CN105358689A - 细胞内表型筛选 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及用于鉴定涉及细胞表型的细胞靶标的方法，所述方法包括鉴定能修饰细胞表型的胞内抗体，以及鉴定胞内抗体直接或间接的细胞靶标。本发明还涉及胞内抗体3H2-1、3H2-VH和5H4，其能抑制由过敏性刺激引发的肥大细胞中的脱颗粒反应，并且本发明具体涉及胞内抗体3H2-1和5H4，其能够直接或间接地分别靶向ABCF1家族蛋白和C12ORF4家族蛋白。本发明还涉及ABCF1和C12ORF4抑制剂用于治疗中的用途，尤其是用于治疗过敏和/或炎症反应。
Description
本发明涉及用于鉴定涉及细胞表型的细胞靶标的方法，包括鉴定能修饰细胞表型的胞内抗体和鉴定胞内抗体的直接或间接的细胞靶标。本发明还涉及能抑制由过敏性刺激引发的肥大细胞上的脱颗粒反应的胞内抗体，尤其是涉及胞内抗体3H2-1、3H2-VH和5H4，并且具体涉及胞内抗体3H2-1和5H4，其能够直接或间接地分别靶向ABCF1家族的蛋白和C12ORF4家族的蛋白。本发明还涉及ABCF1和C12ORF4抑制剂，其用于治疗中的用途，尤其是用于治疗过敏和/或炎症状况。
对与给定表型有关的细胞靶标的鉴定是更好地理解该表型潜在的细胞机制的基本前提。具体而言，鉴定与医疗状况有关的细胞靶标是制药工业的巨大兴趣所在，因为其使得能够设计新的治疗，所述治疗对这些靶标有效果，并能用于治疗或诊断医疗状况。细胞表型可能经常与给定的病理学有关。因此，能够允许对修饰细胞表型的分子进行鉴定的测定(表型筛选)能对药物设计有巨大帮助。对与给定表型有关的新细胞靶标的鉴定对其他行业也是重要的，例如在化妆品中或在植物和食品工业中。
理解已知或未知的细胞分子在给定表型中起的作用并不是件容易的事，这尤其是因为细胞途径是高度复杂的并且因为许多细胞内分子在若干不同的细胞途径中起作用。因此，使靶蛋白失活(例如通过RNA干扰)能对一些细胞途径具有调节作用并且因此产生一些伴随的表型效应，所述表型效应可能彼此难以区分。此外，许多细胞蛋白能呈现不同的构象和/或可以包含翻译后修饰如磷酸化的氨基酸，并且因此可以与或不与另一个分子相互作用，作为它们的构象的功能或翻译后修饰的功能。因此，能够允许对那些造成给定表型的细胞靶标进行筛选，并且甚至对呈特定构象和/或经修饰的或未经修饰的状态的靶标进行筛选而不使这些细胞靶标完全失活的技术，对于更好地理解一些细胞途径是具有极高价值的工具。
抗体可被视为精密工具，因为它们对它们的靶标是高度特异性的，并且能针对蛋白的几乎任何部分产生，并且尤其是针对较大的平面区域(蛋白相互作用常在此处发生，并且其更难用小有机分子或肽靶向)产生。然而，天然抗体不适应于细胞内环境，因为它们的尺寸大并且因为细胞质的还原环境阻止了二硫桥的形成，并因此阻止了抗体的适当折叠。已经开发了重组抗体，其中包括scFv、双抗体和sdAb，用于细胞内环境中的表达。将它们称为“细胞内抗体”或“胞内抗体”。
发明人的团队近期所描述的一个应用，是将根据其对靶抗体(或“Ab”)的调节效果预先选出的胞内抗体用于筛选小分子文库的用途(欧洲专利EP1743178B1)。其目的在于分离出能模拟感兴趣的scFv的细胞内作用并且可以体内使用的候选药物。发明人将Ab的这种ELISA置换应用在过敏模型中。同一团队此前的工作已分离出了针对酪氨酸激酶Syk的SH2结构域的scFv，所述结构域与肥大细胞激活的早期阶段有关。已经显示，这种scFv在肥大细胞系中的细胞内表达抑制了由IgE受体激活所诱导的过敏递质(mediator)的释放，而不干扰Syk的激酶活性(Dauvillier等，2002)。开发出了Ab置换测定(Abdisplacementassay)来分离抗-SykscFv的分子模拟物。以这个方式，对3000种分子的化学文库进行筛选，结果鉴定出了一种分子，指定为C-13。这种分子具有高抗过敏潜能，因为进一步的研究证明了其在小鼠中体外抑制肥大细胞激活的能力以及体内抑制过敏性休克的能力(Mazuc等，2008)。通过结构分析和定向诱变还鉴定出了C-13与Syk相互作用的位点。在Syk的两个SH2结构域之间的界面处鉴定出的腔(cavity)被用于对500000种分子的文库进行计算机中的(insilico)第二次筛选。以这种方式，按照其抑制过敏递质释放的能力选出了85种非酶的Syk抑制剂(Villoutreix等，2011)。
Inoue等(2011)描述了用随机化的细胞内骆驼科动物VHH文库进行的功能缺失筛选。作者认为常规VH结构域在细胞内环境中是不可溶的。在相应的日本专利申请JP2008-136455中，Inoue等的作者也认为scFvs在细胞内功能缺失筛选的背景下是无用的，因为其细胞内稳定性和功能性低。
发明人开发出了基于使用细胞内抗体(或“胞内抗体”)的新的表型筛选技术，用于鉴定能对细胞途径起作用并调节感兴趣的表型的细胞靶标。本工作描述了首例用细胞内人抗体片段在哺乳动物细胞中进行的表型选择。
发明人开发出的新方法允许鉴定与给定表型有关的细胞内靶标，并且尤其是未知的细胞内靶标或已知的此前未与给定表型联系在一起的靶标。发明人使用这项技术鉴定出两种RBL-2H3细胞克隆，称为3H2和5H4，其分别表达抗体片段3H2-1和3H2-VH，以及5H4。当在肥大细胞中表达时，这些抗体片段抑制脱颗粒反应，所述脱颗粒反应通常由过敏挑战而引发。发明人还鉴定出了两种蛋白，ABCF1和LOC297607，它们分别能与3H2-1和5H4一起沉淀。发明人证明了LOC297607涉及肥大细胞脱颗粒，对于LOC297607现有技术中没有记载已知的功能。
用于在蛋白质组规模实现表型筛选的细胞内Ab的选择提供了诸多优势。确实，当在细胞中表达时，它们能干扰蛋白功能并进而产生给定的表型。此外，伴随着它们的高亲和性和特异性特性，它们潜在地能够靶向细胞中的任何分子，尤其是蛋白，以及更精确地说靶向一些亚结构域或转录后修饰(其可能涉及具体的信号传导)。在疾病模型的背景下，细胞内抗体提供的另一个优点是，当它们的靶标被鉴定出来时，它们便能用于指导药物开发。
更具体而言，高多样性的且针对细胞内表达进行优化后的组合的(combinatory)scFv文库的使用，使发明人能进行大规模表型筛选。将这种筛选应用于肥大细胞激活的模型，它们在这个信号传导途径中鉴定出了新的分子参与者(molecularplayer)。
这个方法最初是用允许scFv文库在肥大细胞系中表达的质粒系统开发出来的。为了尽可能保持文库的初始多样性，选出了施行多拷贝表达模式的转染条件。进行了表型选择，其导致呈现感兴趣的表型且表达scFv的细胞富集，所述scFv抑制所研究的信号传导途径。两种具体抗体(Ab)片段3H2-1和5H4在肥大细胞系RBL-2H3中的表达，强烈抑制了细胞释放过敏递质的能力。在产生它们以后，将这些抗体体外使用，以通过免疫沉淀实验与质谱法联用来鉴定它们的蛋白靶标。蛋白ABCF1和LOC297607从而分别被鉴定为3H2-1和5H4的靶标。
LOC297607(或“LOC”)是此前功能未知的蛋白，其似乎涉及经过FcεRI的肥大细胞激活。的确，用shRNA的实验的初步结果提示其干预对受体激活后的早期事件以及对过敏递质释放的稍后事件的调控。在肥大细胞中通过评估干预由FcεRI介导的信号转导的蛋白的活性等来更精确地鉴定蛋白LOC的分子配偶体(partner)会是有趣的。
此外，一些基因组数据提示蛋白LOC和炎症之间的联系。一项用染色体定位作图技术的研究通过在猪中的杂交辐射显示了LOC的染色体基因座可能与炎症有关，并且更具体与特定形式的关节炎有关(Genini等，2006)。在Genebank中分析这个染色体基因座时，发明人发现LOC基因与编码蛋白酪氨酸磷酸酶PTPN6的基因共定位。此外，这种染色体共定位在大鼠、小鼠和人之间是保守的。这个信息说明，这些蛋白可能涉及相同的信号传导网络。的确，鉴定蛋白-蛋白相互作用的新方法是基于在不同物种间比较关联蛋白序列之间的染色体距离(Pazos和Valencia，2001)。
为了将这种表型筛选方法最大化并扩大其范围，发明人采用逆转录病毒系统对其进行调整使之适应于scFv文库的细胞内表达。与此前的质粒系统相比，这种表达模式使得能够对更广泛的全部细胞类型进行转染，并提供稳定表达，这使得能在更长的时期进行表型研究。
在质粒选择期间，每个细胞表达了2000-2500个scFv的拷贝，这使得在处理相对小数量的细胞时能对多样性广泛的scFv进行探索。然而，每个细胞表达如此多scFv的事实，施予了它们每一个之间在细胞内作用方面的强烈竞争，并因此可能维持高背景噪声。就这一点而言，每个细胞不超过3个拷贝的逆转录病毒文库表达，具有降低选择压力的优点。这些条件也使筛选能在更为生理学的条件中进行，在所述生理学的条件中蛋白网络的完整性不被过表达破坏。
高通量测序分析揭示，在逆转录病毒选择期间的每两轮中包含再克隆步骤，使得scFv更好地富集。来自同一个选择(selection)且经过独立分析的细胞克隆显示出对β-己糖胺酶脱颗粒作用的显著抑制，这说明该选择有效地允许抑制性的scFv富集。
最后，使得对三个选择能够互相进行比较的主要数据，是在细胞刺激后膜联蛋白V标记的表型的演变(evolution)(图26)。发明人发现包括了逆转录病毒再克隆步骤的选择使其朝着最明显的抑制性表型收敛，因为其几乎被被完全消除(92％抑制)。一个假说是，在有再克隆的情况下，被选出的细胞群会在同时具有良好增殖和抑制性表型的克隆中富集。这种假说能解释两个逆转录病毒选择之间在朝着抑制性表型的收敛上的差异。
本发明已证明了基于scFv的文库能成功地用于表型的细胞内筛选。通过使用scFvs的高多样性文库，基于具有细胞内稳定性的恒定框架，发明人成功发现并鉴定了针对给定表型的未知的细胞内靶标，所述表型例如肥大细胞脱颗粒。
发明人还发现，截短的scFv，包括胞内抗体3H2-VH、5H4-VH在细胞内环境中可以是稳定且功能性的。具体而言，发现限定为完整VH结构域的胞内抗体5H4-VH在所述细胞内环境中是稳定的，并且成功地抑制了肥大细胞脱颗粒。
本发明第一个方面是用于鉴定涉及细胞表型的细胞靶标的方法，该方法包括：
a)鉴定胞内抗体，当其存在于细胞内时其能诱导、修饰或抑制所述表型；
b)鉴定细胞靶标，其是所述细胞中所述胞内抗体的直接或间接靶标；并任选地
c)分离所述细胞靶标。
优选的胞内抗体包含免疫球蛋白的完整VH和/或VL结构域。
抗体是识别蛋白，其能特异性地结合抗原上的独特表位。抗体的抗原结合位点称为互补位。抗体属于免疫球蛋白(Ig)类的蛋白。免疫球蛋白是一种蛋白家族，该家族的蛋白的共同之处在于都有特异性的结构域，称为“Ig-折叠”。最多的天然存在的抗体(或常规抗体)是约150kDa的球蛋白，其包含两条轻链(L)和两条重链(H)通过二硫键连结在一起。以没有轻链为特征的非常规的抗体在骆驼科动物(camelid)和非软骨鱼类(如鲨鱼)中发现。轻链和重链包含恒定区(分别是CL和CH)和可变区(分别是VL和VH)。在哺乳动物中有5类Ig重链(α、δ、ε、γ、μ)，其长度为约450–550个氨基酸，以及2类Ig轻链(κ、λ)，其长度为约210-220个氨基酸。Ig链由称为“Ig域”的结构域组成。α、δ和γ重链由一个可变结构域、三个恒定结构域和一个增加柔性的铰链区组成。ε和μ重链由一个可变结构域和四个恒定结构域组成。κ和λ轻链由一个可变结构域和一个恒定结构域组成。Ig结构域通常具有约110个氨基酸。每个可变结构域包含高变区或环，其负责表位结合，并被称为互补决定区(CDR)，而CDRs之间的低变区称为框架区。完整哺乳动物VH和VL结构域包含3个CDR，称为CDR1、CDR2、和CDR3，以及4个框架区，称为FR1、FR2、FR3和FR4。相比之下，截短的VH和VL结构域缺少CDR中的至少一个或框架区中的至少一个，例如通过在核苷酸序列内出现终止密码子而编码所述截短的VH和VL结构域。类似地，截短的scFv缺少VH和/或VL结构域的CDR中的至少一个或框架区中的至少一个。截短的scFv可能由单个的完整VH或VL结构域组成。重链CDR3是与抗原相互作用的主要贡献者。所有Ig结构域都具有特有的紧凑球状结构，称为“Ig-折叠”。Ig-折叠的结构是技术人员所熟知的。简言之，其由以希腊钥匙拓扑结构排成两个β-片层的7-9个反向平行β-链的两层夹心组成。其主干在两个β-片层之间反复交替。典型地，其模式为(片层1中的N-末端β-发夹)-(片层2中的β-发夹)-(片层1中的β-链)-(片层2中C-末端β-发夹)。两个β-片层也是通过二硫桥互相连接的。CDR区形成环，其被保持于夹心结构的外部。
常规抗体由木瓜蛋白酶消化产生三个片段：两个Fab片段(抗原结合片段)和一个Fc片段(可结晶片段)。Fab片段是一种结合到抗原的抗体区域。它约为50kDa且由每条重链和轻链的一个恒定和一个可变结构域组成。两个可变结构域(VL和VH)塑造形成了抗原结合位点(互补位)。Fc区是抗体的尾部区域，其与细胞表面受体(Fc受体)相互作用。常规抗体由胃蛋白酶消化产生两个片段：F(ab’)2片段(抗原结合片段)和pFc’片段。F(ab’)2片段包含两个抗原结合位点并可通过温和的还原反应分裂为两个Fab’片段。重链和轻链可变区可以融合到一起形成单链可变片段(scFv)，其保留了Fab片段的特异性而仅有其一半的大小(约25kDa)。scFv的VL和VH结构域通常通过约15个氨基酸的短肽接头互相连接。所述接头通常富含甘氨酸以具有柔性，以及富含丝氨酸或苏氨酸以具有溶解性。能通过将两个或三个scFvs连接在一起从而设计出二价或三价的scFv。二价scFvs(双抗体的一种形式)是为人所感兴趣的，因为它们对于它们的靶标具有非常高的亲和性。单结构域抗体(sdAb)是约12-15kDa的抗体，其由单个可变结构域(VL或VH结构域)组成。例如，sdAbs能由骆驼科动物VHH结构域、由常规抗体的VH或VL结构域、或由重组VH或VL结构域组成。scFv、双抗体和sdAbs的一个优点是它们能被表达为单肽并能例如在细菌中产生且在噬菌体上展示。
根据本发明，抗体(或“Ab”)是包含了免疫球蛋白的至少一个VL或VH结构域的蛋白。
根据本发明，胞内抗体(或“细胞内抗体”)是一种抗体，例如scFv、双抗体和sdAb，其适合在细胞内环境中使用。具体而言，所述抗体能在细胞胞质溶胶和/或核的还原条件中折叠，并且在细胞内环境中是稳定的。胞内抗体能具体包含完整VH结构域、完整VL结构域、或二者皆有。胞内抗体能具体是scFv、包含至少一个完整VH或VL结构域的截短的scFv、双抗体或是VH或VL结构域。优选地，胞内抗体是scFv或包含至少一个完整VH或VL结构域的截短的scFv，最优选的是完整VH结构域。
根据本发明并根据对术语的普遍理解(Muyldermans,2001)，VH或VL结构域指的是常规的VH或VL结构域，即抗体的(而不是的骆驼科动物抗体的)VH或VL结构域。就其他方面而言，术语“VH结构域”不包括VHH片段，尤其是骆驼科动物VHH片段。因此，在本发明的一个具体实施方案中，VH结构域和优选地VL结构域是非骆驼科动物抗体，或是来源于非骆驼科动物抗体，优选为非骆驼科动物的哺乳动物抗体或是来源于非骆驼科动物的哺乳动物抗体。在另一个实施方案中，VH和优选地VL结构域不是非软骨鱼抗体或不是来源于非软骨鱼抗体。
常规VH或VL结构域和骆驼科动物VHH之间的差异在许多序列和结构差异中找到了基础(Muyldermans,2001)。例如，骆驼VHH的CDR1和CDR2环采取的结构超出了针对常规抗体的VH或VL结构域所描述的标准结构。此外，VH结构域在其FR2区中包含4个标准的疏水氨基酸，其参与了与VL结构域的界面。在VHH中这些氨基酸都是突变的。这些突变，Val37Phe(或Tyr)、Gly44Glu(或Gln)、Leu45Arg(或Cys)和Trp47Gly(或Ser、Leu，或Phe)(Kabat编号，参考Kabat等,1991，以及Kontermann和Dübel,2010)在骆驼抗体内是高度保守的并且是将它们与常规VH结构域区分开的关键特征。相比于常规抗体的CDR3环(对于人抗体是12个氨基酸，对于小鼠抗体是9个氨基酸)，VHH抗体的CDR3环也更长(16-18个氨基酸，通常对于骆驼VHH是17个)。
已确认VHHs具有结合凹陷式抗原位点的能力，这是归功于其较小的尺寸和其延长的CDR3环穿入这些位点中的能力。然而，VHHs的单结构域性质对结合小抗原来说可能是缺点，因为这些能结合到VH-VL界面处的沟或腔中。
在一个具体实施方案中，根据本发明的VH结构域包含如下氨基酸中一个或多个，优选为全部：氨基酸V37、G44、L45和W47，参考Kabat编号方案。
或者，根据本发明的VH结构域包含(优选为在FR2区中)基序VNNNNNNGLNW，其中每个N是彼此独立地选出的氨基酸，优选为选自遗传密码的20种标准氨基酸。
此外，或者可替代地，根据本发明的VH结构域也能包含(优选为在FR2区中)基序VNNNNNNGLNW的变体，其中每个N是氨基酸，其彼此独立地选出，优选为选自遗传密码的20种标准氨基酸，并且其中所述变体包含一个或多个，如1-2个或1-3个任何“N”氨基酸的氨基酸添加，和/或一个或多个，如1-2个或1-3个任何“N”氨基酸的氨基酸缺失。
VH结构域和/或VL结构域的CDR3环优选地包含1-15个氨基酸，更优选为1-12个氨基酸。
不仅含有完整scFvs、还含有截短的scFvs的胞内抗体高多样性文库的使用，使得能够企及高多样性的表位。虽然完整scFvs优选地与靶蛋白的表面或与小抗原相互作用，但截短的scFvs，如sdAbs，因为它们的尺寸较小，更适合于与蛋白腔相互作用。因此完整scFvs更适合于破坏蛋白-蛋白相互作用，而截短的scFvs，如sdAbs更适合于与其靶抗原上的小分子结合位点或酶位点相互作用。因此，在用于筛选未知靶标的文库中存在两种类型的胞内抗体是高度有利的。
在一个具体的实施方案中，胞内抗体包含来源于人抗体的VL和/或VH结构域。更优选地，胞内抗体是来源于人抗体的scFv、包含来源于人抗体的至少一个完整VL或VH结构域的截短的scFv、来源于人抗体的双抗体或来源于人抗体的VL或VH结构域。更普遍而言，胞内抗体可以来源于人抗体。
如此处所意指的，“来源于人抗体的VL或VH结构域”表示与人免疫球蛋白的VL或VH结构域完全相同或基本完全相同的VL或VH结构域。“基本完全相同”意指所述VL或VH结构域可具有人免疫球蛋白的VL或VH结构域，其中将修饰引入了一个或多个CDR区，优选为引入CDR3区。也可以将修饰引入框架区，只要它们对VL或VH结构域的细胞内折叠和/或细胞内稳定性没有不利影响的话。
修饰能由一个或多个氨基酸的点突变、添加和/或缺失组成，例如1-20个氨基酸，特别是1-15个氨基酸，更具体是1-12个氨基酸。当将修饰引入一个CDR区时，可以修饰该CDR的一个至全部的氨基酸。优选地，引入修饰以具有与和经修饰的CDR或框架区相对应的天然人CDRs或框架区中所观察到的相同的氨基酸表现。还引入修饰，以使“来源于人抗体的VL或VH结构域”在使用下文所述用于评估抗体来源物种的测试时仍然被识别为人的。在其他方面，当“来源于人抗体的VL或VH结构域”的序列与多种物种(包括人类(homosapiens))的免疫球蛋白或其片段的文库比对时，“最佳命中”对应于人免疫球蛋白或其片段。
如此处所意指，来源于人抗体的scFv包含来源于人抗体的VL结构域和来源于人抗体的VH结构域。类似地，来源于人抗体的双抗体包含两个来源于人抗体的sdAbs。
若作适当变动(mutatismutandi)，术语“来源于特定物种或物种群体的抗体的”(例如“来源非骆驼科动物抗体的”)应当以与“来源于人抗体的”相似的方式理解。
在另一个实施方案中，胞内抗体包含人源化的VL和/或VH结构域。更优选的是，胞内抗体是人源化的scFv、包含至少一个完整人源化VL或VH结构域的截短的scFv、人源化的双抗体或人源化的VL或VH结构域。更普遍地说，胞内抗体可以是人源化的胞内抗体。
“人源化的”胞内抗体意指通过对非人抗体进行工程改造使其对人免疫原性较低从而获得的胞内抗体。优选地通过“CDR移植”获得了胞内抗体，即其包含人框架区，以及一个或多个源于非人物种的CDR区，优选为非骆驼科动物非人物种。框架可以是“固定框架”，即对于全部人源化抗体都是相同的框架，或可用“最佳命中”方法来选出，即在进行序列比对时，其是与要被取代的非人框架具有最多匹配的人框架。
抗体来源物种(例如人抗体)能通过分析所述抗体与不同物种的免疫球蛋白的序列同源性，并确定所述抗体与其显示出最高同源性的免疫球蛋白的物种而评估。这种分析可以通过例如查询国际免疫遗传学信息系统(www.igmt.org)的数据库来进行。
通过使用来源于人抗体的胞内抗体文库，将根据这个实施方案的筛选方法具体充分调整以适应于在人细胞中鉴定靶标。其还能够鉴定对人体内治疗用途有直接价值的胞内抗体，因为它们是非免疫原性的。
根据具体的实施方案，胞内抗体是3H2-1胞内抗体，即包含scFv3H2-1的VH结构域的CDR3序列(如图7所示，即PIAVSDY)的胞内抗体。优选地，3H2-1胞内抗体还包含scFv3H2-1的VH结构域的CDR1和CDR2序列。更优选的是，3H2-1胞内抗体还包含3H2-1的VL结构域的CDR3序列，即QTYDGSRAV，并且任选地还包含其CDR1和CDR2序列。根据优选的实施方案，3H2-1胞内抗体包含图28中所示的氨基酸序列3H2-1(SEQIDNO:1)或由该氨基酸序列组成。胞内抗体还可以是如上所述的3H2-1胞内抗体的变体，尤其是如下这样的胞内抗体，所述胞内抗体的氨基酸序列包含1、2或3个在CDR区(特别是CDR3区，更特别是VH结构域的CDR3区)中的突变，其中所述突变不影响该胞内抗体与ABCF1蛋白或ABCF1家族的另一蛋白相互作用的能力。或者，所述胞内抗体是部分或完全抑制scFv3H2-1(SEQIDNO:1)和ABCF1家族蛋白(优选为ABCF1)之间相互作用的胞内抗体。
根据另一个具体实施方案，所述胞内抗体是3H2-VH胞内抗体，即包含3H2-VH的VH结构域的CDR3序列(如图7所示，即GVRGGYGLDF)的胞内抗体。优选地，3H2-VH胞内抗体还包含3H2-VH的VH结构域的CDR1和CDR2序列。根据优选的实施方案，3H2-VH胞内抗体包含图28中所示的氨基酸序列3H2-VH(SEQIDNO:2)或由该氨基酸序列组成。胞内抗体还可以是如上所述的3H2-VH胞内抗体的变体，尤其是如下这样的胞内抗体，所述胞内抗体的氨基酸序列包含1、2或3个在CDR区(特别是CDR3区，更特别是VH结构域的CDR3区)中的突变。
根据另一个具体实施方案，所述胞内抗体是5H4胞内抗体，即包含scFv5H4的VH结构域的CDR3序列(如图7所示，DGGLREGFDC)的胞内抗体。优选地，5H4胞内抗体还包含scFv5H4的VH结构域的CDR1和CDR2序列。根据优选的实施方案，5H4胞内抗体包含图28中所示的氨基酸序列5H4(SEQIDNO:3)、5H4-VH(SEQIDNO:4)或5H4-VL(SEQIDNO:5)，或由上述氨基酸序列组成。胞内抗体还可以是如上所限定的5H4胞内抗体的变体，尤其是如下这样的胞内抗体，所述胞内抗体的氨基酸序列包含1、2或3个在CDR区(特别是CDR3区，更特别是VH结构域的CDR3区)中的突变，其中所述突变不影响该胞内抗体与LOC297607蛋白或“LOC”家族的另一蛋白相互作用的能力。或者，所述胞内抗体是部分或完全抑制scFv5H4、5H4-VL或5H4-VH中至少一种与“LOC”家族蛋白(优选为LOC297607)之间相互作用的胞内抗体。
根据另一个具体实施方案，所述胞内抗体包含SEQIDNO:7至SEQIDNO:18所示的VHCDR3序列之一。优选地，胞内抗体包含SEQIDNO:19至SEQIDNO:29所示的VLCDR3序列之一或包含一个谷氨酰胺作为VLCDR3序列。更优选地，胞内抗体包含表1中所示的VH和VLCDR3序列(也分别称为H3和L3)的组合之一。更优选地，胞内抗体包含如图28所示的scFv13R4的VH和/或VL结构域的CDR1和CDR2序列中的一个或多个，以及在如从表1中所示的那些中选出的一个簇(cluster)的VH和VL。更优选地，胞内抗体还包含scFv13R4的VH和/或VL结构域的一个或多个框架序列FR1、FR2、FR3和FR4，如图28所示。更优选地，胞内抗体包含scFv13R4的VH和/或VL结构域的框架序列和CDR1和CDR2序列，如图28所示。
如此处所用，术语“SEQIDNO:7至SEQIDNO:18”可以指组中的各单个序列，即SEQIDNO:7、SEQIDNO:8、SEQIDNO:9等等，每个序列都被视为独立的。术语“SEQIDNO:7至SEQIDNO:18”还可以指组中序列的任何组合，如“SEQIDNO:8和SEQIDNO:13”，或“SEQIDNO:9和SEQIDNO:12和SEQIDNO:16”，这些例子仅作描述而非限制。同样的含义也适用于术语SEQIDNO:19至SEQIDNO:29。
表1
在本发明方法的一个具体实施方案中，步骤a)包含筛选细胞内表达的胞内抗体文库，以鉴定能诱导、修饰或抑制细胞表型的胞内抗体。优选的是，文库中每个胞内抗体包含完整的VH和/或VL结构域。
胞内抗体文库能例如通过选择在细胞内功能性的胞内抗体来获得。在细胞内功能性的胞内抗体优选为这样的胞内抗体，当所述胞内抗体在细胞内表达时，其能结合细胞内靶标，特别是修饰细胞的表型。平均来看，仅有约0.1-1％胞内抗体适于在细胞内使用。这个比例能具体通过用WO2008/110914和Philibert等,2007中所述方法得到显著提高。简言之，这种方法首先包括选择胞内抗体，例如scFv如13R4(SEQIDNO:6)，其在体外是稳定的并且在细胞胞质溶胶中显示出最佳的折叠特性，然后将修饰引入其一个或多个CDR区，优选为引入VH和/或VL链的CDR3区(也分别称为H3和L3)，更特别是引入重链CDR3(H3)。所述修饰能由一个或多个氨基酸(例如1-12个氨基酸)的点突变、添加和/或缺失组成。还可将突变引入框架区。
在一个具体实施方案中，所述胞内抗体文库和/或所述分子文库是通过选择在细胞内功能性的胞内抗体、然后将修饰引入其一个或多个CDR区(特别是VH和/或VL结构域的CDR3区)而获得的。
在另一个实施方案中，胞内抗体文库包含scFvs以及包含至少一个完整VH或VL结构域的截短的scFvs。
优选地，胞内抗体文库包含至少105、更优选为至少106、107、108、109或1010个不同的胞内抗体。
使用胞内抗体的高多样性文库增加了可能的靶标数量。大量的胞内抗体不仅能使我们得到全部多样性的细胞内靶标(包括蛋白的各种翻译后变体)，还能使我们得到同一靶标上的各种表位。可以对单个靶标作用的不同机制进行靶向，从而增加筛选方法的成功率。
在优选的实施方案中，步骤a)包括：
i)获得分子文库，其中来自文库的每个分子编码不同的胞内抗体，所述胞内抗体包含免疫球蛋白的完整VH和/或VL结构域；
ii)对具有步骤i)的分子文库的细胞群体进行转染；
iii)在足以获得可检测的对所述表型的诱导、修饰或抑制的时间和条件下培养经转染的细胞；
iv)将显示出对所述表型的诱导、修饰或抑制的步骤iii)的细胞选出；
v)任选地，在选自步骤iv)的细胞上或在再克隆自选自步骤iv)的细胞的细胞上重复步骤iii)和iv)，以进行一轮或多轮额外的选择；和
vi)鉴定引起对所述表型的诱导、修饰或抑制的胞内抗体。
根据一个具体的实施方案，将形成一轮选择的步骤iii)至iv)重复多于1次。这意味着将选自步骤iv)的细胞按照步骤iii)再次培养以用于又一次选择步骤。例如可以在步骤vi)前进行2-10轮选择，优选为5-8轮。进一步地，所述方法可以包含一轮或多轮选择后(即步骤iv)或v)后)的再克隆步骤。再克隆步骤可以例如在每轮选择后或在某几轮后进行，例如每两轮。其后，可以对再克隆的细胞进行一轮或多轮选择。再克隆步骤可以包含从步骤iv)之后选出的细胞提取DNA、通过PCR扩增scFv序列，以及将其再克隆至表达载体中以及将其再次转染至细胞中。这使得在每轮选择有更明显的表型，并使得产生所研究表型的scFv序列富集。
优选地，编码胞内抗体的分子是载体。优选地，所述载体适于在真核细胞中表达，例如在哺乳动物细胞中，如在人、啮齿类和灵长类细胞中表达。所述载体可以是能进行瞬时表达的非整合型载体，例如质粒或腺病毒载体，或是整合型载体如逆转录病毒载体。载体可以还编码将胞内抗体引导至特异性的细胞区室或细胞膜的信号。
具体而言，当使用非整合型载体时，每个细胞可转染大量的拷贝，例如100-100000个拷贝，优选为500-20000个拷贝，例如约10000个拷贝。根据这个实施方案，需要的细胞更少。随后进行额外的亚克隆步骤以鉴定感兴趣的胞内抗体。这个实施方案具体而言适用于筛选显性表型中的修饰。
当使用整合型载体时，优选的是每个细胞转染少于5个拷贝，更优选为1、2或3个拷贝。
可以体外或体内转染细胞，作为完整生物体的一部分。如果体内转染细胞，则细胞表型可以是可在完整生物体中确定的表型。
胞内抗体可以与另一个蛋白融合，例如引发可检测信号(如GFP蛋白)的蛋白。
细胞靶标可以是完全细胞内的或是部分细胞内的分子。对于部分细胞内分子的情况，其可以是膜蛋白，所述膜蛋白可包含细胞内和/或细胞外结构域。细胞靶标可以具体而言是蛋白、肽、碳水化合物、脂质或甚至核酸。如果靶标是蛋白，其可能是例如酶，如激酶或蛋白磷酸酶、跨膜受体、转录因子、支架蛋白如微管蛋白、代谢酶类、涉及蛋白合成和周转(turnover)的蛋白如核糖体蛋白、分子伴侣和蛋白酶，等等。细胞靶标对于细胞可以是内源性或外源性的。外源性靶标具体而言包括蛋白、核酸、病毒来源的颗粒以及完整病毒、细菌抗原。细胞靶标还可以是未知蛋白或是功能未知的已知蛋白。
细胞靶标是与胞内抗体相互作用的靶标，所述相互作用是直接通过与其结合(直接靶标)进行或是间接地进行的(在某种意义上其不与胞内抗体结合但胞内抗体对其具有间接作用)。直接靶标可以是这样的靶标，其与胞内抗体在体外结合的相应解离常数(Kd)至少为1nM。间接靶标也可以是这样的分子，所述分子与另一个细胞分子相互作用，而胞内抗体同样与所述细胞分子相互作用；或者间接靶标可以是这样的分子，所述分子是由所述胞内抗体调节的细胞途径的一部分。例如，间接靶标可以是这样的分子，所述分子能与胞内抗体一起沉淀，因为其结合到另一个胞内分子，而所述胞内抗体也与该胞内分子结合。
无论直接或间接，胞内抗体和靶标之间的相互作用对于一种或多种细胞途径具有调节作用。这种相互作用可以例如改变靶标的构象和/或磷酸化状态，并从而在细胞中诱导、增强或抑制其与一种或多种其他分子(尤其是蛋白质)相互作用的能力。这种相互作用可以完全地或部分地使所述靶标和/或另一个蛋白活化或是失活。
细胞表型可以是任何可观察的或可测量的细胞特性，包括形态特征、发育阶段、生物化学或生理学特性。例如，表型可以是细胞死亡、衰老的开始、对抗生素的抗性、对病毒或细菌攻击的抗性、受体的表达或失去表达、将化合物释放到细胞环境外。表型也可以是任何类型的信号，例如由重组报告基因的表达引发的信号，如荧光。优选的细胞表型是与动物或植物疾病有关的表型，优选为影响人类的病理学特征(pathology)。因此这种表型是吸引治疗或诊断兴趣的表型。在一个具体的实施方案中，表型是与过敏或炎症有关的表型，具体是与I型过敏反应有关的。表型可以是能在体外细胞培养上或在体内完整生物上观察到或测量到的特性。
细胞表型中的修饰可以是对细胞表型的调节(如强度的增加或减少)、诱导(或发生)或抑制(或阻遏)。
细胞可以是原核生物细胞或真核生物细胞。优选的细胞是真核细胞，如酵母细胞或更高等的真核生物细胞，例如动物细胞或植物细胞。在一个具体的实施方案中，细胞是哺乳动物细胞，如小鼠、大鼠或人细胞。在优选的实施方案中，细胞是人细胞。根据一个具体的实施方案，细胞是涉及过敏、炎症或二者均涉及的真核细胞，而细胞表型是与过敏反应、炎症反应有关或与二者均有关的表型。例如，细胞是肥大细胞而细胞表型是脱颗粒和促炎症递质的释放。
造成表型诱导、修饰或抑制的胞内抗体可以通过任何合适的方法来鉴定。例如，将显示出表型诱导、修饰或抑制的细胞进行克隆，并提取来自每个克隆的DNA。将编码scFv的基因通过PCR扩增并测序。
胞内抗体的直接或间接靶标可以通过任何合适的方法分离出来。例如，胞内抗体的直接或间接靶标可以通过结合测定来分离，其中将所述胞内抗体用可检测的标记来进行标记。或者，将直接或间接的靶标与标记的胞内抗体一起进行免疫沉淀。一旦将靶标分离出来，可以用例如质谱分析法(MS-MS)对其进行鉴定。
根据一个具体的实施方案，所述方法还包括用RNA干扰技术或所述靶标的已知抑制剂(如抗体)进行靶标确认的步骤。所述方法还可以包括鉴定靶标表位的步骤，和/或对靶标进行表征的步骤。对表位的鉴定吸引了极大的兴趣，因为其可指导对于靶标上感兴趣的位点的鉴定。在又一个实施方案中，所述方法可以包括鉴定分子的步骤，所述分子同步骤a)中鉴定出的胞内抗体与步骤b)中鉴定出的蛋白的结合进行竞争，并且所述分子能修饰所述细胞表型。
本发明的另一个方面是一种胞内抗体，其包含如图7中所示的scFv3H2-1的VH结构域的CDR3序列，即PIAVSDY(SEQIDNO:42)(“3H2-1胞内抗体”)。优选的3H2-1胞内抗体还包含scFv3H2-1的VH结构域的CDR1和CDR2序列。更优选的是，3H2-1胞内抗体进一步包含3H2-1的VL结构域的CDR3序列，即QTYDGSRAV，并且任选地还包含其CDR1和CDR2序列。根据优选的实施方案，3H2-1胞内抗体包含如图28中所示的氨基酸序列3H2-1(SEQIDNO:1)，或是由上述氨基酸序列组成。胞内抗体还可以是如上所限定的3H2-1胞内抗体的变体，尤其是这样的胞内抗体，所述胞内抗体的氨基酸序列包含1、2或3个在CDR区中的突变，特别是CDR3区，更特别是VH结构域的CDR3区中的突变，其中所述突变不影响胞内抗体与ABCF1蛋白或ABCF1家族的另一蛋白相互作用的能力。在一个具体的实施方案中，胞内抗体用于治疗中的用途，特别是在治疗过敏和/或炎症中的用途。
本发明一个进一步的方面是一种胞内抗体，其包含如图7中所示的3H2-VH的VH结构域的CDR3序列，即GVRGGYGLDF(SEQIDNO:43)(“3H2-VH胞内抗体”)。优选的3H2-VH胞内抗体还包含3H2-VH的VH结构域的CDR1和CDR2序列。根据一个优选的实施方案，3H2-VH胞内抗体包含图28中所示的氨基酸序列3H2-VH(SEQIDNO:2)或由上述氨基酸序列组成。胞内抗体还可以是如上所限定的3H2-VH胞内抗体的变体，尤其是这样的胞内抗体，其氨基酸序列包含1、2或3个在CDR区中的突变，特别是CDR3区，更特别是VH结构域的CDR3区中的突变，其中所述突变不影响胞内抗体与其目前未知的靶标相互作用的能力。在一个具体的实施方案中，胞内抗体用于在治疗中的用途，特别是在治疗过敏和/或炎症中的用途。
本发明一个进一步的方面是一种胞内抗体，其包含如图7中所示的胞内抗体5H4的VH结构域的CDR3序列，即GGLREGFDC(SEQIDNO:44)(“5H4胞内抗体”)。优选的5H4胞内抗体还包含scFv5H4的VH结构域的CDR1和CDR2序列。根据一个优选的实施方案，5H4胞内抗体包含图28中所示的氨基酸序列5H4(SEQIDNO:3)、5H4-VH(SEQIDNO:4)或5H4-VL(SEQIDNO:5)，或由上述氨基酸序列组成。胞内抗体还可以是如上所限定的5H4胞内抗体的变体，尤其是这样的胞内抗体，其氨基酸序列包含1、2或3个在CDR区中的突变，特别是CDR3区，更特别是VH结构域的CDR3区中的突变，其中所述突变不影响胞内抗体与LOC297607蛋白或“LOC”家族的另一蛋白相互作用的能力。在一个具体的实施方案中，胞内抗体用于在治疗中的用途，尤其是在治疗过敏和/或炎症中的用途。
本发明的另一个方面是包含表1中所示的VHCDR3序列之一的胞内抗体，其用于治疗中的用途，尤其是用于在治疗过敏和/或炎症中的用途。优选的抗体还包含表1中所示的VLCDR3序列之一。更优选地，其包含表1中所示的VH和VLCDR3序列的组合之一。优选地，胞内抗体包含图28中所示的scFv13R4的框架序列和CDR1和CDR2序列，以及表1中所示的VH和VLCDR3的组合之一。
本发明的另一个方面是一种核酸序列，其包含编码根据本发明如上所限定的胞内抗体的序列，或由上述序列组成，或是含有所述核酸序列的载体，或是含有所述核酸序列或所述载体的真核细胞。
优选的载体适合于所述核酸在哺乳动物细胞、哺乳动物组织或哺乳动物器官中的引入和表达，例如逆转录病毒载体、慢病毒载体或质粒。
本发明的另一个方面在于如上所限定的3H2-1胞内抗体用于鉴定如下分子的用途，所述分子能同所述胞内抗体与ABCF1家族蛋白(优选为ABCF1蛋白)的结合进行竞争，并能够在涉及过敏、炎症或二者均有涉及的细胞中修饰与过敏反应、炎症反应有关或与二者均有关的表型。
ABCF1(ATP-结合盒亚家族F成员1)蛋白是ABC蛋白超家族的成员。其是超家族的亚家族F或GCN20的一部分。ABC亚家族F包含其他成员，如ABCF2和ABCF3蛋白。
ABCF1家族的蛋白可以是具有如下这样的氨基酸序列的蛋白，所述氨基酸序列与SEQIDNO:41中所示氨基酸序列具有至少60％同一性，优选为至少70％同一性，最优选为至少80％同一性或至少90％或至少95％或至少99％同一性。其还可以是由如下这样的多核苷酸编码的蛋白，所述多核苷酸与SEQIDNO:40中所示核苷酸序列具有至少60％同一性，优选为至少70％同一性，最优选为至少80％同一性或至少90％或至少95％或至少99％同一性。其尤其还可以是人蛋白ABCF1或是人ABCF1蛋白的任何直向同源物。其还可以是人ABCF1蛋白的任何同源物或横向同源物。需要注意，编码ABCF1蛋白的基因在许多物种中是高度保守的(例如在黑猩猩、猕猴、狗、奶牛、小鼠、大鼠、斑马鱼、果蝇、蚊子、秀丽隐杆线虫(C.elegans)、粟酒裂殖酵母(S.pombe)、拟南芥和水稻中)。
本发明一个进一步的方面在于如上所限定的5H4胞内抗体用于鉴定分子的用途，所述分子能同所述胞内抗体与C12ORF4或“LOC”家族的蛋白的结合进行竞争，并能够在涉及过敏、炎症或二者均有涉及的细胞中修饰与过敏反应、炎症反应有关或与二者均有关的表型。
C12ORF4或“LOC”家族的蛋白可以是具有如下这样的氨基酸序列的蛋白，所述氨基酸序列与SEQIDNO:33、SEQIDNO:35、SEQIDNO:37和SEQIDNO:39所示的氨基酸序列之一，优选为与SEQIDNO:35中所示的氨基酸序列具有至少60％同一性，优选为至少70％同一性，最优选为至少80％同一性或至少90％或至少95％或至少99％同一性。其还可以是由如下这样的多核苷酸编码的蛋白，所述多核苷酸与SEQIDNO:32、SEQIDNO:34、SEQIDNO:36、SEQIDNO:38之一，优选为与SEQIDNO:34中所示核苷酸序列具有至少60％同一性，优选为至少70％同一性，最优选为至少80％同一性或至少90％或至少95％或至少99％同一性。其还尤其可以是蛋白C12ORF4、LOC297607、LOC57102或LOC28040之一，优选为人C12ORF4蛋白或是人C12ORF4蛋白的任何直向同源物。其还可以是人C12ORF4蛋白的任何同源物或横向同源物。需要注意，编码蛋白C12ORF4的基因在许多物种中是高度保守的(例如在黑猩猩、狗、奶牛、小鼠、大鼠、鸡、斑马鱼、果蝇、蚊子和秀丽隐杆线虫中)。
与过敏反应、炎症反应有关或与二者均有关的表型可能与其中发生过敏反应或炎症反应发生的疾病或状况有关，具体是I、II、III和IV型超敏反应、类风湿性关节炎、强直性脊柱炎、和系统性红斑狼疮(SLE)。
涉及过敏反应、炎症反应或二者的细胞可以选自肥大细胞和嗜碱性粒细胞，吞噬性细胞(phagocyticcells)或吞噬细胞(phagocytes)(粒细胞(主要为中性)和清扫细胞)和淋巴细胞。
根据上述用途之中的一个或另一个的具体实施方案，能同胞内抗体与靶蛋白的结合竞争的分子是分子量为100-2500Da的有机分子。
在又一个方面，本发明涉及一种ABCF1家族的蛋白(具体是ABCF1)的抑制剂，其用于在治疗过敏、炎症或二者的方法中的用途。这种抑制剂在此处称为“ABCF1抑制剂”。
在一个具体实施方案中，根据本发明的ABCF1抑制剂用于治疗过敏、炎症或二者的方法中的用途，尤其是治疗如下这样的疾病或状况，在其中发生过敏反应和/或炎症反应，尤其为I、II、III和IV型超敏反应、类风湿性关节炎、强直性脊柱炎和系统性红斑狼疮(SLE)。
在又一个方面，本发明涉及制造用于治疗过敏、炎症或二者的药物或药物组合物的方法，其包括：
-鉴定ABCF1家族的蛋白(尤其是ABCF1)的抑制剂；
-制造包含所述抑制剂的药物或药物组合物。
在一个具体实施方案中，所述ABCF1抑制剂是
-胞内抗体或其抗原结合片段，其能结合至ABCF1家族的蛋白(特别是蛋白ABCF1)，优选为根据本发明的3H2-1胞内抗体；
-能干扰ABCF1家族的蛋白(特别是ABCF1)在细胞中表达的RNA分子；或
-具有100-2500Da的分子量的有机分子，其能用ABCF1家族的蛋白(特别是蛋白ABCF1)将根据本发明的3H2-1胞内抗体从其结合位点置换出来。
根据本发明，胞内抗体的抗原结合片段可以包含VH或VL结构域的至少一个CDR环，优选为VH或VL结构域的CDR3环，更优选为VH结构域的CDR3环。
在又一个方面，本发明涉及C12ORF4家族(也称为“LOC”家族)的蛋白，特别是C12ORF4、LOC297607、LOC57102或LOC28040，最优选为C12ORF4的抑制剂，其用于治疗中的用途。这种抑制剂在此处被称为“LOC抑制剂”。在一个具体实施方案中，根据本发明的LOC抑制剂用于治疗过敏、炎症或二者的方法中的用途，尤其是治疗如下这样的疾病或状况，在其中发生过敏反应和/或炎症反应，尤其为I、II、III和IV型超敏反应、类风湿性关节炎、强直性脊柱炎和系统性红斑狼疮(SLE)。
在又一个方面，本发明涉及制造用于治疗过敏、炎症或二者的药物或药物组合物的方法，其包括：
-鉴定C12ORF4家族的蛋白(特别是C12ORF4)的抑制剂；
-制造包含所述抑制剂的药物或药物组合物。
在一个具体实施方案中，所述LOC抑制剂是
-胞内抗体或其抗原结合片段，其能结合至C12ORF4家族的蛋白，特别为C12ORF4、LOC297607、LOC57102或LOC29040，优选为结合至C12ORF4，优选为根据本发明的5H4、5H4-VL或5H4-VH胞内抗体及其抗原结合部分；
-能干扰C12ORF4家族的蛋白(特别为C12ORF4、LOC297607、LOC57102或LOC29040，优选为C12ORF4)在细胞中表达的RNA分子；或
-具有100-2500Da的分子量的有机分子，其能用C12ORF4家族的蛋白(特别为C12ORF4、LOC297607、LOC57102或LOC29040，优选为C12ORF4)将根据本发明的5H4胞内抗体从其结合位点置换出来。
附图说明
图1：抗体分子以及一些可能的重组片段的示意图
重链可变区以黑色显示。轻链可变区以灰色显示。
a)是IgG的示意图。二硫键用虚线表示。
b)是一些单价和二价抗体片段的展示。
图2：表型选择原则
将scFv文库克隆于表达载体中(步骤1)并转染至合适的细胞系中(步骤2)。根据步骤3中给定的表型分选细胞。在所述的情况下，在用荧光膜联蛋白V进行细胞染色后通过FACS进行分选。在进行合适轮数的筛选后，用富集的scFv群体来产生稳定的克隆并对scFv基因进行测序(步骤4)。在大肠杆菌中产生了最佳的scFv并用它们来鉴定它们的靶标，所述鉴定是通过从细胞提取物捕获所述靶标并通过质谱分析法来分析被捕获的蛋白(步骤5)。然后用常用技术来确定所述靶标在给定表型中的意义(步骤6)。
图3：RBL-2H3肥大细胞系中胞内抗体的质粒文库的细胞内表达
在(a)中，抗体片段的表达是通过RT-PCR来测量的；而在(b)中是通过免疫荧光用抗-myc标签9E10单克隆抗体，然后进行指明的选择轮次来测量的。
图4：选择轮次全程中被转染细胞群体的FACS富集
对于每轮选择，在用膜联蛋白-V-APC染色后，通过FACS对用胞内抗体的质粒文库来转染的细胞群体进行分析。用IgE/DNP(+)来刺激细胞或是通过省略DNP(-)而不刺激细胞。移位(shift)值在(a)中通过水平标记物即标记的M1来表示。(b)显示了膜联蛋白-V-APC在第1至7轮选择的移位值。
图5：FcεRI介导的β-己糖胺酶释放的百分比
对产生自胞内抗体治理文库转染之后第7轮选择的24个稳定的RBL-2H3克隆进行的分析；用RBL-2H3细胞系作为阳性对照。
图6：FcεRI介导的钙流出增加
用不相关的非抑制性胞内抗体(用作阳性对照)对一些产生自第7轮选择的稳定RBL-2H3克隆进行平行分析。通过在20秒后添加抗原DNP来刺激载有IgE的细胞，并通过FACS用Fluo3染料来评估钙的升高。测试的克隆名称于图中表明。
图7：细胞克隆5H4和3H2中表达的scFv的序列
a)5H4-VH、5H4-VL、3H2-1和3H2-VH片段的示意图
b)CDR3环的序列，与初始scFv13R4进行比较显示。
图8：RBL-2H3稳定克隆在FcεRI刺激后的β-己糖胺酶释放
图9：FcεRI介导的膜联蛋白-V-APC染色，通过FACS测量
箭头表示未受刺激的细胞群体(+IgE/-DNP)；在用IgE和抗原DNP(+IgE/+DNP)与细胞进行温育后的FcεRI刺激依赖性的膜联蛋白V移位。
图10：通过FACS可视化的钙流出
为了测量钙流出，将抗原DNP添加到载有IgE的细胞，并通过FACS用Fluo3染料来测量细胞内钙的升高。
图11：靶标鉴定
对从细胞提取物捕获的蛋白用(a)scFv3H2-1和(b)5H4-VH片段进行的质谱分析。
与具有最高蛋白评分(Protscore)的蛋白对应的条带以凝胶上的箭头表示。
图12：LOC297607的BLAST比对
符号“*”表示用人蛋白作为参照的序列同一性百分比。
图13：scFv3H2-1靶标的确认
在图11a中鉴定出的蛋白的身份(identity)用针对ABCF1蛋白的市售抗体进行确证。(a)用市售的抗ABCF1抗体揭示了对比无关的scFv(irr)用scFv3H2-1捕获的细胞提取物。(b)用scFv3H2-1-Fc融合物(左)和市售的抗ABCF1抗体(右)对RBL-3H2细胞的免疫荧光分析。
图14：5H4-VH片段靶标的确认
用针对C12orf4蛋白的市售抗体对在图11b中鉴定出的蛋白的身份进行确证。(a)用市售的抗C12orf4抗体揭示了对比无关的VH用5H4-VH片段捕获的细胞提取物。(b)用5H4-VH-Fc融合物(右上角图)、市售的抗C12orf4抗体(左下角图)和合并(右下角图)染色的RBL-3H2细胞的免疫荧光共聚焦分析。左上角图是代表对核的Hoechst染色。
图15：LOC297607的核酸序列，大鼠C12Orf4基因
表示了两种shRNA的定位(序列中的粗体)和序列。
图16：用两种shRNA(sh1和sh2)使RBL-2H3细胞系中的LOC297607失效，通过(a)qPCR和(b)通过western印迹评估
用对萤光素酶(shLUC)特异性的无关的shRNA转染RBL-2H3细胞群体作为对照。
图17：与使用shRNA的LOC297607失效有关的细胞表型
FcεRI介导的对经转染的RBL-2H3细胞群的激活通过如下量度进行评估：(a)β-己糖胺酶释放；b)TNF-α分泌；c)细胞内钙流出升高。将RBL-2H3细胞系与使用对萤光素酶特异性的(shLUC)shRNA(作为对照)或使用对LOC297607(sh1)特异性的shRNA转染的细胞群体平行使用。
图18：对用sh1Loc和shLUC(对照)转染的RBL-2H3群体的Western印迹分析，选择后5天
在FcεRI刺激(+IgE/+DNP)后0、3和10分钟制备细胞提取物。使用了对指明靶标特异性的抗体。
图19：RBL-2H3细胞群体的膜联蛋白V-APC染色，所述RBL-2H3细胞群体由进行胞内抗体逆转录病毒文库转染之后不同轮次的选择产生
图20：胞内抗体逆转录病毒文库的表型选择步骤全过程中的膜联蛋白V-APC染色的比较
箭头表示未受刺激的细胞群体(+IgE/-DNP)；在将细胞与IgE和抗原DNP(+IgE/+DNP)一起进行温育后，FcεRI刺激依赖性的膜联蛋白V移位。百分比表示移位的值。
图21：对胞内抗体逆转录病毒文库的表型选择步骤期间β-己糖胺酶释放的测量
a)包括克隆步骤的选择
b)没有可克隆步骤的选择
图22：对产生自胞内抗体逆转录病毒文库的RBL-2H3克隆的β-己糖胺酶释放的测量
图23：来自每个簇的一个代表性的scFv基因的CDR3环的氨基酸序列
图24：对富集的VH基因序列的高通量测序和比较
图25：产生自逆转录病毒和质粒选择的VH序列维恩图(VennDiagram)
图26：产生自不同表型选择的细胞群体的膜联蛋白V染色比较
箭头表示未受刺激的细胞群体(+IgE/-DNP)；在将细胞与IgE和抗原DNP(+IgE/+DNP)进行温育后，FcεRI刺激依赖性的膜联蛋白V移位
图27：通过测量β-己糖胺酶释放和通过测量TNF-α分泌评估FcεRI介导的肥大细胞脱颗粒
将来自每个簇的一个代表性的scFv基因转染到RBL-2H3细胞系中，并研究细胞表型。与用无关的scFv片段获得的结果比较计算出指明的百分比。
图28：胞内抗体序列13R4、3H2-1、3H2-VH、5H4、5H4-VH和5H4-VL的比对
实施例
发明人开发出的表型筛选方法是基于选择的，所述选择从能诱导在治疗上感兴趣的表型的scFvs的组合文库进行。用肥大细胞脱颗粒的细胞模型研究了与过敏有关的表型。发明人开发的功能性筛选的步骤在图2中描述。首先，将高多样性的且针对细胞内表达优化后的scFv组合文库克隆到质粒表达载体中以及逆转录病毒表达载体中。转染肥大细胞系(步骤2)，然后进行表型筛选。对表现出对脱颗粒的抑制并且先天表达如下scFvs的细胞进行分选，所述scFvs干扰涉及所讨论的信号传导途径的蛋白(步骤3)。将这些细胞表达的scFv基因用于再次转染相同的肥大细胞系，并进行新的选择轮次。将在最后一轮选择中分选出的细胞中表达的scFvs的序列用于产生稳定的转染子(步骤4)。这使得能对每个scFv得抑制性潜力进行个别分析。感兴趣的scFvs的潜在靶标通过质谱分析法来鉴定(步骤5)。最终，最后一步在于研究这些蛋白在与肥大细胞激活有关的信号传导途径中所扮演的角色(步骤6)。
开发出了两个平行的方法，或是用质粒表达系统或是用逆转录病毒系统。这类方法可用于研究多重细胞表型。
实施例1：用质粒表达系统的表型筛选
步骤1：scFv文库的克隆
本策略使用高多样性(109种)的人scFvs的组合文库，使得在理论上能够覆盖细胞中表达的所有蛋白(当考虑到可选剪接和翻译后修饰时，约为106种)。此外，用恒定框架来构造该文库，其允许在胞质溶胶中具有优异稳定性，从而在真核细胞的胞质中优化scFvs的细胞内表达。框架抗体是13R4人scFv，其具有如图28中所述的序列。通过PCR将表位多样性引入至VH和VLCDR3s中，并产生了两种“亚文库”(Philibert等,2007)。将表位多样性引入至VH和VLCDR3s中是通过模拟天然存在的人CDR3环中的氨基酸分布，从而产生人来源的scFvs或在其他方面尽可能像人的一样的scFvs而进行的。
通过PCR来组装这两种亚文库，并将其克隆至真核细胞表达载体pEF/myc/cyto中(Persic等,1997)。这种载体包含EF1a型强力启动子，并经调整以适应scFvs的胞质表达。其还允许纳入C末端c-Myc标签(EQKLISEEDL)，其被单克隆抗体9E10识别。
在细菌转化后，产生了具有109种的多样性的文库。
步骤2：肥大细胞的转染
将肥大细胞系RBL-2H3(来源于亚克隆RBL(“大鼠嗜碱性白血病”)的细胞系)用于研究。该细胞系常用于过敏领域中，并且其信号传导途径已经被研究透彻。
通过电穿孔用此前克隆的载体pEF/myc/cyto来转染这些细胞。选择与电击有关的电压、电容和生化条件，以尽可能维持scFv文库的初始多样性。因此要考虑的参数有：
-数量可控的待转染细胞，
-10-20％的转染后存活率，
-估计为80％的转染效率。
如此得到了多拷贝转染条件，其中每个细胞用2000-2500个重组质粒转染。逆转录实验和随后的qPCR(RT-qPCR)显示，在这些条件中，能检测到2500个中的一个scFv的单基因拷贝的转录。因此，在第一轮选择中，用3mgDNA对3x108个细胞进行电穿孔。在考虑到此前引用的参数的同时，这允许在理论上代表了约50倍的scFv文库。
scFv文库的胞内表达通过进行对如下序列的RT-qPCR分析来控制，所述序列由每轮选择后得到的细胞表达(参见图2)。这种分析显示，按照每个质粒拷贝扩增的cDNA来看，scFv表达随每轮选择增加(图3a)。
通过对转染的细胞的细胞免疫荧光(IF)进行观察，将结果关联起来。用与Alexa488偶联的9E10抗体进行标记的细胞揭示了相当扩散的胞质表达，并存在少量scFv不可溶聚集物，后者在选择期间逐渐减少(图3b)。
步骤3：表型选择
对于每轮选择，经由FcεRI(高亲和性IgE受体)，通过添加与其Ag(二硝基苯基(DNP))偶联的IgE来刺激经转染的细胞。在刺激之后，立即用与APC(别藻蓝素)偶联的膜联蛋白V对细胞进行标记。这种标记物在胞吐作用期间特异性地结合至质膜处暴露的磷酯酰丝氨酸，与脱颗粒的强度成比例(Demo等,1999)。荧光膜联蛋白V使得能用流式细胞仪在脱粒的细胞(强标记的)和激活被抑制的细胞(弱标记的)之间形成差异。用碘化丙啶(PI)进行标记，使得能够排除凋亡细胞。当用FACS分选时，将用空载体转染的细胞群体作为对照。
分选了对应于0-10％的脱颗粒最少的细胞的区域，所述细胞先天表达抑制的scFvs。每次选择后，提取经分选的细胞的质粒DNA，并通过PCR扩增scFvs的序列并再克隆至同一表达载体中，以转染RBL-2H3细胞并进行新一轮选择。因此进行了8轮富集。随着选择进行的对膜联蛋白移位的分析揭示了细胞脱颗粒的显著减少(图4)。的确，在第一轮，用IgE/DNP的刺激诱导了总群体的约52％的膜联蛋白标记水平；而这个百分比在第7和第8轮选择时减少至19％。
步骤4：稳定转染子的产生和分析
在选择以后，将从细胞提取的DNA用于产生大鼠肥大细胞系RBL-2H3的稳定转染子。通过用提取的DNA电穿孔，然后通过用抗生素G418(Geneticine)以2mg/mL的终浓度进行选择，从而获得了稳定转染子。通过有限的稀释获得了稳定的细胞转染子克隆。分离了132个稳定克隆，并通过测量β-己糖胺酶释放分析了它们与FcεRI激活有关的表型，所述β-己糖胺酶是预先形成的过敏递质，通过胞吐作用释放。
-稳定克隆的表型
进行了一式两份的细胞测试。图5显示了所有测试克隆的代表性样品。将RBL-2H3细胞用作脱颗粒的对照，用不同的克隆与其按照酶释放的百分比进行比较。结果显示53个克隆(42％)显示出对脱颗粒的抑制，其中10个(8％)显示出至少50％的抑制水平。
在第一次筛选后，选出了34个克隆并用第二次细胞测试进行分析，所述二次细胞测试是对细胞内钙流出的测量。在FcεRI激活数秒钟后，通过细胞内储存的Ca2+的释放而引发钙流出，然后是钙流入。用钙传感器(sensor)，Fluo3-AM进行细胞标记，所述Fluo3-AM被FACS检测到的荧光与细胞内Ca2+的量成比例。图6显示了对应于10个克隆的选择的钙流出的测量。与这些通过测量β-己糖胺酶获得的结果相关，大多数分析的克隆显示出对钙流出的抑制。
-序列分析
提取出了34个显示出抑制β-己糖胺酶的克隆的基因组DNA，并通过PCR扩增了由这些细胞表达的scFv基因，并测序。分析揭示，65％的细胞克隆显示出2-3个序列的混合。此外，74％的来自表型选择的scFvs显示出完整序列。然而，14％的分析物在VL的CDR3(L3)处是截短的，3％在VH的CDR3(H3)处是截短的，而9％既没有H3也没有L3。
保留了两个克隆，3H2和5H4，用于进一步研究，所述克隆显示出明显的和可再现的脱颗粒抑制表型(图7a)。首先，对克隆3H2和5H4的膜FcεRI进行标记，以验证获得的抑制性表型并不是由于IgE受体表达的缺陷造成的。这些分析显示出与未被转染的RBL-2H3细胞相似的标记。
-克隆3H2
平行地进行了三个能对该克隆的脱颗粒进行评估的细胞测试，并显示，β-己糖胺酶释放被抑制了59％(图8)，以及膜联蛋白V-Fitc标记(图9)。然而，这个克隆的胞内流出受到轻微影响(图10)。对克隆3H2表达的scFv的序列分析显示了对应于称为3H2-1的完整scFv和对应于仅含一个VH结构域的称为3H2-VH的截短基因的两个序列(图7、28)。对scFv3H2-1、3H2-VH和scFv13R4的氨基酸序列的比对证实了仅VH和VLCDR3区显示出可变性，所述scFv13R4充当初始骨架scFv用于构建文库。
产生了新的稳定的RBL-2H3系转染子并分析了表达3H2-1和3H2-VH的克隆。进行了三个能评估这些克隆的脱颗粒的细胞测试，其显示β-己糖胺酶释放在表达3H2-VH的细胞中受到强力抑制(图8)，而在表达3H2-1和3H2-VH的稳定RBL-2H3转染子中膜联蛋白V-Fitc标记(图9)和细胞内流出受到抑制(图10)。
-克隆5H4
对这个克隆表达的scFv的序列的分析揭示，在L3的开端存在终止密码子(图7、28)。对应的截短的基因缺少其C末端终点，以及Myc标签。初始文库的可变性仅由CDR3s携带，假设VH结构域单独便能导致5H4对于其靶标的特异性以及其抑制性的活性，特别是自从文献报道了这种形式对于靶向蛋白的效力(Stijlemans等,2004；Tanaka等,2007)。
因此，将如下两种5H4形式再克隆至pEF/myc/cyto载体中：对应于初始克隆序列的5H4-VL；以及仅含VH结构域的5H4-VH(图28)。将C末端Myc标签再次引入序列。
产生了RBL-2H3系的新的稳定转染子。这些群体的细胞测试揭示，FcεRI的刺激导致了钙转移的大量减少(图10)；β-己糖胺酶释放受到抑制(图8)；以及通过膜联蛋白V-APC的标记降低(图9)。这些结果显示5H4-VH形式产生了与5H4-VL相似的表型。
步骤5：选出的scFvs的生产及其靶标的鉴定
-scFvs的生产
为了将选出的Ab片段用于鉴定其靶标，将三个序列3H2-1、5H4-VH和5H4-VL克隆至两个原核表达载体中，所述原核表达载体使他们能从大肠杆菌细胞质(pET23载体)和周质(pHEN2载体)提取物产生。
还将它们克隆至真核细胞表达载体(ps1119)中，所述真核细胞表达载体能使他们的产物与小鼠Fc融合为二聚体形式(Moutel等，2009)。
-靶标鉴定
纯化了这三个Ab片段以及合适的无关Abs，并借助其6xHis标签将其固定在磁性镍珠上。将它们用于免疫沉淀来自RBL-2H3细胞的蛋白裂解物，所述RBL-2H3细胞事先经过FcεRI刺激或未受刺激。免疫沉淀后，在低严格条件下洗涤珠子，以保存低亲和性的结合。
在丙烯酰胺凝胶(SDS-PAGE)上进行电泳，并用考马斯蓝染色后，切下当被Ab片段3H2-1和5H4免疫沉淀时显示出的条带，其强度或是比无关Ab更高，或者用无关Ab没有条带。在用胰蛋白酶消化后，通过质谱MS/MS用MALDI-TOF(基质辅助激光脱附/电离飞行时间质谱)技术来分析条带。
使用的质谱分析仪是由激光(其将之前消化的肽电离)；分析器(其测量被电离的肽的质量/电荷(m/z)比作为其飞行时间的函数)；以及探测器(其记录每个给定m/z比的离子数量)组成的。所得的m/z比范围使得能对肽和因此存在于样品中的蛋白进行鉴定，所述鉴定是通过查询Genebank大鼠数据库以及小鼠数据库以供比较(小鼠Genebank数据库更加完整)而进行的。置信指数或蛋白质评分(ProtScore)是每个蛋白的特征，其是鉴定为其序列的一部分的肽的数量的函数，也是这些肽性质(组成、大小)的函数。高于3的蛋白质评分对应于0.1％的鉴定为假阳性的可能性，换言之该蛋白存在的可能性有99.9％。对于测试的Ab片段蛋白质评分最高且没有无关Ab或无关Ab不显著的蛋白被保留下来。
在scFv3H2-1的情况下，在这项分析结束时选出了10个蛋白，其蛋白质评分范围从4至51，相对于对照的蛋白质评分为0至2。保留了95kDa蛋白ABCF1(ATP结合盒亚家族F成员1)，其具有最高的蛋白质评分(图11a和表2)。
表2
在表中，各栏如下：第1栏，用胞内抗体鉴定出的蛋白的蛋白质评分。第2栏，用无关的胞内抗体鉴定出的蛋白的蛋白质评分。第3栏，鉴定出的蛋白的Genbankgi号。第4栏，蛋白在Genbank中的名称。第5栏，预测的分子量。
这种蛋白是ABC转运蛋白家族的特有成员，因为其是仅有的一个不包含跨膜结构域的。一些研究表明，其具有通过与eIF2因子(真核起始因子2)相互作用而起始翻译的作用(Paytubi等,2009,2008；Tyzack等,2000)。此前的工作报道了，在滑膜细胞中，编码ABCF1的基因受到TNF-α的调控。在此背景下，这个蛋白可能参与了蛋白合成的增加以及参与炎症过程(Richard等,1998)。此外，编码ABCF1的基因的基因座定位在HLA区(人白细胞抗原)，其可能与对自身免疫疾病易感有关(Ota等,2007)。
在5H4的情况下，比较对5H4-VH和5H4-VL获得的结果显示，被所述两种形式所免疫沉淀的蛋白是相同的。因此，仅将5H4-VH用于进一步的实验中。MS/MS结果允许选择8种蛋白质评分范围从4至22的蛋白，相比之下对照中为0至2。保留了64kDa蛋白LOC297607(下文称“LOC”)，其在三次独立实验中的蛋白质评分为16-22(图11b和表3)。
表3
在这个表中，各栏如下：第1栏，用胞内抗体鉴定出的蛋白的蛋白质评分。当进行了一些实验时，3个值以“/”来分开报道。第2栏，用无关的胞内抗体鉴定出的蛋白的蛋白质评分。第3栏，鉴定出的蛋白的Genbankgi号。第4栏，蛋白在Genbank中的名称。第5栏，预测的分子量。
在较高等的真核细胞中发现了功能至今未知的蛋白，其遍在表达。用cDNA文库鉴定出的它的序列在物种间高度保守(图12)。
步骤6：蛋白靶标的验证
-3H2-1潜在靶标：ABCF1
为了确认对蛋白的鉴定，重复了为质谱分析法进行的IP(免疫沉淀)实验，然后是通过针对ABCF1蛋白的市售Ab揭示的免疫印迹(图13a)。这个印迹显示，ABCF1蛋白被scFv3H2-1特异性地免疫沉淀，因为其在对照IP中不存在。
用二聚体化形式的3H2-1(3H2-Fc)，以及针对ABCF1的市售抗体，对RBL-2H3细胞进行了IF标记。这些分析揭示了相似的细胞质标记(图13b)。
-5H4潜在靶标：LOC297607
以与质谱分析相同的方式，用5H4-VH进行了RBL-2H3裂解物的IP，并通过用针对LOC蛋白的市售Ab的WB来揭示(图14a)。该印迹揭示了5H4-VH识别天然形式的LOC蛋白。
这个结果通过IF分析和共聚焦显微镜的双标记得到了证实。这项实验揭示了对LOC蛋白的胞质溶胶标记，以及对应于5H4-VH和针对LOC的市售Ab的信号的共定位(图14b)。
-5H4靶标：LOC297607，通过shRNA证实
通过shRNA(短发夹RNA)对LOC蛋白的表达进行抑制，然后进行相关表型的研究，以通过独立方法来确认LOC蛋白在肥大细胞激活中作用。因此，用Dharmacon软件(http://www.dharmacon.com/designcenter)构建了针对LOC蛋白的两个shRNA，sh1(SEQIDNO:30)和sh2(SEQIDNO:31)；以及一个对照的无关shRNA：针对萤光素酶的shLUC。相应的shRNA序列在图15中显示。
将shRNA克隆至逆转录病毒表达载体pSIREN中以感染RBL-2H3系。用嘌呤霉素进行选择，这使得仅有被感染的表达不同shRNA的细胞被回收。从嘌呤霉素选择开始，进行了5、10和15天在下文详述的细胞测试，并在三个独立系列的shRNA感染的细胞上进行。
为了对蛋白表达的消失进行控制，首先对提取自不同类型细胞的RNA进行了RT-qPCR。
图16a显示了用受感染的细胞获得的结果，之前用编码次黄嘌呤-鸟苷酸磷酸核糖基转移酶的管家基因HPRT进行标准化。这个实验揭示了，sh1表达在选择的第5天清除了这个蛋白的85％的信使，并在选择的第10天和第15天清楚了66至73％。通过sh2对LOC信使的清除显示了相似的结果，在选择5和15天有范围从58至64％的抑制。
还通过WB来确认了对蛋白的清除。来自表达不同shRNA的细胞的蛋白提取物用针对LOC的市售Ab来揭示。在对轨道之间的电荷进行标准化后，在选择5天后，当sh1表达时细胞内LOC蛋白的损失被评估为50-71％(取决于系列)，而在选择15天后多达88％(图16b)。sh2的表达是较低抑制(约30％)的源头。
在整个嘌呤霉素选择过程中，进行细胞测试以评估shRNA对肥大细胞激活的影响。β-己糖胺酶的测量揭示，在选择的5天后，表达sh1的细胞表现出28％的显著抑制(图17a)。TNF-α(一种新合成的(neosynthesised)递质)的释放，在选择的第5天也受到了41％的抑制(图17b)。细胞内钙流出分析也在第5天显示出重大抑制(图17c)。
在肥大细胞激活后，信号转导通过蛋白酪氨酸激酶(PTK)和蛋白酪氨酸磷酸酶(PTP)的活性之间的平衡来介导。这是由若干细胞内基质的磷酸化增加而引起的。通过WB用针对P-Tyr的单克隆抗体Ab4G10对未受FcεRI刺激的或受其刺激的细胞的蛋白提取物进行了分析。注意到，LOC表达的减少影响了一些细胞内蛋白的磷酸化，所述细胞内蛋白迁移了约130、75、50-60kDa(图18)。为了得到关于这些蛋白身份的启示，用针对相似大小的且已知涉及肥大细胞激活的蛋白的不同抗体揭示了这个印迹。
-将磷酸-特异性的抗体用于涉及肥大细胞激活的关键蛋白，说明了LOC干扰Src家族酪氨酸激酶Fyn的信号传导途径。的确，我们观察到了对蛋白Gab2(GRB2相关结合蛋白2)(一种Fyn的底物)的磷酸化的抑制，以及随后的Akt(蛋白激酶B)和NF-κB(激活的B细胞的核因子κ轻链增强子)的磷酸化受到了影响。
这些初步结果确认了蛋白LOC涉及FcεRI激活之后的肥大细胞激活。的确，在通过shRNA感染后第一周期间，细胞中的蛋白的部分清除是抑制钙流出以及预先形成和新合成的过敏递质(β-己糖胺酶和TNF-α)释放的表型的根源。
LOC蛋白的结构是未知的，对保守的基序进行了检索，其揭示了潜在的酪氨酸和丝氨酸残基磷酸化位点。我们还鉴定了两个邻近的“ITIM-样”基序，其与免疫细胞的抑制性受体中存在的基序相似，并且能通过其SH2结构域(氨基酸319-342：SLYSTSLCGLVLLVDNRINSYSGI)招募潜在的配偶体(partner)。
实施例2：用逆转录病毒表达系统进行的表型筛选
用逆转录病毒系统来调整表型筛选以适应scFv文库在相同的肥大细胞系中的表达。其目标是优化这类方法以将其应用到其他表型的研究。原则与实施例1中所述方法的相同，除了如下选择：的确，病毒方法先天地使得能够在整个选择期间避免在先的scFv文库再克隆步骤，以及相同群体的使用。
步骤1：scFv文库的克隆
将与质粒选择相同的scFv文库(Philibert等,2007)克隆至pMSCV-hygro-GFP载体中。这个载体一方面在细胞被感染时带来了潮霉素抗性，另一方面使得能够产生与GFP蛋白融合的scFv。因此可以评估感染效率，并且还可以在整个选择过程中监测和控制胞内scFv表达。在克隆了文库之后，通过大肠杆菌的转化将其扩增。推定的初始多样性为2x108个克隆。
步骤2：RBL-2H3系的感染
使用的逆转录病毒上清在用编码scFv文库、衣壳蛋白以及兼噬性被膜(amphotropicenvelop)蛋白的基因共转染293T细胞后产生。这个系统使得能够以超过95％的效率感染RBL-2H3系。
通过qPCR来检验每个细胞的拷贝数，并显示每个细胞具有1-3个scFv拷贝。为了保持在可控的实验条件中，感染了4x107个RBL-2H3细胞。因此，在这些条件下，推定的初始scFv文库的多样性约为108。
步骤3：表型筛选
感染后4天，用IgE/DNP激活细胞，并将其用膜联蛋白V-APC和碘化丙啶进行标志，并通过FACS分析(图19)。
然后分选对应于最少荧光细胞的10％的群体，并直接进行培养，以扩增细胞用于接下来在一周后的选择。用此方式进行了8轮选择。
在第6轮选择中表现出对表型的抑制。的确，未受IgE/DNP刺激的和受IgE/DNP刺激的细胞群体之间，膜联蛋白V-APC的移位从第一轮的51％变为第6轮的16％，和第7轮的15％。
为了控制表型的出现是来自抑制性scFv的富集而不是由于细胞偏好如群体漂移，或是根据其基因组插入位点的scFv富集，进行了逆转录病毒文库的第二次选择，包括再克隆步骤。
从来源于第3轮选择的细胞的DNA开始，通过PCR扩增scFv序列并将其克隆至pMSCV新-潮霉素-GFP(new-hygro-GFP)载体中。在转化至病毒中后，对新的细胞群体进行感染。每2轮选择重复这个再克隆步骤(在第5’和第7’轮)。
用膜联蛋白V-APC标记的结果显示这种选择方法也使得向抑制性表型收敛，这证明其不是所使用的细胞群体的表型漂移(图20)。有趣的是，具有再克隆的选择几乎完全清除了所述表型，因为对应的抑制超过90％。
对来源于不同轮选择的细胞群体的脱颗粒表型的演变进行了分析。将来自不同分选步骤的细胞的等分试样解冻，并传代培养以达到对整个群体的β-己糖胺酶释放的某个量度。结果显示，与对照细胞相比，用scFv文库感染的来自第7轮的细胞有75％的脱颗粒的减少(图21a)，而来自第7’轮的细胞有57％(图21b)。
步骤4：稳定转染子的产生与分析
-稳定转染子的表型
将来自包括再克隆步骤的逆转录病毒选择的细胞等分试样以有限稀释接种在96孔板上。在潮霉素选择后，通过测量β-己糖胺酶的释放，一式两份分析了50个细胞克隆(图22)。
该分析揭示了测试的50个克隆的脱颗粒与10个无关克隆相比，受到了平均为54％的抑制。
-高通量测序
通过高通量测序(或NGS，“下一代测序”)，用Illumina技术来分析了逆转录病毒文库在两个表型选择模式期间(有或没有再克隆步骤)的多样性演变。
被分析的scFv序列扩增自在第一轮筛选前感染的106个细胞(原初文库(naivelibrary))，还扩增自来自第3、5和7轮中每一轮的5x105个细胞(进行或不进行再克隆)。最终对33x106个scFv进行了测序。
从感染了原初文库并进行了分析的106个细胞，得到了约107条VH序列，其中4-5x105条序列是独一无二的。这个结果说明文库的多样性已经受到了逆转录病毒感染的显著影响。的确，所述差异可能是由于如下事实造成的：在逆转录病毒感染和基因组DNA提取之间的3-4天期间，细胞将有时间倍增，这以2的系数降低了多样性。
测序揭示了超过99％的读取序列都具有H3或L3而没有移码或终止密码子。
对独一无二的核苷酸序列的翻译产生了2-3x105个独一无二的VH氨基酸序列和3x105个VL序列。这些结果反映了来自106个被分析细胞的文库的实际多样性。这个多样性潜在地随VH和VL之间可能的组合数而增长。
这些测序分析还揭示了以相同数量的被分析细胞开始，直接和再克隆的逆转录病毒选择之间独一无二序列的数量是相当的，这表明克隆步骤似乎不影响文库的多样性。
-统计学分析
测序后，用SAMSeq软件(微阵列的显著性分析)对数据进行了统计学分析(Li和Tibshirani，2011)，其对于每条序列计算了富集的统计学分数，并从而确定了在选择期间显著富集的序列子集合。通过设置FDR(错误发现率)为0.05，有2500-10000条序列表现出富集。
统计学分析的下一步是对两种选择在不同轮次之间的scFv序列富集方面、或在倍数变化(FoldChange,FC)和出现频率(这对应于每个文库中同一序列的存在)方面进行比较。此处的数字涉及VH序列的分析。用VL文库获得了相似的结果。
被认为富集的序列相当于在选择期间有增加，且其在原初文库和第7轮之间的FC大于或等于100的序列。最终，以再克隆的选择富集了110条VH序列，而直接选择为107。
将这些序列彼此进行比较，使其能集合成簇或族，其中它们之间具有至少60％同一性。将110条来自再克隆的选择的序列中的71条再集合成14个簇(每个含有2-25条序列)，并将107条直接选择的序列中的54条集合成17个簇(每个簇2-7条序列)。在这31个簇中，我们保留了那些在7轮后至少以0.1％存在于最终富集的文库中的簇。最终，10个来自再克隆的选择的簇和3个来自直接选择的簇被选出并进行进一步研究(图23)。
-逆转录病毒选择的比较
两次选择后富集的VH序列频率和FC的比较揭示：
-再克隆的选择导致FC高达直接选择的两倍：FCmax分别等于1246和492；
-发生频率的中值也约为再克隆的选择的两倍重要：频率分别等于7.6x10-5和4.2x10-5(图24)
-最后，来自再克隆的选择的110个VH代表第7轮后文库全部序列的40％，而来自直接选择的107个VH代表低于10％。
总之，根据这个分析，在发生频率和倍数变化方面，再克隆的选择似乎都具有比直接选择更佳的富集。一个假说是，没有再克隆，选择可能由于在偏好感兴趣的表型出现的插入位点的富集而带有倾向性。因此选择中包括再克隆步骤会通过限制这种倾向性而优化scFv抑制剂的富集。
-逆转录病毒和质粒选择的比较
最终，对应于质粒选择的178条scFv序列(随机装订(stitched)的稳定克隆和序列)包含在第二次分析中，以比较用质粒和逆转录病毒选择富集的scFv序列，所述比较是以簇进行而不是单独进行的。
有趣的是，注意到两种选择仅有一条共有序列，并且其是5H4的VH结构域(图25)。值得注意的是，5H4簇是从再克隆的选择中选出的10个最佳簇的一部分。
这条序列用逆转录病毒选择表现出150倍的富集。
-逆转录病毒克隆的验证
将13个簇的每一个的最频繁序列克隆到pMSCV-潮霉素-GFP逆转录病毒载体中，并且分析了逆转录病毒感染的细胞群体的细胞表型。如图27中所述，大多数克隆显示出FcεRI刺激后对脱颗粒的抑制。这些结果确证了在最后一轮选择中抑制性抗体序列的存在以及通过如下统计学方法正确地鉴定出了这些抗体序列。
材料和方法
1.试剂和抗体
使用的所有抗体都是从SantaCruzBiotechnology(SantaCruz,CA,USA)获得的，除了磷酸特异性的抗体(phosphor-specificAntibodies)，其是从CellSignalingTechnologies(Danvers,MA,USA)获得的。抗-LOC(抗-C12orf4)抗体和所有试剂都是从Sigma-Aldrich(StLouis,MO,USA)获得的。
2.细胞培养
大鼠肥大细胞系RBL-2H3：在37℃，有5％CO2的湿润温育箱中，在DMEM培养基中培养RBL-2H3细胞(ATCC,Manassas,VA)，所述培养基补充有15％胎牛血清(FCS)和抗生素。将贴壁细胞一周传代3次。通过在37℃在5分钟期间用胰蛋白酶处理来使细胞脱附，并随后通过添加两倍体积的细胞培养基来灭活。
细胞系293T(或HEK-T)：在37℃，有5％CO2的湿润温育箱中将这些细胞保持在DMEM培养基中的培养物中，所述培养基补充有10％FCS和抗生素。
杂交瘤：在37℃，有5％CO2的湿润温育箱中将产生鼠单克隆抗体的杂交瘤保持在DMEM培养基中的培养物中，所述培养基补充有10％FCS和抗生素。将含有抗体的培养上清过滤并保存在20℃。通过ELISA技术确定抗体浓度。
3.表型选择
3.1scFv文库的克隆
将真核细胞胞质表达表达载体pEF/myc/cyto(Invitrogen)用于在RBL-2H3细胞中表达scFv文库。这个载体包含启动子EF1a，接着是含有初始ATG的NcoI位点。克隆是在NcoI和NotI位点之间进行的，后者之后是可通过9E10单克隆抗体来检测的c-Myc表位。为了将scFv文库克隆到这个载体中，通过PCR用PfuADN-聚合酶(Promega,Madison,WI,USA)和M13rev-49和scFvCAT2.rev引物(35个循环，55℃)对VHpool和VLpool亚文库(其是CDR3环的多样性的来源(P.Philibert等,2007))进行组装。纯化后，用NcoI(Fermentas,ThermoFisherScientific,Waltham,MA,USA)和NotI(NewEnglandBiolabs,Ipswich,MA,U.S.)酶来消化PCR，然后在凝胶上进行纯化和定量。pEF/myc/cyto载体也用NcoI和NotI酶进行消化，并随后在凝胶上进行纯化和定量。将线性化的载体用于与T4DNA连接酶插入物的等摩尔连接。在65℃将连接灭活20分钟并纯化。将其用于对C-Max5αF'感受态细菌进行电穿孔(Sidhu等,2000)，然后将其铺板于含有100μg/ml氨苄青霉素的LB的600cm2方形皿中。在37℃温育16h后，用推刮器(rake)将细胞回收到含有10％甘油的LB中并以等分试样保存在-80℃。用NucleobondXtraMaxi试剂盒(MachereyNagel)，将相当于文库多样性的40倍的等分试样用于制备DNA。这个DNA相当于随后用于RBL-2H3细胞系转染的文库。对氨苄青霉素有抗性的细菌进行计数，以评估scFv文库的初始多样性。在这些条件下，克隆到pEF载体中的文库的估计大小为109个克隆。为了scFv文库通过逆转录病毒感染的表达，使用了包含包装序列ψ的pMSCV-潮霉素-GFP载体(Clontech)。克隆在Sfi和NotI位点之间进行。对于这个克隆，克隆到pMSCV载体中的文库的估计大小为2x108个克隆。为了表型选择期间的再克隆步骤，从分选的细胞的基因组DNA，通过PCR用pMSCV.for和EGFP-N.back引物，用TaqPhusion来扩增scFv序列。用Sfi和NotI酶消化与文库相对应的插入，在凝胶上纯化，然后通过连接再次克隆到pMSCV-潮霉素-GFP载体中。与之前一样，通过CMax5αF'细菌培养来扩增质粒DNA，并通过试剂盒纯化。
3.2scFv文库的质粒转染
通过离心用培养基将被胰蛋白酶消化的RBL-2H3细胞洗涤一次，然后以107细胞/ml将其重悬于培养基中，所述培养基补充有1mM丙酮酸钠(Invitrogen)。将500μl这种细胞悬液与50μg质粒混合并转移至4mm电穿孔杯(BioRad,Hercules,CA,U.S.)中。将小杯置于冰上5分钟然后用GenePulserI(BioRad)以310V和960μF电容进行电穿孔。脉冲后，将细胞悬液置于含有在有5％CO2的温育箱中预热过的培养基的培养瓶中。24小时后，更换培养基。在第一轮选择中，对3x108个细胞进行了电穿孔，然后每个随后的轮次仅电穿孔了107个细胞。稳定转染子的选择培养基含有如下这样的培养基，所述培养基通过在转染后第一周添加终浓度为1mg/ml并且后续为2mg/ml的遗传霉素(G418,Gibco)从而得到补充。
3.3scFv文库的逆转录病毒感染
最初，通过293T细胞来产生逆转录病毒上清。铺板之后一天，用阳离子剂(Polyplus,Illkirch,France)，用感兴趣的DNA，以及编码兼噬性被膜基因(vsv-g)和gag/pol基因的DNA进行瞬时双转染。48h后，收集培养物上清，过滤，并用于感染RBL-2H3细胞。因此，在早上将细胞铺板，并用1/3体积的逆转录病毒上清、2/3体积的培养基和8μg/ml凝聚胺感染。感染后48h，用补充有选择剂的新鲜培养基替换培养基。转基因的表达从感染后第4-5天能检测到。通过向培养基添加1mg/ml潮霉素B(Invitrogen)来选出稳定转染子。
3.4细胞激活、膜联蛋白标记和细胞分选
将细胞在37℃与抗DNP(二硝基苯基)IgE杂交瘤(hybridome)上清以0.5μg/ml的最终IgE浓度温育一晚。在激活当天，将细胞用RPMI洗涤一次并用Tyrode缓冲液(10mMHEPESpH7.4、130mMNaCl、5mMKCl、1mMCaCl2、1mMMgCl2、5.6mM葡萄糖和0.01％BSA)洗涤一次。然后在Tyrode缓冲液中用100ng/mlDNP-KLH(与二硝基苯基缀合的钥孔血兰素，Sigma-Aldrich,StLouis,MO,USA)在37℃黑暗中激活细胞45分钟。通过将细胞置于冰上或通过在4℃离心来终止激活。一旦细胞受到刺激，立即用膜联蛋白V-APC(BectonDickinsonBiosciences,SanJose,CA,USA)对它们按如下步骤进行标志：将100μl膜联蛋白V-APC添加至2x106细胞(包含在500μl中)，在黑暗中置于冰上30min。然后用20μg/ml碘化丙啶来标记细胞3分钟，然后进行FACS分析。通过流式细胞术进行的分析和分选在标记之后立即进行，凭借FACSAriacell分选仪(BD)在MontpellierRioImaging平台上进行。
3.5DNA提取
合成所有寡核苷酸并通过HPLC由MWG(Ebersberg,Allemagne)对其进行纯化。质粒DNA提取和纯化、PCR和连接试剂盒，均来自MachereyNagel(Duren,Germany)。基因组DNA和RNA提取是通过Qiagen(Germantown,MD,USA)制造的试剂盒进行的。
4.稳定转染子的分析
4.1稳定克隆的产生
如上所述转染RBL-2H3细胞并在有限稀释中以每5孔1个细胞接种在96孔培养板上。在转染后2天通过添加与所用质粒提供的抗性相对应的抗生素从而选出转染子。
4.2β-己糖胺酶释放的测量
实验前一天，在96孔培养板上每孔接种105个细胞。24小时后，如此前所述通过添加抗DNPIgE过夜，然后是50-200ng/mlDNP-KLH在37℃持续45分钟，来激活贴壁细胞。在收集每孔上清后(S1)，用裂解缓冲液(Tyrode缓冲液，0.5％Triton,50μg/ml抑肽酶,50μg/ml抑蛋白酶肽,50μg/ml胃蛋白酶抑制剂,2mMPMSF)在冰上裂解细胞20分钟。然后将平板以2000rpm离心5分钟，并收获与细胞裂解物对应的上清(S2)。通过在37℃添加50μl终浓度为1.3mg/ml的β-己糖胺酶底物(对二硝基苯基-N-乙酰基-β-D-氨基葡萄糖苷酶,SIGMA)1h30，对20μl的各个S1和S2上清实施β-己糖胺酶剂量。β-己糖胺酶底物是在pH4.5的0.1M柠檬酸溶液中新鲜配制的或储存于-20℃。通过向每孔添加75μl的0.4M甘氨酸(pH10.7)来终止反应，并通过测量405nm处的光多样性来评估染色强度。β-己糖胺酶释放的百分比根据如下比率来计算：S1/(S1+S2)x100。
4.3膜联蛋白V-Fitc标记
与Fitc(25μg/ml储液,AssayDesigns,AnnArbor,MI)偶联的膜联蛋白V被用于脱颗粒分析。将10μl的膜联蛋白V-Fitc添加到106个细胞中(包含在1ml中)，避光置于冰上30min。然后，为了将脱颗粒细胞群体与经历凋亡的细胞进行区分，将终浓度为20μg/ml的碘化丙啶添加至细胞，3分钟后进行流式细胞术分析。
4.4钙流出的测量
为了测量细胞内钙流出，通过在37℃添加抗-DNPIgE伴随搅拌(60-70rpm)保持2-3小时刺激悬液中的106个细胞。在RPMI中洗涤后(1000rpm离心5分钟)，用Fluo3-AM(Invitrogen)以5μM的终浓度在室温避光对细胞进行标记30分钟。标记后，在RPMI中进行洗涤，然后将细胞以106细胞/ml重悬，并保持在冰上。使标记稳定1h。在其通过添加DNP激活和通过流式细胞术分选之前，将所述细胞在37℃温育10分钟。将两个等分试样的细胞用于分析作为时间的函数的FL1中的钙流出。第一管细胞使得能设置细胞计数器以排除碎片和确立细胞的基底荧光。然后通过添加终浓度为200ng/ml的DNP-KLH来激活第二批细胞。细胞内Ca2+流在数秒内增加，而分析进行2-3分钟。随后，在Excel上对群体的平均荧光进行分析。
4.5TNF-α释放的测量
在实验前一天，在12孔培养板上每孔接种8x105个细胞。次日，在用RPMI洗涤和用Tyrode洗涤后，如早前所述在37℃用每孔200μl的50ng/mlDNP-KLH激活细胞2h。收获上清并用于对释放的TNF-α进行定量，所述定量是用ELISA试剂盒(BD)进行的。用冷的PBS洗涤细胞单层一次，并在补充有0.1％Triton和蛋白酶抑制剂(CompleteMini无EDTA片剂,Roche)的PBS中于4℃裂解15分钟。用BCAssay试剂盒(Uptima)测量细胞蛋白的量，以将结果标准化。
4.6高通量测序
提取了用于原初文库的106个细胞的基因组DNA，或用于随后文库的5x106个细胞的基因组DNA，并通过PCR用在VH和VLscFv结构域边界的引物进行扩增。然后根据测序步骤制备要分析的DNA。
在MGX-Montpellier测序平台上进行分析。
用SAM软件分析数据。
5.靶标鉴定和验证
5.1Ab片段的产生和纯化
-与小鼠Fc融合的scFv的产生
在先将抗体片段通过在BgIII和EcoRI位点插入克隆至载体ps1119中，所述载体允许与小鼠IgG1型的Fc(mufc)融合表达scFv。用(Polyplus)、用编码Ac片段的DNA和载体ps1119瞬时转染293T细胞。转染后6h，用OPTIMEM(Gibco)替换培养基。在6天后收获富含muFc形式的scFv的培养上清，以0.2μm过滤并储存于-80℃。
-来自细菌胞质提取物的抗体片段的产生
将抗体片段克隆至载体pET23NN(来自Novagen的经修饰的载体，其允许表达scFv产物C末端处的Myc标签和6xHis标签)中的NcoI和NotI位点之间。scFv在大肠杆菌胞质中表达所遵循的实验方案已被发明人团队描述(Guglielmi和PierreMartineau,2009)。
-来自细菌周质提取物的抗体片段的产生
将抗体片段插入到载体pHEN2中的位点NcoI和NotI处。如此转化HB2151细菌。在16℃，于含有100μg/ml氨苄青霉素和1％葡萄糖的2xTY中预培养16小时后，在37℃细菌重新开始生长。在0.8的OD600nm处，通过在30℃添加终浓度为1mM的IPTG持续3-4h，从而引发诱导。然后以3500rpm将细菌离心20分钟并在冰上将沉淀于如下缓冲液中裂解15分钟：30mMTris、pH8、20％蔗糖、1mMEDTA、1mMPMSF。离心后，将5mMMgCl2和MgSO4添加至上清周质。然后将提取物储存在-20℃。
-镍树脂上的纯化
在来自Qiagen的镍NTA树脂上纯化抗体片段。然后是相应的Ni-NTA旋转试剂盒的步骤。
-镍磁珠上的纯化
对于每次免疫沉淀，根据试剂盒说明书，用20μl的磁性镍珠(Ademtech,Pessac,France)从对应于50ml的培养物的细菌胞质提取物纯化scFv。
5.2细胞蛋白裂解物的产生和免疫沉淀
在RPMI中将细胞层洗涤两次。用50-100ng/mlDNP-KLH在RPMI中的溶液将激活的细胞在37℃在黑暗中刺激3-10分钟。用含有磷酸酶抑制剂(100mMNaF，5mM原钒酸盐)的冷的PBS洗涤后，将细胞在冰上用含有PBS的裂解缓冲液裂解15分钟，所述PBS补充有0.5％脱氧胆酸钠、1％NP-40、0.1％SDS。在用推刮器刮擦培养皿后，通过在4℃以13000rpm离心15分钟，使细胞裂解物澄清。将等分试样的含有蛋白提取物的上清用BCAssay试剂盒(Uptima)进行测定，将剩余的裂解物用上样缓冲液来补足(2％SDS，10％甘油，2.5％β-巯基乙醇，0.01％溴酚蓝，30mMTrispH6.8)。
对于免疫沉淀，用3mg的蛋白裂解物与之前从磁性镍珠上的细菌胞质提取物纯化出的scFv在4℃进行2h免疫沉淀。洗脱前，用此前描述的补充有10mM咪唑的裂解缓冲液进行三次10分钟的洗涤。洗脱通过添加500mM咪唑进行，然后用上样缓冲液补充洗出液，并加载于凝胶上用于SDS-PAGE电泳。
5.3SDS-PAGE和MS/MS分析
将免疫沉淀的蛋白通过10％丙烯酰胺凝胶上的电泳进行分离。用考马斯亮蓝进行染色后，将感兴趣的条带切下、脱色、还原(reduced)、烷基化并用胰蛋白酶处理消化，如此前的工作所述(Shevchenko等,2007)。用于质谱分析的方法是纳反相LC-MALDIMS/MS。然后用ProteinPilot软件分析数据。在Montpellier,France的ProteomicsImaging和MolecularInteraction平台上进行MS/MS分析。
5.4Western印迹
为了进行这些分析，将蛋白转移至0.2μm硝酸纤维素膜上。在每次杂交前，将膜于TBS-T缓冲液(10mMTrispH7.4,150mMNaCl,和0.1％Tween)中的5％BSA中室温封闭1h。在用特异性的和与过氧化物酶(HRP)偶联的二级抗体杂交后，凭借ECL-Plus化学发光底物(PerkinElmer,Waltham,MA,UnitedStates)并用化学发光摄像机G-Box(Syngene,Cambridge,UK)使蛋白可视化。对检测到的信号强度的定量是用同一制造商提供的软件来评估的。
5.5免疫荧光
将细胞接种于Labtek匣中的玻片上。这些实验的所有阶段都在室温进行。在PBS中洗涤两次后，用3.7％甲醛(Sigma)固定细胞10分钟，然后用含有0.05％皂素和0.2％BSA的PBS将细胞透化10分钟。然后将抗体温育1-2h。洗涤后，将玻片装在Mowiol中并在3-4h后观察。
5.6shRNA
将使用的shRNA序列(图15中列出)通过连接克隆至载体pSIREN(Clontech)中。在转化热感受态细菌后产生DNA，并通过使用试剂盒来将其纯化。
如前述在用含有不同shRNA序列和病毒DNA的pSIREN载体双转染293T细胞后产生了逆转录病毒上清。通过在逆转录病毒感染2天后向培养基添加2.5g/ml的嘌呤霉素(HyClone,ThermoScientific)选出被感染的RBL-2H3细胞。
5.7.RT-qPCR
用Qiagen试剂盒从105-106个细胞提取总RNA并将其纯化。用100ng的随机引物，用M-MuLV逆转录酶(Invitrogen)对1μg的总RNA进行反转录。随后对由此获得的cDNA通过使用SYBRGreenI主混合物进行qPCR，并在LightCycler480(Roche)上进行检测。用同一制造商提供的软件分析数据。
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序列
SEQIDNO:1:细胞内抗体3H2-1
SEQIDNO:2:细胞内抗体3H2-VH
SEQIDNO:3:细胞内抗体5H4
SEQIDNO:4:细胞内抗体5H4-VH
SEQIDNO:5:细胞内抗体5H4-VL
SEQIDNO:6:细胞内抗体13R4
SEQIDNO:7:簇R_1的细胞内抗体的VH链的CDR3
SEQIDNO:8:簇R_2的细胞内抗体的VH链的CDR3
SEQIDNO:9:簇R_3的细胞内抗体的VH链的CDR3
SEQIDNO:10:簇R_4的细胞内抗体的VH链的CDR3
SEQIDNO:11:簇R_5的细胞内抗体的VH链的CDR3
SEQIDNO:12:簇R_6的细胞内抗体的VH链的CDR3
SEQIDNO:13:簇R_7的细胞内抗体的VH链的CDR3
SEQIDNO:14:簇R_9的簇R_8细胞内抗体的VH链的CDR3
SEQIDNO:15:簇R_10的细胞内抗体的VH链的CDR3
SEQIDNO:16:簇D_1的细胞内抗体的VH链的CDR3
SEQIDNO:17:簇D_2的细胞内抗体的VH链的CDR3
SEQIDNO:18:簇D_3的细胞内抗体的VH链的CDR3
SEQIDNO:19:簇R_1的细胞内抗体的VL链的CDR3
SEQIDNO:20:簇R_2的细胞内抗体的VL链的CDR3
SEQIDNO:21:簇R_3的细胞内抗体的VL链的CDR3
SEQIDNO:22:簇R_4的细胞内抗体的VL链的CDR3
SEQIDNO:23:簇R_5的细胞内抗体的VL链的CDR3
SEQIDNO:24:簇R_6的细胞内抗体的VL链的CDR3
SEQIDNO:25:簇R_9的细胞内抗体的VL链的CDR3
SEQIDNO:26:簇R_10的细胞内抗体的VL链的CDR3
SEQIDNO:27:簇D_1的细胞内抗体的VL链的CDR3
SEQIDNO:28:簇D_2的细胞内抗体的VL链的CDR3
SEQIDNO:29:簇D_3的细胞内抗体的VL链的CDR3
SEQIDNO:30:sh1shRNA对LOC297607的有义链
SEQIDNO:31:sh2shRNA对LOC297607的有义链
SEQIDNO:32:LOC297607CDS(登录号:NM_001106623.1GI:157820036)
SEQIDNO:33:LOC297607的氨基酸序列(NP_001100093.1GI:157820037)
SEQIDNO:34:C12ORF4CDS(登录号:NM_020374.2GI:22095357)
SEQIDNO:35:C12ORF4的氨基酸序列(登录号:NP_065107.1GI:9966847)
SEQIDNO:36LOC57102CDS(登录号:JV047725.1；GI:384948381)
SEQIDNO:37:LOC57102的氨基酸序列(登录号:AFI37796.1GI:384948382)
SEQIDNO:38:LOC28040CDS(登录号:NM_138594.3GI:142372851)
SEQIDNO:39:LOC28040的氨基酸序列(NP_613060.1GI:20070406)
SEQIDNO:40:人ABCF1CDS(登录号:NM_001025091.1GI:69354670)
SEQIDNO:41:人ABCF1的氨基酸序列(登录号:NP_001020262.1GI:69354671)
SEQIDNO:42:胞内抗体3H2-1的VH结构域的CDR3序列
SEQIDNO:43:胞内抗体3H2-VH的VH结构域的CDR3序列
SEQIDNO:44:胞内抗体5H4的VH结构域的CDR3序列
SEQIDNO:45:sh1shRNA对LOC297607的有义链
SEQIDNO:46:sh2shRNA对LOC297607的有义链
Claims (39)
1.用于鉴定涉及细胞表型的细胞靶标的方法，该方法包括：
a)鉴定包含免疫球蛋白的完整VH和/或VL结构域的胞内抗体，当其存在于细胞内时其能诱导、修饰或抑制所述表型；
b)鉴定细胞靶标，其是所述细胞中所述胞内抗体的直接或间接靶标；并任选地
c)分离所述细胞靶标。
2.根据权利要求1的方法，其中步骤a)包括筛选细胞内表达的胞内抗体文库，其中所述胞内抗体包含免疫球蛋白的完整VH和/或VL结构域。
3.根据权利要求1或2的方法，其中步骤a)包括：
i)获得分子文库，其中来自文库的每个分子编码不同的胞内抗体，所述胞内抗体包含免疫球蛋白的完整VH和/或VL结构域；
ii)对具有步骤i)的分子文库的细胞群进行转染；
iii)在足以获得可检测的对所述表型的诱导、修饰或抑制的时间和条件下培养经转染的细胞；
iv)将显示出对所述表型的诱导、修饰或抑制的步骤iii)的细胞选出；
v)任选地，在选自步骤iv)的细胞上或在再克隆自选自步骤iv)的细胞的细胞上重复步骤iii)和iv)，以进行一轮或多轮额外的选择；和
vi)鉴定引起对所述表型的诱导、修饰或抑制的胞内抗体。
4.根据权利要求3的方法，其中所述方法包括至少一轮选择后的再克隆步骤，以及对再克隆的细胞进行一轮或多轮选择。
5.根据权利要求3或4的方法，其中所述编码胞内抗体的分子是载体。
6.根据权利要求5的方法，其中所述载体是整合载体如逆转录病毒载体。
7.根据权利要求2-6中任一项的方法，其中所述胞内抗体文库和/或所述分子文库是通过对在细胞内是功能性的胞内抗体进行选择，然后在其一个或多个CDR区中引入修饰而获得的。
8.根据权利要求1-7中任一项的方法，其中所述胞内抗体的所述直接或间接靶标结合至所述胞内抗体或能与所述胞内抗体一起被免疫沉淀。
9.根据权利要求1-8中任一项的方法，其中所述胞内抗体是scFv、包含至少一个完整VH或VL结构域的截短的scFv、双抗体(diabody)、完整VH结构域或完整VL结构域。
10.根据权利要求1-9任一项的方法，其中所述完整VH结构域和/或完整VL结构域来源于人抗体。
11.根据权利要求1-10任一项的方法，其进一步包括：
-用RNA干扰技术或所述细胞靶标的已知抑制剂进行靶标确认的步骤；和/或
-鉴定所述细胞靶标的表位或活性位点的步骤；和/或
-鉴定分子的步骤，所述分子与步骤a)中鉴定出的胞内抗体对步骤b)中鉴定出的靶标的结合进行竞争，并且所述分子能够修饰所述细胞表型。
12.根据权利要求1-11任一项的方法，其中所述细胞是真核细胞，优选为哺乳动物细胞如人细胞。
13.根据权利要求12的方法，其中所述真核细胞是涉及过敏、炎症或二者均涉及的细胞，并且其中所述表型是关于过敏反应、炎症反应或与二者均有关的表型。
14.包含scFv5H4的VH结构域的CDR3序列“DGGLREGFDC”的胞内抗体。
15.根据权利要求14的胞内抗体，其进一步包含scFv13R4的VH结构域的CDR1序列和CDR2序列。
16.根据权利要求14的胞内抗体，其中所述胞内抗体是胞内抗体5H4(SEQIDNO:3)、5H4-VH(SEQIDNO:4)或5H4-VL(SEQIDNO:5)。
17.胞内抗体，其包含scFv3H2-1的VH结构域的CDR3序列“PIAVSDY”。
18.根据权利要求17的胞内抗体，其进一步包含scFv3H2-1的VL结构域的CDR3序列，并且优选地包含scFv13R4的VH结构域的CDR1序列和CDR2序列，和/或scFv13R4的VL结构域的CDR1序列和CDR2序列。
19.根据权利要求18的胞内抗体，其中所述胞内抗体是胞内抗体3H2-1(SEQIDNO:1)。
20.胞内抗体，其包含scFv3H2-VH的VH结构域的CDR3序列“GVRGGYGLDF”。
21.根据权利要求20的胞内抗体，其进一步包含scFv13R4的VH结构域的CDR1序列和CDR2序列。
22.根据权利要求21的胞内抗体，其中所述胞内抗体是胞内抗体3H2-VH(SEQIDNO:2)。
23.胞内抗体，其包含SEQIDNO:7至SEQIDNO:18所示的VHCDR3序列之一。
24.根据权利要求23的胞内抗体，其中所述胞内抗体进一步包含SEQIDNO:19至SEQIDNO:29所示的VLCDR3序列之一或进一步包含一个谷氨酰胺作为VLCDR3序列。
25.根据权利要求24的胞内抗体，其中所述胞内抗体进一步包含scFv13R4的VH结构域的CDR1序列和CDR2序列，和/或scFv13R4的VL结构域的CDR1序列和CDR2序列。
26.根据权利要求14-25的胞内抗体，其用于治疗中的用途。
27.根据权利要求26的胞内抗体，其用于治疗过敏和/或炎症。
28.根据权利要求14-16任一项的胞内抗体用于鉴定分子的用途，所述分子能与所述胞内抗体对来自C12ORF4家族的蛋白的结合进行竞争，并能在涉及过敏和/或炎症的细胞中修饰与过敏和/或炎症反应有关的表型。
29.根据权利要求28的用途，其中所述来自C12ORF4家族的蛋白是C12ORF4、LOC57102、LOC297607或LOC28040，优选为C12ORF4。
30.根据权利要求17-19任一项的胞内抗体用于鉴定分子的用途，所述分子能与所述胞内抗体对来自ABCF1家族的蛋白的结合进行竞争，并能在涉及过敏和/或炎症的细胞中修饰与过敏和/或炎症反应有关的表型。
31.根据权利要求28-30任一项的用途，其中所述分子是具有100-2500Da的分子量的有机分子。
32.来自C12ORF4家族的蛋白的抑制剂，其用于治疗中的用途。
33.根据权利要求32的抑制剂，其用于治疗过敏和/或炎症。
34.根据权利要求32或33的抑制剂，其中所述抑制剂是
-胞内抗体或其抗原结合片段，其能结合至C12ORF4家族的蛋白，优选为根据权利要求14-16任一项的胞内抗体或其抗原结合片段；
-能干扰C12ORF4家族的蛋白在细胞中表达的RNA分子；或
-具有100-2500Da的分子量的有机分子，其能将根据权利要求8-10任一项的胞内抗体从其与C12ORF4家族的蛋白的结合位点置换出来。
35.根据权利要求32-34的抑制剂，其中所述C12ORF4家族的蛋白是C12ORF4、LOC57102、LOC297607或LOC28040，优选为C12ORF4。
36.ABCF1家族的蛋白的抑制剂，其用于治疗中的用途。
37.根据权利要求36的抑制剂，其用于治疗过敏和/或炎症的用途。
38.根据权利要求36或37的抑制剂，其中所述抑制剂是
-胞内抗体或其抗原结合片段，其能结合至ABCF1家族的蛋白，优选为根据权利要求17-19任一项的胞内抗体或其抗原结合片段；
-能干扰ABCF1家族的蛋白在细胞中表达的RNA分子；或
-具有100-2500Da的分子量的有机分子，其能将根据权利要求11-13任一项的胞内抗体从其与ABCF1家族的蛋白的结合位点置换出来。
39.根据权利要求36-38的抑制剂，其中所述ABCF1家族的蛋白是ABCF1。
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