、顺铂交联、氧化损伤、水解损伤、其他甲基化碱基、大体积DNA或RNA碱基加合物、光化学反应产物、链间交联产物、错配碱基和其他类型的核酸“损伤”。同样，本发明的某些实施方式涉及“损伤”且根据本发明这类损伤也被视作核酸的修饰。可通过使DNA暴露于辐射(如UV)、致癌化学品、交联剂(如甲醛)、某些酶(如缺刻酶、糖苷酶、外切核酸酶、甲基化酶、其他核酶、葡糖基转移酶等)、病毒、毒素和其他化学品、热破坏等产生修饰的核苷酸。在体内，DNA损伤是导致多种疾病(如癌症、心血管疾病和神经系统疾病)的突变的主要来源(参见例如Lindahl,T.(1993)Nature 362(6422):709-15，其通过引用全文纳入本文用于所有目的)。本发明提供的方法和系统还可用于检测多种DNA构象，具体而言是二级结构形式如发夹环、茎环、内部环、凸起、假结、碱基三聚体、超螺旋、内部杂交等；且还可用于检测与核酸相互作用的试剂，例如结合的蛋白质或其他部分。
在一些实施方式中，通过本发明的电容测序方法进行五色DNA测序。五色DNA测序通常利用具有碱基的核苷酸类似物，其优先与模板或无碱基位点中的第五碱基相联系。这类五色测序描述于例如美国专利申请20110183320，其通过引用全文纳入本文用于所有目的。
监测生物反应
虽然本发明的纳米级电容元件和系统在本申请的大部分内容中都被描述为用于核酸测序，但应理解这些装置和系统也可用于其他分析反应，包括实时监测生物反应，具体是以单分子水平监测生物分子的相互作用。分析这类反应的能力为研究这些反应并潜在地鉴定影响这类反应的因素和/或方法(例如刺激、增强或抑制这类反应)提供了契机。
本发明提供了在单分子(或单分子复合物)水平上观察两种或更多种特异性相互作用反应物的相互作用以与其他相互作用独立地监测该相互作用的进展。换言之，可在支持物上的单个反应位点处监测单个固定的反应组分，使得从反应位点接收的电容信号与支持物上其他反应位点处的其他固定的反应组分之间是可解析的。在优选的实施方式中，这些方法使用纳米级电容装置监测电容可检测标记物，使得包含电容可检测标记物的单个反应物可与包含不同的电容可检测标记物的不同的单个反应物区分。可在电容装置的阵列中进行多种分析反应。电容装置的阵列中的多种分析反应可同时进行，并可彼此同步化或不同步化。在这类阵列中，可因此同时且独立地监测多种反应。
该监测通常包括提供与一种或多种信号转导事件的相互作用，所述信号转导事件可指示该相互作用的一种或多种特性。这类信号转导事件可包括保留靠近给定电容装置的电容标记的反应物。例如，在一些实施方式中，这些标记物提供可通过电容检测系统检测的电容信号，所述电容检测系统可操作地连接发生分析反应的反应位点。本文中，反应位点是监测分析反应处基材之上或附近的位置，且可表示例如基材上的某一位置，其中分析反应的一种或多种组分固定或其中监测分析反应的“检测体积”。分析检测的信号以确定分析反应的一种或多种特性，例如起始、终止、亲和性、生物化学事件(例如结合、键切割、构象变化等)、底物利用、产物形成、反应的动力学(例如速率、后续生物化学事件之间的时间、后续生物化学事件的开始/结束之间的时间、处理能力、错误特征等)等。这些特性可通常分为两类：反应物特性和相互作用特性。反应物特性包括特定反应物的特性，例如反应物的类型/性质、反应物的浓度、反应物上的标记物等。相互作用特性包括多种反应物之间给定相互作用的特性，例如速率、常数、亲和性等，且通常基于这类相互作用期间获得的反应数据测定。例如，聚合化反应的一些特性包括掺入生长的聚合物的单体的特性、掺入的速率、聚合酶与模板相关联的时间长度，和合成的聚合物的长度。在一些实施方式中，分析反应的多种不同组分(例如不同类型的单体)经差异化标记以允许各标记的组分在反应过程期间与其他标记的组分区分。例如，聚合物中单体A的掺入可与单体B的掺入区分。
在某些优选的实施方式中，监测和/或确定反应的多种特性。例如，这些可以是一种或多种反应组分的多种特性(例如性质、浓度等；“反应物特性”)、两种或更多种反应组分之间相互作用的一种或多种特性(例如，涉及产物形成、反应的动力学、结合或解离常数等；“相互作用特性”)，或优选地，反应物特性与相互作用特性的组合。
在一些实施方式中，反应化合物包含多种类型的非固定结合伙伴，且所确定的特性是具体类型的非固定结合伙伴之一，例如与特点反应位点相关。通常，电容标记物通过本发明所述连接基团接合非固定结合伙伴，使得非固定结合伙伴上的电容标记物将在其与固定的结合伙伴相互作用时被感知，所述固定的结合伙伴固定于一个或多个纳米级电极附近。在一些实施方式中，反应位点的阵列包含多种类型的固定的结合伙伴，其各自位于不同的反应位点处，且确定某一特性，所述特性鉴定不同的反应位点中每一个处存在哪种类型的固定的结合伙伴。在一些实施方式中，包含多种类型的固定的结合伙伴(其各自位于不同的反应位点处)的阵列与包含多种类型的非固定结合伙伴的反应化合物接触；反应期间确定的特性用于鉴定各反应位点处存在哪种类型的固定的结合伙伴和哪种类型的非固定结合伙伴与该固定的结合伙伴相关联。在一些情况中，非固定和固定的结合伙伴之间相互作用的特异性足够高，从而足够检测特定反应位点处存在的非固定结合伙伴上的标记物以鉴定该反应位点处固定的结合伙伴。在一些实施方式中，确定定量反应组分之间相互作用的特定方面的特性，例如固定的结合伙伴与非固定结合伙伴之间的亲和力、反应的催化速率或该相互作用的其他方面。在一些情况中，不同的电容信号转导事件(例如一种或多种反应组分上的不同的电容标记物)被用于监测或确定观察下反应的不同特性，但在一些实施方式中单个电容信号转导事件可提供超过一种类型的特性信息。例如，如果非固定结合伙伴具有特定的电容标记物，所述电容标记物不仅从多个不同的非固定结合伙伴中进行鉴定，还基于实时监测的多个参数提供关于反应的动力学信息，例如结合发生所需时间、其与反应位点相联系的时间、结合/解离速率(on/off rate)等。
在一些实施方式中，多种不同的相互作用或反应可同时或依次发生且被监测，其中各单个相互作用彼此独立地被监测，例如在电子元件(如电容装置或纳米FET)中，使得观察下不同的相互作用之间存在分辨。例如，多种不同的非固定反应组分可同时或依次与固定的反应组分相互作用；例如，多种不同的非固定反应组分可以是针对某一固定的反应伙伴的不同的非固定反应伙伴，或可改变两种反应组分之间相互作用的不同的试剂，或用于在反应位点处掺入正在合成的聚合酶的单体。在其他实施方式中，非固定反应组分与合成反应产物之间的相互作用在合成反应期间发生，例如一旦该产物适用于这类相互作用时。例如，该产物可需要具有特定长度，或在某些构型(例如特定的较高级结构)中适于与非固定相互作用组分相互作用。或者，可在反应位点处进行合成反应，且随后暴露于包含随后可与合成反应的产物相互作用的非固定反应组分的反应混合物，其优选固定于反应位点处。在优选的实施方式中，监测合成反应以确定正在合成的产物的特性(例如长度、化学组成等)。合成产物的特性的知识以及与特定反应组分相互作用的检测提供额外的特性，例如特定反应组分的结合位点。可使用本发明的电容装置和系统测量的生物相互作用的示例描述于例如美国专利申请20100323912 Real-Time Analytical Methods and Systems(实时分析方法和系统)，其通过引用纳入本文用于所有目的。
系统
在一些方面中，本发明提供了使用纳米级电子元件(如电容或纳米FET装置)进行实时单分子电子测序的系统。电容或纳米FET测量系统用于随时间监测纳米级电子元件以允许确定具有电容标记物的核苷酸类似物是否与酶相联系。即，纳米级电子元件和酶设置成使得溶液中自由扩散的电容或电导标记的核苷酸类似物基本不会在纳米级电子元件处被检测到。仅当标记物由于其与聚合酶相联系而靠近纳米级电子元件时，才能将标记物检测和鉴定为掺入的核苷酸。自由扩散的核苷酸类似物与酶的活性位点中的类似物之间的一个差别是接近纳米级电子元件所需的时间。扩散的核苷酸类似物将快速地扩散出入纳米级电极附近，而待掺入的核苷酸类似物将花费更长的时间，例如以毫秒数量级的时间靠近纳米级电极。因此，纳米级电子测量系统将检测是否存在待掺入生长的核酸链的核苷酸类似物，其同时处于酶的活性位点中。当核苷酸掺入生长链时，与核苷酸类似物的磷酸部分接合的电容标记物被切割并扩散离开酶和电极。因此，该电容测量系统确定掺入前活性位点中存在类似物，此外例如通过阻抗变化的幅度确定不同的标记物的性质。随着聚合酶反应继续并通过纳米级电子测量系统监测，可通过互补核苷酸类似物掺入生长的核酸链的时间顺序来确定模板核酸的序列。
本发明的系统包括芯片，所述芯片包含本发明所述的纳米级电子装置的阵列，其可逆地啮合其他系统元件。该具有纳米级电子装置的阵列的芯片可以是一次性使用芯片或该芯片可使用多次。该系统通常具有其中置有芯片的外壳。该外壳具有提供与芯片上电连接之间可逆连接的电连接器。提供与插入插座中的芯片之间可靠的可逆电连接的插座是熟知的。可以使用与顶部、侧面、底部或这些面的组合之间的电连接。
当芯片插入外壳时，该系统提供流体储器，向其中添加包含测序反应混合物的流体。在一些情况中，该流体储器被包含为芯片的一部分。在一些情况中，流体储器的一部分与外壳相关联，使得插入芯片形成储器。该流体储器可以是例如其中可导入流体的孔或腔。导入的流体测序反应混合物接触芯片的表面上的电容装置。该系统将通常包括环境控制组件，其包括温度控制和流体上蒸汽相的控制。可控制蒸汽的温度和化学组成，例如通过在反应混合物上提供惰性气体流以最小化样品的氧化。在一些情况中，该系统可具有流体处理系统，用于在进行测序反应之前、期间或之后将各组分递送和移除至流体储器。
在一些情况中，该流体储器还将提供测序反应混合物与参比电极或反电极或上述两者的接触。如上文所述，为进行该方法，在一些情况中使用参比电极、反电极或上述两者。在一些情况中，一个或多个这类电极位于芯片上。使用参比电极和/或反电极且其不位于芯片上时，使其与流体储器中的测序反应混合物接触。
通过外壳上的连接器接触芯片的是电子件，其用于向电子元件提供电压并测量阻抗变化，例如电流/电压源和量表。例如，对于电容测量，该源提供电流和电压以随时间向电极提供适当交流电信号以进行本发明的方法。该量表用于测量阻抗和/或电容。在一些情况中，该源和量表合并为单个单元。在一些情况中，芯片上的阵列中的各电子元件都通过系统内单独的源和单独的量表组件访问。在一些情况中，使用多重化，使得单个源可驱动多个电子元件。在一些情况中，单个源将驱动芯片上的所有电子元件，同时使用单独的量表组件测量各电子元件。可以使用源和量表的任何合适组合。
使用计算机控制和分析系统来控制输入电压和电流并提供计算机实施的控制功能，例如，控制机器人、环境条件和系统的多个组件的状态。计算机控制系统还包括用于计算数据分析的组件(例如用于单分子测序应用，确定和表征核苷酸掺入事件)。如上文所述，在一些情况中，一些控制功能可在芯片上实施，特别是控制源波功能，或处理来自芯片上电容装置的电信号。在一些情况中，该计算机控制和分析系统对出入芯片的信号提供基本所有控制，且该芯片简单地作为从中提取阻抗、电容和或电导信息的电子元件。在一些情况中，该芯片可承担一些控制和分析功能。该芯片可处理来自电子元件的类似物数据。该芯片还可具有数字组件的类似物，并可进行数字信号的分析和储存功能。在芯片上实施多少功能和计算机控制和分析系统保留多少功能的决定可基于获得的相对功能关联添加功能的成本来做出。
还提供了与计算数据组件可操作地偶联的用户界面，使得系统的用户起始并终止分析、控制多种参数(例如相对于分析条件、测序反应混合物环境等)并管理/接收通过系统获得的数据(例如核酸序列数据)。在一些情况中，该用户界面与计算机控制和分析系统接合。此外，可提供远程用户界面，其通过无线网络连接整个系统。这类用户输入装置可包括其他目的的装置，例如笔记本计算机，如Apple iPad，或运行用户界面应用的智能电话。任选地，该用户界面包含某一组件(如数据端口)，用户可通过该组件接收通过分析系统获得的数据并将数据置于可移动电子储存介质用于在基质分析系统以外的位置使用。
本发明的各方面涉及机器或计算机实施的过程，和/或整合至指示这类过程的计算机可读介质上的软件。同样地，上述的反应和系统所生成的信号数据被输入或接收至计算机或其他数据处理器，并用于本发明所列举的多种处理步骤或组件中的一种或多种。一旦进行这些过程，所述计算机实施过程的输出物可以有形或可观察的形式产生，例如打印成用户可读报告，显示在计算机显示器上，或其可储存于一个或多个数据库中用于后续评价、处理、报告等，或其可由计算机保留或传输至不同的计算机以用于设置后续反应或数据处理。
用于进行本发明的过程的计算机的范围是从个人计算机(如运行Intel Pentium或DuoCore处理器的
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型计算机或PC)到工作站、实验室设备或高速服务器(其运行UNIX、LINUX、
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或其他系统)。本发明的逻辑处理可完全由通用型逻辑处理器(如CPU)执行软件和/或固件逻辑指令进行；或完全通过整合至实验室或诊断系统或相机系统的专用逻辑处理回路(如ASIC)进行(其还可包括软件或固件元件)；或通过通用型或专用逻辑回路的组合进行。信号数据的数据格式可包括任何方便的格式，包括基于数字图像的数据格式，如JPEG、GIF、BMP、TIFF或其他方便的格式，但也可使用基于视频的格式，如avi、mpeg、mov、rmv或其他视频格式。本发明的软件过程可通常以多种编程语言进行编程，例如Matlab、C、C++、C#、NET、Visual Basic、Python、JAVA、CGI等。
虽然以通过掺入过程或系统进行的特定测序来描述，但应理解本发明的过程的某些方面可应用于更宽范围的分析反应或其他操作和示例性目的以外的变化的系统构造。
实施例
实施例1–实时电容测序
生成具有9个单独的纳米电极对的电容测序芯片。在硅基材上沉积、图案化并蚀刻第一铂层、SiO2层、第二铂层和氮化硅层。该过程生成具有9个纳米电极对的基材，其具有延伸至硅基材边缘的电互连，如图5所示。SiO2层的厚度是约4纳米。铂电极层的厚度是约10纳米。电互连提供纳米电极与芯片外电子件之间的连接。
在使用氧等离子体对芯片进行表面处理并清洗后，对芯片进行化学处理以使表面特异性偏向选择性接合聚合酶与纳米级电极之间的SiO2层，如美国专利8,193,123中所述。使用硅烷-PEG-生物素的溶液处理芯片，其顺序为优先向电极之间SiO2层提供与表面接合的生物素。
将λDNA片段化并将发夹适体与片段的末端连接以生成环状模板的文库，所述环状模板各自具有互补双链区，其在各端上与发夹闭合，参见美国专利8,153,375。向该文库中添加引物，其与发夹适体内的区域杂交以提供引物化的DNA文库。
美国专利申请20110189659描述了选择Φ29DNA聚合酶从而以适于检测的速率进行DNA合成。该DNA聚合酶具有生物素标签序列，参见美国专利申请20110306096。使用过量的链霉亲和素处理DNA聚合酶以生成DNA聚合酶-链霉亲和素的溶液。该DNA聚合酶-链霉亲和素与引物化的环形DNA构建体在一定条件下混合，从而形成聚合酶-模板复合物的文库。
电容测序芯片安装于电容测序系统内，使得在芯片上形成储器，以允许导入接触芯片上纳米电极对的测序溶液。该电容测序系统具有容纳测序芯片的插座，使得芯片上的电互连啮合插座上的连接器以允许传导出入纳米电极的电信号。
复合的聚合酶模板的文库被稀释并应用于基材，使得聚合酶上的链霉亲和素结合与纳米电极之间的SiO2层接合的生物素基团。选择稀释的水平使得至少一些纳米电极对可具有与其结合的单个活性酶。这可通过连续稀释进行。泊松统计表明，在适当的稀释下，超过三分之一的纳米电极对可具有最佳稀释水平下结合的单个聚合酶。
向储器中添加测序溶液以使测序系统接触芯片。在一些情况中，还使用与测序溶液接触的反电极。该测序溶液具有聚合酶活性所需的组分以及具有调节系统的电容性能所需水平的离子。该溶液具有钾离子以维持适当的电解质水平，且具有聚合酶活性所需的Mg++或Mn++。该测序溶液还具有四种差异标记的核苷酸类似物，如图10所示。各类似物具有包含六磷酸、脱氧核糖和核碱基的核苷酸部分。接合核苷酸部分的末端磷酸的是聚乙二醇(PEG)接头。该PEG接头具有77个PEG单元且连接电容标记物。与各核苷酸类似物接合的是不同尺寸的球体。在该实施例中，使用聚苯乙烯球体。在其他实施例中，使用例如二氧化钛或金球体。对应于G的核苷酸类似物具有直径约15nm的聚苯乙烯球体。对应于A的核苷酸类似物具有直径约25nm的聚苯乙烯球体。对应于T的核苷酸类似物具有直径约5nm的聚苯乙烯球体，且对应于C的核苷酸类似物具有直径约10nm的聚苯乙烯球体。
当存在核苷酸合成所需的所有试剂时，聚合酶开始向引物中添加核苷酸以生成新生链。当待掺入的核苷酸类似物与酶相关联时，通过纳米电极对电容的变化感知电容标记物。一旦来自核苷酸类似物的核苷酸被加入新生链，则切割并释放标记物。
对于电测量，使用两台亚飞安远程源表(sub-femtoamp remote SourceMeter)作为电压源以偏向电极并作为阻抗/电容检测元件。为选择用于测序的AC电流特征，进行实验，其中扫描电极上电流的频率并监测电极处的阻抗。确定峰的特性以精细调节提供最佳检测性能和核苷酸类似物之间最佳区分的频率组。
为检测测序，该源表循环若干频率水平。当核苷酸类似物被掺入生长链时，其存在于酶活性位点中，并因此保持在电极附近，与扩散性物质在电极附近存在的时间相比持续更长的时间。在一些情况中，掺入的核苷酸在活性位点中的平均时间是100至500毫秒。观察到阻抗或电容的峰，持续核苷酸类似物在酶的活性位点中存在的那段时间。基于所观察到的电容的变化量来确定核苷酸类似物之间的区别。在给定的掺入事件期间，频率水平交替数百次。具有多个点可实现改进的信噪比。随后使用碱基读出软件采用来自多次测量的合并的电容数据来读出掺入的碱基。
尽管已经出于阐述和理解的目的在某种程度上详细地描述了本发明，但是本领域技术人员通过阅读本说明书可清楚地了解，可在不背离本发明真实范围的情况下进行各种形式和细节的变化。例如，上述所有的技术和设备都可以用于各种组合。本申请中提到的所有公开出版物、专利、专利申请和/或其他文献都通过引用全文纳入本文中，相当于所述各单独的公开出版物、专利、专利申请和/或其他文献都独立且单独地通过引用纳入本文用于所有目的。

Claims (15)

1.一种用于核酸测序的方法，所述方法包括：
提供包含纳米FET的阵列的基材，各纳米FET包含源、漏区和栅，多个纳米FET包含含有聚合酶和模板核酸的单个聚合酶复合物，所述复合物与所述纳米FET的栅接合或与靠近所述纳米FET的栅的基材接合；
提供多种类型的核苷酸类似物，各类型的核苷酸类似物包含通过接头与核苷酸类似物的磷酸部分接合的电导标记物，其中各类型的核苷酸类似物具有不同接头，并且各不同接头经选择以使各类型的核苷酸类似物表现出不同的电流振荡频率特性；
使所述基材接触多种类型的核苷酸类似物，接触条件为发生聚合酶介导的核酸合成，导致切割所述电导标记物和新生核酸链的生长；
在所述源和漏区之间施加电压，当所述核苷酸类似物位于所述酶的活性位点中时，所述核苷酸类似物上的电导标记物产生栅的电导的可测量变化；
随时间监测所述纳米FET处的电信号，所述电信号表示核苷酸类似物的掺入事件，其中所述电信号包括测量电流振荡频率，其中所述核苷酸类似物与所述聚合酶相关联时，所述核苷酸类似物的电流振荡频率特征用于鉴定掺入的核苷酸的类型；以及
使用所述监测的电信号确定所述模板核酸的序列，
其中，所述方法不需要核苷酸或核苷酸类似物上标记物的还原或氧化。
2.如权利要求1所述的方法，其中，用于确定所述模板核酸序列的监测的电信号还包括信号的持续时间，其表示核苷酸类似物在聚合酶的活性位点中的停留时间。
3.如权利要求1所述的方法，各纳米FET的栅包含纳米线。
4.如权利要求1所述的方法，各纳米FET的栅包含掺杂硅。
5.如权利要求1所述的方法，其中，跨所述源和漏区的电压是DC。
6.如权利要求1所述的方法，其中，跨所述源和漏区的电压是AC，且所述AC电压的频率随时间变化。
7.如权利要求1所述的方法，所述多种类型的核苷酸类似物包括对应于A、G、C、T或A、G、C、U的四种类型的核苷酸类似物。
8.如权利要求1所述的方法，所述纳米FET的栅包含碳纳米管。
9.如权利要求1所述的方法，所述纳米FET的栅包含单壁碳纳米管。
10.如权利要求7所述的方法，所述电导标志物包括纳米颗粒。
11.如权利要求10所述的方法，所述纳米颗粒的尺寸为2nm至50nm。
12.如权利要求1所述的方法，所述基材接触对应于A、G、C、T或A、G、C、U的四种类型的核苷酸类似物，所述四种类型的核苷酸类似物各自具有不同长度的接头。
13.如权利要求7所述的方法，其中所述类型的核苷酸类似物中的一些具有不同电导标记物类型。
14.如权利要求13所述的方法，其中所述类型的核苷酸类似物包括至少一个正电荷电导标记物和至少一个负电荷电导标记物。
15.如权利要求1所述的方法，所述接头包括聚乙二醇。
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