CN1053217C - 新的微生物以及利用这些微生物生产生物素同效维生素的方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种突变菌株，该菌株的具有的葡萄糖消耗速率至多为野生型菌株的四分之一，该突变菌株属于埃希氏杆菌属，芽孢杆菌属，假单胞杆菌属，或赛氏杆菌属，具有的葡萄糖消耗速率至多为相应野生型菌株的四分之一，且其中的生物素反馈抑制途经已去除。本发明还提供了利用该突菌株生产生物素的方法。

Description

新的微生物以及利用这些微生物生产生物素同效维生素的方法

本发明涉及新的突变菌株，这些菌株具有的葡萄糖消耗速率至多为野生型菌株的四分之一，尤其是涉及属于用于生产生物素的埃希氏杆菌属的突变菌株。此外，本发明涉及利用这些突变菌株生产生物素同效维生素的方法。

为了提高一种具体有用物质的生产率，已制备了各种突变菌株。例如，就用于生产生物素的细菌而言(作为这种具体的有用物质该生物素是动物、植物和微生物的一种重要维生素。)经人工突变得到的微生物，例如芽孢杆菌属，色杆菌属，假单胞杆菌属以及节杆菌属是已知的。更具体地说，在最近几年中，属于埃希氏杆菌属的对α-脱氢生物素具抗性的一个菌株(例如，参见日本未审查的专利公开(kokai)No.61-149091)，属于埃希氏杆菌属的其中的生物素反馈抑制途径已去除的一个菌株(如参见日本未审查的专利公开(kokai)No.61-202686)，属于埃希氏杆菌属的乙酸生产率降低的一个菌株(参见，如欧洲专利公开No.0316229)作为属于埃希氏杆菌属的用于基因重组过程中的寄主一载体系统的寄主微生物是已知的。作为除埃希氏杆菌属以外的微生物，具有作为一种具体的重组质粒的寄主已知使用了属于芽孢杆菌属，假单胞杆菌属和酵母菌属的那些属的微生物(参见例如日本未审查的专利公开(kokai)No.64-44889)。值得注意的是，上面提到的专利申请还公开了利用含有与寄主相应的重组质粒的一个转化体生产生物素的方法。

另一方面，大家已公认担负糖类磷酸化作用的一种酶的突变体可影响几种糖类的同化作用，且其模型也已被提出[参见例如：大肠杆菌和鼠伤寒沙门氏菌，F.C.Neidhardt，Vo1.1，AmericanSociety For Microbiology：pp.127-150，(1987)]。但是，没有文献描述它们与具体物质的生产率之间的相互关系。

就生物素而言(生物素是借助微生物生产的有用物质的一个例子)，上文中描述的所有突变菌株可达到预定的目的，但仍有改进的余地。例如，就欧洲专利公开No.0316229而言(上文描述的公开文献之一)，公开了一种与以前的利用葡萄糖作为基质进行全程合成生产生物素的方法相比更廉价而有效的方法，该方法利用遗传工程技术，从技能上改进了E.coli重组体，该重组体包括如上文所述的去除了生物素的反馈抑制途径且增加了降低乙酸生产能力的表型的一个突变菌株作为寄主，并含有一个重组质粒，在该质粒中将从具有生物素生产能力的大肠杆菌获得的生物素操纵子DNA插入到载体DNA中。

然而，普遍存在的问题是需要提供一种能提高有用物质，特别是生物素的生产率的突变菌株，因此，本发明的一个目的是提供一种利用微生物生产一种具体的有用物质，尤其是利用含有插入了生物素操纵子的重组质粒的微生物生产生物素的更有效的方法。

根据不同于常规观点的见解，即根据下列观点：用含有葡萄糖作为糖类的常用的发酵培养基进行培养时，虽然野生型菌株优先消耗葡萄糖，而对葡萄糖同化作用能力已降低的突变型菌株优先消耗其他碳源(如氨基酸)。解除葡萄糖的抑制作用后，于是期望后者对具体有用物质的生产起有利作用，发明人调查了这种突变体与生物素生产力之间的关系，结果是，发现含有上文所提到的质粒的突变体中有一部分积累了大量的生物素。

因此，用本发明所述的微生物突变菌株可达到上文中所述的目的，该突变菌株属于埃希氏杆菌属，芽孢杆菌属和赛氏杆菌属的任一个属，其特征是它的最大葡萄糖消耗速率至多为相应的野生型菌株的四分之一。

尤其是，涉及生物素生产率的问题，可通过生产生物素的一种方法解决，该方法包括在一种营养培养基中培养上文所述的突变菌株，该突变株含有携带有插入到载体DNA中的来源于埃希氏杆菌属的微生物的一个生物素操纵子的一个重组质粒，然而，收集培养基中形成和积累的生物素和/或脱硫生物素。

本发明的突变菌株可以来源于但不限至于属于埃希氏杆菌属，芽孢杆菌属和赛氏杆菌属的各种类型的微生物，只要能达到本发明的目的的菌株都可。作为寄主一载体系统，则优先使用属于埃希氏杆菌的，特别是于大肠杆菌的突变菌株。在这些菌株中，更为优选的是已去除生物素反馈抑制途径的用于生产生物素的菌株，(此后本文中有时也称之为“DR菌株”)。用作突变菌株的亲代菌株的具体菌株例包括，但不限于：大肠杆菌(E.coli)菌株DR-85(FERM P-8096)，DRK-332(FERM BP-2113)和DRK-3323(FERM BP-2116)(参见日本未审查的专利公开(kokai)No.61-202686，No.62-155081，以及欧洲专利公开No.0316299，如上文所述)。

这里所提及的“FERM”编号是指在日本工业科学和技术机构，发酵研究院的寄存号。

从这些亲代菌株出发，用已知的诱变处理方法可获得最大值至多为相应的野生型菌株的四分之一的具有的最大葡萄糖消耗速率的突变菌株，以下面的葡萄糖消耗速率作为指标。

本文中所用的“葡萄糖消耗速率”是指每单位时间[(T)小时]内每单位量的细菌细胞[(x)克/升]消耗的葡萄糖的量[(S)克/升]，且可用下面的等式定义。本文所用的术语“相应于野生型菌株”是指一个概念，它包括了其中发生了在葡萄糖消耗能力上没有显示明显的变化的不同于本发明目的的突变的突变菌株。

γ(克葡萄糖/克细胞x小时)＝1/X×dS/dT

为了获得如上所述的突变菌株，例如，将已用常规方法例如，用一种诱变剂如N-甲基-N’-硝基-N-亚硝基胍诱变处理的微生物按照“Eiken化学有限公司的产品手册。第5版”的描述在一种葡萄糖同化鉴别琼脂平板培养基上培养，该突变菌株在此培养基上形成白色菌落而容易分离。该原理是基于下面的事实，当菌落在含有可同化的葡萄糖的上面所述的琼脂培养基上生长时．由于产生有机酸等物质而降低了培养基的PH值。即是说，由于在培养基中加入的染料“溴酚蓝”，菌落变成橙色。相反，通过诱变处理获得的本发明所述的突变菌株形成的菌落显示白色，因为PH值几乎没有发生变化。

如此得到的突变菌株的具体例子包括大肠杆菌(E.coli)DRG024菌株，该菌株已于1990年3月22日保芷于上文所述的日本工业科学技术机构，发酵研究院的专利微生物保芷中心，给予保芷号为11366，于1991年3月14日将该保芷于国内官方机构的该菌株转移至布达佩斯条约规定的国际保芷机构，给出保芷号为FEPM BP-3309，以及DRG005菌株，DRG014菌株，DRG026菌株和DRG101菌株进行相同保芷。大肠杆菌DRG024菌株也已于1991年4月26日保藏于中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，其保藏号为M91040。利用下述方法很容易判断，这样的突变菌株具有最大葡萄糖消耗速率是至多为相应野生型菌株的四分之一的特征，该方法为：在作为起始浓度中含有适当量的葡萄糖的培养基上培养该菌株，经一定培养时间后，利用借助一个酶促反应测定葡萄糖浓度的仪器，例如，由YSI生产的27型定量测定仪测定剩余的葡萄糖量，然后将它与葡萄糖同化能力没有降低的野生型菌株相比较。通过测定微生物的葡萄糖同化能力而决定葡萄糖消耗速率的较可取的方法描述于下文的实施例1(2)中。

按上文所述得到的突变菌件(本文中有时称之为“DR突变菌株”)有工业应用价值，例如，有利于在本发明的其他方面使用。更具体地说，本发明提供了具有生物素高度生产能力的突变菌株，其中用重组质粒转化上文所述的突变菌株(该重组质粒携带有来自于埃希氏杆菌属的微生物的一个生物素操纵子，该操纵子插入到载体DNA中)，本发明还提及了使用该突变株生产生物素的方法。

本文中所用术语“生物素同效维生素”是指生物素本身，以及它的前体脱硫生物素。对于转化到本发明突变菌株中的重组质粒，可使用任何载体，只要这些载体能在寄主载体系统中表达该生物素产生能力。优选要提到的是利用常规的分离质粒方法从我们提供的大肠杆菌(E.coli)菌株DRK-3323(pXBA321)(FERM BP-2117)和DRK-332(pKHN31)(FERM BP-2114)中得到的pXBA312和pKHN31。

具有上文中描述的这样一个重组质粒的本发明所述的突变菌株可用下列方法得到，即按常规方法如Mandel M，et.al在“J.Mol.Biol.53.109(1970)”中描述的氯化钙方法将上文中所述的得到的重组质粒转化到DG突变菌株中，随后在琼脂培养基上培养得到的转化子，在该培养基上由于引入了载体的表现型，带有重组质粒的细菌细胞的克隆，可选择性地生长，采集出现的菌落。

由此得到的带有重组质粒的DG突变菌株包括，例如，大肠杆菌(E.coli)DRG 024[pXBA312]菌株，如上文所述它已于1991年3月22日寄存于日本工业科学和技术机构，发酵研究院的专利微生物保芷中心，并给出寄存号11365，然后，于1991年8月14日将该保芷于国内官方机构的菌株转移至布达佩斯条约的规定的国际权威保芷机构保芷，保芷号为FERMBP-3308，对[pXBA312]菌株和DRG101[pXBA312]菌办理了同样的保芷手续，大肠杆菌DRG024[pXBA312]菌株也已于1991年4月26日保藏于中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，其保藏号为M91039。

在通常用于培养埃希氏杆菌属的微生物的适当条件及营养培养基上培养上述得到的微生物，能在培养基中积累大量的生物素。例如可使用已知的含有碳源，氮源和无机物质的合成或天然培养基。所用的碳源包括碳水化合物如甘油、果糖、蔗糖、麦芽糖、甘露糖、淀粉、水解淀粉液、糖蜜等。所用量的优选范围为约0.5-5.0％。对于本发明的葡萄糖同化能力已降低的微生物，如果利用葡萄糖没有严格限制作为单一碳源的一种培养基，例如，下文中所述的含有酵母浸提物或酪旦白水解物的一种天然培养基时，葡萄糖仍也可作为可利用的碳源。对于这种情况，符合要求的用量范围为约0.5-5.0％。

可利用的氮源包括氨，各种无机或有机铵盐如氯化铵，磷酸铵，硫酸铵，以及天然的有机氮源如氨基酸，肉浸膏，酵母抽提物，玉米浸渍液，酪旦白水解物，以及脱脂黄豆或它的消化物。在许多情况下，天然有机氮源不仅可用作为氮源，也可用作为碳源。

作为无机构质，可利用磷酸氢二钾、磷酸二氢钾、硫酸镁、氯化钠、硫酸亚铁、氯化钙、氯化锌、硫酸铜、氯化镁、氯化钴、钼酸铵、硼酸等。

培养本发明的DG菌株时，也可如欧洲专利公开号.0316229所述加入丙氨酸。使用的丙氨酸可以是D型化合物，L型化合物或DL-型化合物，其中的每一种可产生同样的效果。

考虑到费用问题用DL型复合物较合适。加入到培养基中的丙氨酸的浓度以1-10克/升为好，更最好是3-7克/升。可以在培养开始时立即一次加入丙氨酸，也可分成几部分在培养期间加入。

至于得到的引入了对抗生素具抗性的表型的微生物，通过将相应的抗生素加入到培养中可防止其他微生物的污染。培养最好在好氧条件下进行，例如摇荡培养或通气培养。优选的培养温度是25-37℃，在培养过程中培养基的PH值最好保持在基本上为中性。产生生物素的培养时间通常约为24-48小时，如果不加入新的营养而再继续培养48小时，可使脱硫生物素有效地积累。在培养结束后，按常规的从天然物质中提取和纯化的方法，利用生物素或脱硫生物素的性质，可从营养培养液中收集生物素或脱硫生物素。例如，通过从已培养的物质中除去细菌细胞，用活性炭处理剩下的营养液，然后洗提活性炭，利用离子交换树脂纯化洗提液，或者是直接用离子交换树脂处理培养物过滤液使之纯化，然后从水或乙醇中重结晶。

按照本发明，可获得降低了葡萄糖同化能力的新颖微生物，利用该微生物可以方便地生产特定的有用物质。利用该微生物作寄主，且将例如已插入了生物素操纵子的一个重组质粒整合到寄主中而得到的微生物可以方便地用于生物素的产生。

实施例

(1)从去除了生物素反馈抑制途径的大肠杆菌(E.coli)中制备DG突变菌株。

将反馈抑制途径已去除的大肠杆菌DRK3323(FERM BP-2116)在L-培养基(10克/升旦白胨，5克/升酵母抽提物，1克/升葡萄糖，5克/升氯化钠，调PH为7.2)中在37℃，振荡条件下培养3小时。收集处于对数生长期的细菌细胞，且洗涤细胞，然后悬浮于含有100ug/ml的N-甲基-N′-硝基-N-亚硝基胍的TM缓冲液(0.61％Tris，0.6％马束酸，调PH值为6.0)中，在37℃下保持30分仲以便诱变发生。在细菌细胞收集且洗涤后，将重新悬浮的溶液加到一个常规尺寸的培养皿中，将该悬浮液覆盖在琼脂平板培养基上(2克/升旦白，10克/升葡萄糖，5克/升氯化钠，0.3克/升磷酸氢二钾，0.08克/升溴酚蓝，PH7.0)该培养基是将Eiken化学有限公司产品手册，第5版描述的用于分解葡萄糖的培养基的琼脂浓度变化成常用的琼脂平板培养基上的浓度而制备的，由此获得了约200-800个菌落。在37℃培养48小时后，白色或近于白色未转为橙色的菌落，通过采集方法分离，以得到生物素的反馈抑制途经去除的大肠杆菌(E.coli)的DG突变菌株，即DRG024菌株(FERM BP-3309)，DRG 005菌株，DRG 014菌株，DRG 026菌株，以及DRG 101菌株。

作为前培养，用一个白金环从维持琼脂平板培养物将上文中所述的DRG024菌株，DRG005，DRG 026，DRG101和DRK3323接种到L培养基(10克/升旦白胨，5g/e酵母抽提物，1克/升葡萄糖介质，5克/升氯化钠，PH调至7.0)然后在37℃培养8-12小时。

(2)测量葡萄糖消耗速率

将0.2ml这种预培养物接种到体积为500ml的Sakaguchi烧瓶(Iwaki玻璃有限公司生产)后，在37℃进行振荡培养，每隔2小时从该瓶中取样，测量细菌细胞的混浊度，计算干细菌细胞的重量(X)以克/升表示。同时，将获得的培养物的等分试样离心，且取200μl上清液注入到测量葡萄糖浓度的仪器(YsI制备，27型)。测量留下的葡萄糖的量以决定消耗的葡萄糖的量(S)。

利用这些数值，按照等级数微分法，利用Gregory-Newton的通式可得出每一时间期间内消耗葡萄糖的速率(ν)

ν(克/葡萄糖X小时)＝1/XXds/dT(参见工程数学，Vol.1Wily Ed.Brain Book Publisher，PP.96)。

得到的DG突变菌株和亲本菌株DRK3323(PERM BP-2116)的葡萄糖消耗速率的最大值显示于表1中。

培养基A            (克/升)

磷酸氢二钠(12H₂O)   17.6

磷酸钾               2.4

硫酸铵               4.0酵母浸提物                           10.0旦白胨                               10.0硫酸亚铁(7H₂O)                      0.1氯化钙(2H₂O)                        0.05氯化镁(4H₂O)                        0.05硫酸镁(7H₂O)                        0.1葡萄糖                               5.0DL-丙氨酸                            5.0

表    1菌株            葡萄糖消耗速率最大值(ν)DRG024                               0.2DRG005                               0.05DRG014                               0.1DRG026                               0.5DRG101                               0.1DRK3323                              2.0(3)确定糖类同化作用能力

将DRG005，DRG101和DRK3323菌株在L-培养基中培养12小时，然后用PBS缓冲液洗二次。将相等量的每一种细胞转移至Mg基本合成培养基上，该培养基含有浓度分别为0.2％的合适的糖类或列于下表中的一种代谢中间物作为单一碳源。在培养24小时后，测定细胞是否已生长。结果显示于表2中。对于DRG005菌株和DRG101菌株，很明显可看到同化葡萄糖或其他几种糖类的能力降低。

               表    2

菌株           DRK3323        DRG005    DRG101

(加入的糖类)

葡萄糖           +              -         -

甘油             +              -         +

麦芽糖           +              -         -

果糖             +              -         -

阿拉伯糖         +              +         +

丙酮酸钠         +              +         +

实施例2制备含有重组质粒的DG突变菌株

采用常规方法，例如氯化钙方法[Mol.Gen.Genet.Vol.124，PP1-10(1973)]用重组质粒pXBA312(其中生物素操纵子插入到载体DNA中)转化大肠杆菌(E.coli)DRG024菌株，DRG005菌株，DRG014菌株，DRG026菌株，或DRG101菌株，然后在含有10ug/ml四环素的LB固体平板培养基上分离所形成的菌落，分别得到DRG024[pXBA312]菌株(FERM BP-3308)，DRG005[pXBA312]菌株，DRG014[pXBA312]菌株，DRG026[pXBA312]菌株，或DRG101[pXBA312]菌株。

              实施例3制造生物素

作为一种预培养物，利用一个白金环将维持性琼脂平板培养的含有该重组质粒的DRG突变菌株接种到L培养基(10克/升旦白胨，5克/长酵母浸提物，1克/升葡萄糖，5克/升氯化钠；调PH至7.0；对于合有重组质粒的细菌细胞培养时，再加入29ug/ml四环素)，在37℃培养8-12小时。将0.2ml该预培养物接种到合有20ml上文中描述的A培养基的500ml体积的Sakaguchi烧瓶(由Iwaki玻璃有限公司制造)，然后培养。96小时后，取样，然后测定细菌细胞的混浊度以及积累的生物素和脱硫生物素的量。结果显示于表3中。

为了对生物素进行定量分析，将离心后除去细菌细胞得到的上清液稀释至适当的程度，用胚芽乳杆菌(Lactobacillus plan-tarum)(ATCC8014)进行生物测定。对于脱硫生物素的定量分析，利用抗生物素旦白阿维丁通过比色法测定生物素和脱硫生物素的总体浓度(Metbod in Enzymology，Vol.XVIII，PP.49)从总浓度中减去上文中描述生物测定方法测出的生物素的量而计算出脱硫生物素的量。

                  表    3菌株    细胞浓度    积累的脱硫    积累的生

     (克/升)    生物素的量    物素的量

                 (mg/升)      (mg/升)DRG024      5         82             10[pXBA312]DRG005      4         73              9[pxBA312]DRG014      4         69              9[pXBA312]DRG026      5         80              10[pxBA312]DRG101      5         80              10[pxBA312]DRK3323    4         13         9[pxBA312](对照)

Claims (6)

1.一种制备生物素的方法，其特征在于在一种营养培养基中培养一种属于埃希氏杆菌，芽孢杆菌和赛氏杆菌的任一属的微生物突变菌株，它的最大葡萄糖消耗速率至多为相应野生型菌株的四分之一；然后收集培养液中形成和积累的生物素和/或脱硫生物素。

2.根据权利要求1所说的方法，其中所说的微生物属于埃希氏杆菌属。

3.根据权利要求2所说的方法，其中所说的微生物是用于生产生物素同效维生素的。

4.根据权利要求3所说的方法，该菌株的生物素反馈抑制途径已去除。

5.根据权利要求4所说的方法，该菌株含有携带有插入到载体DNA中的来源于埃希氏杆菌属的微生物的一个生物素操纵子的一个重组质粒。

6.根据权利要求5所说的方法，该菌株选自于下列一组菌株：DRG024[pXBA312]菌株(CCTCC M91039)，DRG005[pXBA312]菌株，DRG014[pXBA312]菌株，DRG026[pXBA312]菌株，以及DRG101[pXBA312]菌株。