CN105331591A - PQQ-sGDH突变体、聚核苷酸及葡萄糖检测装置 - Google Patents
PQQ-sGDH突变体、聚核苷酸及葡萄糖检测装置 Download PDFInfo
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Abstract
本发明提供一种可溶性吡咯喹啉醌依赖性葡萄糖脱氢酶(PQQ-sGDH)突变体，其氨基酸位置对应于醋酸钙不动杆菌的野生型PQQ-sGDH序列SEQ？ID？NO？1，所述PQQ-sGDH突变体携带的突变包括以下一组突变中的一种：A194F、基于A194F的组合突变、基于Q192A的组合突变或基于Q192S的组合突变。这些PQQ-sGDH突变体具有良好的葡萄糖底物特异性，对麦芽糖等糖的交叉反应性显著下降，特别适合用于检测血液等样品中的葡萄糖。
Description
技术领域
本发明涉及可溶性吡咯喹啉醌依赖性葡萄糖脱氢酶(PQQ-sGDH)突变体，具体而言就是以醋酸钙不动杆菌野生型PQQ-sGDH编码基因或其编码蛋白同源性在90％以上的DNA作为模板，利用PCR扩增进行定点突变，获得一系列具有良好的葡萄糖底物特异性和/或热稳定性且对麦芽糖的交叉反应性显著降低的PQQ-sGDH突变体。同时还提供编码所述PQQ-sGDH突变体的聚核苷酸、包含所述聚核苷酸的表达载体、包含所述表达载体的转化细胞以及利用所述PQQ-sGDH突变体检测样品中葡萄的方法、试剂和装置。
背景技术
血糖浓度是糖尿病的一个非常重要的标志物。血糖浓度的测定在糖尿病的临床诊断和管理中极为重要。血糖的检测通常涉及酶催化下的葡萄糖氧化。根据酶的类型不同，可分为葡萄糖氧化酶(GOD)和葡萄糖脱氢酶(GDH)。在利用试纸条和血糖仪检测血糖时，GOD虽然具有较高的特异性，也不受到葡萄糖之外的糖类物质的干扰，但是极易受到血液中氧气的干扰而导致测定结果不准确。而GDH则不受到血液中氧气的干扰，因而得到广泛应用。
对GDH而言，根据其辅酶的不同，它大致可分为吡咯喹啉醌依赖性葡萄糖脱氢酶(PQQ-GDH)，黄素腺嘌呤二核苷酸依赖性葡萄糖脱氢酶(FAD-GDH)和烟酰胺腺嘌呤二核苷酸依赖性葡萄糖脱氢酶(NAD-GDH)。作为GDH中的一种，PQQ-GDH使用吡咯喹啉醌(PQQ)作为辅酶。
PQQ-GDH的EC编号早前为EC1.1.99.17，后被更改为EC1.1.5.2。目前科学家们已在细菌中发现两类PQQ-GDH(EC1.1.5.2)：第一种为膜结合的PQQ-GDH(PQQ-mGDH)；第二种是可溶性的PQQ-GDH(PQQ-sGDH)。这两种PQQ-GDH的生化性质差异较大。PQQ-sGDH只在不动杆菌属细菌的周质空间(periplasmicspace)中发现，如醋酸钙不动杆菌(Acinetobactercalcoacelicus)和鲍曼氏不动杆菌(A.baumannii)，以下以醋酸钙不动杆菌为例进行说明。
醋酸钙不动杆菌同时含有上述两种不同的PQQ-GDH，其中，PQQ-mGDH只在细菌细胞内是有活性的，而PQQ-sGDH只在细菌细胞外表现出活性。此外，它们的序列并不存在显著的同源性。PQQ-sGDH是由两个相同的亚基组成的，每个亚基含有3个钙离子，每个亚基的分子量为50kD，每个亚基的N端是一个由24个氨基酸残基组成的信号肽，在分泌到周质空间中后被切除。PQQ-sGDH可以催化多种单糖和二糖氧化成相应的酮，酮再进一步水解成醛糖酸，并且，该酶可以将氧化反应时产生的电子提供给吩嗪硫酸甲酯(PMS)、2,6-二氯靛酚(DCIP)、沃斯特蓝(Wurster’sblue)以及短链泛醌分子如泛醌Q1和泛醌Q2以及某些人工电子受体，如N-甲基二甲基苯基吡唑酮硫酸甲酯(N-methylphenazoniummethylsulfate)，以及导电聚合物等。相比于PQQ-mGDH，PQQ-sGDH具有良好的水溶性和较广的电子受体特异性，因此，它非常适合用于试纸条或血糖仪的葡萄糖测定之中。
然而，醋酸钙不动杆菌的野生型PQQ-sGDH也有自身的缺陷，即底物特异性较差：不仅能与葡萄糖发生氧化反应，而且也能氧化麦芽糖、半乳糖、乳糖、甘露糖、木糖和核糖等单糖和二糖分子发生氧化反应。这种反应性可能会使得一些糖尿病患者在测定自身血糖水平时获得错误的测量值。特别是当糖尿病患者静脉注射含麦芽糖或半乳糖或木糖制剂或者进行基于艾考糊精(icodextrin)的腹腔透析时，利用以PQQ-sGDH作为氧化酶的血糖仪测定的血糖值会错误性地升高，如果这些病人根据错误的血糖值接收治疗，可能会造成异常的低血糖症、昏迷，甚至死亡。
发明内容
针对现有技术的不足之处，本发明在醋酸钙不动杆菌野生型PQQ-sGDH编码基因或与其编码蛋白的氨基酸序列同源性在90％以上的DNA序列的基础上，利用定点突变PCR获得PQQ-sGDH突变体，所述突变体具有良好的葡萄糖底物特异性和/或热稳定性，对麦芽糖等糖的交叉反应性显著下降，将所述突变体用于血液等样品中的葡萄糖测试时，所测得的葡萄糖值准确性显著提高。
野生型PQQ-sGDH最先是从醋酸钙不动杆菌菌株LMD79.41中分离出来，其氨基酸序列和DNA序列分别在SEQIDNO1和SEQIDNO2中给出。
本发明中提及的“同源性”，是指来自除醋酸钙不动杆菌之外的微生物的野生型PQQ-sGDH在氨基酸序列上与SEQIDNO1具有至少90％的同源性。比如，鲍曼氏不动杆菌野生型PQQ-sGDH就满足这个条件，其野生型氨基酸序列已在中国专利申请CN200610067817.6中公开。这种同源性可利用ClustalW软件进行氨基酸序列比对就可得出。
本发明中的“氨基酸位点编号”是基于醋酸钙不动杆菌的野生型PQQ-sGDH序列SEQIDNO1计算出的。至于来自于其他微生物(如鲍曼氏不动杆菌)的野生型PQQ-sGDH的氨基酸位点编号，可通过ClustalW软件进行氨基酸序列比对找出这两种细菌的氨基酸位点编号的对应关系。本发明基于便于描述的原因，仅仅利用SEQIDNO1进行氨基酸位点编号。
本发明中诸如“A194F”之类的符号均表示一种替代突变，以A194F为例进行说明，其意思为194位点上的丙氨酸(Ala,A)被苯丙氨酸(Phe,F)取代。再以N452X为例，其意思为452位点上的天冬酰胺(Asn,N)被除N之外的任何一种氨基酸(X)取代，即X选自丙氨酸(Ala,A)、精氨酸(Arg,R)、天冬氨酸(Asp,D)、半胱氨酸(Cys,C)、谷氨酰胺(Gln,Q)、谷氨酸(Glu,E)、组氨酸(His,H)、异亮氨酸(Ile,I)、甘氨酸(Gly,G)、亮氨酸(Leu,L)、赖氨酸(Lys,K)、甲硫氨酸(Met,M)、苯丙氨酸(Phe,F)、脯氨酸(Pro,P)、丝氨酸(Ser,S)、苏氨酸(Thr,T)、色氨酸(Trp,W)、酪氨酸(Tyr,Y)或缬氨酸(Val,V)中的任何一种氨基酸。
本发明中诸如“A194F+M365V”之类的符号均表示一种组合替代突变，以A194F+M365V为例进行说明，其意思为194位点上的A被F取代和365位点上的M被V取代，其中“+”表示“+”前后的两种替代突变同时发生。
本发明的目的在于提供一种可溶性吡咯喹啉醌依赖性葡萄糖脱氢酶(PQQ-sGDH)突变体，所述PQQ-sGDH突变体源自于醋酸钙不动杆菌的野生型PQQ-sGDH氨基酸序列SEQIDNO1，或者源自于其他微生物的与SEQIDNO1具有至少90％同源性的野生型氨基酸序列，所述PQQ-sGDH突变体的氨基酸位点编号对应于来自醋酸钙不动杆菌的野生型PQQ-sGDH氨基酸序列SEQIDNO1，所述PQQ-sGDH突变体携带的突变包括选自以下一组突变中的一种：(1)A194F；(2)选自Q192A或Q192S的一种突变，且所述PQQ-sGDH突变体还在99、170、193、270、318、365、366、367、372、402、452和455位点中至少一个位点发生替换突变。
进一步地，所述PQQ-sGDH突变体携带的突变包括选自以下一组突变中的一种：(1)A194F，且所述PQQ-sGDH突变体还在99、167、170、192、193、270、318、365、366、367、372、402、452和455位点中至少一个位点发生替换突变；(2)选自Q192A或Q192S中的一种突变，且所述PQQ-sGDH突变体还在99、167、170、193、270、318、365、366、367、372、402、452和455位点中至少两个位点发生替换突变。
进一步地，所述PQQ-sGDH突变体携带的突变包括选自以下一组突变中的一种：(1)A194F，且所述突变体还在99、167、170、192、193、270、318、365、366、367、372、402、452和455位点中至少两个位点发生替换突变；
(2)Q192A+G99X+D167X+N452X；(3)Q192S+G99X+D167X+N452X；
(4)Q192A+G99X+S170X+Q270X+M365X+N452X+T372X；
(5)Q192A+G99X+S170X+Q270X+T366X+N452X+T372X；
(6)Q192A+G99X+S170X+Q270X+T366X+N452X+R402X；
(7)Q192A+G99X+S170X+Q270X+T366X+N452X+A318X；
(8)Q192A+G99X+S170X+Q270X+T366N+K455X+T372X；
(9)Q192S+G99X+S170X+Q270X+M365X+N452X+T372X；
(10)Q192S+G99X+S170X+Q270X+T366X+N452X+T372X；
(11)Q192S+G99X+S170X+Q270X+T366X+N452X+R402X；
(12)Q192S+G99X+S170X+Q270X+T366X+N452X+A318X；
(13)Q192S+G99X+S170X+Q270X+T366N+K455X+T372X。
进一步地，所述PQQ-sGDH突变体携带的突变包括选自以下一组突变中的一种：(1)A194F+G99X+D167X+N452X；
(2)A194F+G99X+S170X+Q270X+T366N+N452X+T372X；
(3)A194F+G99X+S170X+Q270X+T366N+N452X+R402X；
(4)A194F+G99X+S170X+Q270X+T366N+N452X+A318X；
(5)A194F+G99X+S170X+Q270X+T366N+K455X+T372X；
(6)Q192A+G99X+D167X+N452X+M365X；
(7)Q192A+G99X+D167X+N452X+T366X；
(8)Q192A+G99X+S170X+Q270X+M365X+T366X+N452X+T372X；
(9)Q192A+G99X+S170X+Q270X+T366N+N452X+K455X+T372X；
(10)Q192S+G99X+D167X+N452X+M365X；
(11)Q192S+G99X+D167X+N452X+T366X；
(12)Q192S+G99X+S170X+Q270X+M365X+T366X+N452X+T372X；
(13)Q192S+G99X+S170X+Q270X+T366N+N452X+K455X+T372X。
进一步地，所述PQQ-sGDH突变体携带的突变包括选自以下一组突变中的一种：(1)A194F+G99X+D167X+N452X+M365X；
(2)A194F+G99X+D167X+N452X+T366X；
(3)A194F+G99X+S170X+Q270X+T366N+N452X+K455X+T372X；
(4)Q192A+G99X+D167X+N452X+T366X+S170X；
(5)Q192A+G99X+S170X+Q270X+M365X+T366N+N452X+K455X+T372X；
(6)Q192S+G99X+D167X+N452X+T366X+S170X；
(7)Q192S+G99X+S170X+Q270X+M365X+T366N+N452X+K455X+T372X。
进一步地，所述PQQ-sGDH突变体携带的突变包括选自以下一组突变中的一种：(1)A194F+G99X+D167X+N452X+T366X+S170X；
(2)Q192A+G99X+D167X+N452X+T366X+S170X+Q270X；
(3)Q192S+G99X+D167X+N452X+T366X+S170X+Q270X。
进一步地，所述PQQ-sGDH突变体携带的突变包括A194F+G99X+D167X+N452X+T366X+S170X+Q270X。
进一步地，所述PQQ-sGDH突变体携带的突变若包括99位点，则99位点的G可被除G之外的任何一种氨基酸(X)取代，其中，X优选自W。
所述PQQ-sGDH突变体携带的突变若包括167位点，则167位点的D可被除D之外的任何一种氨基酸(X)取代，其中，X优选自E。
所述PQQ-sGDH突变体携带的突变若包括170位点，则170位点的S可被除S之外的任何一种氨基酸(X)取代，其中，X优选自G。
所述PQQ-sGDH突变体携带的突变若包括192位点，则192位点的Q可被除Q之外的任何一种氨基酸(X)取代，其中，X优选自A或S；最优地，X选自S。
所述PQQ-sGDH突变体携带的突变若包括193位点，则193位点的L可被除L之外的任何一种氨基酸(X)取代，其中，X优选自P或F。所述PQQ-sGDH突变体携带的突变若包括270位点，则270位点的Q可被除Q之外的任何一种氨基酸(X)取代，其中，X优选自H。
所述PQQ-sGDH突变体携带的突变若包括318位点，则318位点的A可被除A之外的任何一种氨基酸(X)取代，其中，X优选自D。
所述PQQ-sGDH突变体携带的突变若包括365位点，则365位点的M可被除M之外的任何一种氨基酸(X)取代，其中，X优选自V。
所述PQQ-sGDH突变体携带的突变若包括366位点，则366位点的T可被除T之外的任何一种氨基酸(X)取代，其中，X优选自N或V。
所述PQQ-sGDH突变体携带的突变若包括367位点，则367位点的Y可被除Y之外的任何一种氨基酸(X)取代，其中，X优选自C或S。
所述PQQ-sGDH突变体携带的突变若包括372位点，则372位点的T可被除T之外的任何一种氨基酸(X)取代，其中，X优选自S、G、C或D。
所述PQQ-sGDH突变体携带的突变若包括402位点，则402位点的R可被除R之外的任何一种氨基酸(X)取代，其中，X优选自I。
所述PQQ-sGDH突变体携带的突变若包括452位点，则452位点的N可被除N之外的任何一种氨基酸(X)取代，其中，X优选自T、P、V、C、L、D、I或A。
所述PQQ-sGDH突变体携带的突变若包括455位点，则455位点的K可被除K之外的任何一种氨基酸(X)取代，其中，X优选自R或I。
本发明的目的还在于提供一种分离的聚核苷酸，所述聚核苷酸编码所述PQQ-sGDH突变体。所述聚核苷酸为编码PQQ-sGDH突变体的基因序列。
本发明的目的还在于提供一种表达载体，所述表达载体包含所述聚核苷酸。表达载体可分为质粒和病毒(包括噬菌体)两种类型。
本发明的目的还在于提供一种转化细胞，所述转化细胞包含所述表达载体。
本发明的目的还在于提供一种制备PQQ-sGDH突变体的方法，所述方法包括：培养所述转化细胞；诱导表达载体中的聚核苷酸表达；分离和纯化所述PQQ-sGDH突变体。
本发明的还在于提供利用所述PQQ-sGDH突变体检测样品中葡萄糖的方法，所述方法包括：所述PQQ-sGDH突变体与样品中的葡萄糖发生酶促反应；检测所述酶促反应产生的信号。
本发明的目的还在于提供一种用于检测样品中葡萄糖的试剂，所述试剂包括所述PQQ-sGDH突变体。
本发明的目的还在于提供一种用于检测样品中葡萄糖的装置，所述装置包括所述PQQ-sGDH突变体。
具体实施方式
本发明利用来自醋酸钙不动杆菌LMD79.41的野生型PQQ-sGDH编码基因或其编码蛋白同源性在90％以上的DNA作为模板，利用定点突变PCR进行扩增，获得一系列PQQ-sGDH突变体，在相同条件下检测并比较野生型PQQ-sGDH和不同PQQ-sGDH突变体对葡萄糖和麦芽糖等糖分子的酶活性，发明人意外地发现一些性能优越的PQQ-sGDH突变体，这些突变体对葡萄糖的底物特异性显著提高，同时对麦芽糖等糖分子的交叉反应性显著下降。
为了便于计算和比较各种PQQ-sGDH突变体和野生型PQQ-sGDH的底物特异性或交叉反应性，将用葡萄糖作为底物进行测量时测得的酶活性定义为100％，并选择除葡萄糖之外的其他糖分子(如麦芽糖、半乳糖等)进行测量从而测得其酶活性并且与前者进行比较。根据这些测量结果，就可评价各种PQQ-sGDH突变体和野生型PQQ-sGDH的底物特异性或交叉反应性。
已知检测PQQ-sGDH突变体和野生型PQQ-sGDH酶活性的方法有好多种，如利用试剂PMS和DCIP测定其酶活性。
野生型PQQ-sGDH对除葡萄糖之外的其他糖分子的交叉反应性的百分比计算方法如公式1所示：
野生型PQQ-sGDH交叉反应性[％]＝(野生型PQQ-sGDH对其他糖分子的酶活性/野生型PQQ-sGDH对葡萄糖的酶活性)×100％(公式1)
每种PQQ-sGDH突变体对除葡萄糖之外的其他糖分子的交叉反应性的百分比计算方法如公式2所示：
PQQ-sGDH突变体交叉反应性[％]＝(PQQ-sGDH突变体对其他糖分子的酶活性/PQQ-sGDH突变体对葡萄糖的酶活性)×100％(公式2)
同时为了突出地表明PQQ-sGDH突变体对麦芽糖、半乳糖等糖分子的交叉反应性相比于野生型PQQ-sGDH对麦芽糖、半乳糖等糖分子的交叉反应性得到显著提高，可按照公式3来计算PQQ-sGDH突变体的底物特异性改善程度：
(公式3)
其中，对公式3进行适当的数学变换，可知PQQ-sGDH突变体的改善的底物特异性实质上为公式1的计算值除以公式2的计算值。
公式1、公式2和公式3中的其他糖分子指的是除葡萄糖之外对葡萄糖的临床测试产生干扰的糖分子，优选麦芽糖、半乳糖、木糖、甘露糖和阿洛糖(allose)，尤其是麦芽糖或半乳糖。
除了考虑PQQ-sGDH突变体的交叉反应性和改善的底物特异性外，还有一个衡量PQQ-sGDH突变体性能的指标便是PQQ-sGDH突变体的热稳定性，即将所获得的野生型PQQ-sGDH和每种PQQ-sGDH突变体在50℃中放置30min后，以百分率计算50℃放置前的初始酶活性和50℃放置后的残留酶活性。
本发明公开了PQQ-sGDH突变体的制备方法。在制备时，可以采用PCR定点突变方法获得一系列PQQ-sGDH突变体。
为了生产以上提及的野生型PQQ-sGDH和PQQ-sGDH突变体，可使用表达载体和宿主细胞，而且应当确保所选择的表达载体与所选择的表达载体相匹配。
本发明所使用的表达载体可分为原核生物表达载体和真核生物表达载体。对原核生物表达载体和真核生物表达载体而言，原核生物或真核生物细胞宿主的不同就会决定了相应的表达载体不同。
最常用于外源蛋白表达的原核生物细胞为大肠杆菌(Escherichiacoli)和枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)等。大肠杆菌常用的表达载体有pET系列载体(Novagen)、pGEX系列载体(Pharmacia)、pQE系列载体(Qiagen)、pACYC系列载体(Addgene)、pBAD系列表达载体(Invitrogen)、pDEST/pREST系列表达载体(Invitrogen)以及pTrcHis2系列表达载体(Invitrogen)等，而枯草芽孢杆菌常用的表达载体有pHT01、pHT08、pHT09、pHT10和pHT43等。
最常用于外源蛋白表达的真核生物细胞为酵母细胞、昆虫细胞、植物细胞和哺乳动物细胞。常用于外源蛋白表达的酵母细胞为毕赤酵母(Pichiapastoris)细胞和酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae)细胞，其中毕赤酵母常用的表达载体有pPIC系列载体(Invitrogen)、pGAPZ/pGAPα系列表达载体(Invitrogen)和pAO815表达载体(Invitrogen)；酿酒酵母常用的表达载体有pYES系列表达载体(Invitrogen)和pYC系列表达载体(Invitrogen)等。
常用于外源蛋白表达的昆虫细胞有草地贪夜蛾(Spodopterafrugiperda)细胞系Sf9和Sf-21，粉纹夜蛾(Trichoplusiani)细胞系Tn-368和BTI-TN-5B1-4等，这些细胞系使用的表达载体为重组杆状病毒(baculovirus)。
植物细胞的常见表达载体可选自基于根瘤农杆菌(Agrobacteriumtumefaciens)的Ti质粒或基于发根农杆菌(Agrobacteriumrhizogenes)的Ri质粒而构建出的衍生载体，也可使用诸如烟草花叶病毒(tobaccomosaicvirus)、马铃薯病毒X(potatovirusX)和豇豆花叶病毒(cowpeamosaicvirus)之类的植物病毒作为表达载体。
常用于外源蛋白表达的哺乳动物细胞有CHO、HEK、BHK、HeLa、COS、SP2/0和NIH3T3等细胞系。常见的哺乳动物细胞表达载体有腺病毒表达载体、pSV和pCMV系列质粒载体、痘病毒表达载体和逆转录病毒表达载体等。
无论选自以上任何一种表达载体，都可以利用本领域已知的各种方法，如氯化钙转化法、聚乙二醇(PEG)介导的原生质体转化法、电穿孔法、基因枪法、显微注射、激光注射、DEAE-葡聚糖转染法、磷酸钙共沉淀转染法或人工脂质体介导转染法等，将这种携带PQQ-sGDH突变体编码基因的表达载体导入合适的宿主细胞后，所获得的宿主细胞即为转化细胞。在允许该外源基因表达的条件下培养所述转化细胞，这样就可产生所需的PQQ-sGDH突变体。
当然，PQQ-sGDH突变体也可通过体外翻译由编码所述突变体的基因通过转录产生的mRNA来获得，例如，将这种基因插入到合适的表达载体中，所述表达载体就可用于体外转录/翻译系统中。
无论是采用基于转化细胞的表达系统，还是体外转录/翻译系统，表达所需的PQQ-sGDH突变体蛋白后，就可采用各种常规的蛋白质纯化技术，分离并纯化所述突变体，例如可以使用色谱法，如离子交换色谱、凝胶过滤色谱和亲和色谱等。
本发明所获得的一系列PQQ-sGDH突变体的主要用途之一就是用于试纸条或生物传感器中，以便检测糖尿病患者血液中的葡萄糖浓度。当然，除了可以用于检测血液中的葡萄糖外，也可用于检测尿液、唾液和泪液等体液中的葡萄糖。
本发明也包括使用本发明所提供的PQQ-sGDH突变体来检测样品中葡萄糖的方法，以及在检测时所使用的装置和试剂。本领域利用PQQ-sGDH酶检测葡萄糖的方法、装置和试剂有很多种，这里略举一两个例子加以说明，但是这并不意味着所述方法、装置和试剂仅仅限于这一两个例子。比如，中国专利申请CN200580005551.6公开了一种检测样品葡萄糖浓度的装置。该装置所含有的试剂可以含有PQQ-sGDH突变体，用于稳定PQQ-sGDH突变体酶活性的稳定剂，以及电子受体(electronacceptor)，其中，稳定剂优选自海藻糖、蔗糖、甘油、甘露醇和核糖，而合适的电子受体可选自铁氰化钾、对苯醌及其衍生物、吩嗪硫酸甲酯(PMS)、甲基蓝、二茂铁及其衍生物。检测时，如果样品中含有葡萄糖时，PQQ-sGDH突变体与葡萄糖发生酶促反应并产生电子，在电子受体的传递下，所产生的电子被传递给电极，通过检测所产生的电流值就可计算出样品中的葡萄糖浓度。
再比如，也可以采用美国专利US5,484,708A公开的方法、装置和试剂检测样品中的葡萄糖：将1-萘酚-4-磺酸(1-Naphthol-4-sulfonicacid)、一种偶联剂、一种缓冲液和含葡萄糖的样品溶液加入到比色皿中混匀，然后加入PQQ-sGDH酶后，发生酶促反应而导致颜色变化，接着利用分光光度计测量特定检测波长下的吸光值，其中，特定检测波长与所选择的偶联剂相关，比如，当这种偶联剂为N,N-双(2-羟乙基)-4-亚硝基-苯胺(N,N-Bis(2-hydroxyethyl)-4-nitrosoaniline)，检测波长为606nm；当这种偶联剂为2,4,6-三溴-3-羟基苯甲酸(2,4,6-tribromo-3-hydroxybenzoicacid)时，检测波长为705nm。
以下实施例进一步说明本发明。这些实施例不是用来限制本发明范围，而是提供对本发明的进一步理解。在以下实施例中提及的DNA提取、克隆、PCR定点突变、转达载体构建、转化细胞制备以及蛋白表达和纯化等方法是本领域已知的(MichaelR.Green和JosephSambrook编著的《MolecularCloning:ALaboratoryManual(FourthEdition)》；FredM.Ausubel和RogerBren等编著的《CurrentProtocolsinMolecularBiology》(2015))，并且可以根据技术人员的需要进行适当修改。
实施例1：大肠杆菌中野生型PQQ-sGDH的克隆和表达
醋酸钙不动杆菌菌株LMD79.41野生型PQQ-sGDH编码基因由南京金斯瑞生物科技有限公司进行体外合成，然后按照本领域已知的技术，将该合成的基因插入到质粒PET30a(购买自Novagen)中，从而获得重组质粒，随后将10μl所获得的重组质粒导入到宿主细胞大肠杆菌菌株BL21中，即为大肠杆菌转化细胞，然后在1mlLB液体培养基中37℃培养1小时后，将细菌涂布于琼脂平板，并在37℃生长过夜。从琼脂平板上挑选细菌斑点进行DNA测序，接着，将经DNA测序证实重组质粒成功导入的细菌斑点接种至50mlLB培养基中，37℃培养至OD600为1.0时，加入IPTG50μl，诱导野生型PQQ-sGDH编码基因表达，继续培养3个小时后，收集菌体。
可通过离心法，收集这些菌体，然后利用QIAGENPlasmidMidiKit(Qiagen)从这些菌体中分离出携带野生型PQQ-sGDH编码基因的重组质粒。
实施例2：利用PCR定点突变制备PQQ-sGDH突变体
以实施例1中分离出的重组质粒为起始模板，利用PCR扩增进行定点突变，使得194位点上的A被F替代。
用于获得A194F突变的引物如SEQIDNO3和SEQIDNO4中所示：
SEQIDNO3：
5'-TGACCAAGGGCGTAACCAGCTTTTCTATTTGTTCTTGCCAAATCAAGCAC-3'
SEQIDNO4：
5'-GTGCTTGATTTGGCAAGAACAAATAGAAAAGCTGGTTACGCCCTTGGTCA-3'。
以实施例1中构建的重组质粒为起始模板，利用PCR扩增进行定点突变，使得192位点上的Q被A或S替代。
用于获得Q192A突变的引物如SEQIDNO5和SEQIDNO6中所示：
SEQIDNO5：
5'-ATTGGTGACCAAGGGCGTAACGCGCTTGCTTATTTGTTCTTGCCAA-3'
SEQIDNO6：
5'-TTGGCAAGAACAAATAAGCAAGCGCGTTACGCCCTTGGTCACCAAT-3’。
用于获得Q192S突变的引物如SEQIDNO7和SEQIDNO8中所示：
SEQIDNO7：
5'-TGGTGACCAAGGGCGTAACTCGCTTGCTTATTTGTTCTTGCCA-3'
SEQIDNO8：
5'-TGGCAAGAACAAATAAGCAAGCGAGTTACGCCCTTGGTCACCA-3'。
根据上述引物，依据从Takara公司购买的Primerstar多聚酶说明书进行PCR反应，分别获得发生单位点突变(A194F、Q192A或Q192S)的PQQ-sGDH突变体编码基因扩增产物，然后按照实施例1中的方法进行克隆和表达，细菌培养，并收集菌体，同时还可从收集的菌体中获得携带发生所述单位点突变的PQQ-sGDH突变体编码基因的重组质粒。
接着，利用所获得的携带发生所述单位点突变的PQQ-sGDH突变体编码基因的重组质粒，再次进行PCR定点突变，在A194F、Q192A或Q192S的基础上，选择性地对99、167、170、193、270、318、365、366、367、372、402、452和455等位点中的一个位点进行突变，从而获得一系列基于A194F、Q192A或Q192S的两位点组合突变。尤其地，对452位点还会进行饱和突变，即将452位点的N分别替换为A、R、D、C、Q、E、H、I、G、L、K、M、F、P、S、T、W、Y或V。如果想要获得三位点组合突变，则需要在两位点组合突变的基础上，选择性地对99、167、170、193、270、318、365、366、367、372、402、452和455中的其他一个位点进行突变。类似地，通过重复上述操作，还可获得基于A194F、Q192A或Q192S的四位点或四位点以上的组合突变。针对上述每种组合突变，按照实施例1中的方法进行克隆和表达，以及细菌培养，并收集菌体，同时还可从收集的菌体中获得相应的重组质粒。
上述所有PQQ-sGDH突变体编码基因均经DNA测序验证。
实施例3：野生型PQQ-sGDH或PQQ-sGDH突变体的纯化
首先将实施例1中收集的菌体(携带野生型PQQ-sGDH编码基因)，或者实施例2中收集的菌体(携带PQQ-sGDH突变体编码基因)，在37℃的条件下培养至OD600为1.0时，加入IPTG50μl，诱导野生型PQQ-sGDH或PQQ-sGDH突变体编码基因表达，然后通过离心从培养基中收集大肠杆菌菌体，用磷酸盐缓冲液A(0.2M氯化钠，20mM磷酸二氢钠，pH7.0)重悬，用高压或者超声波等破碎方法让存在于细胞内的野生型PQQ-sGDH或PQQ-sGDH突变体释放出来，然后通过离心收集上清液，这样得到的上清液就含有野生型PQQ-sGDH或PQQ-sGDH突变体的粗酶液。
接着，将获得的粗酶液样品上样到事先用磷酸盐缓冲液A平衡的His-tag吸附柱中，先用磷酸盐缓冲液B(0.2M氯化钠，50mM咪唑，20mM磷酸磷酸二氢钠，pH7.0)进行洗涤后，最后使用磷酸盐缓冲液C(0.5M氯化钠，150mM咪唑，20mM磷酸磷酸二氢钠，pH7.0)进行洗脱，这样就能获得高纯度的野生型PQQ-sGDH或PQQ-sGDH突变体酶溶液。所获得的酶溶液经干燥后还可制成酶粉末。
实施例4：野生型PQQ-sGDH和PQQ-sGDH突变体酶活性检测
检测前需先进行试剂配制：试剂A:10mMMOPS缓冲液(包含1mMCaCl2的MOPS-NaOH缓冲液pH7.0)；试剂B：葡萄糖溶液(1.2M)；试剂C:PMS溶液(20mM)；试剂D:DCIP溶液(4.0mM)；试剂E:酶稀释液(包含1mMCaCl2和0.1％TritonX-100的20mMpH7.0的MOPS-NaOH缓冲液)。
对试剂A中加入适量的PQQ，使得PQQ的浓度达到1mM，得到试剂A1。将实施例3中的野生型PQQ-sGDH或PQQ-sGDH突变体粉末用去离子水进行溶解，使其浓度为1mg/ml，得到检测酶液。
为了测量酶活性，先对野生型PQQ-sGDH或PQQ-sGDH突变体进行活化，即将900μl试剂A1和100μl检测酶液在室温下反应1个小时，用于酶的活化。
酶活化后，检测野生型PQQ-sGDH或PQQ-sGDH突变体的酶活性，酶活性测定方法如下所示，其中其检测原理为：
PQQ-sGDH+葡萄糖+PMS→葡萄糖酸-1,5-内酯+PMS(还原型)
PMS(还原型)+DCIP→PMS+DCIP(还原型)
反应完成后，利用分光光度计检测600nm波长下的吸光值(OD)。规定：野生型PQQ-sGDH或PQQ-sGDH突变体1分钟时间内还原1μmolDCIP的酶活性为1U。
其详细的检测步骤如下所示：
(1)在遮光的反应瓶中配制以下的反应混合液，在冰上贮藏(用于临时配制)，其组分如下所示：
(2)将2.9ml的反应混合液加入试管中，放置在25℃水浴锅中预热5min；
(3)加入0.1ml的野生型PQQ-sGDH或PQQ-sGDH突变体酶溶液，平稳地进行反转混合；
(4)在维持25℃温度不变的条件下，使用分光光度计绘制5min时间内600nm波长下的OD下降曲线。根据曲线初期时呈直线的部分，计算每1分钟的OD变化(ΔOD试验)，同时用试剂E代替(4)中的酶溶液，按照同样方法进行检测，测定空白值(ΔOD空白)；
(5)计算酶活性：
U/ml＝[ΔOD/min(ΔOD试验-ΔOD空白)×Vt×df]/(22×1.0×Vs)，
U/mg＝(U/ml)×1/C，其中，
Vt为反应总体积，为3.0ml，Vs为样品体积，为0.1ml；
22:在上述测定条件下的DCIP的毫摩尔吸光系数(cm2/微摩尔)，1.0：光径(cm)，df:稀释系数，C：溶液中的酶浓度(mg/ml)。
在检测时，应注意在检测前，应用预冷的试剂E溶解酶粉末，用相同缓冲液稀释为0.1-0.8U/ml。另外由于该酶的粘附性，优选使用塑料试管进行检测。
实施例5：野生型PQQ-sGDH或PQQ-sGDH突变体酶热稳定性测定
制备含有1mg野生型PQQ-sGDH或PQQ-sGDH突变体和0.016mgPQQ的20mM磷酸钾溶液(pH7.0)，以活化野生型PQQ-sGDH或PQQ-sGDH突变体。在室温保温30min后，按照实施例4中的方法，测定对葡萄糖的初始酶活性，然后将酶溶液在50℃的水浴中保温30分钟后，检测酶溶液的剩余酶活性，并以百分率计算。
实施例6：野生型PQQ-sGDH和PQQ-sGDH突变体交叉反应性和热稳定性测试
将实施例1或实施例2中收集的菌体用超声进行细胞破碎，将破碎后的菌液进行离心，取离心后的上清液100μl，并往上清液中加入900μl含有1mMPQQ和1mMCaCl2的10mMMOPS缓冲液(pH7.0)，在室温下反应1个小时，反应后形成的全酶用于下面的交叉反应和热稳定性测试。
按照实施例4中的酶活性测定方法，取一定量的野生型PQQ-sGDH和PQQ-sGDH突变体酶溶液，用浓度30mM的葡萄糖水溶液进行测试，同时用浓度30mM的麦芽糖水溶液进行测试。
计算酶活性时，将使用30mM葡萄糖作为底物的值设定为100％活性。将麦芽糖测得的值与葡萄糖数值相比较，并按照公式1和公式2分别计算野生型PQQ-sGDH对麦芽糖的交叉反应性[％]和PQQ-sGDH突变体对麦芽糖的交叉反应性[％]。在以下的表中，以M/G表示野生型PQQ-sGDH或PQQ-sGDH突变体对麦芽糖的交叉反应性。同时基于此，按照公式3计算出各种PQQ-sGDH突变体的改善的底物特异性。
野生型PQQ-sGDH和PQQ-sGDH突变体的热稳定性按照实施例5中的方法进行检测。
(1)A194F和基于A194F的组合突变
其交叉反应性和热稳定性检测结果如表1所示：
表1
由表1可知，PQQ-sGDH突变体单位点突变A194F的M/G为86.46％，改善的底物特异性为1.20，这意味着与野生型PQQ-sGDH相比，该突变体具有1.20倍改善的底物特异性(麦芽糖/葡萄糖)。而基于A194F的两位点组合突变的M/G最低为12.24％，改善的底物特异性最低为2.41。而基于A194F的三位点组合突变的M/G最低为8.98％，改善的底物特异性最低为3.74。而基于A194F的四位点及以上组合突变的M/G最低为1.87％，改善的底物特异性最低为12.86。由此可知，表1中的各种PQQ-sGDH突变体对麦芽糖的交叉反应性显著降低，其对葡萄糖的底物特异性显著提高。
(2)基于Q192A的组合突变
其交叉反应性和热稳定性检测结果如表2所示：
表2
由表2可知，基于Q192A的两位点组合突变的M/G最低为14.36％，改善的底物特异性最低为2.56。而基于Q194A的三位点组合突变的M/G最低为6.74％，改善的底物特异性最低为4.14。而基于Q194A的四位点及以上组合突变的M/G最低为1.99％，改善的底物特异性最低为11.70。由此可知，表2中的各种PQQ-sGDH突变体对麦芽糖的交叉反应性显著降低，其对葡萄糖的底物特异性显著提高。
(3)基于Q192S的组合突变
其交叉反应性和热稳定性检测结果如表3所示：
表3
由表3可知，基于Q192S的两位点组合突变的M/G最低为9.55％，改善的底物特异性最低为2.98。而基于Q194S的三位点组合突变的M/G最低为6.63％，改善的底物特异性最低为4.36。而基于Q194S的四位点及以上组合突变的M/G最低为1.75％，改善的底物特异性为最低为12.76。由此可知，表3中的各种PQQ-sGDH突变体对麦芽糖的交叉反应性显著降低，其对葡萄糖的底物特异性显著提高。
实施例7：麦芽糖干扰性实验
用野生型PQQ-sGDH或PQQ-sGDH突变体进行葡萄糖测定。参比样品含有50mg/dl葡萄糖。试验样品含有50mg/dl葡萄糖和100mg/dl麦芽糖。每次测定时使用相同量的酶活性(U/ml；参见实施例4)。
事先配制测试溶液：
1000μl0.2M柠檬酸缓冲液(pH5.8)，含有0.315mg(4-(二甲基膦基甲基)-2-甲基-吡唑并[1.5a]-咪唑-3-基)-(4-亚硝基苯基)-胺(英文名为：(4-(dimethylphosphinylmethyl)-2-methylpyrazolo-[1.5a]-imidazol-3-yl)-(4-nitrosophenyl)-amine)。
接着，往比色杯中加入1ml测试溶液和0.015ml参比样品或试验样品，并混匀。
随后再加入0.050ml90U/ml野生型PQQ-sGDH或PQQ-sGDH突变体开始该测定。监测620nm的吸光度变化。5分钟后，观察到恒定值，计算5分钟之内的吸光度变化值。把用野生型PQQ-sGDH测量参比样品获得的吸光度变化值设定为100％，基于此设定值，分别计算野生型PQQ-sGDH测量试验样品，PQQ-sGDH突变体测量参比样品和试验样品的百分率。
结果如表4所示：
表4
由表4可以清楚地看出，所测量的葡萄糖数值当在该测定中使用PQQ-sGDH突变体(A194F)时显著下降，这也就意味着与野生型PQQ-sGDH相比，在利用PQQ-sGDH突变体(A194F)测量葡萄糖时，麦芽糖的存在对测量结果的干扰显著下降。
同时也对本发明中的其他PQQ-sGDH突变体也进行了麦芽糖干扰性实验同样发现，结果也发现与野生型PQQ-sGDH相比，麦芽糖的存在对测量结果的干扰显著下降。
此外，可以利用中国专利申请CN200580005551.6公开的葡萄糖检测装置检测血液样品中的葡萄糖浓度，其中该装置的反应层含有本发明提供的PQQ-sGDH突变体，结果发现，如果样品存在麦芽糖时，与野生型PQQ-sGDH相比，利用本发明提供的任何一种PQQ-sGDH突变体检测到的数值准确性显著提高，样品中的麦芽糖对测量结果的干扰显著下降。
Claims (10)
1.一种PQQ-sGDH突变体，所述PQQ-sGDH突变体源自于醋酸钙不动杆菌的野生型PQQ-sGDH氨基酸序列SEQIDNO1，或者源自于其他微生物的与SEQIDNO1具有至少90％同源性的野生型氨基酸序列，所述PQQ-sGDH突变体的氨基酸位点编号对应于来自醋酸钙不动杆菌的野生型PQQ-sGDH氨基酸序列SEQIDNO1，其特征在于，所述PQQ-sGDH突变体携带的突变包括选自以下一组突变中的一种：(1)A194F；(2)选自Q192A或Q192S的一种突变，且所述PQQ-sGDH突变体还在99、170、193、270、318、365、366、367、372、402、452和455位点中至少一个位点发生替换突变。
2.如权利要求1所述的PQQ-sGDH突变体，所述PQQ-sGDH突变体携带的突变包括选自以下一组突变中的一种：(1)A194F，且所述PQQ-sGDH突变体还在99、167、170、192、193、270、318、365、366、367、372、402、452和455位点中至少一个位点发生替换突变；(2)选自Q192A或Q192S中的一种突变，且所述PQQ-sGDH突变体还在99、167、170、193、270、318、365、366、367、372、402、452和455位点中至少两个位点发生替换突变。
3.如权利要求2所述的PQQ-sGDH突变体，所述PQQ-sGDH突变体携带的突变包括选自以下一组突变中的一种：(1)A194F，且所述PQQ-sGDH突变体还在99、167、170、192、193、270、318、365、366、367、372、402、452和455位点中至少两个位点发生替换突变；(2)Q192A+G99X+D167X+N452X；(3)Q192S+G99X+D167X+N452X；
(4)Q192A+G99X+S170X+Q270X+M365X+N452X+T372X；
(5)Q192A+G99X+S170X+Q270X+T366X+N452X+T372X；
(6)Q192A+G99X+S170X+Q270X+T366X+N452X+R402X；
(7)Q192A+G99X+S170X+Q270X+T366X+N452X+A318X；
(8)Q192A+G99X+S170X+Q270X+T366N+K455X+T372X；
(9)Q192S+G99X+S170X+Q270X+M365X+N452X+T372X；
(10)Q192S+G99X+S170X+Q270X+T366X+N452X+T372X；
(11)Q192S+G99X+S170X+Q270X+T366X+N452X+R402X；
(12)Q192S+G99X+S170X+Q270X+T366X+N452X+A318X；
(13)Q192S+G99X+S170X+Q270X+T366N+K455X+T372X。
4.如权利要求3所述的PQQ-sGDH突变体，所述PQQ-sGDH突变体携带的突变包括选自以下一组突变中的一种：(1)A194F+G99X+D167X+N452X；
(2)A194F+G99X+S170X+Q270X+T366N+N452X+T372X；
(3)A194F+G99X+S170X+Q270X+T366N+N452X+R402X；
(4)A194F+G99X+S170X+Q270X+T366N+N452X+A318X；
(5)A194F+G99X+S170X+Q270X+T366N+K455X+T372X；
(6)Q192A+G99X+D167X+N452X+M365X；
(7)Q192A+G99X+D167X+N452X+T366X；
(8)Q192A+G99X+S170X+Q270X+M365X+T366X+N452X+T372X；
(9)Q192A+G99X+S170X+Q270X+T366N+N452X+K455X+T372X；
(10)Q192S+G99X+D167X+N452X+M365X；
(11)Q192S+G99X+D167X+N452X+T366X；
(12)Q192S+G99X+S170X+Q270X+M365X+T366X+N452X+T372X；
(13)Q192S+G99X+S170X+Q270X+T366N+N452X+K455X+T372X。
5.如权利要求4所述的PQQ-sGDH突变体，所述PQQ-sGDH突变体携带的突变包括选自以下一组突变中的一种：(1)A194F+G99X+D167X+N452X+M365X；
(2)A194F+G99X+D167X+N452X+T366X；
(3)A194F+G99X+S170X+Q270X+T366N+N452X+K455X+T372X；
(4)Q192A+G99X+D167X+N452X+T366X+S170X；
(5)Q192A+G99X+S170X+Q270X+M365X+T366N+N452X+K455X+T372X；
(6)Q192S+G99X+D167X+N452X+T366X+S170X；
(7)Q192S+G99X+S170X+Q270X+M365X+T366N+N452X+K455X+T372X。
6.如权利要求5所述的PQQ-sGDH突变体，所述PQQ-sGDH突变体携带的突变包括选自以下一组突变中的一种：
(1)A194F+G99X+D167X+N452X+T366X+S170X；
(2)Q192A+G99X+D167X+N452X+T366X+S170X+Q270X；
(3)Q192S+G99X+D167X+N452X+T366X+S170X+Q270X。
7.如权利要求6所述的PQQ-sGDH突变体，所述PQQ-sGDH突变体携带的突变包括A194F+G99X+D167X+N452X+T366X+S170X+Q270X。
8.如权利要求3-7之一所述的PQQ-sGDH突变体，所述PQQ-sGDH突变体携带的突变，若包含G99X，则G99X中的X选自W；若包含D167X，则D167X中的X选自E；若包含S170X，则S170X中的X选自G；若包含Q192X，则Q192X中的X选自A或S；若包含L193X，则L193X中的X选自P或F；若包含Q270X，则Q270X中的X选自H；若包含A318X，则A318X中的X选自D；若包含M365X，则M365X中的X选自V；若包含T366X，则T366X中的X选自N或V；若包含Y367X，则Y367X中的X选自C或S；若包含T372X，则T372X中的X选自S、G、C或D；若包含R402X，则R402X中的X选自I；若包含N452X，则N452X中的X选自T、P、V、C、L、D、I或A；若包含K455X，则K455X中的X选自R或I。
9.一种分离的聚核苷酸，所述聚核苷酸编码权利要求1-7之一中的PQQ-sGDH突变体。
10.一种用于检测样品中葡萄糖的装置，所述装置包括权利要求1-7之一中的PQQ-sGDH突变体。
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