CN105378050A - 具有蛋白酶活性的多肽和编码它们的多核苷酸 - Google Patents

Abstract

本发明涉及具有蛋白酶活性的分离的多肽和编码这些多肽的多核苷酸。本发明还涉及核酸构建体、载体、以及包括这些多核苷酸的宿主细胞，连同在啤酒生产中使用这些多肽的方法。

Description

具有蛋白酶活性的多肽和编码它们的多核苷酸

对序列表的引用

本申请包括一个计算机可读形式的序列表，将其通过引用结合在此。

发明背景

发明领域

本发明涉及具有蛋白酶活性的多肽和编码这些多肽的多核苷酸。本发明还涉及核酸构建体、载体、以及包括这些多核苷酸的宿主细胞，连同在啤酒生产中使用这些多肽的方法。

相关技术说明

本发明提供具有蛋白酶活性的多肽和编码这些多肽的多核苷酸。

本发明还提供了在饮料中使用本发明的多肽改进胶体稳定性的方法。

许多饮料(像啤酒、葡萄酒、果汁等)在制造过程中或在储存后发展沉淀。这种现象被描述为混浊形成。一种形式的混浊形成通常被认为是由于存在于该饮料中的蛋白和多酚的相互作用。这种相互作用导致形成胶体颗粒的不溶性或半可溶性的悬浮液。由于混浊形成可类似于由微生物污染产生的晦度，但是通常优选的是，这些饮料(特别是啤酒)甚至在长期储存后是非常清澈且透明的。因此已经开发了用以减轻这类混浊形成的方法。这些方法靶向这些蛋白或多酚或两者。

硅胶、膨润土、聚(乙烯基聚吡咯烷酮)(PVPP)等已经用来吸附蛋白和多酚、减少混浊形成和改进胶体稳定性。然而，这类材料，当反复使用时会导致收益减少并且因此导致成本的增加。此外，它们还从该饮料去除其他希望的化合物，这可能影响其质量。

酶，特别是蛋白酶，也在发酵过程中使用以改进饮料(特别是啤酒)的胶体稳定性。传统上，蛋白酶像木瓜蛋白酶和菠萝蛋白酶，已经被用于减少冷混浊形成。然而，这些蛋白酶已经显示出会通过水解参与泡沫的形成和稳定的蛋白而影响饮料的泡沫稳定性。此外，这些也引起饮料的香味变化。另一种途径是使用主要水解混浊形成蛋白并且很少水解泡沫形成蛋白的蛋白酶。例如，已知一种脯氨酸特异性内切蛋白酶(例如，从EP1326957)。

发明概述

本发明涉及具有蛋白酶活性的多肽，所以我们要求：

一种具有蛋白酶活性的多肽，该多肽选自下组，该组由以下各项组成：

(a)一种多肽，该多肽与SEQIDNO:1的多肽具有至少60％序列一致性；

(b)由一种多核苷酸编码的一种多肽，该多核苷酸在低严格条件下与SEQIDNO:2的成熟多肽编码序列杂交；

(c)一种多肽，该多肽由与SEQIDNO:2的多肽编码序列具有至少60％序列一致性的多核苷酸编码；

(d)SEQIDNO:1的多肽的一种变体，该变体在一个或多个位置处包括取代、缺失和/或插入；和

(e)(a)、(b)、(c)或(d)的多肽的一个片段，该片段具有蛋白酶活性。

本发明还涉及编码本发明多肽的分离的多核苷酸；核酸构建体；重组表达载体；包括这些多核苷酸的重组宿主细胞；以及产生这些多肽的方法。

本发明还涉及使用本发明的一种或多种多肽改进饮料中的胶体稳定性的方法，该饮料为例如但不限于啤酒、基于麦芽汁的非酒精饮料、葡萄酒以及果汁。一种改进胶体稳定性的方式是通过防止或减少混浊。

在一个方面，本发明涉及一种改进啤酒胶体稳定性的方法，该方法包括在啤酒生产过程中向醪液和/或麦芽汁中添加本发明的一种或多种多肽。

在另一个方面中，本发明涉及本发明的一种或多种多肽在酿造中的用途。

在一个方面中，该接触是与麦芽汁一起进行的。在另一个方面中，该一种或多种多肽被添加到麦芽汁中。在另一个方面中，该接触是与醪液一起进行的。在另一个方面中，该一种或多种多肽被添加到醪液中。在一个方面中，该接触是在发酵过程中进行的。在另一个方面中，该一种或多种多肽是在发酵过程中添加的。在一个方面中，该接触是在滤清后进行的。在另一个方面中，该接触是在喷洒过程中进行的。在一个方面中，该接触是在20℃-80℃的温度进行的。在另一个方面中，该接触是在至少30℃的温度进行的。在另一个方面中，该接触是在至少40℃的温度进行的。在一个方面中，该接触是在至少50℃的温度进行的。在另一个方面中，该接触是在至少60℃的温度进行的。在另一个方面中，该接触是在至少70℃的温度进行的。在一个方面中，该接触是在至少75℃的温度进行的。

定义

具有蛋白酶活性的多肽

具有蛋白酶活性的多肽或蛋白酶有时还被指定为肽酶、朊酶、肽水解酶或蛋白水解酶。蛋白酶可以是在其任一端开始水解肽的外切型蛋白酶或在多肽链内部发挥作用的内切型蛋白酶(内肽酶)。内肽酶对N-和C-末端被封闭的肽底物显示出活性，这些底物与所讨论的蛋白酶的特异性有关。

术语“蛋白酶”在此被定义为水解肽键的酶。蛋白酶的定义也适用于如在此使用的术语“亲本蛋白酶”和“蛋白酶变体”的蛋白酶部分。术语“蛋白酶”包括属于EC3.4酶组(包括其13个亚类中的每一个)的任何酶。EC编号参考加利福尼亚州(California)的圣迭戈(SanDiego)的NC-IUBMB学术出版社(AcademicPress)的1992年酶命名法，分别包括出版于欧洲生物化学杂志(Eur.J.Biochem.)1994，223，1-5；欧洲生物化学杂志1995，232，1-6；欧洲生物化学杂志1996，237，1-5；欧洲生物化学杂志1997，250，1-6；以及欧洲生物化学杂志1999，264，610-650的增刊1-5。命名会定期得以增补和更新；参见例如万维网(WWW)于http://www.chem.qmw.ac.uk/iubmb/enzyme/index.html。

本发明的和根据本发明使用的蛋白酶选自下组，该组由以下各项组成：

(a)属于EC3.4.24酶组的蛋白酶；和/或

(b)M5家族的蛋白酶；

如在基因(Gene)88:87-95(1990)和在MEROPS蛋白酶数据库，发行，9.6(www.merops.sanger.ac.uk)中所述的。该数据库描述于罗林斯(Rawlings)，N.D.，巴雷特(Barrett)，A.J.和贝特曼(Bateman)，A.(2012)MEROPS：蛋白水解酶数据库，它们的底物和抑制剂(MEROPS:thedatabaseofproteolyticenzymes,theirsubstratesandinhibitors)，核酸研究(NucleicAcidsRes)40，D343-D350中。

可以使用任何测定来测量蛋白酶活性，其中采用一种底物，该底物包括与所讨论的蛋白酶的特异性相关的肽键。pH测定和温度测定同样适用于所讨论的蛋白酶。pH值测定的实例是pH2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、或12。温度测定的实例是15℃、20℃、25℃、30℃、35℃、37℃、40℃、45℃、50℃、55℃、60℃、65℃、70℃、80℃、90℃、或95℃。蛋白酶底物的实例为酪蛋白，如Azurine-CrosslinkedCasein(AZCL-酪蛋白)。适合的蛋白酶测定的实例描述于实验部分中。

蛋白酶活性：术语“蛋白酶活性”意指通过水解多肽链中的将氨基酸连接在一起的肽键，催化酰胺键或蛋白的水解的蛋白水解活性(EC3.4)。用于测定蛋白酶活性的若干测定在本领域是可获得的。出于本发明的目的，根据实例中所描述的程序确定蛋白酶活性。在一个方面中，本发明的这些多肽具有SEQIDNO:1的成熟多肽的至少20％，例如至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、至少95％或至少100％的蛋白酶活性。

等位基因变体：术语“等位基因变体”意指占据同一染色体基因座的基因的两种或更多种可替代形式中的任一种。等位基因变异由突变天然产生，并且可以导致群体内的多态性。基因突变可以是沉默的(在所编码的多肽中没有改变)或可编码具有改变的氨基酸序列的多肽。多肽的等位基因变体是由基因的等位基因变体编码的多肽。

催化结构域：术语“催化结构域”意思指一种酶的包含该酶的催化机器的区域。

cDNA：术语“cDNA”是指可以通过从得自真核或原核细胞的成熟的、剪接的mRNA分子进行反转录而制备的DNA分子。cDNA缺乏可以存在于对应基因组DNA中的内含子序列。早先的初始RNA转录本是mRNA的前体，其在呈现为成熟的剪接的mRNA之前要经一系列的步骤进行加工，包括剪接。

编码序列：术语“编码序列”意指直接指定一个多肽的氨基酸序列的多核苷酸。编码序列的边界一般由一个开放阅读框架决定，该开放阅读框架从一个起始密码子(如ATG、GTG或TTG)开始并且以一个终止密码子(如TAA、TAG或TGA)结束。编码序列可以是一种基因组DNA、cDNA、合成DNA或其组合。

控制序列：术语“控制序列”意指对于表达编码本发明的成熟多肽的多核苷酸所必需的核酸序列。每个控制序列对于编码该多肽的多核苷酸来说可以是天然的(即，来自相同基因)或外源的(即，来自不同基因)，或相对于彼此是天然的或外源的。此类控制序列包括但不限于前导子、聚腺苷酸化序列、前肽序列、启动子、信号肽序列、以及转录终止子。至少，控制序列包括启动子，以及转录和翻译终止信号。出于引入有利于将这些控制序列与编码一种多肽的多核苷酸的编码区连接的特异性限制酶切位点的目的，这些控制序列可以提供有多个接头。

表达：术语“表达”包括涉及多肽产生的任何步骤，包括但不限于，转录、转录后修饰、翻译、翻译后修饰、以及分泌。

表达载体：术语“表达载体”意指线性或环状DNA分子，该分子包括编码多肽的多核苷酸并且该多核苷酸可操作地与提供用于其表达的控制序列相连接。

片段：术语“片段”意指具有从成熟多肽或结构域的氨基和/或羧基端缺失的一个或多个(例如，若干个)氨基酸的多肽；其中该片段具有蛋白酶活性。在一个方面中，一个片段包含SEQIDNO:1的氨基酸数目的至少85％、至少90％、至少95％。

高严格条件：术语“高严格条件”意指对于长度为至少100个核苷酸的探针而言，遵循标准DNA印迹程序，在42℃下在5XSSPE、0.3％SDS、200微克/ml剪切并变性的鲑鱼精子DNA和50％甲酰胺中预杂交和杂交12至24小时。载体材料最终使用2XSSC、0.2％SDS，在65℃下洗涤三次，每次15分钟。

宿主细胞：术语“宿主细胞”意指易于用包括本发明的多核苷酸的核酸构建体或表达载体转化、转染、转导等的任何细胞类型。术语“宿主细胞”涵盖由于复制期间发生的突变而与亲本细胞不同的亲本细胞的任何后代。

分离的：术语“分离的”意指处于自然界中不出现的形式或环境中的物质。分离的物质的非限制性实例包括(1)任何非天然发生的物质，(2)包括但不限于任何酶、变体、核酸、蛋白质、肽或辅因子的任何物质，该物质至少部分地从与其本质相关的一种或多种或所有天然发生的成分中去除；(3)相对于天然发现的物质通过人工修饰的任何物质；或(4)通过增加该物质相对于与其天然相关的其他组分的量而修饰的任何物质(例如，宿主细胞中的重组体产量；编码该物质的基因的多拷贝；以及使用比编码该物质的基因天然相关的启动子强的启动子)。

低严格条件：术语“低严格条件”意指对于长度为至少100个核苷酸的探针而言，遵循标准DNA印迹程序，在42℃下在5XSSPE、0.3％SDS、200微克/ml剪切并变性的鲑鱼精子DNA和25％甲酰胺中预杂交和杂交12至24小时。载体材料最终使用2XSSC、0.2％SDS，在50℃下洗涤三次，每次15分钟。

成熟多肽：术语“成熟多肽”意指在翻译和任何翻译后修饰如N-末端加工、C-末端截短、糖基化作用、磷酸化作用等之后处于其最终形式的多肽。在一方面，成熟多肽是SEQIDNO:1。

成熟多肽编码序列：术语“成熟多肽编码序列”意指编码具有蛋白酶活性的成熟多肽的一种多核苷酸。在一方面，成熟多肽编码序列是SEQIDNO:2。

中严格条件：术语“中严格条件”意指对于长度为至少100个核苷酸的探针而言，遵循标准DNA印迹程序，在42℃下在5XSSPE、0.3％SDS、200微克/ml剪切并变性的鲑鱼精子DNA和35％甲酰胺中预杂交和杂交12至24小时。载体材料最终使用2XSSC、0.2％SDS，在55℃下洗涤三次，每次15分钟。

中-高严格条件：术语“中-高严格条件”意指对于长度为至少100个核苷酸的探针而言，遵循标准DNA印迹程序，在42℃下在5XSSPE、0.3％SDS、200微克/ml剪切并变性的鲑鱼精子DNA和35％甲酰胺中预杂交和杂交12至24小时。载体材料最终使用2XSSC、0.2％SDS，在60℃下洗涤三次，每次15分钟。

核酸构建体：术语“核酸构建体”意指单链或双链的一种核酸分子，该核酸分子是从天然存在的基因中分离的，或以一种本来不存在于自然界中的方式被修饰成含有核酸的区段，或是合成的，该核酸分子包括一个或多个控制序列。

可操作地连接：术语“可操作地连接”意指如下的构造，其中，控制序列相对于多核苷酸的编码序列安置在适当位置处，从而使得该控制序列指导该编码序列的表达。

序列一致性：两个氨基酸序列之间或者两个核苷酸序列之间的关联度通过参数“序列一致性”来描述。

出于本发明的目的，使用如在EMBOSS包(EMBOSS：欧洲分子生物学开放软件套件(TheEuropeanMolecularBiologyOpenSoftwareSuite)，赖斯(Rice)等人，2000，遗传学趋势(TrendsGenet.)16:276-277)(优选5.0.0版或更新版本)的尼德尔(Needle)程序中所实施的尼德尔曼-翁施(Needleman-Wunsch)算法(Needleman(尼德尔曼)和Wunsch(翁施)，1970，分子生物学杂志(J.Mol.Biol.)48:443-453)来确定两个氨基酸序列之间的序列一致性。所使用的参数是空位开放罚分10，空位延伸罚分0.5，以及EBLOSUM62(BLOSUM62的EMBOSS版本)取代矩阵。尼德尔标注的“最长的一致性”的输出(使用-非简化选项获得)被用作百分比一致性，并且如下计算：

(一致的残基X100)/(比对长度-比对中的空位总数)

出于本发明的目的，使用如在EMBOSS包(EMBOSS：欧洲分子生物学开放软件套件，赖斯(Rice)等人，2000，见上文)(优选5.0.0版或更新版本)的尼德尔程序中所实施的尼德尔曼-翁施算法(尼德尔曼(Needleman)和翁施(Wunsch)，1970，见上文)来确定两个脱氧核糖核苷酸序列之间的序列一致性。所使用的参数是空位开放罚分10，空位拓展罚分0.5，和EDNAFULL(NCBINUC4.4的EMBOSS版)取代矩阵。尼德尔标注的“最长的一致性”的输出(使用-非简化选项获得)被用作百分比一致性，并且如下计算：

(一致的脱氧核糖核苷酸x100)/(比对长度-比对中的空位总数)。

子序列：术语“子序列”意指使一个或多个(例如，若干个)核苷酸从成熟多肽编码序列的5'端和/或3'端缺失的多核苷酸；其中该子序列编码具有蛋白酶活性的片段。

基本上纯的多核苷酸：术语“基本上纯的多核苷酸”意指不含其他外来的或不需要的核苷酸的多核苷酸制品，并且其存在的形式适于在基因工程改造的多肽生产系统内进行使用。因而，基本上纯的多核苷酸包含按重量计最多10％、最多8％、最多6％、最多5％、最多4％、最多3％、最多2％、最多1％和最多0.5％与该多核苷酸天然或重组关联的其他多核苷酸物质。然而，基本上纯的多核苷酸可以包含天然存在的5'和3'非翻译区，如启动子和终止子。优选地，该多核苷酸是按重量计至少90％纯的，例如至少92％纯的、至少94％纯的、至少95％纯的、至少96％纯的、至少97％纯的、至少98％纯的、至少99％纯的、以及至少99.5％纯的。本发明的多核苷酸优选以一种基本上纯的形式存在。

基本上纯的多肽：术语“基本上纯的多肽”意指这样一种制品，该制品包括与其天然关联或重组关联的按重量计至多10％、至多8％、至多6％、至多5％、至多4％、至多3％、至多2％、至多1％、以及至多0.5％的其他多肽物质。优选地，该多肽按存在于制剂中的总多肽材料的重量计是至少90％纯的，例如至少91％纯的、至少92％纯的、至少93％纯的、至少94％纯的、至少95％纯的、至少96％纯的、至少97％纯的、至少98％纯的、至少99％纯的、至少99.5％纯的、以及100％纯的。本发明的多肽优选处于基本上纯的形式。这可以例如通过熟知的重组方法或通过经典纯化方法制备该多肽来实现。

变体：术语“变体”意指在一个或多个(例如，若干个)位置包括改变(即，取代、插入和/或缺失)的具有蛋白酶活性的一个多肽。取代意指用一个不同氨基酸置换占用一个位置的氨基酸；缺失意指去除占据一个位置的氨基酸；并且插入意指邻近于并且紧跟着占据一个位置的氨基酸之后添加一个或多个(例如，若干个)氨基酸(例如，1-5个氨基酸)。本发明的这些变体具有SEQIDNO:2的成熟多肽的至少20％，例如至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、至少95％或至少100％的蛋白酶活性。

非常高严格条件：术语“非常高严格条件”是指对于长度为至少100个核苷酸的探针而言，遵循标准DNA印迹程序，在42℃下在5XSSPE、0.3％SDS、200微克/ml剪切并变性的鲑鱼精子DNA和50％甲酰胺中预杂交和杂交12至24小时。载体材料最终使用2XSSC、0.2％SDS，在70℃下洗涤三次，每次15分钟。

非常低严格条件：术语“非常低严格条件”是指对于长度为至少100个核苷酸的探针而言，遵循标准DNA印迹程序，在42℃下在5XSSPE、0.3％SDS、200微克/ml剪切并变性的鲑鱼精子DNA和25％甲酰胺中预杂交和杂交12至24小时。载体材料最终使用2XSSC、0.2％SDS，在45℃下洗涤三次，每次15分钟。

饮料：如在此使用的术语饮料具有在本领域中的常规含义并且包括，但不限于，啤酒、基于麦芽汁的非酒精饮料、葡萄酒以及果汁。

啤酒：如在此使用的，术语“啤酒”意在至少涵盖制备自以下各项的啤酒：制备自未发芽谷物的醪液，连同所有制备自发芽的谷物的醪液，以及所有制备自发芽的与未发芽的谷物的混合物的醪液。术语“啤酒”还涵盖制备自辅料的啤酒，以及具有所有可能酒精度的啤酒(包括无醇啤酒)。

加工助剂：“加工助剂”是一种试剂，该试剂是在酿造和/或储存过程中使用以便减少混浊形成。该加工助剂包括但不限于例如硅胶、PVPP、膨润土。

胶体稳定性：可以将啤酒的胶体稳定性定义为在以EBC单位测量的胶体不稳定性变得大于2之前的加温周期的量。一种加温周期对应于约25天的保质期(MEBAK2.15.2.1、Fociertmethode,Vorausbestimmungderchemisch-physikalischenMethodensamlungderBrautechnicheAnalysekommission(MEBAK),SelbstverlagderMEBAK,FreisingWeihenstephan)。

混浊：混浊在本领域也被称为“晦度(cloudiness)”或“浊度(turbidity)”或“胶体不稳定性(colloidalinstability)”并且因此可以互换地使用。

术语“醪液(mash)”和“麦芽汁(wort)”具有在本领域中的常规含义。

发明详细说明

具有蛋白酶活性的多肽

在一个实施例中，本发明涉及与SEQIDNO:1成熟多肽具有至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或100％序列一致性的多肽(特别是分离的多肽)，这些多肽具有蛋白酶活性。在一个方面中，这些多肽与SEQIDNO:1的成熟多肽相差多达10个(例如，1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个或10个)氨基酸。在另一个方面中，该多肽与SEQIDNO:1的成熟多肽相差不超过20个氨基酸，例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18或20个。

本发明的多肽优选地包括或由SEQIDNO:1的氨基酸序列或其等位基因变体组成；或是其具有蛋白酶活性的片段。在另一个方面中，该多肽包括SEQIDNO:1的成熟多肽或由其组成。在另一个实施例中，本发明涉及由以下多核苷酸编码的具有蛋白酶活性的分离的多肽，该多核苷酸在非常低严格条件、低严格条件、中严格条件、中-高严格条件、高严格条件或非常高严格条件下与SEQIDNO:2的成熟多肽编码序列杂交(萨姆布鲁克(Sambrook)等人，1989，分子克隆实验指南(MolecularCloning,ALaboratoryManual)，第二版，冷泉港(ColdSpringHarbor)，纽约)。

SEQIDNO:2的多核苷酸或其子序列，连同SEQIDNO:1的多肽或其片段可根据本领域熟知的方法用于设计核酸探针以鉴定和克隆来自不同属或种的株系的、编码具有蛋白酶活性的多肽的DNA。具体而言，可以根据标准DNA印迹程序，使用这类探针与感兴趣的细胞的基因组DNA或cDNA杂交，以便鉴别和分离其中的对应基因。这类探针可以明显短于完整序列，但是长度应为至少15，例如至少25、至少35、或至少70个核苷酸。优选地，核酸探针的长度为至少100个核苷酸，例如长度为至少200个核苷酸、至少300个核苷酸、至少400个核苷酸、至少500个核苷酸、至少600个核苷酸、至少700个核苷酸、至少800个核苷酸或至少900个核苷酸。DNA和RNA探针两者都可使用。典型地将探针进行标记(例如，用³²P、³H、³⁵S、生物素、或抗生物素蛋白)，以检测相应的基因。本发明涵盖此类探针。

可以筛选从这类其他菌株制备的基因组DNA或cDNA文库的与上述探针杂交并编码具有蛋白酶活性的多肽的DNA。来自这类其他菌株的基因组DNA或其他DNA可以通过琼脂糖或聚丙烯酰胺凝胶电泳，或其他分离技术来分离。来自文库的DNA或分离的DNA可转移到并固定在硝酸纤维素或其他适合的载体材料上。为了鉴定与SEQIDNO:2或其子序列杂交的克隆或DNA，将载体材料用于DNA印迹中。

出于本发明的目的，杂交表示多核苷酸与对应于以下项的标记的核酸探针杂交：(i)SEQIDNO:2；(ii)SEQIDNO:2的成熟多肽编码序列；(iii)它们的全长互补体；或(iv)它们的子序列；杂交是在非常低的至非常高的严格条件下进行。可以使用例如X-射线胶片或本领域已知的任何其他检测手段来检测在这些条件下核酸探针杂交的分子。

在另一个实施例中，本发明涉及一种分离的多肽，该多肽具有蛋白酶活性，由与SEQIDNO:2的成熟多肽编码序列具有至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或100％序列一致性的多核苷酸编码。

在另一个实施例中，本发明涉及在一个或多个(例如，若干个)位置处包括取代、缺失、和/或插入的SEQIDNO:1的成熟多肽的变体。在一个实施例中，引入SEQIDNO:1的成熟多肽中的氨基酸取代、缺失和/或插入的数目不超过20，例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、或19。这些氨基酸变化可以具有微小性质，即，不会显著地影响蛋白质的折叠和/或活性的保守氨基酸取代或插入；小缺失，典型地为1-30个氨基酸；小的氨基-端的或羧基端的延伸，例如氨基端蛋氨酸残基；高达20-25个残基的小连接肽；或通过改变净电荷或另一功能，例如聚组氨酸段、抗原表位或结合域，有利于纯化的小的延伸。

保守取代的实例是在下组的范围内：碱性氨基酸(精氨酸、赖氨酸及组氨酸)、酸性氨基酸(谷氨酸和天冬氨酸)、极性氨基酸(谷氨酰胺和天冬酰胺)、疏水性氨基酸(亮氨酸、异亮氨酸及缬氨酸)、芳香族氨基酸(苯丙氨酸、色氨酸及酪氨酸)及小氨基酸(甘氨酸、丙氨酸、丝氨酸、苏氨酸及甲硫氨酸)。一般不会改变特异性活性的氨基酸取代是本领域已知的并且例如由H.诺伊拉特(H.Neurath)和R.L.希尔(R.L.Hill)，1979，在蛋白质(TheProteins)，学术出版社，纽约中描述。常见的取代为Ala/Ser、Val/Ile、Asp/Glu、Thr/Ser、Ala/Gly、Ala/Thr、Ser/Asn、Ala/Val、Ser/Gly、Tyr/Phe、Ala/Pro、Lys/Arg、Asp/Asn、Leu/Ile、Leu/Val、Ala/Glu、和Asp/Gly。

我们已经在实例6表明了不同取代不会改变该酶的混浊减少能力。

可替代地，氨基酸改变具有这样一种性质:改变多肽的物理化学特性。例如，氨基酸改变可以提高多肽的热稳定性、改变底物特异性、改变最适pH，等等。

可以根据本领域中已知的程序，如定点诱变或丙氨酸扫描诱变(坎宁汉(Cunningham)和威尔斯(Wells)，1989，科学(Science)244:1081-1085)来鉴定多肽中的必需氨基酸。在后一项技术中，在该分子中的每个残基处引入单个丙氨酸突变，并且对所得突变体分子的蛋白酶活性进行测试以鉴别对于该分子的活性至关重要的氨基酸残基。还参见，希尔顿(Hilton)等人，1996，生物化学杂志(J.Biol.Chem.)271:4699-4708。也可结合假定接触位点氨基酸的突变，如通过以下技术例如核磁共振、结晶学、电子衍射、或光亲和标记进行确定的对结构进行物理学分析，从而确定酶的活性位点或其他生物学相互作用。参见，例如，德弗斯(deVos)等人，1992，科学(Science)255:306-312；史密斯(Smith)等人，1992，分子生物学杂志(J.Mol.Biol.)224:899-904；乌乐达维尔(Wlodaver)等人，1992，欧洲生化学会联合会快报(FEBSLett.)309:59-64。还可以从与相关多肽的比对来推断鉴定必需氨基酸。

可以做出单个或多个氨基酸取代、缺失和/或插入并且使用诱变、重组和/或改组的已知方法进行测试，随后进行相关筛选程序，如由里德哈尔-奥尔森(Reidhaar-Olson)和萨奥尔(Sauer)，1988，科学(Science)241:53-57；博维(Bowie)和萨奥尔，1989，美国国家科学院院刊(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)86:2152-2156；WO95/17413；或WO95/22625所披露的那些。可以使用的其他方法包括易错PCR、噬菌体展示(例如，洛曼(Lowman)等人，1991，生物化学(Biochemistry)30:10832-10837；美国专利号5,223,409；WO92/06204)以及区域定向诱变(德比什尔(Derbyshire)等人，1986，基因(Gene)46:145；内尔(Ner)等人，1988，DNA7:127)。

可以结合诱变/改组方法与高通量自动化筛选方法来检测由宿主细胞表达的克隆的、诱变的多肽的活性(内斯(Ness)等人，1999，自然生物技术(NatureBiotechnology)17:893-896)。编码活性多肽的诱变的DNA分子可以回收自宿主细胞，并且使用本领域的标准方法对其进行迅速测序。这些方法允许迅速确定多肽中单个氨基酸残基的重要性。

该多肽可以是一种杂合多肽，其中一种多肽的一个区域在另一种多肽的一个区域的N-末端或C-末端处融合。

该多肽可以是融合多肽或可切割的融合多肽，其中另一种多肽在本发明多肽的N-末端或C-末端处融合。通过将编码另一多肽的多核苷酸融合到本发明的多核苷酸而产生融合多肽。用于产生融合多肽的技术在本领域是已知的，并包括连接编码多肽的编码序列，这样使得它们在框内并且使得融合多肽的表达处于相同的一个或多个启动子和终止子的控制下。融合多肽还可以使用内含肽技术来构建，其中融合多肽在翻译后产生(库珀(Cooper)等人，1993，欧洲分子生物学学会杂志(EMBOJ.)12:2575-2583；道森(Dawson)等人，1994，科学(Science)266:776-779)。

融合多肽可以在两个多肽之间进一步包括一个切割位点。在融合蛋白分泌之时，该位点被切割，从而释放出这两个多肽。切割位点的实例包括但不限于在以下文献中披露的位点：马丁(Martin)等人，2003，工业微生物与生物技术杂志(J.Ind.Microbiol.Biotechnol.)3:568-576；斯维特娜(Svetina)等人，2000，生物技术杂志(J.Biotechnol.)76:245-251；拉斯穆森-威尔逊(Rasmussen-Wilson)等人，1997，应用与环境微生物学(Appl.Environ.Microbiol.)63:3488-3493；沃德(Ward)等人，1995，生物技术(Biotechnology)13:498-503；以及孔特雷拉斯(Contreras)等人，1991，生物技术9:378-381；伊顿(Eaton)等人，1986，生物化学(Biochemistry)25:505-512；柯林斯-拉西(Collins-Racie)等人，1995，生物技术13:982-987；卡特(Carter)等人，1989，蛋白质：结构、功能以及遗传学(Proteins:Structure，Function，andGenetics)6:240-248；以及史蒂文斯(Stevens)，2003，药物发现世界(DrugDiscoveryWorld)4:35-48。

具有蛋白酶活性的多肽的来源

可以从任何属的微生物获得本发明的具有蛋白酶活性的多肽。出于本发明的目的，如在此结合一种给定的来源使用的术语“从...获得”应意指由多核苷酸编码的多肽是由该来源或者由其中已经插入来自该来源的多核苷酸的一种菌株产生的。在一个方面，从给定来源获得的多肽被分泌到细胞外。在一个方面，该多肽是从指孢囊菌属获得，例如但不限于，变孢指孢囊菌(Dactylosporangiumvariesporum)(更名为变孢糖丝菌(Saccharothrixvariisporea)Cf.金姆(Kim)等人，2011国际系统与进化微生物学杂志(Int.J.Syst.Evol.Microbiol.)，2011,61,310-314)。

这些物种的菌株可以容易地在许多培养物保藏中心为公众所获得，如美国典型培养物保藏中心(ATCC)、德国微生物菌种保藏中心(DeutscheSammlungvonMikroorganismenundZellkulturenGmbH，DSMZ)、荷兰菌种保藏中心(CentraalbureauVoorSchimmelcultures，CBS)以及美国农业研究菌种保藏中心北方地区研究中心(NRRL)。

可以使用以上提到的探针从其他来源，包括从自然界(例如，土壤、堆肥、水等等)分离的微生物或直接从自然材料(例如，土壤、堆肥、水等等)获得的DNA样品鉴定和获得该多肽。用于从自然生活环境中直接分离微生物和DNA的技术是本领域熟知的。然后可以通过类似地筛选另一微生物的基因组DNA或cDNA文库或混合的DNA样品来获得编码该多肽的多核苷酸。一旦用一种或多种探针检测到编码多肽的多核苷酸，就可以通过使用本领域普通技术人员已知的技术分离或克隆该多核苷酸(参见例如，萨姆布鲁克(Sambrook)等人，1989，同上)。

多核苷酸

本发明还涉及编码本发明的多肽的分离的多核苷酸，如在此所述。

用于分离或克隆多核苷酸的技术是本领域中已知的并且包括从基因组DNA或cDNA，或其组合进行分离。可以例如通过使用熟知的聚合酶链反应(PCR)或表达文库的抗体筛选来检测具有共有结构特征的克隆DNA片段，实现从基因组DNA克隆多核苷酸。参见例如，伊尼斯(Innis)等人，1990，PCR：方法和应用指南(PCR:AGuidetoMethodsandApplication)，学术出版社(AcademicPress)，纽约。可以使用其他核酸扩增程序例如连接酶链式反应(LCR)、连接激活转录(LAT)和基于多核苷酸的扩增(NASBA)。这些多核苷酸可以由指孢囊菌属或糖丝菌属菌株或相关生物体克隆，并且因此，例如可以是该多核苷酸的多肽编码区的等位基因或种变体。

编码本发明的多肽的多核苷酸的修饰对于合成实质上类似于该多肽的多肽可能是必需的。术语“实质上类似”于该多肽是指该多肽的非天然发生的形式。这些多肽可能以某种工程化方式而不同于从其天然来源分离的多肽，例如在比活性、热稳定性、最优pH等方面不同的变体。这些变体可以基于以SEQIDNO:2的成熟多肽编码序列(例如其子序列)形式呈现的多核苷酸，和/或通过引入不会改变该多肽的氨基酸序列，但对应于预定用于产生该酶的宿主生物体的密码子使用的核苷酸取代，或通过引入可能产生不同氨基酸序列的核苷酸取代来构建。对于核苷酸取代的一般描述，参见例如福德(Ford)等人，1991，蛋白表达与纯化(ProteinExpressionandPurification)2:95-107。

核酸构建体

本发明还涉及核酸构建体，这些核酸构建体包括可操作地连接至一个或多个控制序列的本发明的多核苷酸，在与控制序列相容的条件下，这些控制序列指导编码序列在合适的宿主细胞中的表达。

该多核苷酸可以按各种方式操纵以提供该多肽的表达。取决于表达载体，在其插入载体以前操纵多核苷酸可以是希望的或必需的。用于利用重组DNA方法修饰多核苷酸的技术是本领域熟知的。

该控制序列可以是一个启动子，即，被宿主细胞识别以对编码本发明的多肽的多核苷酸进行表达的一种多核苷酸。该启动子包含转录控制序列，这些序列介导了该多肽的表达。该启动子可以是在宿主细胞中显示出转录活性的任何多核苷酸，包括突变型、截短型及杂合型启动子，并且可以是由编码与该宿主细胞同源或异源的细胞外或细胞内多肽的基因获得。

用于在细菌宿主细胞中指导本发明的核酸构建体的转录的合适启动子的实例是从以下基因中获得的启动子：解淀粉芽孢杆菌α-淀粉酶基因(amyQ)、地衣芽孢杆菌α-淀粉酶基因(amyL)、地衣芽孢杆菌青霉素酶基因(penP)、嗜热脂肪芽孢杆菌麦芽糖淀粉酶基因(amyM)、枯草芽孢杆菌果聚糖蔗糖酶基因(sacB)、枯草芽孢杆菌xylA和xylB基因、苏云金芽孢杆菌cryIIIA基因(阿盖塞(Agaisse)和勒尔克吕(Lereclus)，1994，分子微生物学(MolecularMicrobiology)13:97-107)、大肠杆菌lac操纵子、大肠杆菌trc启动子(埃贡(Egon)等人，1988，基因(Gene)69:301-315)、天蓝链霉菌琼脂水解酶基因(dagA)、以及原核β-内酰胺酶基因(维拉-卡马洛夫(Villa-Kamaroff)等人，1978，美国国家科学院院刊(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)75:3727-3731)、以及tac启动子(德波尔(DeBoer)等人，1983，美国国家科学院院刊80:21-25)。其他启动子描述在吉尔伯特(Gilbert)等人，1980，科学美国人(ScientificAmerican)242:74-94的“来自重组细菌的有用蛋白质(Usefulproteinsfromrecombinantbacteria)”；以及在萨姆布鲁克(Sambrook)等人，1989，见上文。串联启动子的实例披露在WO99/43835中。

用于指导本发明的核酸构建体在丝状真菌宿主细胞中的转录的合适启动子的实例是从以下各项的基因获得的启动子：构巢曲霉乙酰胺酶、黑曲霉中性α-淀粉酶、黑曲霉酸稳定性α-淀粉酶、黑曲霉或泡盛曲霉葡糖淀粉酶(glaA)、米曲霉TAKA淀粉酶、米曲霉碱性蛋白酶、米曲霉丙糖磷酸异构酶、尖镰孢胰蛋白酶样蛋白酶(WO96/00787)、镶片镰孢淀粉葡糖苷酶(WO00/56900)、镶片镰孢Daria(WO00/56900)、镶片镰孢Quinn(WO00/56900)、米黑根毛霉(Rhizomucormiehei)脂肪酶、米黑根毛霉天冬氨酸蛋白酶、里氏木霉β-葡糖苷酶、里氏木霉纤维二糖水解酶I、里氏木霉纤维二糖水解酶II、里氏木霉内切葡聚糖酶I、里氏木霉内切葡聚糖酶II、里氏木霉内切葡聚糖酶III、里氏木霉内切葡聚糖酶V、里氏木霉木聚糖酶I、里氏木霉木聚糖酶II、里氏木霉木聚糖酶III、里氏木霉β-木糖苷酶、以及里氏木霉翻译延长因子，以及NA2-tpi启动子(一种修饰的启动子，其来自曲霉属中性α-淀粉酶基因，其中未翻译的前导序列由曲霉属丙糖磷酸异构酶基因的未翻译的前导序列替代；非限制性实例包括修饰的启动子，其来自黑曲霉中性α-淀粉酶的基因，其中未翻译的前导序列由构巢曲霉或米曲霉丙糖磷酸异构酶基因的未翻译的前导序列替代)；以及其突变型启动子、截短型启动子、以及杂合型启动子。其他启动子描述于美国专利号6,011,147中。

在酵母宿主中，有用的启动子从以下的基因获得：酿酒酵母烯醇酶(ENO-1)、酿酒酵母半乳糖激酶(GAL1)、酿酒酵母醇脱氢酶/甘油醛-3-磷酸脱氢酶(ADH1、ADH2/GAP)、酿酒酵母丙糖磷酸异构酶(TPI)、酿酒酵母金属硫蛋白(CUP1)、以及酿酒酵母3-磷酸甘油酸激酶。罗马诺斯(Romanos)等人，1992，酵母(Yeast)8:423-488描述了酵母宿主细胞的其他有用的启动子。

控制序列还可以是由宿主细胞识别以终止转录的一种转录终止子。该终止子可操作地连接到编码该多肽的多核苷酸的3'-末端。在该宿主细胞中起作用的任何终止子都可以用于本发明中。

用于细菌宿主细胞的优选终止子是从克劳氏芽孢杆菌碱性蛋白酶(aprH)、地衣芽孢杆菌α-淀粉酶(amyL)以及大肠杆菌核糖体RNA(rrnB)的基因获得。

用于丝状真菌宿主细胞的优选终止子是从以下各项的基因获得：构巢曲霉乙酰胺酶、构巢曲霉邻氨基苯甲酸合酶、黑曲霉葡糖淀粉酶、黑曲霉α-葡糖苷酶、米曲霉TAKA淀粉酶、尖镰孢胰蛋白酶样蛋白酶、里氏木霉β-葡糖苷酶、里氏木霉纤维二糖水解酶I、里氏木霉纤维二糖水解酶II、里氏木霉内切葡聚糖酶I、里氏木霉内切葡聚糖酶II、里氏木霉内切葡聚糖酶III、里氏木霉内切葡聚糖酶V、里氏木霉木聚糖酶I、里氏木霉木聚糖酶II、里氏木霉木聚糖酶III、里氏木霉β-木糖苷酶以及里氏木霉翻译延长因子。

用于酵母宿主细胞的优选终止子是从以下各项的基因获得：酿酒酵母烯醇酶、酿酒酵母细胞色素C(CYC1)以及酿酒酵母甘油醛-3-磷酸脱氢酶。用于酵母宿主细胞的其他有用的终止子由罗马努斯等人，1992，见上文描述。

控制序列还可以是启动子下游和基因的编码序列上游的mRNA稳定子区，其增加该基因的表达。

适合的mRNA稳定子区的实例是从以下获得的：苏云金芽孢杆菌cryIIIA基因(WO94/25612)和枯草芽孢杆菌SP82基因(化(Hue)等人，1995，细菌学杂志(JournalofBacteriology)177:3465-3471)。

该控制序列还可以是一个前导序列，一种对宿主细胞翻译很重要的非翻译mRNA区域。该前导子可操作地连接到编码该多肽的多核苷酸的5'-末端。可以使用在宿主细胞中具有功能的任何前导序列。

用于丝状真菌宿主细胞的优选前导序列是从米曲霉TAKA淀粉酶和构巢曲霉丙糖磷酸异构酶的基因获得。

适用于酵母宿主细胞的前导序列从以下各项的基因获得：酿酒酵母烯醇酶(ENO-1)、酿酒酵母3-磷酸甘油酸激酶、酿酒酵母α因子、以及酿酒酵母醇脱氢酶/甘油醛-3-磷酸脱氢酶(ADH2/GAP)。

控制序列还可以是一种聚腺苷酸化序列，可操作地连接至该多核苷酸的3’-末端并且当转录时由宿主细胞识别为将聚腺苷酸残基添加至所转录的mRNA的信号的序列。可以使用在宿主细胞中起作用的任何多腺苷酸化序列。

用于丝状真菌宿主细胞的优选多腺苷酸化序列是从以下各项的基因中获得的：构巢曲霉邻氨基苯甲酸合成酶、黑曲霉葡糖淀粉酶、黑曲霉α-葡萄糖苷酶、米曲霉TAKA淀粉酶、以及尖孢镰刀菌胰蛋白酶样蛋白酶。

对于酵母宿主细胞有用的多聚腺苷酸化序列在郭(Guo)和谢尔曼(Sherman)，1995，分子细胞生物学(Mol.CellularBiol.)15:5983-5990中得以描述。

控制序列也可以是编码与多肽的N-端连接并指导多肽进入细胞的分泌通路的信号肽的信号肽编码区。多核苷酸的编码序列的5’-端可以固有地包括在翻译阅读框架中与编码多肽的编码序列的区段天然地连接的一个信号肽编码序列。可替代地，编码序列5’末端可以包括对于该编码序列是外源的信号肽编码序列。在编码序列不天然地包含信号肽编码序列的情况下，可能需要外源信号肽编码序列。可替代地，外源信号肽编码序列可简单地替换天然的信号肽编码序列以便增强该多肽的分泌。然而，可以使用指导所表达多肽进入宿主细胞的分泌通路的任何信号肽编码序列。

用于细菌宿主细胞的有效信号肽编码序列是从以下各项的基因获得的信号肽编码序列：芽孢杆菌属NCIB11837产麦芽糖淀粉酶、地衣芽孢杆菌枯草杆菌蛋白酶、地衣芽孢杆菌β-内酰胺酶、嗜热脂肪芽孢杆菌α-淀粉酶、嗜热脂肪芽孢杆菌中性蛋白酶(nprT、nprS、nprM)以及枯草芽孢杆菌prsA。西蒙纳(Simonen)和帕尔瓦(Palva)，1993，微生物学评论(MicrobiologicalReviews)57:109-137描述了另外的信号肽。

用于丝状真菌宿主细胞的有效信号肽编码序列是获得自以下项的基因的信号肽编码序列：黑曲霉中性淀粉酶、黑曲霉葡糖淀粉酶、米曲霉TAKA淀粉酶、特异腐质霉纤维素酶、特异腐质霉内切葡聚糖酶V、柔毛腐质霉脂肪酶以及米黑根毛霉天冬氨酸蛋白酶。

对于酵母宿主细胞有用的信号肽获得自以下项的基因：酿酒酵母α-因子和酿酒酵母转化酶。见上文，罗马诺斯(Romanos)等人(1992)描述了其他有用的信号肽编码序列。

该控制序列还可以是编码位于多肽的N-末端处的前肽的一个前肽编码序列。生成的多肽被称为前体酶(proenzyme)或多肽原(或者在一些情况下被称为酶原(zymogen))。多肽原通常是无活性的并且可以通过从该多肽原上催化切割或自动催化切割前肽而被转化成一种活性多肽。前肽编码序列可以从以下各项的基因获得：枯草芽孢杆菌碱性蛋白酶(aprE)、枯草芽孢杆菌中性蛋白酶(nprT)、嗜热毁丝霉漆酶(WO95/33836)、米黑根毛霉天冬氨酸蛋白酶、以及酿酒酵母α-因子。

在信号肽序列和前肽序列二者都存在的情况下，该前肽序列定位成紧邻多肽的N-末端并且该信号肽序列定位成紧邻该前肽序列的N-末端。

还可能希望地是添加调控序列，这些调控序列相对于宿主细胞的生长来调节多肽的表达。调节序列的实例是使得基因的表达响应于化学或物理刺激(包括调控化合物的存在)而开启或关闭的那些序列。原核系统中的调控序列包括lac、tac以及trp操纵子系统。在酵母中，可以使用ADH2系统或GAL1系统。在丝状真菌中，可以使用黑曲霉葡糖淀粉酶启动子、米曲霉TAKAα-淀粉酶启动子和米曲霉葡糖淀粉酶启动子、里氏木霉纤维二糖水解酶I启动子以及里氏木霉纤维二糖水解酶II启动子。调节序列的其他实例是允许基因扩增的那些。在真核系统中，这些调节序列包括在甲氨蝶呤存在下被扩增的二氢叶酸还原酶基因以及用重金属扩增的金属硫蛋白基因。在这些情况中，编码多肽的多核苷酸将与调控序列可操作地连接。

表达载体

本发明还涉及包括本发明的多核苷酸、启动子、以及转录和翻译终止信号的重组表达载体。不同的核苷酸和控制序列可以连接在一起以产生一个重组表达载体，这一重组表达载体可以包括一个或多个便利的限制酶切位点以允许在这些位点处插入或取代编码该变体的多核苷酸。可替代地，该多核苷酸可以通过将该多核苷酸或包括该多核苷酸的核酸构建体插入用于表达的适当载体中来表达。在产生该表达载体时，该编码序列是位于该载体中，这样使得该编码序列与该供表达的适当控制序列可操作地连接。

重组表达载体可以是任何载体(例如，质粒或病毒)，其能够方便地进行重组DNA程序，并且能够引起多核苷酸的表达。载体的选择将典型地取决于该载体与有待引入该载体的宿主细胞的相容性。该载体可以是一种线性的或闭合的环状质粒。

载体可以是自主复制载体，即，作为染色体外实体存在的载体，其复制独立于染色体复制，例如，质粒、染色体外元件、微染色体或人工染色体。该载体可以包含用于确保自我复制的任何装置。可替代地，该载体可以是这样一种载体，当它被引入该宿主细胞中时，被整合到基因组中并且与其中已整合了它的一个或多个染色体一起复制。此外，可以使用单一载体或质粒或两个或更多个载体或质粒(这些载体或质粒共同含有待引入到宿主细胞的基因组中的总DNA)或转座子。

该载体优选包含允许容易选择转化细胞、转染细胞、转导细胞或类似细胞的一个或多个选择性标记。选择性标记是一种基因，该基因的产物提供了杀生物剂抗性或病毒抗性、重金属抗性、营养缺陷型的原养型等。

细菌性选择性标记的实例是地衣芽孢杆菌或枯草芽孢杆菌dal基因，或赋予抗生素抗性(例如氨苄青霉素、氯霉素、卡那霉素、新霉素、大观霉素或四环素抗性)的标记。用于酵母宿主细胞的适合的标记包括但不限于ADE2、HIS3、LEU2、LYS2、MET3、TRP1、以及URA3。用于在丝状真菌宿主细胞中使用的选择性标记包括但不限于，adeA(磷酸核糖酰氨基咪唑-琥珀羧胺合酶)、adeB(磷酸核糖酰-氨基咪唑合酶)、amdS(乙酰胺酶)、argB(鸟氨酸氨甲酰基转移酶)、bar(草丁膦乙酰转移酶)、hph(潮霉素磷酸转移酶)、niaD(硝酸还原酶)、pyrG(乳清酸核苷-5'-磷酸脱羧酶)、sC(硫酸腺苷基转移酶)、以及trpC(邻氨基苯甲酸合酶)、连同其等效物。优选在曲霉属细胞中使用的是构巢曲霉或米曲霉amdS和pyrG基因以及吸水链霉菌(Streptomyceshygroscopicus)bar基因。优选在木霉属细胞中使用的是adeA、adeB、amdS、hph以及pyrG基因。

选择性标记可以是在W02010/039889中描述的双选择性标记系统。在一方面，双选择性标记是hph-tk双选择性标记系统。

载体优选含有允许载体整合到宿主细胞的基因组中或载体在细胞中独立于基因组自主复制的一个或多个元件。

对于整合到该宿主细胞基因组中，该载体可以依靠编码该多肽的多核苷酸序列或者用于通过同源或非同源重组整合到该基因组中的该载体的任何其他元件。可替代地，该载体可以包含用于指导通过同源重组而整合到宿主细胞基因组中的一个或多个染色体中的一个或多个精确位置处的另外的多核苷酸。为了增加在精确位置整合的可能性，这些整合的元件应包含足够数量的核酸，例如100至10,000个碱基对、400至10,000个碱基对、以及800至10,000个碱基对，这些碱基对与对应的靶序列具有高度的序列一致性以提高同源重组的可能性。这些整合元件可以是与宿主细胞的基因组内的靶序列同源的任何序列。此外，这些整合元件可以是非编码多核苷酸或编码多核苷酸。另一方面，该载体可以通过非同源重组整合到宿主细胞的基因组中。

对于自主复制，载体可以进一步包括使该载体能够在所讨论的宿主细胞中自主复制的复制起点。复制起点可以是在细胞中起作用的介导自主复制的任何质粒复制子。术语“复制起点”或“质粒复制子”意指使质粒或载体能够在体内复制的多核苷酸。

细菌复制起点的实例是允许在大肠杆菌中复制的质粒pBR322、pUC19、pACYC177、以及pACYC184的复制起点，以及允许在芽孢杆菌中复制的质粒pUB110、pE194、pTA1060、以及pAMβ1的复制起点。

用于在酵母宿主细胞中使用的复制起点的实例是2微米复制起点ARS1、ARS4、ARS1与CEN3的组合以及ARS4与CEN6的组合。

在丝状真菌细胞内有用的复制起点的实例是AMA1和ANS1(格姆斯(Gems)等人，1991，基因(Gene)98:61-67；卡伦(Cullen)等人，1987，核酸研究(NucleicAcidsRes.)15:9163-9175；WO00/24883)。AMA1基因的分离和包括该基因的质粒或载体的构建可根据WO00/24883披露的方法完成。

可以将本发明的多核苷酸的多于一个的拷贝插入到宿主细胞中以增加多肽的产生。通过将序列的至少一个另外的拷贝整合到宿主细胞基因组中或者通过包含一个与该多核苷酸一起的可扩增的选择性标记基因可以获得多核苷酸的增加的拷贝数目，其中通过在适当的选择性试剂的存在下培养细胞可以选择包含选择性标记基因的经扩增的拷贝的细胞、以及由此该多核苷酸的另外的拷贝。

用于连接以上所描述的元件以构建本发明的重组表达载体的程序是本领域的普通技术人员熟知的(参见，例如，萨姆布鲁克(Sambrook)等人，1989，见上文)。

宿主细胞

本发明还涉及重组宿主细胞，这些重组宿主细胞包括本发明的多核苷酸，该多核苷酸可操作地连接至一个或多个控制序列，该一个或多个控制序列指导本发明的多肽的产生。将包含多核苷酸的构建体或载体引入到宿主细胞中，这样使得该构建体或载体被维持作为染色体整合体或作为自主复制的染色体外载体，如早前所描述。术语“宿主细胞”涵盖由于复制期间发生的突变与亲本细胞不同的亲本细胞的任何后代。宿主细胞的选择在很大程度上取决于编码该多肽的基因及其来源。

该宿主细胞可以是有用于重组产生本发明的多肽的任何细胞，例如原核细胞或真核细胞。

原核宿主细胞可以是任何革兰氏阳性或革兰氏阴性细菌。革兰氏阳性细菌包括但不限于：芽孢杆菌属、梭菌属、肠球菌属、土芽孢杆菌属、乳杆菌属、乳球菌属、海洋芽孢杆菌属、葡萄球菌属、链球菌属以及链霉菌属。革兰氏阴性细菌包括但不限于：弯曲杆菌属、大肠杆菌、黄杆菌菌、梭杆菌属、螺杆菌属、泥杆菌属、奈瑟氏菌属、假单胞菌属、沙门氏菌属以及脲原体属。

细菌宿主细胞可以是任何芽孢杆菌细胞，包括但不限于：嗜碱芽孢杆菌、解淀粉芽孢杆菌、短芽孢杆菌、环状芽孢杆菌、克劳氏芽孢杆菌、凝结芽孢杆菌、坚强芽孢杆菌、灿烂芽孢杆菌、迟缓芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、巨大芽孢杆菌、短小芽孢杆菌、嗜热脂肪芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌以及苏云金芽孢杆菌细胞。

细菌宿主细胞还可以是任何链球菌细胞，包括但不限于：似马链球菌、酿脓链球菌、乳房链球菌以及马链球菌兽瘟亚种细胞。

细菌宿主细胞还可以是任何链霉菌属细胞，包括但不限于：不产色链霉菌、除虫链霉菌、天蓝链霉菌、灰色链霉菌以及浅青紫链霉菌细胞。

将DNA引入芽孢杆菌属细胞中可通过以下来实现：原生质体转化(参见例如，张(Chang)和科恩(Cohen)，1979，分子遗传学与基因组学(Mol.Gen.Genet.)168:111-115)、感受态细胞转化(参见，例如，杨格(Young)和斯皮宰曾(Spizizen)，1961，细菌学杂志(J.Bacteriol.)81:823-829；或杜拜努(Dubnau)以及大卫杜夫-阿贝尔森(Davidoff-Abelson)，1971，分子生物学杂志(J.Mol.Biol.)56:209-221)、电穿孔(参见，例如，茂川(Shigekawa)和道尔(Dower)，1988，生物技术(Biotechniques)6:742-751)、或者接合(参见，例如克勒(Koehler)和索恩(Thorne)，1987，细菌学杂志169:5271-5278)。将DNA引入大肠杆菌细胞中可通过以下来实现：原生质体转化(参见例如，哈纳汗(Hanahan)，1983，分子生物学杂志(J.Mol.Biol.)166:557-580)或电穿孔(参见例如，道尔(Dower)等人，1988，核酸研究(NucleicAcidsRes.)16:6127-6145)。将DNA引入链霉菌属细胞中可通过以下来实现：原生质体转化、电穿孔(参见例如，贡(Gong)等人，2004，叶线形微生物学(FoliaMicrobiol.)(Praha(布拉格))49:399-405)、接合(参见例如，马佐迪耶(Mazodier)等人，1989，细菌学杂志(J.Bacteriol.)171:3583-3585)、或转导(参见例如，伯克(Burke)等人，2001，美国国家科学院院刊(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)98:6289-6294)。将DNA引入假单孢菌属细胞中可通过以下来实现：电穿孔(参见例如，蔡(Choi)等人，2006，微生物学方法杂志(J.Microbiol.Methods)64:391-397)或接合(参见例如，皮内多(Pinedo)和斯梅茨(Smets)，2005，应用与环境微生物学(Appl.Environ.Microbiol.)71:51-57)。将DNA引入链球菌属细胞中可通过以下来实现：天然感受态(参见例如，佩里(Perry)和藏满(Kuramitsu)，1981，感染与免疫(Infect.Immun.)32:1295-1297)、原生质体转化(参见，例如，凯特(Catt)和乔力克(Jollick)，1991，微生物学(Microbios)68:189-207)、电穿孔(参见，例如，巴克利(Buckley)等人，1999，应用与环境微生物学(Appl.Environ.Microbiol.)65:3800-3804)、或者接合(参见，例如，克莱威尔(Clewell)，1981，微生物学评论(Microbiol.Rev.)45:409-436)。然而，可以使用本领域已知的用于将DNA引入宿主细胞中的任何方法。

宿主细胞还可以是真核细胞，如哺乳动物、昆虫、植物、或真菌细胞。

宿主细胞可以是真菌细胞。如在此使用的“真菌”包括子囊菌门(Ascomycota)、担子菌门(Basidiomycota)、壶菌门(Chytridiomycota)、以及接合菌门(Zygomycota)、连同卵菌门(Oomycota)和全部有丝分裂孢子真菌(如由霍克斯沃思(Hawksworth)等人在安斯沃思和拜斯比真菌词典(AinsworthandBisby’sDictionaryofTheFungi)，第8版，1995，国际应用生物科学中心(CABInternational)，大学出版社(UniversityPress)，英国剑桥(Cambridge，UK)中进行定义的)。

该真菌宿主细胞可以是酵母细胞。如在此使用的“酵母”包括产子嚢酵母(内孢霉目)、产担子酵母和属于半知菌类(芽孢纲)的酵母。由于酵母的分类在未来可能改变，因此出于本发明的目的，酵母应如酵母的生物学和活性(BiologyandActivitiesofYeast)(斯金纳(Skinner)、帕斯莫尔(Passmore)、以及达文波特(Davenport)编辑，应用细菌学学会讨论会系列号9(Soc.App.Bacteriol.SymposiumSeriesNo.9)，1980)中所描述来定义。

酵母宿主细胞可以是假丝酵母属、汉逊酵母属、克鲁弗酵母属、毕赤酵母属、酵母属、裂殖酵母属、或耶氏酵母属细胞，如乳酸克鲁弗酵母(Kluyveromyceslactis)、卡尔酵母、酿酒酵母、糖化酵母、道格拉氏酵母、克鲁弗酵母、诺地酵母、卵形酵母、或解脂耶氏酵母(Yarrowialipolytica)细胞。

真菌宿主细胞可以是丝状真菌细胞。“丝状真菌”包括真菌门(Eumycota)和卵菌门的亚门(如由霍克斯沃思等人，1995，见上文所定义)的所有丝状形式。丝状真菌通常的特征在于由壳多糖、纤维素、右旋糖酐、壳聚糖、甘露聚糖、以及其他复杂多糖构成的菌丝体壁。营养生长是通过菌丝延长，而碳分解代谢是专性需氧的。相反，酵母(如酿酒酵母)的营养生长是通过单细胞菌体的出芽(budding)，而碳分解代谢可以是发酵的。

丝状真菌宿主细胞可以是枝顶孢霉属、曲霉属、短梗霉属、烟管霉属(Bjerkandera)、拟腊菌属、金孢子菌属、鬼伞属、革盖菌属(Coriolus)、隐球菌属、线黑粉菌科(Filibasidium)、镰孢属、腐质霉属、梨孢菌属、毛霉属、毁丝霉属、新美鞭菌属、链孢菌属、拟青霉属、青霉属、平革菌属、射脉菌属(Phlebia)、瘤胃壶菌属、侧耳属(Pleurotus)、裂褶菌属、篮状菌属、嗜热子囊菌属、梭孢壳属、弯颈霉属、栓菌属(Trametes)或木霉属细胞。

例如，丝状真菌宿主细胞可以是泡盛曲霉、臭曲霉、烟曲霉、日本曲霉、构巢曲霉、黑曲霉、米曲霉、黑刺烟管菌(Bjerkanderaadusta)、干拟蜡菌(Ceriporiopsisaneirina)、卡内基拟蜡菌(Ceriporiopsiscaregiea)、浅黄拟蜡孔菌(Ceriporiopsisgilvescens)、潘诺希塔拟蜡菌(Ceriporiopsispannocinta)、环带拟蜡菌(Ceriporiopsisrivulosa)、微红拟蜡菌(Ceriporiopsissubrufa)、虫拟蜡菌(Ceriporiopsissubvermispora)、狭边金孢子菌(Chrysosporiuminops)、嗜角质金孢子菌、卢克诺文思金孢子菌(Chrysosporiumlucknowense)、粪状金孢子菌(Chrysosporiummerdarium)、租金孢子菌、女王杜香金孢子菌(Chrysosporiumqueenslandicum)、热带金孢子菌、褐薄金孢子菌(Chrysosporiumzonatum)、灰盖鬼伞(Coprinuscinereus)、毛革盖菌(Coriolushirsutus)、杆孢状镰孢、谷类镰孢、库威镰孢、大刀镰孢、禾谷镰孢、禾赤镰孢、异孢镰孢、合欢木镰孢、尖镰孢、多枝镰孢、粉红镰孢、接骨木镰孢、肤色镰孢、拟分枝孢镰孢、硫色镰孢、圆镰孢、拟丝孢镰孢、镶片镰孢、特异腐质霉、柔毛腐质霉、米黑毛霉、嗜热毁丝霉、粗糙链孢菌、产紫青霉、黄孢平革菌(Phanerochaetechrysosporium)、射脉菌(Phlebiaradiata)、刺芹侧耳(Pleurotuseryngii)、土生梭孢壳霉、长域毛栓菌(Trametesvillosa)、变色栓菌(Trametesversicolor)、哈茨木霉、康宁木霉、长枝木霉、里氏木霉、或绿色木霉细胞。

可以将真菌细胞通过涉及原生质体形成、原生质体转化、以及细胞壁再生的方法以本身已知的方式转化。用于转化曲霉属和木霉属宿主细胞的适合程序描述于EP238023、约尔顿(Yelton)等人，1984，美国国家科学院院刊(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)81:1470-1474以及克里斯滕森(Christensen)等人，1988，生物/技术(Bio/Technology)6:1419-1422中。用于转化镰孢属物种的适合方法由马拉迪尔(Malardier)等人，1989，基因(Gene)78:147-156和WO96/00787描述。可以使用由如以下文献描述的程序转化酵母：贝克尔(Becker)和瓜伦特(Guarente)，在阿贝尔森(Abelson)，J.N.和西蒙(Simon)，M.I.编，酵母遗传学与分子生物学指南，酶学方法(GuidetoYeastGeneticsandMolecularBiology,MethodsinEnzymology)，第194卷，第182-187页，学术出版社有限公司(AcademicPress,Inc.)，纽约；伊藤(Ito)等人，1983，细菌学杂志153:163；以及哈尼恩(Hinnen)等人，1978，美国国家科学院院刊75:1920。

产生方法

本发明还涉及产生本发明的多肽的方法，这些方法包括(a)在有益于产生该多肽的条件下培养一种细胞，该细胞以其野生型形式产生该多肽；并且可任选地(b)回收该多肽。在一个方面中，该细胞是指孢囊菌属细胞。在另一个方面中，该细胞是变孢指孢囊菌细胞。在一个方面中，该细胞是一个糖丝菌属细胞。在另一个方面中，该细胞是变孢糖丝菌(Saccharothrixvariisporea)细胞。在另一个方面中，该细胞是变孢糖丝菌ATCC31203或DSM43911。

本发明还涉及产生本发明的多肽的方法，这些方法包括(a)在有益于产生该多肽的条件下培养一种本发明的重组宿主细胞；并且可任选地(b)回收该多肽。

这些宿主细胞是在适合于使用本领域中已知的方法产生该多肽的一种营养培养基中培养的。例如，可以通过在适合的培养基中和在允许表达和/或分离该多肽的条件下，进行摇瓶培养，或者在实验室或工业发酵罐中进行小规模或大规模发酵(包括连续，分批，分批补料，或固态发酵)来培养细胞。该培养是使用本领域中已知的程序，在一种适合营养培养基中发生，该培养基包括碳和氮来源及无机盐。适合的培养基可从商业供应商获得或可以根据公开的组成(例如，在美国典型培养物保藏中心的目录中)制备。如果多肽分泌到该营养培养基中，那么可直接从培养基中直接回收多肽。如果多肽不分泌，那么其可从细胞裂解液中进行回收。

可以使用特异性针对蛋白酶的本领域已知的方法来检测该多肽。这些检测方法包括但不限于，特异性抗体的使用、酶产物的形成或酶底物的消失。例如，可以使用酶测定来确定该多肽的活性。

可以使用本领域已知的方法来回收多肽。例如，该多肽可以通过常规程序，包括但不限于，收集、离心、过滤、萃取、喷雾干燥、蒸发或沉淀，从该营养培养基回收。在一个方面中，回收包括该多肽的发酵液。

可以通过本领域中已知的多种程序来纯化该多肽以获得基本上纯的多肽，这些程序包括但不限于：色谱法(例如，离子交换色谱、亲和色谱、疏水作用色谱、色谱聚焦、以及尺寸排阻色谱)、电泳程序(例如，制备型等电点聚焦)、差别溶解度(例如，硫酸铵沉淀)、SDS-PAGE、或萃取(参见例如，蛋白质纯化(ProteinPurification)，詹森(Janson)和赖登(Ryden)编辑，VCH出版社(VCHPublishers)，纽约，1989)。

在一个替代性方面中，没有回收该多肽，而是将表达该多肽的本发明的宿主细胞用作该多肽的来源。

植物

本发明还涉及分离的植物，例如转基因植物、植物部分或植物细胞，这些植物包括本发明的多肽，从而表达并且产生可回收的量的多肽或结构域。多肽或结构域可从植物或植物部分回收。作为替代方案，包括该多肽或结构域的植物或植物部分可以按原样用于改善食品或饲料的质量，例如改善营养价值、可口性及流变学特性，或破坏抗营养因素。

转基因植物可以是双子叶的(双子叶植物)或单子叶的(单子叶植物)。单子叶植物的实例是草，如草甸草(蓝草，早熟禾属)；饲草，如羊茅属(Festuca)、黑麦草属(Lolium)；温带草，如翦股颖属(Agrostis)；以及谷类，例如小麦、燕麦、黑麦、大麦、稻、高粱、以及玉蜀黍(玉米)。

双子叶植物的实例是烟草、豆类(如羽扇豆(lupins)、马铃薯、糖甜菜(sugarbeet)、豌豆、豆(bean)和大豆(soybean))、以及十字花科植物(十字花科(familyBrassicaceae))(如花椰菜、油菜籽、以及紧密相关的模式生物拟南芥)。

植物部分的实例是茎、愈伤组织、叶、根、果实、种子、以及块茎、以及包括这些部分的独立组织，例如，表皮、叶肉、薄壁组织(parenchyme)、维管组织、分生组织。特定植物细胞区室，如叶绿体、质外体(apoplast)、线粒体、液泡、过氧化物酶体以及细胞质也被认为是植物部分。此外，任何植物细胞，无论是何种组织来源，都被认为是植物部分。同样地，植物部分，如分离以有助于本发明的利用的特定组织和细胞也被认为是植物部分，例如胚、胚乳、糊粉和种皮。

同样包括于本发明范围内的是此类植物、植物部分以及植物细胞的子代。

可以根据本领域已知方法构建表达该多肽或结构域的转基因植物或植物细胞。简而言之，通过将编码该多肽或结构域的一个或多个表达构建体结合到植物宿主基因组或叶绿体基因组中并且将所得改性植物或植物细胞繁殖成转基因的植物或植物细胞来构建植物或植物细胞。

表达构建体方便地是核酸构建体，它包括编码多肽或结构域的多核苷酸，该多核苷酸可操作地与选择的植物或植物部分中表达该多核苷酸所需的适当调节序列连接。而且，表达构建体可包含用于鉴别整合了此表达构建体的植物细胞的选择性标记，和将此构建体引入所讨论的植物所必需的DNA序列(后者取决于所用的引入DNA的方法)。

例如基于希望在何时、何处、和怎样表达该多肽或结构域来确定调节序列，例如启动子和终止子序列以及任选的信号序列或转运序列的选择。例如编码多肽或结构域的基因的表达可以是组成型的或诱导型的，或者可以是发育、阶段或组织特异性的，并且基因产物可以被靶向至特定组织或植物部分，例如种子或叶。调节序列由例如塔格(Tague)等人，1988，植物生理学(PlantPhysiology)86:506描述。

对于组成型表达，可以使用35S-CaMV、玉米泛素1、或稻肌动蛋白1启动子(弗兰克(Franck)等人，1980，细胞(Cell)21:285-294；克里斯滕森(Christensen)等人，1992，植物分子生物学(PlantMol.Biol.)18:675-689；张(Zhang)等人，1991，植物细胞(PlantCell)3:1155-1165)。器官特异性启动子可以是以下各项的启动子，例如来自贮藏库组织(例如种子、马铃薯块茎、和果实)(爱德华兹(Edwards)和科鲁兹(Coruzzi)，1990，遗传学年鉴(Ann.Rev.Genet.)24:275-303)，或来自代谢库组织(例如分生组织)(伊藤(Ito)等人，1994，植物分子生物学(PlantMol.Biol.)24:863-878)的启动子，种子特异性启动子，例如来自稻的谷蛋白、醇溶谷蛋白、球蛋白或白蛋白启动子(吴(Wu)等人，1998，植物与细胞生理学(PlantCellPhysiol.)39:885-889)，来自豆球蛋白B4的蚕豆启动子和来自蚕豆的未知种子蛋白基因(康拉德(Conrad)等人，1998，植物生理学杂志(J.PlantPhysiol.)152:708-711)，来自种子油体蛋白的启动子(陈(Chen)等人，1998，植物与细胞生理学(PlantCellPhysiol.)39:935-941)，来自欧洲油菜的贮藏蛋白napA启动子，或本领域已知的任何其他种子特异性启动子，例如，如在WO91/14772中所描述的。此外，启动子可以是叶特异性启动子，如来自稻或番茄的rbcs启动子(京冢(Kyozuka)等人，1993，植物生理学(PlantPhysiol.)102:991-1000)、小球藻病毒腺嘌呤甲基转移酶基因启动子(麦卓(Mitra)和希金斯(Higgins)，1994，植物分子生物学(PlantMol.Biol.)26:85-93)、来自稻的aldP基因启动子(加贺屋(Kagaya)等人，1995，分子遗传学与基因组学(Mol.Gen.Genet.)248:668-674)、或伤口诱导型启动子(如马铃薯pin2启动子)(许(Xu)等人，1993，植物分子生物学22:573-588)。同样地，启动子可以通过非生物处理来诱导，如温度、干旱、或盐度变化，或通过外源施加的激活该启动子的物质来诱导，例如乙醇、雌激素、植物激素(如乙烯、脱落酸和赤霉酸)、以及重金属。

还可使用启动子增强子元件，从而在植物中达到多肽或结构域的更高表达。例如，启动子增强子元件可以是位于启动子和编码多肽或结构域的多核苷酸序列之间的内含子。例如，许等人，1993，见上文，披露了使用稻肌动蛋白1基因的第一内含子以增强表达。

该选择性标记基因及该表达构建体的任何其他部分可以选自本领域中可用的那些。

可以根据本领域中已知的常规技术将核酸构建体结合到植物基因组中，这些常规技术包括土壤杆菌介导的转化、病毒介导的转化、微注射、粒子轰击、生物射弹转化、以及电穿孔(加塞尔(Gasser)等人，1990，科学(Science)244:1293；波特里库斯(Potrykus)，1990，生物/技术(Bio/Technology)8:535；岛本(Shimamoto)等人，1989，自然(Nature)338:274)。

目前根癌土壤杆菌介导的基因转移是一种用于产生转基因双子叶植物(关于综述，请参见霍伊卡(Hooykas)和施尔伯鲁特(Schilperoort)，1992，植物分子生物学(PlantMol.Biol.)19:15-38)并且用于转化单子叶植物的方法，但对于这些植物还常常使用其他的转化方法。用于产生转基因单子叶植物的方法是粒子(包衣有转化DNA的微观金或钨粒子)轰击胚愈伤组织或发育中的胚(克里斯托(Christou)，1992，植物杂志(PlantJ.)2:275-281；岛本(Shimamoto)，1994，生物技术当前述评(Curr.Opin.Biotechnol.)5:158-162；瓦西尔(Vasil)等人，1992，生物/技术(Bio/Technology)10:667-674)。用于转化单子叶植物的替代方法是基于原生质体转化，如由奥米儒勒(Omirulleh)等人，1993，植物分子生物学(PlantMol.Biol.)21:415-428所描述。另外的转化方法包括美国专利号6,395,966和7,151,204(两者都通过引用以其全文结合于此)中所描述的那些。

在转化后，根据本领域熟知的方法选出已并入了表达构建体的转化体，并使其再生成为完整植物。通常设计转化程序用于通过如下方法在再生期间或在后续世代中选择性消除选择基因：例如，使用带有两个独立的T-DNA构建体的共转化或利用特异性重组酶位点特异性地切除选择基因。

除用本发明的构建体直接转化特定植物基因型外，还可以通过使具有该构建体的植物与缺乏该构建体的第二植物进行杂交来产生转基因植物。例如，可以通过杂交将编码多肽或结构域的构建体引入特定植物品种中，无需总是直接地转化该给定品种的植物。因此，本发明不仅涵盖了从根据本发明已经转化的细胞直接再生的植物，而且还涵盖了这类植物的后代。如在此使用的，后代可以是指根据本发明制备的亲本植物的任何代的后代。此类后代可以包括根据本发明制备的DNA构建体。杂交导致通过供体植物系与起始系交叉授粉，将转基因引入植物系。此类步骤的非限制性实例描述于美国专利号7,151,204中。

植物可以通过回交转化方法生成。例如，植物包括被称为回交转化的基因型、种系、近交体、或杂交体的植物。

可以使用遗传标记以协助本发明的一种或多种转基因从一个遗传背景渗入到另一个。标记协助的选择提供了相对于常规育种的优势，在于其可以用于避免由表型变异导致的错误。另外，遗传标记可以在具体杂交的个别后代中提供有关良种种质相对程度的数据。例如，当具有所希望性状并且另外具有非农艺学所希望的遗传背景的植物与良种亲本杂交时，可以使用遗传标记来选择不仅具有感兴趣的性状，还具有相对较大比例所希望种质的后代。以此方式，使一种或多种性状渗入特定遗传背景所需的世代数得以最小化。

本发明还涉及产生本发明的多肽或结构域的方法，这些方法包括(a)在有益于产生该多肽或结构域的条件下培养转基因植物或植物细胞，该转基因植物或植物细胞包含编码该多肽或结构域的多核苷酸；并且(b)回收该多肽或结构域。

发酵液配制品或细胞组合物

本发明还涉及包括本发明的多肽的一种发酵液配制品或细胞组合物。发酵液产物进一步包含在发酵过程中使用的另外的成分，例如像，细胞(包括含有编码本发明的多肽的基因的宿主细胞，这些宿主细胞被用于产生感兴趣的多肽)、细胞碎片、生物质、发酵介质和/或发酵产物。在一些实施例中，该组合物是含有一种或多种有机酸、杀死的细胞和/或细胞碎片以及培养基的细胞杀灭的全培养液。

如在此使用的术语“发酵液”是指由细胞发酵产生、不经历或经历最低限的回收和/或纯化的制剂。例如，当微生物培养物生长至饱和，在碳限制条件下孵育以允许蛋白质合成(例如，由宿主细胞进行酶的表达)并且分泌到细胞培养基中时，产生发酵液。发酵液可以包含在发酵结束时得到的发酵材料的未分级的或分级的内容物。典型地，发酵液是未分级的并且包括用过的培养基以及例如通过离心去除微生物细胞(例如，丝状真菌细胞)之后存在的细胞碎片。在一些实施例中，发酵液包含用过的细胞培养基、胞外酶以及有活力的和/或无活力的微生物细胞。

在一个实施例中，该发酵液配制品和细胞组合物包括一种第一有机酸组分(包括至少一种1-5碳的有机酸和/或其盐)以及一种第二有机酸组分(包括至少一种6碳或更多碳的有机酸和/或其盐)。在一个具体实施例中，该第一有机酸组分是乙酸、甲酸、丙酸、其盐，或前述酸中的两种或更多种的混合物；并且该第二有机酸组分是苯甲酸、环己烷羧酸、4-甲基戊酸、苯乙酸、其盐，或前述酸中的两种或更多种的混合物。

在一个方面中，该组合物包含一种或多种有机酸，并且任选地进一步包含杀死的细胞和/或细胞碎片。在一个实施例中，从细胞杀灭的全培养液中去除这些杀死的细胞和/或细胞碎片，以提供不含这些组分的组合物。

这些发酵液配制品或细胞组合物可以进一步包含一种防腐剂和/或抗微生物(例如抑菌)剂，包括但不限于山梨醇、氯化钠、山梨酸钾、以及本领域中已知的其他试剂。

该细胞杀灭的全培养液或组合物可以包含在发酵终止时得到的发酵物质的未分级的内容物。典型地，该细胞杀灭的全培养液或组合物包含用过的培养基以及在微生物细胞(例如，丝状真菌细胞)生长至饱和、在碳限制条件下孵育以允许蛋白质合成之后存在的细胞碎片。在一些实施例中，细胞杀灭的全培养液或组合物含有用过的细胞培养基、胞外酶、和杀死的丝状真菌细胞。在一些实施例中，可以使用本领域已知方法来使细胞杀灭的全培养液或组合物中存在的微生物细胞透性化和/或裂解。

在此描述的全培养液或细胞组合物典型地是液体，但是可以含有不溶组分，例如杀死的细胞、细胞碎片、培养基组分、和/或一种或多种不溶性酶。在一些实施例中，可以除去不溶性组分以提供澄清的液体组合物。

可以通过WO90/15861或WO2010/096673所述的方法产生本发明的全培养液配制品和细胞组合物。

酶组合物

本发明还涉及包含本发明的一种多肽的组合物。优选地，这些组合物富含这种多肽。术语“富集”指示该组合物的蛋白酶活性已经增加，例如，以至少1.1的一个富集因子。

这些组合物可以包含本发明的多肽作为主要酶组分，例如单组分组合物。可替代地，这些组合物可以包括多种酶活性，如一种或多种(例如，若干种)选自下组的酶，该组由以下各项组成：水解酶、异构酶、连接酶、裂解酶、氧化还原酶、或转移酶，例如，α-半乳糖苷酶、α-葡糖苷酶、氨肽酶、淀粉酶、β-半乳糖苷酶、β-葡糖苷酶、β-木糖苷酶、糖酶、羧肽酶、过氧化氢酶、纤维二糖水解酶、纤维素酶、壳多糖酶、角质酶、环糊精葡萄糖基转移酶、脱氧核糖核酸酶、内切葡聚糖酶、酯酶、葡糖淀粉酶、转化酶、漆酶、脂肪酶、甘露糖苷酶、变聚糖酶、氧化酶、果胶分解酶、过氧化物酶、植酸酶、多酚氧化酶、蛋白水解酶、核糖核酸酶、转谷氨酰胺酶、或木聚糖酶。

这些组合物可根据本领域已知的方法制备并且可以是液体或干燥组合物的形式。可以根据本领域中已知的方法稳定这些组合物。

下文中给出本发明的组合物的优选用途的实例。可以基于本领域已知的方法来确定组合物的剂量和使用该组合物的其他条件。

用途

啤酒酿造的方法是本领域的普通技术人员熟知的。可以按照如下方式概述一种常规程序：

起始材料是发芽(即,使其潮湿或浸泡、萌发并且随后干燥)的大麦和/或未发芽的附属物，其称为谷粉。在打浆过程中，其中将该谷粉研磨并与水混合，加热和搅拌，通过在麦芽中天然存在的酶辅助降解包括碳水化合物的聚合物。

打浆之后，有必要从从这些固体(用过的谷物颗粒和附属物颗粒)分离液体提取物(麦芽汁)以得到一种澄清的麦芽汁。这种过程被描述为滤清。滤清之前，可以将醪液温度升高至约75℃-78℃(称为煮浆)。麦芽汁过滤是重要的，因为固体富含大量蛋白、变性不足的淀粉、脂类和脂肪酸、硅酸盐及多酚(鞣酸)以及蛋白。

收集第一麦芽汁后留在酒糟中的提取物通过在滤清饼(lautercake)的顶部添加热水也可以被洗出。这一过程被叫做喷洒(sparging)。热水流过酒糟并溶解剩余的提取物。稀释的麦芽汁被叫做第二麦芽汁，并且其提取物从第一麦芽汁的原始比重下降至1％-2％。添加啤酒花后，煮沸麦芽汁。由此，许多物质(包括若干蛋白质)变性并且将发生蛋白质-多酚络合物的沉淀。冷却并除去沉淀物后，为成品啤酒麦芽汁充气并添加酵母。典型地持续5-10天的主发酵后，除去大部分酵母并且将所谓的生啤(greenbeer)储存在低温度(典型地在0-5摄氏度)下1至12周。在此期间，剩余的酵母将与蛋白-多酚络合物以及其他不可溶物质一起沉淀或沉积。为了除去剩余的过量分散颗粒，进行过滤。现在可以在装瓶之前将发酵啤酒碳化。二氧化碳不仅有助于感观的“丰满(fullness)”或“大量(body)”，它也赋予“麻刺感(tingling)”和“新鲜”。而且，它充当一种增味剂并且充当具有发泡潜力的增强剂并且在延长产品的货架期中发挥重要作用。

不被理论所束缚，据信在低温下或长时间的储存的啤酒中蛋白和多酚之间的相互作用导致发展聚集物，这被称为混浊。由于混浊的形成影响啤酒的质量参数之一，即，胶体稳定性，已经开发了阻止此类混浊形成的方法。在酿造过程中，在啤酒成熟过程中通过冷却该液体来沉淀大部分的蛋白-多酚复合物。使用PVPP、硅胶、膨润土等去除任何剩余的多酚和/或蛋白。

另一种减少混浊形成的方法是通过使用蛋白酶。蛋白酶像木瓜蛋白酶被用来切割这些蛋白，可能产生更低和/或更多可溶性蛋白-多酚聚集物。然而，使用这些酶还影响泡沫形成和泡沫稳定所涉及的蛋白，进一步影响最终啤酒的质量。

诸位发明人发现在啤酒生产过程中使醪液和/或麦芽汁与本发明的一种或多种多肽接触导致改进的胶体稳定性和/或泡沫稳定性。诸位发明人还出人意料的发现在啤酒生产过程中将醪液和/或麦芽汁与本发明的一种或多种多肽接触导致改进的胶体稳定性而不显著影响泡沫稳定性。

待根据本发明使用的一种或多种多肽优选地是纯化的。如在此使用的术语“纯化的”涵盖酶蛋白制剂，其中该制剂已经富集了所讨论的酶蛋白。此类富集例如可以：除去产生酶蛋白的生物体的细胞，通过蛋白特异性沉淀或使用色谱程序去除非蛋白质材料，其中所讨论的酶蛋白被选择性地吸附并从一种色谱基质中洗脱。该一种或多种多肽可能已经纯化至这样的程度，使得仅有少量的其他蛋白质是存在的。表述“其他蛋白”特别涉及其他的酶。用于本发明的方法的一种或多种多肽可以是“基本上纯的”，即基本上不含其中产生该多肽的生物体的其他组分，该生物体可以是一种天然存在的微生物或一种经遗传修饰的用于重组产生该一种或多种多肽的宿主微生物。

然而，针对根据本发明的用途，该一种或多种多肽不必那么纯。它可以，例如，包括其他的酶。在一个优选的方面，用于本发明的方法中的一种或多种多肽已经被纯化以含有总蛋白的至少20％、优选至少30％、至少40％或至少50％(w/w)的一种或多种多肽。

在一个方面，该一种或多种多肽的接触是与一种醪液或麦芽汁或两者进行的。在另一个方面，该一种或多种多肽的接触是与该醪液或与该打浆水或与该谷粉进行的。在一个优选的方面中，与醪液的接触是在打浆过程中进行的。在一个方面中，与醪液的接触是在煮浆过程中进行的。在另一个方面中，该接触是在滤清过程中进行的。在一个方面中，该接触是在喷洒过程中进行的。在另一个方面中，该接触是与麦芽汁进行的。在一个方面中，该一种或多种多肽被添加到麦芽汁中。在一个方面中，该接触是在滤清后进行的。在另一个方面中，该接触是在滤清后但在麦芽汁煮沸之前进行的。在另一个方面中，该接触是在麦芽汁煮沸后但在发酵之前进行的。在另一个优选方面中，该接触是在发酵过程中进行的。

该接触是在取决于如下的温度下进行：该酶的最佳温度以及还有添加该酶的阶段。本领域技术人员将知道如何计算该酶的最佳温度。为了本发明的目的，该接触通常是在至少20℃的温度下进行的，例如，至少25℃、至少30℃、至少35℃、至少40℃、至少45℃、至少50℃、至少55℃，优选地如至少60℃，例如至少65℃，更优选地如至少70℃，并且最优选地如75℃-80℃。具体地，该接触是在约20℃-80℃范围内的温度下进行的，例如30℃-80℃，例如约40℃-80℃，优选地如约50℃-80℃。

在一个方面，该接触是在如下的一个时间段进行：在3分钟至5小时之间，例如在5分钟至5小时之间，优选在5分钟和4小时之间，更优选在5分钟至180分钟之间，例如在5分钟至120分钟之间，更优选在10分钟和120分钟之间并且最优选地在30分钟和90分钟之间。

用于接触的蛋白酶的量通常取决于不同的因素，例如但不限于蛋白酶的类型，蛋白酶的活性等。为了本发明的目的，所使用的蛋白酶的量通常将是大约0.01mg至约100mgEP(酶蛋白)每升的底物，优选约0.05至约50mgEP每升的底物，更优选约0.1至约40mgEP每升的底物。

具体地，所使用的酶的量通常将是大约0.16mg至约16mgEP每升的麦芽汁，优选地约0.8mg至约8mgEP每升的麦芽汁。

在一个方面，使用本发明的方法，该胶体稳定性相比于不存在一种或多种多肽的情况下酿造的啤酒增加了至少10％、例如至少15％、至少20％、至少25％、至少30％、至少35％、至少40％、至少45％、至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、例如至少80％、例如至少81％、例如至少82％、例如至少83％、例如至少84％、例如至少85％、例如至少86％、例如至少87％、例如至少88％、例如至少89％、例如为至少90％、例如至少91％、例如至少92％、例如至少93％、例如至少94％、例如至少95％、例如至少96％、例如至少97％、例如至少98％、例如至少99％、例如至少100％、例如至少101％、例如至少102％、例如至少103％、例如至少104％、例如至少105％、例如至少106％、例如至少107％、例如至少108％、例如至少109％、例如至少110％。在另一个方面，相比于不存在该一种或多种多肽的情况下酿造的啤酒，胶体稳定性增加范围是约10％-110％，例如约20％-110％、30％-110％、40％-110％，优选约50％-110％，更优选地范围是60％-110％，最优选范围是70％-110％，甚至最优选地范围是80％-110％。

可以通过使用如在实例中描述的一种方法确定胶体稳定性。

在一个方面，相比于不存在该一种或多种多肽的情况下酿造的啤酒，混浊减少至少5％，例如，至少10％、至少15％、至少20％、至少25％、至少30％、至少35％、至少40％、至少45％、至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、例如至少80％、例如至少81％、例如至少82％、例如至少83％、例如至少84％、例如至少85％、例如至少86％、例如至少87％、例如至少88％、例如至少89％、例如至少90％、例如在至少91％、例如至少92％、例如至少93％、例如至少94％、例如至少95％、例如至少96％、例如至少97％、例如至少98％、例如至少99％、例如至少100％。在另一个方面，相比于不存在该一种或多种多肽的情况下酿造的啤酒，混浊减小范围是约5％-100％，例如约10％-100％、30％-100％、40％-100％，优选约50％-100％，更优选地范围是60％-100％，最优选范围是70％-100％，甚至最优选地范围是80％-100％。

在另一个方面，相比于通过使用加工助剂加工的啤酒，本发明的方法导致混浊的减少。

为了在饮料中定量混浊的量，经常使用浊度计(也称为混浊度测量仪)。在浊度计中测量光的量，其相对于入射光束的方向在前述的角度是散射的。浊度测量非常合适用于测量形成的混浊(作为蛋白-多酚相互作用的结果)。可以例如通过使用如在实例中描述的一种方法来测量混浊。

在另一个方面，本发明的方法导致在酿造和储存过程中对加工助剂的使用降低以减少混浊形成。在一个方面，该降低是100％，这意味着没有使用加工助剂。

在另一个方面，啤酒是在未用二氧化硅稳定化并且优选地未用二氧化硅和PVPP稳定化的情况下产生的。在一个方面，使用本发明的方法，相比于不存在本发明的一种或多种多肽的情况下酿造的啤酒，泡沫稳定性是不受影响的。在一个方面，使用本发明的方法，相比于使用一种加工助剂加工的啤酒该泡沫稳定性不受影响。

在一个方面，相比于不存在本发明的一种或多种多肽的情况下酿造的啤酒，啤酒的泡沫稳定性是至少80％，例如81％、82％、83％、84％，像至少85％，例如，86％、87％、88％、89％，像至少90％，例如，90％、91％、92％、93％、94％，像至少95％，例如96％、97％、98％，像至少99％。在另一个方面，相比于不存在本发明的一种或多种多肽的情况下酿造的啤酒，啤酒的泡沫稳定性是在80％-99％范围内，例如，85％-99％、90％-99％、95％-99％。

在另一个方面，相比于不存在加工助剂的情况下酿造的啤酒，啤酒的泡沫稳定性是至少80％，例如81％、82％、83％、84％，像至少85％、例如，86％、87％、88％、89％，像至少90％，例如，90％、91％、92％、93％、94％，像至少95％，例如96％、97％、98％，像至少99％。在另一个方面，相比于不存在加工助剂的情况下酿造的啤酒，啤酒的泡沫稳定性是在80％-99％范围内，例如，85％-99％、90％-99％、95％-99％。

可以通过使用如在实例中描述的一种方法确定泡沫稳定性。

在一个方面中，本发明涉及本发明的一种或多种多肽在酿造，特别是啤酒酿造中的用途。在另一个方面中，本发明涉及在酿造，特别是啤酒酿造中使用本发明的一种或多种多肽的方法。在另一个方面中，本发明涉及使用本发明的一种或多种多肽的酿造方法。

通过以下实例进一步描述本发明，这些实例不应当解释为限制本发明的范围。

实例

实例1：

来自变孢指孢囊菌JCM3273的M5蛋白酶在枯草芽孢杆菌中的克隆和表达

变孢指孢囊菌(菌株JCM3273)近来已经被重归类为变孢糖丝菌(Saccharothrixvariisporea)(金姆(Kim)等人，国际系统与进化微生物学杂志(IntJSystEvolMicrobiol.)；2011年2月；61(Pt2):310-4)。

M5蛋白酶基因来源于菌株号JCM3273(日本微生物保藏中心(JapanCollectionofMicroorganisms))。

一种基于来自变孢指孢囊菌的M5蛋白酶的蛋白质序列的合成基因被设计为具有SEQIDNO:3的序列。(SEQIDNO:3编码具有信号肽、原肽、和成熟蛋白酶肽的全长蛋白酶)。

如在WO99/43835描述的，该天然信号肽是通过将该合成基因融合至编码来自克劳氏芽孢杆菌(Bacillusclausii)的碱性蛋白酶(aprH)的信号肽的DNA进行替换。在转化时将所得基因通过同源重组整合至枯草芽孢杆菌宿主细胞基因组中。

该枯草芽孢杆菌表达宿主通过在其染色体上的基因插入或基因缺失而缺乏以下基因产物：SpoIIAC-、BioI-、NprE-、AprE-、AmyE-、SrfAC-。在三联启动子系统的控制下表达该基因构建体(如描述于WO99/43835中)。将编码氯霉素乙酰转移酶的基因用作标记物(如描述于狄代丽柯森(Diderichsen)等人，1993，质粒(Plasmid)30:312-315中)。

选择一种表达克隆并且将其在500mL带挡板的锥形瓶(Erlenmeyerflask)中的旋转摇床上培养，每个锥形瓶包含补充有34mg/l氯霉素的100ml基于酪蛋白的培养基。将该克隆在37℃培养3天并且通过SDS-PAGE分析测定成功的表达。

实例2：

M5蛋白酶的表征和纯化

1)ProtazymeAK测定：

底物：ProtazymeAK片剂(交联和染色的酪蛋白；来自麦格酶公司(Megazyme))

温度：受控的(测定温度)。

测定缓冲液：100mM琥珀酸，100mMHEPES，100mMCHES，100mMCABS，1mMCaCl2，150mMKCl，0.01％TritonX-100，用HCl或NaOH调节至pH值2.0、3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0、10.0、及11.0。

通过温和搅拌，将ProtazymeAK片剂悬浮于2.0ml0.01％TritonX-100中。将500μl的这种悬浮液和500μl的测定缓冲液分散在艾本德管中并置于冰上。添加20μl蛋白酶样品(稀释在0.01％TritonX-100中)。通过将艾本德管转移至设定为测定温度的艾本德恒温混匀仪(Eppendorfthermomixer)来启动测定。将管在艾本德恒温混匀仪上在最高振摇速率(1400rpm)下孵育30分钟。通过转移该管返回至冰浴停止孵育。随后将管在冰冷的离心机中离心数分钟并将200μl上清液转移至微量滴定板。读取OD650作为蛋白酶活性的度量。在测定法中包含空白缓冲液(bufferblind)(代替酶)。

来自变孢指孢囊菌的M5蛋白酶的纯化

将来自实例1的培养上清液离心(26000xg，20min)并且将上清液小心地与沉淀物倾析分开。上清液通过耐洁(Nalgene)0.2μm过滤装置过滤以便除去剩余芽孢杆菌宿主细胞。将0.2μm滤液转移至G25塞法戴克斯(sephadex)柱(来自GE医疗公司(GEHealthcare))上的100mMH3BO3，10mMMES，2mMCaCl2，pH6。将经G25塞法戴克斯转移的酶施加至在100mMH3BO3，10mMMES，2mMCaCl2，pH6中平衡的杆菌肽琼脂糖柱(来自Upfront色谱公司(Upfrontchromatography))上。在用平衡缓冲液充分地洗涤该柱之后，将M5蛋白酶用具有25％(v/v)2-丙醇的100mMH3BO3，10mMMES，2mMCaCl2，1MNaCl，pH6洗脱。在G25塞法戴克斯柱上将洗脱峰转移到50mMH3BO3，5mMMES，1mMCaCl2，pH8.5。将经G25塞法戴克斯转移的杆菌肽峰值施加到在50mMH3BO3，5mMMES，1mMCaCl2，pH8.5中平衡的SOURCE30Q柱(来自GE医疗公司)。在将柱用平衡缓冲液洗涤之后，将M5蛋白酶以在相同缓冲液中的线性NaCl梯度(0-->0.5M)经五个柱体积进行洗脱。将来自该柱的级分针对蛋白酶活性进行分析(使用在pH7下的ProtazymeAK测定法)，并且合并峰级分。用20％CH3COOH将该合并物的pH调节至6.0。经pH调节的合并物是纯化的制剂并且用于进一步表征。当通过SDS-PAGE分析该纯化的制剂时，考马斯染色的凝胶显示一个单一的带。

来自变孢指孢囊菌的M5蛋白酶的表征

将ProtazymeAK测定法用于获得pH-活性曲线和pH-稳定性曲线(在指示的pH值下2小时之后的残余活性)。对于pH-稳定性曲线，将蛋白酶在不同测定缓冲液中稀释7x以达到这些缓冲液的pH值并且然后在37℃下孵育2小时。在孵育之后，通过稀释于pH7.0测定缓冲液中，将蛋白酶孵育物的pH调节至相同的pH值。在pH7.0下，测量相对于样品的残余活性，将其在稳定条件(5℃，pH7.0)下保持。使用ProtazymeAK测定法以获得在pH7.0下的温度-活性曲线。结果示于表1-3中。

表1：在37℃下的pH-活性曲线

注释：活性是相对于酶的最佳pH而言。

表2：pH-稳定性曲线(在37℃下2小时之后的残余活性)

注释：活性是相对于样品的残余活性，将该样品保持在稳定条件(5℃，pH7.0)下。

表3：在pH7.0处的温度活性曲线

注释：活性是相对于酶的最佳温度而言。

来自变孢指孢囊菌的M5蛋白酶的其他实验室测定表明它被1,10-菲咯啉和EDTA抑制。

通过埃德曼(EDMAN)降解的N-末端测序揭示其是ATACATG。

如通过SDS-PAGE所确定的相对分子量为约Mr＝37kDa，并且通过完整的分子量分析确定的分子量是36658.5Da。

成熟序列(来自MS数据、埃德曼降解数据和DNA测序)示于SEQIDNo:1。

来自这一成熟序列的计算的分子量是36658.4Da。

实例3：

M5蛋白酶在麦芽汁混浊减少中的作用

在这个实例中使用SeqIDNo:1的M5蛋白酶。

标准麦芽汁制备：向打浆烧杯里添加50.0g研磨的麦芽(0.2mm)，连同200mlH₂O(50℃)和3.0mlCaCl₂溶液(11.0gCaCl₂·2H₂O/500mlH₂O)。使用以下打浆曲线：50℃持续20分钟、63℃持续30分钟、72℃持续20分钟、78℃持续15分钟，冷却至20℃(1℃加热/分钟)。

打浆之后，加入另外的水至300g并且通过沃特曼(Whatman)过滤器5971/2将麦芽汁过滤。在此之后将麦芽汁的一个等分部分调节至pH6.0或pH7.0、预加热至60℃并且与对应于3.2和15mgEP(酶蛋白)/升麦芽汁的量的M5蛋白酶在60℃孵育1小时。将对照也在60℃下保持1小时(pH6.0或7.0)，不经酶处理。

该酶处理后，将麦芽汁持续煮沸15分钟并且此后冷却至15℃。

通过根据西伯特(Siebert)1997(美国酿造化学协会杂志(J.Am.Soc.Brew.Chem.)55(2):73-78,1997)公开的方法修改的方法来测量麦芽汁中混浊。

简言之，将25mL麦芽汁转移到一个25mL混浊测量仪室，添加15mL乙酸盐缓冲液pH4.5、以300rpm搅拌1分钟并且测量EBC混浊单位(零值)。将混浊测量仪室放置在多点搅拌器(300RPM)中并且添加0.47mLx2BrewtanC溶液(200mg鞣酸/1L)至该麦芽汁溶液中。孵育40分钟之后在2100AN浊度计上测量混浊EBC值。然后将在40分钟之后的测量值减去背景值以给出麦芽汁中形成混浊的潜力的度量。表4中给出结果。

表4：麦芽汁的混浊测量结果

从以上的表格中，显然，分别在60℃pH6.0和7.0下与未经处理的对照相比，M5蛋白酶可以减少高达42％麦芽汁混浊。

对于上面的条件，M5蛋白酶的蛋白降解模式证实无蛋白Z、LTP1或BDAI-1降解，表明对重要泡沫蛋白没有损害。此外、SDS-PAGE结果还表明被认为包含泡沫活性蛋白的低分子量(LMW)区域(10-15kDa)没有降解。

实例4：

M5蛋白酶处理的麦芽汁的实验室发酵试验

如实例3中所述产生一种标准麦芽汁。

加热麦芽汁至60℃的孵育温度之前将麦芽汁-pH调节至6.0。添加M5蛋白酶至达到浓度3.2mgEP/升的麦芽汁并且孵育1h。然后将麦芽汁样品冷却至20℃并且使用乳酸将麦芽汁pH调节至5.3。煮沸之前，添加啤酒花到麦芽汁中持续40分钟以在啤酒中达到计算的15EBC苦味单元的苦味。

离心煮沸的麦芽汁以去除热凝固物。将增殖的酵母添加到麦芽汁中以便麦芽汁达到2x10⁷细胞/mL的浓度。于1L的带有松散连接的盖子的派热克斯(Pyrex)瓶中在12℃发酵7天。到第5天，将该发酵培养液在145rpm下于定轨摇床上振荡。从第5天至第7天，速度降低至120rpm。在发酵之后将这些样品储存在冰上5天。

如实例3中所述在啤酒中进行混浊测量。

使用以下程序来确定啤酒中的泡沫稳定性：

在第一步骤中，通过将混浊的样品由沃特曼597^1/2纸滤器过滤到脱脂的玻璃器皿中除去酵母和剩余粗沉淀。将250mL滤液的等分部分转移到清洁的和脱脂的瓶(0.5L)并且回火至20.0℃。通过在恒定CO₂-压力与温度下间歇的振荡和静止将该啤酒碳酸化至5.75gCO₂/L。使用能够纠正温度偏差的标准NIBEM-T泡沫分析器(滨特尔-诺芮特哈夫曼斯(Pentair-NoritHaffmans)，芬洛(Venlo)，NL)来确定泡沫稳定性。简言之，通过特殊泡沫闪光装置将一个体积的啤酒发泡于一个标准化玻璃烧杯中。基于电导率测量，随着玻璃杯中泡沫塌陷，将玻璃杯转移到含有可移动式电极系统的一个测量单元中。该仪器记录泡沫塌陷的时间对距离。随着时间[ins]推移给出泡沫稳定性直至泡沫在垂直距离上塌陷30mm(NIBEM30-值)。

表5：用M5蛋白酶处理麦芽汁对啤酒混浊和啤酒泡沫稳定性的影响

实例5：

在发酵中添加M5蛋白酶的0.5L实验室发酵

如实例3中所述产生一种标准麦芽汁。

将麦芽汁样品随后冷却至20℃并且使用乳酸将麦芽汁pH调节至5.3。在煮沸40分钟之前添加啤酒花到该麦芽汁以达到在啤酒中计算的15EBC苦味单元的苦味。离心煮沸的麦芽汁以去除热凝固物。添加M5蛋白酶连同以3.2mgEP/升麦芽汁的浓度投入酵母。

将增殖的酵母添加到麦芽汁中以便麦芽汁达到2x10⁷细胞/mL的浓度。于1L的带有松散连接的盖子的派热克斯(Pyrex)瓶中在12℃发酵7天。到第5天，将该发酵培养液在145rpm下于定轨摇床上振荡。从第5天至第7天，速度降低至120rpm。在发酵之后将这些样品储存在冰上5天。

如实例3中所述在啤酒中进行混浊测量。

使用以下程序来确定啤酒中的泡沫稳定性：

在第一步骤中，通过将混浊的样品由沃特曼5971/2纸滤器过滤到脱脂的玻璃器皿中除去酵母和剩余粗沉淀。将250mL滤液的等分部分转移到清洁的和脱脂的瓶(0.5L)并且回火至20.0℃。通过在恒定CO₂-压力与温度下间歇的振荡和静止将该啤酒碳酸化至5.75gCO₂/L。使用能够纠正温度偏差的标准NIBEM-T泡沫分析器(滨特尔-诺芮特哈夫曼斯(Pentair-NoritHaffmans)，芬洛(Venlo)，NL)来确定泡沫稳定性。简言之，通过特殊泡沫闪光装置将一个体积的啤酒发泡于一个标准化玻璃烧杯中。基于电导率测量，随着玻璃杯中泡沫塌陷，将玻璃杯转移到含有可移动式电极系统的一个测量单元中。该仪器记录泡沫塌陷的时间对距离。随着时间[ins]推移给出泡沫稳定性直至泡沫在垂直距离上塌陷30mm(NIBEM30-值)。

表6：在发酵中添加的M5蛋白酶对啤酒混浊和啤酒泡沫稳定性的影响

实例6：

就混浊减少测试M5蛋白酶变体

通过定点诱变构建变体

定点变体是构建自M5蛋白酶(SEQIDNO:1)，包括根据本发明的特定的取代。这些变体是通过传统的克隆DNA片段制得(萨拉布鲁克(Sambrook)等人，分子克隆：实验室手册(MolecularCloning:ALaboratoryManual)，第2版，冷泉港，1989)，使用PCR连同正确地设计的诱变寡核苷酸，这些寡核苷酸在所得序列中引入了所希望的突变。

对应于希望的一个或多个突变位点侧翼的DNA序列合成诱变的寡核苷酸，其由限定插入/缺失/取代的DNA碱基对分离。以此方式，构建并产生下表7中所列的变体。

为了测试本发明的M5蛋白酶变体，将包含本发明的变体的突变DNA转化到一个感受态枯草芽胞杆菌菌株并使用标准方案发酵(PS-1培养基，3-4天，37℃)。

表7：M5的变体

混浊减少实验

在混浊减少实验中测试上述提及的M5蛋白酶变体。

将标准麦芽(与实例3相同的)用于实验1。对于实验2和实验3，打浆中包括25％小麦(w/w)。

对于该小麦内含物，使用以下打浆曲线：54℃持续20分钟，64℃持续60分钟，72℃持续20分钟，以及80℃持续5分钟。在该打浆开始时根据供应商的推荐添加PlusMG和Max。

M5蛋白酶变体的孵育条件：pH5.3，温度60℃，30分钟，并且酶剂量3.2mgEP/l。

结果示于表8中。

表8示出了所有测试的M5蛋白酶变体(24个)具有麦芽汁混浊减少能力。

表8：混浊减少实验

Claims (15)

1.一种具有蛋白酶活性的多肽，该多肽选自下组，该组由以下各项组成：

(a)一种多肽，该多肽与SEQIDNO:1的多肽具有至少60％序列一致性；

(b)由一种多核苷酸编码的一种多肽，该多核苷酸在低严格条件下与SEQIDNO:2的成熟多肽编码序列杂交；

(c)一种多肽，该多肽由与SEQIDNO:2的多肽编码序列具有至少60％序列一致性的多核苷酸编码；

(d)SEQIDNO:1的多肽的一种变体，该变体在一个或多个位置处包括取代、缺失和/或插入；和

(e)(a)、(b)、(c)或(d)的多肽的一个片段，该片段具有蛋白酶活性。

2.如权利要求1所述的多肽，该多肽与SEQIDNO:1的多肽具有至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％的序列一致性。

3.一种包括如权利要求1-2中任一项所述的多肽的组合物。

4.一种分离的多核苷酸，该多核苷酸编码如权利要求1-2中任一项所述的多肽。

5.一种核酸构建体或表达载体，该核酸构建体或表达载体包括如权利要求4所述的多核苷酸，该多核苷酸可操作地连接至指导该多肽在一个表达宿主内产生的一个或多个控制序列。

6.一种重组宿主细胞，该重组宿主细胞包括如权利要求4所述的多核苷酸，该多核苷酸可操作地连接至指导该多肽产生的一个或多个控制序列。

7.一种产生如权利要求1-2中任一项所述的多肽的方法，该方法包括：在有益于产生该多肽的条件下培养一种细胞，该细胞以其野生型形式产生该多肽。

8.一种改进啤酒中胶体稳定性的方法，该方法包括在啤酒生产过程中向醪液和/或麦芽汁中添加如权利要求1-2所述的多肽。

9.根据权利要求8所述的方法，其中接触是从5分钟至120分钟进行的。

10.根据权利要求8所述的方法，其中在打浆过程中添加该多肽。

11.根据权利要求8所述的方法，其中在滤清过程中添加该多肽。

12.根据权利要求8所述的方法，其中在喷洒过程中添加该多肽。

13.根据权利要求8所述的方法，其中在滤清后但在麦芽汁煮沸前添加该多肽。

14.根据权利要求8所述的方法，其中在发酵过程中添加该多肽。

15.如权利要求1-2所述的多肽在啤酒酿造中的用途。