CN105334326A

CN105334326A - 一种铜蓝蛋白检测试剂盒

Info

Publication number: CN105334326A
Application number: CN201510694321.0A
Authority: CN
Inventors: 范刚; 董雯; 李静
Original assignee: Biobase Biodustry Shandong Co Ltd
Current assignee: Biobase Biodustry Shandong Co Ltd
Priority date: 2015-10-24
Filing date: 2015-10-24
Publication date: 2016-02-17

Abstract

本发明公开了一种铜蓝蛋白检测试剂盒，属于临床体外检测试剂技术领域。本发明试剂盒包括试剂R1、试剂R2、校准品。通过在试剂R1中加入一定量的二氧化硅包覆的磁性纳米颗粒和在试剂R2中加入一定量的牛血清白蛋白和Kathon-CG，有效的提高了试剂盒的稳定性和分析灵敏度，其线性范围也较好，试剂的准确度高，有利于在市场中进一步的推广使用。

Description

一种铜蓝蛋白检测试剂盒

技术领域

本发明涉及临床体外检测试剂技术领域，特别涉及一种铜蓝蛋白检测试剂盒。

背景技术

铜蓝蛋白(CP)又称铜氧化酶，是一种含铜的α2糖蛋白，分子量约为12万-16万，不易纯化。目前所知为一个单链多肽，每分子含6-7个铜原子，由于含铜而呈蓝色，含糖约10%，末端唾液酸与多肽链连接，具有遗传上的基因多形性。其作用为调节铜在机体各个部位的分布、合成含铜的酶蛋白，有着抗氧化剂的作用，并具有氧化酶活性。一般认为铜蓝蛋白由肝脏合成，一部分由胆道排泄，尿中含量甚微。铜蓝蛋白测定对某些肝、胆、肾等疾病的诊断有一定意义。

CP具有氧化酶的活性，对多酚及多胺类底物有催化其氧化之能力。最近研究认为CP可催化Fe²⁺氧化为Fe³⁺。对于CP是否是铜的载体存在不同看法。血清中铜的含量虽有95%以非扩散状态处于CP，而有5%呈可透析状态由肠管吸收而运输到肝的，在肝中渗入CP载体蛋白（apoprotein）后又经唾液酸结合，最后释入血循环。在血循环中CP可视为铜的没有毒性的代谢库。细胞可以利用CP分子中的铜来合成含铜的酶蛋白，例如单胺氧化酶、抗坏血酸氧化酶等。

近年来另一研究结果认为CP起着抗氧化剂的作用。在血循环中CP的抗氧化活力可以防止组织中脂质过氧化物和自由基的生成，特别在炎症时具有重要意义。CER也属于一种急性时相反应蛋白。血浆CP在感染、创伤和肿瘤时增加。其最特殊的作用在于协助Wilson病的诊断，即患者血浆CP含量明显下降，而伴有血浆可透析的铜含量增加。大部分患者可有肝功能损害并伴有神经系统的症状，如不及时治疗，此病是进行性和致命的，因此宜及时诊断，并可用铜螯合剂-青霉胺治疗。血浆CP在营养不良、严重肝病及肾病综合征时亦往往下降。妇女妊娠期、口服避孕药时其含量有明显增加。

血浆铜蓝蛋白（CP）临床意义:(1)升高：①重症感染：炎症、肝炎、骨膜炎、肾盂肾炎、结核病、尘肺等。②恶性肿瘤：白血病、恶性淋巴瘤、各种癌。③胆汁瘀滞：原发性胆汁瘀滞型肝硬化、肝外阻塞性黄疸、急性肝炎、慢性肝炎、酒精性肝硬化。④甲状腺功能亢进、风湿病、类风湿性关节炎、再生障碍性贫血、心肌梗死、手术后等。⑤其他：急性精神分裂症、震颤性谵妄、高胱氨酸尿症、妊娠、口服避孕药。⑥见于结核，矽肺，甲亢，恶性肿瘤(如白血病，霍奇金病，肝癌等)等。⑦在生理情况下妊娠，口服避孕药，CP亦可升高。⑧慢性肝炎和肝硬化时铜蓝蛋白的变化规律尚无一致看法，从理论上讲，肝细胞受损害时血中浓度应降低，但RUSSO等测定54例慢性活动性肝病患者血清铜蓝蛋白无一例降低，反而有近一半病例升高，与肝豆状核变性时截然不同。⑨有助于鉴别肝硬化和肝癌，原发性肝癌时血清铜蓝蛋白高于正常的几率为>8.3%，肝硬化时高于正常的几率为12%。(2)降低：①Wilson病即肝豆状核变性(为最有价值的诊断指标)。②营养不良：肾病综合征、吸收不良综合征、蛋白漏出性胃肠症、肾病综合征、低蛋白血症等。③原发性胆汁性肝硬化、原发性胆道闭锁症等。④新生儿、未成熟儿。⑤见于严重的低蛋白血症，肾病综合征等。⑥诊断肝豆状核变性：该病时铜蓝蛋白显著降低，可能由于铜过高地沉积于肝及基底核或是铜蓝蛋白合成障碍所致。

样本中的CP抗原与试剂中相应的抗体反应，形成抗原-抗体复合物，使溶液形成一定浊度。在340nm波长下检测，该浊度的高低在一定量抗体存在时与抗原的含量成正比。通过与同样处理的校准液比较，计算未知样本中CP的含量。该方法是一种无需预处理样本，技术和设备要求不高，而精密度和特异性更高的分析方法。由于该方法不需要昂贵的设备，可以实现自动化，且可测定大量标本，因此受到临床广泛推广。但是普通的铜蓝蛋白检测试剂稳定性不好，灵敏度也不高，因而限制了其在临床上的推广应用。

发明内容

针对现有技术存在的问题，本发明提供了一种铜蓝蛋白检测试剂盒，该试剂盒与常规的试剂盒相比，稳定性比常规的检测试剂盒要好，分析灵敏度高，有利于试剂在临床上的推广应用。

本发明是通过以下措施实现的：

一种铜蓝蛋白检测试剂盒，其特征在于，它包含试剂R1、试剂R2和校准品，其中试剂R1组成为：50mmol/LpH8.0Tris缓冲液、0.1%叠氮钠、0.1%-2%二氧化硅包覆的磁性纳米颗粒、40.0g/L聚乙二醇；试剂R2组成为：50mmol/LpH8.0Tris缓冲液、30ml/L羊抗人CP抗体、20-40g/L牛血清白蛋白、0.05%Kathon-CG。

所述二氧化硅包覆的磁性纳米颗粒为Fe₃O₄/SiO₂复合纳米粒子，粒径为20-50nm。

所述试剂R1和试剂R2在使用时的比例为R1：R2=225：75。

本发明所使用的二氧化硅包覆的磁性纳米颗粒是采用以下方法制备的：

采用多元醇法制备Fe₃O₄纳米粒子。取一定的乙酰丙酮铁和三甘醇加入到回流加热反应装置中，在磁力搅拌和Ar气保护的条件下，将装置缓慢加热至沸腾，并保持回流一段时间。冷却后向反应溶液中加入乙酸乙酯使生成的四氧化三铁纳米粒子产生絮凝，磁性分离黑色产物，清洗数次，分散到乙醇中，即得到稳定的Fe₃O₄纳米粒子乙醇胶体溶液。之后将所得Fe₃O₄纳米粒子采用Stober水解法制得SiO₂包覆的Fe₃O₄纳米粒子。所得Fe₃O₄/SiO₂复合纳米粒子的粒径为20-50nm。

本发明所使用的校准品为上海元升生物技术有限公司生产的CP校准品。

本发明的试剂盒在具有双试剂功能的自动生化分析仪上进行，其具体使用方法为：加入生理盐水、样本或校准品5μl，之后再加入R1试剂225μl预孵育5min后再加入75μl的试剂R2，之后读取吸光度A1，反应5min后，读取吸光度A2，并计算ΔA。

本发明的有益效果：

本发明提供的铜蓝蛋白检测试剂盒，通过在试剂R1中加入二氧化硅包覆的磁性纳米颗粒，该磁性纳米颗粒在静电吸附的作用下与羊抗人CP抗体结合，从而使抗体在磁性纳米颗粒上形成凝集，大大的提高了试剂的分析灵敏度。同时在试剂R2中加入牛血清白蛋白，解决了抗体在稀溶液中不稳定这一难题，在试验中它能使抗体稳定，且相对地中性，但不会影响抗体的性质，而Kathon-CG是一种新型高效环保型广谱杀菌剂、防腐剂，在该试剂盒中使用Kathon-CG有效解决了BSA长时间保存易发霉的缺点，因此BSA与Kathon-CG共同作用有效地增强了试剂盒的稳定性，却不会对试剂的准确度产生影响，有利于该试剂在市场中进一步的推广。

附图说明

图1实施例2准确度验证实验检测结果与对照组检测结果相关性；

图2实施例3准确度验证实验检测结果与对照组检测结果相关性；

图3实施例4准确度验证实验检测结果与对照组检测结果相关性；

图4实施例1-4线性相关验证实验检测结果；

图5稳定性验证实验检测结果；

图6分析灵敏度实验结果。

具体实施方式

为了更好的理解本发明，下面结合具体实施例来进一步详细说明。

实施例1

一种常规的铜蓝蛋白检测试剂盒，它包括试剂R1、试剂R2、校准品。

其中试剂R1组成为：

pH8.0Tris缓冲液50mmol/L

叠氮钠0.1%

聚乙二醇40.0g/L

试剂R2组成为：

pH8.0Tris缓冲液50mmol/L

羊抗人APOE抗体30ml/L

本实施例描述的试剂盒，在使用时，其测定方法是采用具有双试剂功能的东芝120自动分析仪，操作如下：

加入生理盐水、样本或校准品5μl，之后再加入R1试剂225μl预孵育5min后再加入75μl的试剂R2，之后读取吸光度A1，反应5min后，读取吸光度A2，并计算ΔA。

本实施例所使用的校准品为上海元升生物技术有限公司生产的CP校准品。

实施例2

一种铜蓝蛋白检测试剂盒，它包括试剂R1、试剂R2、校准品。

其中试剂R1组成为：

pH8.0Tris缓冲液50mmol/L

叠氮钠0.1%

聚乙二醇40.0g/L

二氧化硅包覆的磁性纳米颗粒0.1%

试剂R2组成为：

pH8.0Tris缓冲液50mmol/L

羊抗人APOE抗体30ml/L

牛血清白蛋白20g/L

Kathon-CG0.05%

具体测定方法同实施例1。

实施例3

一种铜蓝蛋白检测试剂盒，它包括试剂R1、试剂R2、校准品。

其中试剂R1组成为：

pH8.0Tris缓冲液50mmol/L

叠氮钠0.1%

聚乙二醇40.0g/L

二氧化硅包覆的磁性纳米颗粒1%

试剂R2组成为：

pH8.0Tris缓冲液50mmol/L

羊抗人APOE抗体30ml/L

牛血清白蛋白30g/L

Kathon-CG0.05%

具体测定方法同实施例1。

实施例4

一种铜蓝蛋白检测试剂盒，它包括试剂R1、试剂R2、校准品。

其中试剂R1组成为：

pH8.0Tris缓冲液50mmol/L

叠氮钠0.1%

聚乙二醇40.0g/L

二氧化硅包覆的磁性纳米颗粒2%

试剂R2组成为：

pH8.0Tris缓冲液50mmol/L

羊抗人APOE抗体30ml/L

牛血清白蛋白40g/L

Kathon-CG0.05%

具体测定方法同实施例1。

对上述实施例1-4中制得的试剂盒分析性能进行实验验证。

准确度验证实验：

将实施例2、3、4的试剂盒作为实验组，市场上获得认可的一种准确度优异的铜蓝蛋白检测试剂盒（上海某公司生产）作为对照组进行对比实验，对40个样本进行检测，检测的结果如图1-图3。

通过图1-图3的检测数据可知，实施例2、3、4检测试剂盒与对照检测试剂盒的检测结果相关性分别为0.9983、0.9988、0.9985，相关性比较好，表明本发明的试剂盒与市场上获得认可的具有优异准确度的铜蓝蛋白检测试剂盒有高度一致性，证明本发明试剂盒添加的其他各种成分对其准确性不会造成影响，试剂盒依然保持较好的准确度。

线性相关性验证实验：

找到铜蓝蛋白高值样本为80mg/dL，用生理盐水进行系列稀释，配制6个不同浓度的样本，依次为80mg/dL、64mg/dL、48mg/dL、32mg/dL、16mg/dL、0mg/dL浓度的样本，每个浓度水平各样本分别测定三次，分别取其平均值。分别利用实施例1、2、3、4的试剂进行检测。检测结果如图4所示。

上述检测结果显示，实施例1-4检测结果相关性均大于0.999，达到产品标准要求，说明在试剂中加入二氧化硅包覆的磁性纳米颗粒、牛血清白蛋白和Kathon-CG不会降低试剂检测的线性相关性。

稳定性验证实验：

在2℃～8℃、无腐蚀性气体的避光环境中贮存试剂，检测四种实施例试剂的稳定性。四种试剂每月选取同一样本测定其吸光度三次，取平均值，与新鲜的实施例1试剂检测结果进行对比，从而确定试剂的稳定时间。检测数据如图5。

实验结果显示，实施例1试剂在2℃～8℃、无腐蚀性气体的避光环境中贮存15个月稳定，而实施例2、3、4试剂在2℃～8℃、无腐蚀性气体的避光环境中贮存24个月稳定，说明在试剂中加入牛血清白蛋白和Kathon-CG，二者共同作用有效的提高了铜蓝蛋白检测试剂盒的稳定性。

分析灵敏度验证实验：

用本发明铜蓝蛋白试剂盒测试已知浓度在32.6mg/dL的样本，记录吸光度差值。分别利用实施例1、2、3、4的试剂进行检测。检测结果如图6所示。

通过检测数据可知，实施例2、3、4检测试剂盒的吸光度差值均比实施例1的高，说明在试剂中加入二氧化硅包覆的磁性纳米颗粒在静电吸附的作用下与羊抗人CP抗体结合，从而使抗体在磁性纳米颗粒上形成凝集，扩大了响应信号，大大的提高了试剂的分析灵敏度。

综合以上分析，本发明提供的铜蓝蛋白检测试剂盒，在试剂R1中通过加入一定量的二氧化硅包覆的磁性纳米颗粒和在试剂R2中加入一定量的牛血清白蛋白和Kathon-CG能够有效的提高试剂盒的稳定性和分析灵敏度，线性范围较好，试剂的准确度也较好。因此，本发明提供的铜蓝蛋白检测试剂盒有利于在市场中进一步的推广使用。

Claims

1.一种铜蓝蛋白检测试剂盒，其特征在于，它包含试剂R1、试剂R2和校准品，其中试剂R1组成为：50mmol/LpH8.0Tris缓冲液、0.1%叠氮钠、0.1%-2%二氧化硅包覆的磁性纳米颗粒、40.0g/L聚乙二醇；试剂R2组成为：50mmol/LpH8.0Tris缓冲液、30ml/L羊抗人CP抗体、20-40g/L牛血清白蛋白、0.05%Kathon-CG。

2.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述二氧化硅包覆的磁性纳米颗粒为Fe₃O₄/SiO₂复合纳米粒子，粒径为20-50nm。

3.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂R1和试剂R2在使用时的比例为R1：R2=225：75。