CN105311631B - CaP-PLA/PLGA纳微球及其制备方法与应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供一种一步法制备CaP‑PLA纳微球或CaP‑PLGA纳微球药物制剂的方法，以及采用所述方法制备得到的CaP‑PLA纳微球或CaP‑PLGA纳微球，以及采用所述纳微球作为免疫佐剂的应用。该纳微球相对于现有技术中的PLA或PLGA微球，其微球粒径均一，且纳微球表面形成大量的褶皱结构，有利于抗原的吸附，是一种较好的免疫佐剂。另一个方面，制备得到的CaP‑PLA纳微球或CaP‑PLGA纳微球具有pH值敏感性，在不同pH值条件下，对抗原的吸附具有较大的差异，这在实际应用中具有较大的意义。

Description

CaP-PLA/PLGA纳微球及其制备方法与应用

技术领域

本发明涉及一种载体纳微球及其制备方法，特别涉及一种使用所述纳微球作为免疫佐剂的应用。

背景技术

随着基因工程及分子生物学技术的高速发展，通过基因重组方法大规模生产蛋白、多肽药物、疫苗等已成为可能。无论作为治疗性药物还是预防用疫苗，蛋白多肽半衰期短、在体内易降解、失活、需要重复多次给药，这些特点决定了蛋白多肽药物单独用药效果不理想且用药成本昂贵。为了解决这个问题，科技人员开始采用药物缓释或控释技术对蛋白多肽进行包埋，以期增强药物药效、降低用药成本、达到靶向释药的目的。药物载体的研究已经成为世界科学研究的热点课题。另外，随着新的传染病的发现，一些新的重组蛋白、多肽疫苗问世，但这些疫苗虽然具有很高的安全性，但其免疫原性较低，需要添加佐剂才能诱导合适强度和水平的免疫应答。铝盐佐剂是目前应用最广泛的人用疫苗佐剂，研究发现，铝盐佐剂在一些新型疫苗中使用效果不佳，包括仅仅诱导体液免疫应答，无法诱导有效的细胞免疫应答，而对于病毒类感染而言，细胞免疫在感染细胞清除中发挥至关重要的作用。因此，需要开发新型佐剂以适应新型疫苗发展需求。颗粒佐剂由于可以改变抗原呈递途径，能诱导高效的细胞免疫应答，同时，又能通过抗原缓释和颗粒的佐剂功能，诱导有效的体液免疫应答，是有潜力的新型免疫佐剂。

聚乳酸(PLA)材料是一种用途广泛的生物降解高分子材料，已经成为生物医用材料中最受重视的材料之一。(1)聚乳酸也称为聚丙交酯，属于聚酯家族。聚乳酸是以乳酸为主要原料聚合得到的聚合物，原料来源充分且可以再生。聚乳酸的生产过程无污染，产品可以生物降解，实现在自然界中的循环，是理想的绿色高分子材料。常规方法中，聚乳酸可以使用可再生的植物资源(如玉米)所提出的淀粉原料制成。淀粉原料经由发酵过程制成乳酸，再通过化学合成转换成聚乳酸。其具有良好的生物可降解性，使用后能被自然界中微生物完全降解，最终生成二氧化碳和水，不污染环境，这对保护环境非常有利，是公认的环境友好材料。

聚乳酸机械性能及物理性能良好。聚乳酸适用于吹塑、热塑等各种加工方法，加工方便，应用十分广泛。可用于加工从工业到民用的各种塑料制品、包装食品、快餐饭盒、无纺布、工业及民用布。进而加工成农用织物、保健织物、抹布、卫生用品、室外防紫外线织物、帐篷布、地垫面等等，市场前景十分看好。在医药领域，聚乳酸由于其良好的相容性与可降解性，被广泛应用，如可生产一次性输液用具、免拆型手术缝合线等，低分子聚乳酸可作为药物缓释包装剂等。聚乳酸-羟基乙酸共聚物(poly(lactic-co-glycolic acid)，PLGA)由两种单体——乳酸和羟基乙酸随机聚合而成，是一种可降解的功能高分子有机化合物，具有良好的生物相容性、无毒、良好的成囊和成膜的性能，被广泛应用于制药、医用工程材料和现代化工业领域。在美国PLGA通过FDA认证，被正式作为药用辅料收录进美国药典。

PLGA的降解产物是乳酸和羟基乙酸，同时也是人代谢途径的副产物，所以将其应用在医药和生物材料中时，没有毒副作用。当然，乳糖缺陷者除外。通过调整单体比，可改变PLGA的降解速率，已被广泛应用于生物医学领域中，如：皮肤移植，伤口缝合，体内植入，微纳米粒等。市售的治疗晚期前列腺癌的Lupron Depot即是用PLGA充当药物载体。

制备蛋白多肽药物的高分子材料微球或微囊药物载体需要满足下面三个条件：1)需要采用生物降解性材料制备微球；2)制备过程不会导致蛋白多肽药物变性：3)包埋率要足够高。目前大多数包埋蛋白多肽药物的研究基本上都采用PLA或PLGA作为药物载体材料。PLA/PLGA物理性质包括：强度、疏水性和柔曲性。其降解产物乳酸或乙醇酸能够很快从人体内排出。PLA或PLGA作为药物载体或疫苗佐剂的另一个优点：由于高分子链的水解速率仅仪依赖于温度、pH值的变化或催化剂的存在与否，其在体内的各个地方的降解速率基本一致。PLA或PLGA的降解速率主要由高分子材料分子量、结晶度控制，对于PLGA来说，其降解速率还与乙交酯/丙交酯比例有关。

复乳溶剂蒸发法是常用的一种制备缓控释制剂的方法，已有很长一段历史了。同W/O或O/W等普通乳化型药物载体比较，复乳型药物载体包埋率较高、易于控释、不易引起药物失活，成为主要的药物载体制备技术。但是传统溶剂蒸发法长期以来采用机械搅拌、均质乳化和超声等剧烈的方法进行复乳液的制备，大大增加了药物失活的可能，同时能耗过高，不易于工业放大生产。由于机械乳化方法不易定量控制，制备出的载体微球粒径不均一、药物包埋率低且实验重复性差。药物载体粒径不均一还会导致以下问题存在：1)由于粒径不同的药物载体在体内的吸收部位和吸收机理各不相同，如果粒径不均一，就不能对药物载体粒径和吸收部位、吸收机理之间的关系进行有效地研究；2)在进行体内外药理实验时，由于药物载体粒径大小直接影响到所包药物的释放速率，如果药物载体粒径不均一，将导致实验的重复性差，直接影响药物载体的缓控释效果；3)作为疫苗佐剂而言，负载抗原后，由于其粒径大小不均一，导致抗原提呈细胞对其的摄取和转运存在很大差异，如果批次间粒径均一性差异较大，会导致批次间免疫效果的不稳定。

现有技术表明，采用金属等离子处理，可以对PLA/PLGA纤维材料进行矿化改性作用，得到的新的改性材料相比于未改性的材料，具备更多的优点：如纤维孔的直径更小，孔径更均匀，而纤维的韧性更强等。虽然目前已经存在多种方法能够制备得到PLA/PLGA微球，但是制备得到的微球的性质存在各种缺陷，比如微球粒径不均一，制备过程中粒径大小无法准确控制等。而目前对于PLA/PLGA微球的矿化作用研究的较少，尤其是在制备微球的过程中，是否能够通过矿化作用而对PLA/PLGA微球进行改性，得到性质更优的PLA/PLGA微球，目前还不清楚。

在现有技术中有公开微孔膜乳化技术制备复乳液滴，并在此基础上固化复乳液滴制备亲水性药物的聚合物微球或微囊载体。控制载体的直径在0.1微米至100微米以上的乳液或微球，而且由于乳化条件温和，在用作制备易变性的蛋白多肽药物的药物载体时、能够保持药物的活性。但是通过膜乳化技术制备以聚合物材料作为载体的亲水性药物的载体，需要较高的设备要求、严格的工艺控制，因此本发明公开一种更能够提高药物装载率的磷酸钙镀层修饰的CaP-PLA/PLGA纳微球药物制剂、其制备方法及应用等。

发明内容

本发明提供一种制备CaP-PLA/PLGA纳微球药物制剂方法，以及采用所述方法制备得到的CaP-PLA/PLGA纳微球，以及采用所述纳微球作为免疫佐剂的应用。

其中制备CaP-PLA/PLGA纳微球的方法，其包括以下步骤：

将PLA/PLGA溶于有机溶剂中，形成油相O；含有0.1M钙离子的水溶液作为内水相W₁，将油相O和W₁混合，通过超声或匀质法制备初乳液W₁/O；溶解聚乙烯醇(PVA)的水溶液作为外水相W₂，将初乳液加入到W₂中，机械搅拌形成预复乳液W₁/O/W₂；将预复乳液W₁/O/W₂转移到快速膜乳化储料罐中，在适当气体压力下反复过膜，得到粒径均一的复乳液W₁/O/W₂；向复乳液W₁/O/W₂体系中加入含0.1M磷酸根离子的溶液，混匀，离心过滤除去溶液；去离子水洗涤，干燥即得到CaP-PLA/PLGA微球。

其中由复乳液制备纳微球的方法还包括有机溶媒蒸发萃取法，或者相分离法，或者喷雾干燥法。

在其中一个实施方案中，所述制备方法包括：

将PLA/PLGA溶于有机溶剂中，形成油相O；含有0.1M～1M钙离子的水溶液作为内水相W₁，将油相O和W₁混合，通过超声或匀质法制备初乳液W₁/O；溶解聚乙烯醇(PVA)的水溶液作为外水相W₂，将初乳液加入到W₂中，机械搅拌形成预复乳液W₁/O/W₂；将预复乳液W₁/O/W₂转移到快速膜乳化储料罐中，在适当气体压力下反复过膜，得到粒径均一的复乳液W₁/O/W₂；向复乳液W₁/O/W₂体系中加入含0.1M～1M磷酸根离子的溶液，混匀，离心过滤除去溶液；去离子水洗涤，干燥即得到CaP-PLA/PLGA微球。

在其中一个实施方案中，所述制备方法包括：

1)将PLA/PLGA溶于二氯甲烷和乙酸乙酯的混合油相O，二氯甲烷和乙酸乙酯的体积比为10∶1～2∶1，PLA/PLGA浓度是1％～60％质量体积浓度；

2)含0.1M的钙离子溶液作为内水相W₁；

3)溶解了PVA的水溶液作为外水相W₂，其中PVA浓度为0.2％～10％质量体积浓度；

4)将W₁加入到O中，采用超声或均质方法制备初乳液W₁/O，将此初乳液W₁/O加入到W₂中，采用机械搅拌方法制备预复乳液W₁/O/W₂；

5)随后将此预复乳液W₁/O/W₂转移到快速膜乳化的储料罐中，在适当的氮气压力下反复过膜，过膜次数为2～8次，得到粒径均一的复乳液W₁/O/W₂；

6)向复乳液W₁/O/W₂体系中添加含0.1M磷酸根离子的水溶液，混匀后，离心过滤除去溶液，去离子水洗涤，真空干燥即得到CaP-PLA/PLGA纳微球。

在另一实施方案中，所述方法包括：

1)将PLA/PLGA溶于二氯甲烷和乙酸乙酯的混合油相O，二氯甲烷和乙酸乙酯的体积比为7∶1～3∶1，PLA/PLGA浓度是10％～50％质量体积浓度；

2)含0.1M的钙离子溶液作为内水相W₁，其中钙离子来源于氯化钙；

3)溶解了PVA的水溶液作为外水相W₂，其中PVA浓度为2％～5％质量体积浓度；

4)将W₁加入到O中，采用超声或均质方法制备初乳液W₁/O，其中W₁和O的体积比为1∶100至1∶1，乳化时间是1～10min；将此初乳液W₁/O加入到W₂中，采用机械搅拌方法制备预复乳液W₁/O/W₂，其中W₁/O和W₂的体积比是1∶50～1∶200，乳化时间是5～15min；

5)随后将此预复乳液W₁/O/W₂转移到快速膜乳化的储料罐中，在0.1-1Mpa的氮气压力下反复过膜，过膜次数为3～5次，得到粒径均一的复乳液W₁/O/W₂，其中所述膜为SPG膜。

6)向复乳液W₁/O/W₂体系中添加含0.1M磷酸根离子的水溶液，混匀后，离心过滤除去溶液，微球经过去离子水洗涤3～5次，冷冻干燥即得到CaP-PLA/PLGA纳微球。

在另一实施方案中，所述方法包括：

1)将PLA/PLGA溶于二氯甲烷和乙酸乙酯的混合油相O中，二氯甲烷和乙酸乙酯的体积比为4∶1，PLA/PLGA浓度是25％质量体积浓度；

2)含0.1M的钙离子的水溶液作为内水相W₁，其中钙离子来源于氯化钙；

3)溶解了PVA的水溶液作为外水相W₂，其中PVA浓度为3％质量体积浓度；

4)将W₁加入到O中，采用超声方法制备初乳液W₁/O，其中W₁和O的体积比为1∶45，乳化时间是4min；将此初乳液W₁/O加入到W₂中，采用机械搅拌方法制备预复乳液W₁/O/W₂，其中W₁/O和W₂的体积比是1∶75，乳化时间是8min；

5)随后将此预复乳液W₁/O/W₂转移到快速膜乳化的储料罐中，在0.8Mpa的氮气压力下反复过膜，过膜次数为3次，得到粒径均一的复乳液W₁/O/W₂，其中所述膜为SPG膜，孔径大小为2.8微米。

6)向复乳液W₁/O/W₂体系中添加含磷酸根离子的水溶液，混匀后，离心过滤除去溶液，纳微球经过去离子水洗涤3次，冷冻干燥即得到CaP-PLA/PLGA纳微球，其中所述水溶液是浓度为0.1M的磷酸氢二钠或磷酸二氢钠水溶液。

在另一实施方案中，所述方法包括：

1)将PLA/PLGA溶于二氯甲烷和乙酸乙酯的混合油相O，二氯甲烷和乙酸乙酯的体积比为3∶1，PLA/PLGA浓度是40％质量体积浓度；

2)含0.1M的氯化钙的水溶液作为内水相W₁，；

3)溶解了PVA的水溶液作为外水相W₂，其中PVA浓度为4％质量体积浓度；

4)将W₁加入到O中，采用超声或均质方法制备初乳液W₁/O，其中W₁和O的体积比为1∶20，乳化时间是7min；将此初乳液W₁/O加入到W₂中，采用机械搅拌方法制备预复乳液W₁/O/W₂，其中W₁/O和W₂的体积比是1∶120，乳化时间是12分钟；

5)随后将此预复乳液W₁/O/W₂转移到快速膜乳化的储料罐中，在0.，9Mpa的氮气压力下过膜，得到粒径均一的复乳液W₁/O/W₂，其中所述膜为SPG膜，膜孔径大小为2.8微米。

6)向复乳液W₁/O/W₂体系中添加含0.1M磷酸氢二钠的水溶液，混匀后，离心过滤除去溶液，纳微球经过去离子水洗涤3次，冷冻干燥即得到CaP-PLA/PLGA纳微球。

本发明内容还包括采用上述方法制备得到的CaP-PLA/PLGA纳微球。

本发明内容还包括采用上述方法制备得到的CaP-PLA/PLGA纳微球的用途，包括作为免疫佐剂的用途。其中纳微球与免疫抗原的质量比是1∶0.005～1∶0.1。

本发明内容还包括一种含有佐剂的疫苗组合物，其特征在于：所述佐剂是CaP-PLA纳微球或CaP-PLGA纳微球。其中佐剂的浓度是1～40mg/mL。优选的，所述佐剂的浓度是5～20mg/mL。

本发明内容还包括一种含有佐剂的疫苗组合物，其特征在于：所述佐剂是CaP-PLA纳微球或CaP-PLGA纳微球。其中佐剂的浓度是1～40mg/mL。优选的，所述佐剂的浓度是5～20mg/mL。其中所述疫苗选自HBsAg疫苗，重组蛋白HA，季节性流感全病毒灭活病毒，季节性流感裂解蛋白抗原。

本发明内容还包括采用上述方法制备得到的CaP-PLA/PLGA纳微球作为免疫佐剂的用途，包括作为HBsAg抗原佐剂的用途。其中微球与HBsAg抗原的质量比是1∶0.005～1∶0.1。

本发明内容还包括采用上述方法制备得到的CaP-PLA/PLGA纳微球作为免疫佐剂的用途，包括作为重组蛋白HA，季节性流感全病毒灭活病毒，季节性流感裂解蛋白抗原佐剂的用途。其中微球与HBsAg抗原的质量比是1∶0.005～1∶0.1。

本发明内容还包括一种含有佐剂的HBsAg疫苗，其特征在于：所述佐剂是CaP-PLA纳微球或CaP-PLGA纳微球。

本发明内容还包括采用上述方法制备得到的CaP-PLA/PLGA纳微球作为免疫佐剂的应用方法。

本发明内容还包括采用上述方法制备得到的CaP-PLA/PLGA纳微球作为HBsAg抗原免疫佐剂的应用方法。包括：

1)称取采用上述方法制备得到的CaP-PLA/PLGA纳微球5～10mg；

2)将上述微球与1mL HBsAg抗原溶液混匀得到混合溶液，其中HBsAg抗原溶液浓度是5～200μg/mL；

3)将混合溶液在小鼠背部皮下注射，每次注射量为100μL混悬液；

本发明内容还包括采用上述方法制备得到的CaP-PLA/PLGA纳微球作为HBsAg抗原免疫佐剂的应用方法。包括：

1)称取采用上述方法制备得到的CaP-PLA/PLGA纳微球5mg；

2)将上述微球与1mL HBsAg抗原溶液混匀得到混合溶液，其中HBsAg抗原溶液浓度是5～200μg/mL；

3)将混合溶液在小鼠背部皮下注射，每次注射量为100μL混悬液；

本发明内容还包括采用上述方法制备得到的CaP-PLA/PLGA纳微球作为HBsAg抗原免疫佐剂的应用方法。包括：

1)称取采用上述方法制备得到的CaP-PLA/PLGA纳微球5～10mg；

2)将上述微球与1mL HBsAg抗原溶液混匀得到混合溶液，其中HBsAg抗原溶液浓度是40μg/mL；

3)将混合溶液在小鼠背部皮下注射，每次注射量为100μL混悬液；

本发明内容还包括采用上述方法制备得到的CaP-PLA/PLGA纳微球作为HBsAg抗原免疫佐剂的应用方法。包括：

1)称取采用上述方法制备得到的CaP-PLA/PLGA纳微球5mg；

2)将上述微球与1mL HBsAg抗原溶液混匀得到混合溶液，其中HBsAg抗原溶液浓度是40μg/mL；

3)将混合溶液在小鼠背部皮下注射，每次注射量为100μL混悬液；

本发明内容还包括一种采用上述方法制备得到的CaP-PLA纳微球或CaP-PLGA纳微球的应用方法，其特征在于：通过改变缓冲液的pH值从而改变所述纳微球对于抗原的吸附。

本发明内容还包括一种采用上述方法制备得到的CaP-PLA纳微球或CaP-PLGA纳微球的应用方法，其特征在于：通过改变缓冲液的pH值从而改变所述纳微球对于抗原的吸附，将缓冲液pH值从5.7升高至7.2，从而降低所述纳微球对抗原的吸附。

本发明内容还包括一种采用上述方法制备得到的CaP-PLA纳微球或CaP-PLGA纳微球的应用方法，其特征在于：所述纳微球吸附抗原后，具有抗原pH敏感释放行为，通过改变缓冲液的pH值改变抗原释放速率。

本发明内容还包括一种采用上述方法制备得到的CaP-PLA纳微球或CaP-PLGA纳微球的应用方法，其特征在于：所述纳微球吸附抗原后，具有抗原pH敏感释放行为，通过改变缓冲液的pH值改变抗原释放速率，在低pH缓冲液中(pH5.7)，抗原快速释放；在高pH缓冲液中(pH7.2)，抗原几乎不释放或释放很慢。

本发明的有益效果：通过一步法制备CaP-PLA/PLGA纳微球，该纳微球相对于现有技术中的PLA/PLGA微球，微球粒径均一，且微球表面形成大量的褶皱结构，有利于抗原的吸附；同时，所述纳微球由于表面的磷酸盐钙镀层，可通过配基交换模式增强抗原吸附，是一种较好的免疫佐剂。进一步的试验证明，制备得到的CaP-PLA/PLGA纳微球具有pH值的敏感性，在不同pH值条件下，携载抗原的纳微颗粒的抗原释放速率不同，有利于后续免疫应答的提升。

附图说明

图1制备的CaP-PLA纳微球的扫描电镜照片。

图2图1显示的电镜照片的局部放大的照片。

图3制备的CaP-PLA纳微球对HBsAg抗原的吸附结果。

图4制备的CaP-PLA纳微球作为HBsAg抗原佐剂，免疫小鼠后30天的抗体水平检测。

图5制备的CaP-PLA纳微球作为HBsAg抗原佐剂，免疫小鼠后60天的抗体水平检测。

图6制备的CaP-PLA纳微球作为HBsAg抗原佐剂，免疫小鼠后IFN-γ的分泌水平检测。

图7制备的CaP-PLA纳微球吸附HBsAg抗原对pH值的敏感性。

图8CaP-PLA载抗原纳微球在pH7.2缓冲液中抗原释放30min的扫描电镜照片。

图9CaP-PLA载抗原纳微球在pH5.7缓冲液中抗原释放30min后的扫描电镜照片

具体实施方式

实施例1

CaP-PLA微球的制备

1)将PLA溶于二氯甲烷和乙酸乙酯的混合油相O，二氯甲烷和乙酸乙酯的体积比为5∶1，PLA浓度是30％质量体积浓度；

2)含0.1M的钙离子的水溶液作为内水相W₁，其中钙离子来源于氯化钙；

3)溶解了PVA的水溶液作为外水相W₂，其中PVA浓度为5％质量体积浓度；

4)将W₁加入到O中，采用超声方法制备初乳液W₁/O，其中W₁和O的体积比为1∶30，乳化时间是2min；将此初乳液W₁/O加入到W₂中，采用机械搅拌方法制备预复乳液W₁/O/W₂，其中W₁/O和W₂的体积比是1∶50，乳化时间是5min；

5)随后将此预复乳液W₁/O/W₂转移到快速膜乳化的储料罐中，在0.75Mpa的氮气压力下过膜3次，得到粒径均一的复乳液W₁/O/W₂，其中所述膜为SPG膜，孔径大小为2.8微米。

6)向复乳液W₁/O/W₂体系中添加含0.1M磷酸氢二钠的水溶液，混匀后，离心过滤除去溶液，微球经过去离子水洗涤3次，冷冻干燥即得到CaP-PLA纳微球。

制备得到的微球的电镜照片如说明书附图图1所示。

实施例2

CaP-PLGA微球的制备

1)将PLGA溶于二氯甲烷和乙酸乙酯的混合油相O，二氯甲烷和乙酸乙酯的体积比为8∶1，PLGA浓度是45％质量体积浓度；

2)含0.1M的钙离子的水溶液作为内水相W₁，其中钙离子来源于氯化钙；

3)溶解了PVA的水溶液作为外水相W₂，其中PVA浓度为7％质量体积浓度；

4)将W₁加入到O中，采用匀质法制备初乳液W₁/O，其中W₁和O的体积比为1∶50，乳化时间是6min；将此初乳液W₁/O加入到W₂中，采用机械搅拌方法制备预复乳液W₁/O/W₂，其中W₁/O和W₂的体积比是1∶120，乳化时间是10min；

5)随后将此预复乳液W₁/O/W₂转移到快速膜乳化的储料罐中，在0.6Mpa的氮气压力下过膜6次，得到粒径均一的复乳液W₁/O/W₂，其中所述膜为SPG膜，膜孔径大小为2.8微米。

6)向复乳液W₁/O/W₂体系中添加含0.1M磷酸氢二钠的水溶液，混匀后，离心过滤除去溶液，再用去离子水洗涤3次，冷冻干燥即得到CaP-PLGA纳微球。

实施例3

CaP-PLA微球对抗原的吸附

CaP-PLA微球对HBsAg的吸附将HBsAg原液用pH6.8的磷酸缓冲液稀释到一定浓度，取1mL稀释后的HBsAg溶液，加入少量NaCl，保证抗原溶液有一定盐浓度，再向1mL抗原溶液中加入5mg的CaP-PLA纳微球，使纳微球充分悬浮在HBsAg溶液中，在一定温度下振荡吸附12h，振荡频率20r/min。同时对照试验中加入PLA纳微球和铝盐佐剂。

HBsAg吸附率的测定取振荡吸附后的抗原微球混合溶液，5000r/min离心6min，吸出上清，采用BCA试剂盒和Micro-BCA试剂盒测定其中HBsAg含量。微球对抗原的吸附率(Adsorption Efficiency，AE)按下式计算：

AE＝(吸附前抗原质量-吸附后上清中抗原质量)/吸附前抗原质量X100％。

抗原吸附测定结果参看图3。

实施例4

CaP-PLA微球作为HBsAg抗原免疫佐剂的应用

1)将PLA溶于二氯甲烷和乙酸乙酯的混合油相O，二氯甲烷和乙酸乙酯的体积比为10∶1，PLA浓度是30％质量体积浓度；

2)含0.1M的钙离子的水溶液作为内水相W₁，其中钙离子来源于氯化钙；

3)溶解了PVA的水溶液作为外水相W₂，其中PVA浓度为8％质量体积浓度；

4)将W₁加入到O中，采用匀质法制备初乳液W₁/O，其中W₁和O的体积比为1∶30，乳化时间是3min；将此初乳液W₁/O加入到W₂中，采用机械搅拌方法制备预复乳液W₁/O/W₂，其中W₁/O和W₂的体积比是1∶100，乳化时间是8min；

5)随后将此预复乳液W₁/O/W₂转移到快速膜乳化的储料罐中，在0.55Mpa的氮气压力下过膜4次，得到粒径均一的复乳液W₁/O/W₂，其中所述膜为SPG膜，膜孔径大小为2.8微米。

6)向复乳液W₁/O/W₂体系中添加含0.1M磷酸氢二钠的水溶液，混匀后，离心过滤除去溶液，再用去离子水洗涤3次，冷冻干燥即得到CaP-PLA纳微球。

7)称取制备得到的CaP-PLA纳微球5mg；对照组分别称取5mg PLA纳微球及5mg铝盐佐剂。

8)将上述微球与HBsAg抗原溶液混匀得到混合溶液，其中HBsAg抗原溶液浓度是40μg/mL；

9)将混合溶液在小鼠背部皮下注射，注射量为100μL混悬液；

10)在15d和30d时分别以相同剂量加强免疫，注射量为100μL混悬液；

11)60d时小鼠眼球采血并处死，同时收集血清检测抗体水平和细胞因子水平。

抗体测定水平参看图4-图5，IFN-γ的分泌水平测定请参见图6。

实施例5

载抗原CaP-PLA纳微球的抗原pH敏感释放

取吸附HBsAg抗原的CaP-PLA纳微球各5mg，分别用pH5.7和pH值7.2的PBS进行振荡混合，振荡频率20r/min，进行30min的抗原释放。取抗原-微球混悬液，5000r/min离心6min，吸出上清，采用BCA试剂盒和Micro-BCA试剂盒测定释放的HBsAg量。并进一步计算出微球上未释放的HBsAg量。

根据计算得到的结果，进一步采用电镜扫描抗原在不同pH环境中释放后的载抗原微球照片，考察其pH敏感释放行为。

不同pH值PBS处理后，载抗原微球的抗原释放结果参见图7。

载抗原CaP-PLA微球在不同pH缓冲液中抗原释放后的电镜照片参见图8和图9。

实施例6

CaP-PLA纳微球作为重组蛋白HA免疫佐剂的应用

具体操作及免疫方法参照实施例4，试验结果表明，CaP-PLA纳微球作为佐剂，小鼠的抗体水平显著高于其他两种对照佐剂。

实施例7

CaP-PLGA纳微球作为季节性流感全病毒灭活病毒免疫佐剂的应用

具体操作及免疫方法参照实施例4，试验结果表明，CaP-PLGA纳微球作为佐剂，小鼠的抗体水平同样显著高于其他两种对照佐剂。

实施例8

CaP-PLGA纳微球作为季节性流感裂解蛋白抗原免疫佐剂的应用

具体操作及免疫方法参照实施例4，试验结果表明，CaP-PLGA纳微球作为佐剂，小鼠的抗体水平同样显著高于其他两种对照佐剂。

本发明并不是按照本申请中所描述的具体实施方案而限制的，所述具体实施方案意图作为本发明各方面的单一例示。可以在不背离本发明的精神和范围的前提下，对其进行许多修饰和变化，这对本领域技术人员是显而易见的。在那些本文中所列举的之外，从上述描述看，本发明范围内的功能等同方法和设备对于本领域技术人员是显而易见的。此类修饰和变化形式落入所附权利要求书的范围内。本发明应当仅受限于所附权利要求书的各条款，以及这些权利要求有权的等同方案的全部范围。应当理解的是，本发明并不限于具体的方法、试剂、化合物组合物或生物学系统，它们当然可以有所变化。还应当理解的是，本文中所使用的术语仅出于描述具体的实施方案的目的，而并不意图是限制性的。

Claims (6)

1.一种制备CaP-PLA纳微球的方法，其特征在于，包括以下步骤：

(1)将PLA溶于二氯甲烷和乙酸乙酯的混合油相O，二氯甲烷和乙酸乙酯的体积比为5∶1，PLA浓度是30％质量体积浓度，形成油相O；

(2)含0.1M的钙离子的水溶液作为内水相W₁，其中钙离子来源于氯化钙，将油相O和W₁混合，采用超声方法制备初乳液W₁/O，其中W₁和O的体积比是1∶30，乳化时间是2min；

(3)溶解了PVA的水溶液作为外水相W₂，其中PVA浓度为5％质量体积浓度，将初乳液加入到W₂中，机械搅拌形成预复乳液W₁/O/W₂，其中W₁/O和W₂的体积比是1∶50，乳化时间是5min；

(4)将此预复乳液W₁/O/W₂转移到快速膜乳化的储料罐中，在0.75Mpa的氮气压力下过膜3次，得到粒径均一的复乳液W₁/O/W₂，其中膜为SPG膜，孔径大小为2.8微米；

(5)向复乳液W₁/O/W₂体系中添加含0.1M磷酸氢二钠的水溶液，混匀后，离心过滤除去溶液，微球经过去离子水洗涤3次，冷冻干燥即得到CaP-PLA纳微球。

2.由权利要求1所述方法制备得到的CaP-PLA纳微球，所述的CaP-PLA纳微球用作免疫佐剂。

3.一种含有佐剂的疫苗组合物，其特征在于，所述佐剂是权利要求2所述的CaP-PLA纳微球。

4.如权利要求3所述的疫苗组合物，其特征在于，所述佐剂的浓度是100μg/mL～40mg/mL。

5.如权利要求3或4任一权利要求所述的疫苗组合物，其特征在于：所述疫苗选自HBsAg，重组蛋白HA，季节性流感全病毒灭活病毒，季节性流感裂解蛋白抗原。

6.一种权利要求2所述的CaP-PLA纳微球的体外应用方法，其特征在于：所述纳微球吸附抗原后，具有抗原pH敏感释放行为，通过改变缓冲液的pH值改变抗原释放速率。

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