CN105331620A - 一种人工合成的BT抗虫基因FLAc及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种人工合成的BT抗虫基因FLAc及其应用，其核苷酸序列为：1)序列如SEQ？ID？NO.1所示的DNA分子；或2)SEQ？ID？NO.1所示核苷酸序列经取代、缺失和/或增加一个或几个核苷酸所得的DNA分子；或3)在严格条件下与1)限定的DNA序列杂交且编码相同功能多肽的核苷酸序列。本发明抗虫基因FLAc已报道的Cry基因最大同源性为77％，在拔节期、吐丝期高密度人工接玉米螟均显现出突出的抗玉米螟虫活性，为抗虫性基因的推广及商业化奠定基础。

Description

一种人工合成的BT抗虫基因FLAc及其应用

技术领域

本发明涉及基因工程和生物防治技术领域，具体涉及一种人工合成的BT抗虫基因FLAc及其应用。

背景技术

苏云金芽胞杆菌(Bacillusthuringiensis，简称Bt)是一种分布非常广泛的革兰氏阳性菌。早在1901年从染病的家蚕体液中分离出一种对部分鳞翅目(Lepidoptera)昆虫具有毒杀作用的细菌，即Bt。研究发现Bt在芽孢形成过程中，菌体的一端或两端会形成一个或多个具有生物活性的蛋白质伴胞晶体，能在一些昆虫体内活化成有毒性的蛋白，并与昆虫中肠上皮细胞的特异性受体结合，使其产生穿孔，从而杀灭昆虫。

Bt的杀虫活性与伴胞晶体(parasporalcrystal)有关，人们称这种蛋白质为δ-内毒素(δ-endotoxins)或杀虫晶体蛋白(insecticidalcrystalprotein，ICP)，而将编码这种蛋白的基因统称为Bt基因。目前已经从不同Bt的亚种中分离出400多种Bt基因，它们编码的杀虫晶体蛋白对鳞翅目、双翅目、鞘翅目、膜翅目、同翅目、直翅目、食毛目等多种昆虫，以及线虫、螨类和原生动物具有特异性的杀虫活性。由于该蛋白还具有对人畜无害，不污染环境等优点，Bt基因已成为目前世界上应用最为广泛的抗虫基因。

将具有溶胞作用的杀虫晶体蛋白归到Cyt类，其余归为Cry类，相应的基因记为Cyt和Cry。本专利中涉及的FLAc基因编码的杀虫晶体蛋白为Cry类。杀虫晶体蛋白是根据氨基酸同源性进行分类的。同源性在45％以下，为第一等级，用阿拉伯数字表示；同源性在45％～78％之间，为第二等级，用大写英文字母表示；同源性在78％～95％之间，为第三等级，用小写英文字母表示；同源性在95％以上，为第四等级，用阿拉伯数字表示。例如Cry1Ab2。

对已经获得的Cry蛋白家族X-ray结构研究结果表明，Cry蛋白家族的三维结构典型特征是含有明显能区分出来的三个Domain，即DomainⅠ、DomainⅡ、DomainⅢ。DomainⅠ由7个α螺旋组成，是杀虫蛋白发挥功能的主要区域，参与了杀虫蛋白低聚物形成和插入细胞膜形成穿孔导致细胞死亡的过程，其中第1、3、4和5个α螺旋在发挥功能起到最关键作用。已有的研究表明：第1个α螺旋是启动杀虫活性的部位，当第1个α螺旋被切除后，杀虫蛋白低聚物开始形成，并插入细胞膜导致跨细胞膜穿孔。第3个α螺旋是不同杀虫蛋白亚基相互结合形成低聚物的区域。第4和5个α螺旋形成发卡(hairpin)结构，是杀虫作用的具体执行区域，主要功能是杀虫蛋白形成低聚物的结合点也是插入细胞膜形成跨膜穿孔的区域(Natalie,etal.,2001)。DomainⅡ由β折叠组成3个loop环，主要参与杀虫蛋白与受体结合。DomainⅢ由β折叠组成轮状拓补结构，主要参与杀虫蛋白与受体的识别，是不同BtCry蛋白识别不同害虫的主要功能区域，DomainⅡ和DomainⅢ共同决定靶标害虫的类型(Bravo,etal.,2007)。Cry蛋白家族成员之间虽然氨基酸序列不同，但是在三维结构上相对保守，表明该家族所有成员具有相似的杀虫机制(Cohen,etal.,2008)。

由于Bt杀虫蛋白对靶标害虫群体的生态选择压和Bt杀虫蛋白特异识别昆虫体内的特定受体特性，为昆虫不断进化而产生抗性后代提供了极大的概率。1985年首次报道了印度谷螟对稻谷Bt孢子杀虫剂产生了抗性，经过研究发现实验室条件下给印度谷螟连续饲喂亚致死量孢子杀虫剂15代后就会出现抗性种群(McGaughey，1985)。1997年，在夏威夷种植的豆瓣菜喷施Bt杀虫剂400倍以上时，出现了野生小菜蛾(Plutellaxylostella)抗性群体(Liu和Tabashnik，1997)。在实验室条件下通过给昆虫饲喂Cry杀虫蛋白已经人工筛选出了多个抗性昆虫种群(自然条件下野生型没有产生抗性)，进一步证明了长期大量使用一种Cry蛋白必定会导致抗性昆虫的产生(Tabashnik,etal.,2005)。目前为止，自然条件下共发现了三个鳞翅目害虫对Bt制剂产生了抗性：印度谷螟、小菜蛾和粉纹夜蛾(McGaughey，1985；Tabashnik，1994；Janmaat和Myers，2003)。同时，还报道了四起昆虫对Bt农作物产生抗性的事件：在美国棉铃虫对Cry1Ac的抗虫棉产生抗性(Tabashnik,etal.,2008)；在波多黎各斜纹夜蛾对Cry1F转基因玉米产生抗性(Storer,etal.,2010)；在南非玉米楷夜蛾对Cry1Ab玉米产生抗性(vanRensburg，2007)；在印度棉红铃虫对Cry1Ac转基因棉花产生抗性(Bagla，2010)。

自然界中，由于在Bt菌对靶标昆虫具有特异的毒杀作用，导致靶标昆虫为了生存而产生一些突变来抵抗Bt菌的毒杀，最终导致对Bt菌产生抗性。为了适应靶标昆虫的进化，Bt菌体内杀虫蛋白尤其是Cry蛋白家族也在不断发生突变，从而维持对靶标害虫的杀虫活性。通过Cry蛋白家族系统进化分析表明该家族成员的进化主要有两个途径：即三个结构域的独立突变和不同杀虫蛋白之间DomainⅢ的交换(Bravo，1997；deMaagd,etal.,2001)。三个结构域的独立突变主要是不同的结构域内部发生氨基酸突变，不同结构域之间的突变互不影响，该途径突变最终导致新杀虫蛋白不断的产生，是新杀虫蛋白不断的产生地主要途径。DomainⅢ是Cry蛋白与受体蛋白的识别区域，是决定靶标的主要功能区域，不同杀虫谱Cry蛋白之间通过交换DomainⅢ结构域可以增加杀虫蛋白的杀虫谱。天然存在的不同杀虫蛋白之间DomainⅢ的交换，发生交换的杀虫蛋白DomainIII的氨基酸序列具有高度的相似性。此外，据报道通过人工交换不同杀虫蛋白之间DomainⅢ构建的融合Cry蛋白可以提高杀虫蛋白的杀虫效率，例如通过交换Cry1Ab和Cry1C的DomainⅢ构建了一个新的Cry蛋白(1Ab-1Ab-1C)，该蛋白对甜菜夜蛾幼虫的杀虫活性比单纯Cry1Ab和Cry1C杀虫活性高出十倍以上(deMaagd,etal.,2000)。最新报道表明通过交换不同杀虫蛋白之间的DomainⅢ可以扩大杀虫谱，将Cry3Aa的DomainⅠ和Ⅱ与Cry1Ab的DomainⅢ融合获得的新蛋白能够对玉米根萤叶甲产生毒杀作用，而Cry3Aa和Cry1Ab对其没有活性(Walters,etal.,2010)。

自从转Bt杀虫蛋白基因作物问世以来至上个世纪末，世界范围内相继有二十多个国家和地区开始种植转Bt基因的农作物。而近10年来随着转Bt杀虫基因农作物的不断推出和种植面积的持续上升，除欧洲之外，几乎全球所有的陆地都种植了转Bt杀虫基因农作物。据统计2009年全球的转Bt杀虫基因农作物种植总面积超过了5亿公顷，占全部转基因农作物种植面积的36％。其中2.17亿公顷种植了只含有Bt杀虫基因的转基因农作物，2.87亿公顷种植了转抗除草剂基因和Bt杀虫基因的农作物(James,2010)。美国是转Bt杀虫基因作物种植面积最大的国家，其次是印度、阿根廷、巴西和中国。尽管转BtCry杀虫基因作物对环境的影响在政府和公众之间存在较大的争议，但是Bt杀虫基因农作物产生的巨大生态效益却得到了广泛的认可。发展Bt农作物不仅可以减少农药使用量节约喷施农业所用的石油燃料，也可以通过鼓励实施免耕法种植转基因作物来减少CO₂排放量和保护土壤及水分流失。此外，大面积种植转Bt杀虫蛋白基因农作物，不仅减少了喷施农药的次数(从每生长季16次降低至2-3次)，而且减少了使用农药引起的中毒事件，结合作物增产10％带来的经济效益使农民增收多达40％以上，取得了巨大的经济、社会、生态效益(Subramanian和Qaim，2010)。通过监测农药环境影响指数(environmentalimpactquotient，EIQ)发现，1996-2008年种植转基因作物共减少农药使用量35.5万吨(占总农药使用量的8.4％)。仅2008年一年就减少农药使用量3.46万吨(占总农药使用量的9.6％)，在整个生态网络中农药环境影响指数降低了18.2％(Brookes和Barfoot，2010)。

Bt转基因抗虫植物就是通过研究Bt菌cry和cyt的特性，并将其修饰改造后转入植物中表达，使植物具有抵抗特异害虫的能力。自1995年以来，转Bt马铃薯、棉花和玉米已经在世界上许多国家广泛种植，并产生了很好的经济效益。新的Bt转基因抗虫植物也在不断增多，并逐渐大面积推广种植。Bt转基因植物的产生和发展为提高产量、降低生产成本以及减少环境污染做出了巨大贡献。

发明内容

本发明要解决的技术问题是提供一种可在作物中稳定表达、且表达量高、抗虫效果好的人工合成抗虫基因FLAc及其编码蛋白，并将其应用于载体构建、宿主细胞转化等方面。

本发明具体通过以下技术方案实现：

一种人工合成的BT抗虫基因FLAc，其核苷酸序列为：

1)序列如SEQIDNO.1所示的DNA分子；或

2)SEQIDNO.1所示核苷酸序列经取代、缺失和/或增加一个或几个核苷酸所得的DNA分子；或

3)在严格条件下与(1)限定的DNA序列杂交且编码相同功能多肽的核苷酸序列。

所述的严格条件为在0.1×SSPE或0.1×SSC和0.1％SDS的溶液中，65℃条件下杂交并洗膜。

本发明所述的BT抗虫基因FLAc的编码蛋白也属于本发明的保护范围。

所述的编码蛋白为如下氨基酸序列之一的蛋白：

a)序列如SEQIDNO.2所示的氨基酸序列组成的蛋白质；

b)将SEQIDNO.2所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能由序列SEQIDNO.2衍生的蛋白质。

上述(b)中的蛋白质可人工合成，也可先合成其编码基因，再进行生物表达得到。

本发明还要求保护所述抗虫基因FLAc的重组载体、表达盒、转基因细胞系或重组菌，其中所述重组载体，是将FLAc基因可操作地插入到载体中获得，上述载体可操作性地连于本领域已知的各种载体，尤其是真核表达载体(如pBI121或pCAMBIA3300)。

所述重组载体具体为pTF101.1-ubi-FLAc-2×35S-bar，该重组载体含有一个筛选基因bar，用作转化体的筛选和目的基因转入受体植株的鉴定。

本发明中所述的“可操作地连于”表示如下情况：即线性DNA序列的某些部分能够影响同一线性DNA序列其他部分的活性。例如，如果信号肽DNA作为前体表达并参与多肽的分泌，那么信号肽(分泌前导序列)DNA就是可操作地连于多肽DNA；如果启动子控制序列的转录，那么它是可操作地连于编码序列；如果核糖体结合位点被置于能使其翻译的位置时，那么它是可操作地连于编码序列。一般，“可操作地连于”意味着相邻，而对于分泌前导序列则意味着在阅读框中相邻。

本发明用所述重组载体转化宿主植物细胞，筛选获得转化细胞。然后将转化细胞培育成转基因抗虫能力植株及其后代，所述后代包括植物种子及植物组织。

本发明还提供了所述基因FLAc或含有该基因的重组载体在培育抗虫转基因植物中的应用，具体为通过将所述的基因或重组载体导入目的植物中，得到抗虫性高于所述目的植物的转基因植物。

所述目的植物为单子叶植物或双子叶植物，其中较优选为玉米。

此外，本发明还提供了一种培育抗虫能力植物的方法。该方法包括以下步骤：

1)将上述FLAc基因可操作地连于载体上的表达调控序列后，形成含SEQIDNO：1所示核苷酸序列的重组载体；

2)将重组载体转入植物细胞；

3)经筛选获得转化细胞，然后将转化细胞培育成转基因抗虫能力植株及其后代，所述后代包括植物种子及植物组织。

同时，扩增所述基因的全长或其任一片段的引物对也属于本发明的保护范围。

本发明的有益效果为：

本发明人工合成的抗虫基因FLAc基因与已报道的Cry基因最大同源性为77％；

本发明人工合成的抗虫基因FLAc兼具Cry1Ab、Cry1Ac两个基因的抗虫谱，可抗对Cry1Ab或Cry1Ac产生抗性的玉米螟，在拔节期、吐丝期高密度人工接玉米螟均显现出突出的抗玉米螟虫活性，且抗玉米螟虫级别为高抗免疫级别，为抗虫性基因的推广及商业化奠定基础。此外，该基因也可以转化棉花、水稻、蔬菜等农作物，使其具备相应的抗虫活性，从而降低农药的使用量，以减少环境污染和生产成本。本发明培育出抗虫植物的方法简便而有效，为提高植物抗虫提供了新的有效选择，具有重要的经济价值和广阔的应用前景。

附图说明

图1是FLAc基因植物表达载体的构建图；

图2是转FLAc基因玉米植株pcr检测电泳图；M：DL2000Marker；1：阳性对照(质粒)；2：阴性对照(非转基因植株)；3：空白对照(水)；4：转FLAc玉米植株；

图3是Bt-Cry1Ab/Ac免疫检测试纸条检测结果；A:非转基因玉米植株；B：转FLAc玉米植株；

图4是材料拔节期叶片室内抗虫性比较；A:非转基因玉米植株；B：转FLAc玉米植株；

图5是材料吐丝期室内花丝抗虫性比较；A:非转基因玉米植株接虫0天；B:非转基因玉米植株接虫4天；C:转FLAc玉米植株接虫0天；D:转FLAc玉米植株接虫4天。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明做进一步的说明，以下所述，仅是对本发明的较佳实施例而已，并非对本发明做其他形式的限制，任何熟悉本专业的技术人员可能利用上述揭示的技术内容加以变更为同等变化的等效实施例。凡是未脱离本发明方案内容，依据本发明的技术实质对以下实施例所做的任何简单修改或等同变化，均落在本发明的保护范围内。

以下实施例中的试验方法，如无特别说明，均为常规方法。以下实施例中所用的试验材料及试剂，如无特别说明，均购自常规生化试剂公司。

实施例1新型抗虫基因FLAc的获得

DomainⅢ是Cry蛋白与受体蛋白的识别区域，是决定靶标的主要功能区域，不同杀虫谱Cry蛋白之间通过交换DomainⅢ结构域可以增加杀虫蛋白的杀虫谱。

本发明将Cry1Ab的DomainⅠ和DomainⅡ与Cry1Ac的DomainⅢ进行交换融合，获得MCry1Ac。为了增加基因表达的稳定性，在重组抗虫基因MCry1Ac的基础上，在3’端连入了抗虫基因Cry1Ja1的碳端，得到重组抗虫基因FLMCry1Ac，与已报道Cry基因氨基酸序列最大同源性为91％。

为进一步提高重组抗虫蛋白的抗虫活力或扩大抗虫谱，按照单子叶植物编码特征对FLMCry1Ac进行了基因编码框、消除稀有密码子而利用最佳化密码子，二级结构最小化、调整GC含量等方法进行密码子改造，并合成最终获得FLAc基因，其核苷酸序列如SEQIDNO：1，编码蛋白的氨基酸序列为SEQIDNO：2。改造后的FLAc基因与已报道的核苷酸序列最大同源性为77％。

实施例2FLAc基因植物表达载体的构建

植物表达载体为pTF101.1，改造后重组载体包括：P35S启动子、TEV增强子、bar基因、大豆贮藏蛋白基因vsp终止子、玉米ubi启动子、FLAc基因和根癌农杆菌胭脂碱合成酶基因nos终止子，其中FLAc基因的CDS被连接入载体的限制性内切酶SmaⅠ和SacⅠ位点之间，如图1所示构建的植物表达载体命名为pTF101.1-ubi-FLAc，其核苷酸序列为SEQIDNO：3。

其中：

2×P35S启动子，630bp，来自花椰菜花叶病毒CaMV，负责启动bar基因的表达；

TEV增强子，231bp，来自烟草蚀纹病毒，负责增强bar基因的表达。

bar选择标记基因，552bp，编码171个氨基酸，来自吸水链霉菌，编码草铵膦乙酰转移酶，该酶通过乙酰化使草铵膦脱毒成为一种无活性的化合物，从而避免了对植物造成伤害。转bar基因的供体生物表现出对除草剂草铵膦的抗性。

Tvsp终止子，654bp，来自大豆贮藏蛋白基因，负责终止bar基因转录。

ubi启动子，1986bp，来自玉米基因组ubi基因，负责启动FLAc基因表达。

FLAc基因，3558bp，编码1185个氨基酸，为本发明中所述的重组抗虫基因。转FLAc基因的供体生物表现出对鳞翅目昆虫的抗性。

Tnos终止子，253bp，为根癌农杆菌Ti质粒T-DNA区胭脂碱合成酶基因终止子，终止FLAc基因转录。

实施例3转FLAc基因玉米植株的获得

本实验采用农杆菌介导的玉米遗传转化法，具体方法如下：

1、含有pTF101.1-ubi-FLAc的农杆菌EHA105在YEP固体培养基上涂布，28℃下暗培养1～3d。将培养好的农杆菌从平板上刮下重悬，调OD₅₅₀至0.3，制成侵染液。

2、取授粉9～12d的玉米HiⅡ幼穗，剥取幼胚于侵染液中浸染5min。侵染结束后，幼胚盾片朝上接种于共培养基中，20℃暗培养3d，再转至静息培养基中，28℃暗培养7d。

3、将正常发育的幼胚转至含有1.5mg/L双丙氨膦的选择培养基Ⅰ中，28℃暗培养2周。将诱导的初始愈伤组织转至含有3mg/L双丙氨膦的筛选培养基Ⅱ中，28℃暗培养2周，以后每两周更换一次筛选培养基Ⅱ。

4、当筛选得到的抗性愈伤组织增殖至直径2cm左右时，将其转至暗分化培养基上，25℃暗培养2～3周。将分化得到的胚芽鞘转至光分化培养基上，25℃光下培养2周。待胚芽鞘形成完整的茎、叶和根，将植株转入培养瓶中促根壮苗10d。

5、将植株移栽入营养钵，人工气候室中培养。待植株长出1～2片新叶后移入大花盆，转移至温室。

6、当植株生长至4-6叶期，取叶片提取DNA，采用PCR技术检测外源基因，转基因植株开花后套袋授粉自交结实。种子播种在大田，植株长至4-6叶期是取叶片提取DNA，采用PCR技术检测外源基因。

如图2所示，PCR检测结果表明，FLAc基因已经转移并整合入植物基因组中，获得了转FLAc基因玉米植株。

表1：PCR鉴定中所用引物及反应条件

实施例4检测FLAc基因在转化植物中的表达

采用Bt-Cry1Ab/Ac免疫检测试纸条检测FLAc基因的表达情况。

Bt-Cry1Ab/Ac免疫检测试纸条的使用方法：

1、取约0.3g新鲜幼嫩叶片放在2ml的离心管中。然后将放有叶子的管插在冰盒中，以保持新鲜度。

2、取液氮，将材料速冻，用钻头将材料研磨成粉，向管中迅速加入500μL-lmLSEB4样品提取缓冲液。

3、取出检测条，手持检测条顶端，做好检测标记。不要去掉保护膜。保持检测条垂直，将末端插入至离心管中。插入部分不要超过0.5cm。在检测过程中始终保持插入状态。

4、3-5分钟内出现反应条带(图3)

阳性结果：在检测条上出现两条灰色条带(方格内)，一条检测线和一条质控线。

阴性结果：在检测条上仅出现一条灰色质控线(方格内)。

试纸条检测结果表明，FLAc基因在转FLAc基因玉米植株中得到了表达。

实施例5转FLAc基因玉米植株拔节期叶片室内抗虫性鉴定

拔节期取叶片分别放入不同平皿中，每个平皿接5只初孵玉米螟幼虫，3次重复。接虫4天后观察叶片损伤情况。

结果如图4所示：非转基因植株叶片被玉米螟蛀蚀出很多虫孔，表现为感虫；转FLAc玉米植株叶片没有虫孔，表现为抗虫。

实施例6转FLAc基因玉米植株吐丝期花丝抗虫性鉴定

抽丝期取非转基因玉米植株、转FLAc玉米植株花丝分别放入不同平皿中，每个平皿接5只初孵玉米螟幼虫，3次重复。接虫4天后观察花丝损伤情况。

结果如图5所示：非转基因植株花丝已全部吃光，只剩深褐色的粪便和废屑，表现为感虫；转FLAc基因植株花丝损害相对较小，表现为抗虫。

Claims (9)

1.一种人工合成的BT抗虫基因FLAc，其特征在于，其核苷酸序列为：

1)序列如SEQIDNO.1所示的DNA分子；或

2)SEQIDNO.1所示核苷酸序列经取代、缺失和/或增加一个或几个核苷酸所得的DNA分子；或

3)在严格条件下与(1)限定的DNA序列杂交且编码相同功能多肽的核苷酸序列。

2.权利要求1所述抗虫基因FLAc的编码蛋白。

3.根据权利要求2所述的编码蛋白，其特征在于，所述的编码蛋白为如下氨基酸序列之一的蛋白：

a)序列如SEQIDNO.2所示的氨基酸序列组成的蛋白质；

b)将SEQIDNO.2所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能由序列SEQIDNO.2衍生的蛋白质。

4.含有权利要求1所述抗虫基因FLAc的重组载体、表达盒、转基因细胞系或重组菌。

5.根据权利要求4所述的重组载体，其特征在于，所述重组载体具体为pTF101.1-ubi-FLAc-2×35S-bar。

6.权利要求1所述抗虫基因FLAc或权利要求4所述重组载体在培育抗虫转基因植物中的应用。

7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，通过将所述抗虫基因FLAc或重组表达载体导入目的植物中，得到抗虫性高于所述目的植物的转基因植物。

8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于：所述目的植物为单子叶植物或双子叶植物，所述的单子叶植物为玉米。

9.一种培育抗虫能力植物的方法，其特征在于，包括以下步骤：

1)将所述的FLAc基因可操作地连于载体上的表达调控序列后，形成含SEQIDNO：1所示核苷酸序列的重组载体；

2)将重组载体转入植物细胞；

3)经筛选获得转化细胞，然后将转化细胞培育成转基因抗虫能力植株及其后代，所述后代包括植物种子及植物组织。