CN105297143A - 基于乳液不对称PCR的ssDNA次级文库的制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及生物医学与临床医学技术领域，特别是一种基于乳液不对称PCR的ssDNA次级文库的制备方法；本发明首先合成引物和随机ssDNA文库，然后配置乳液-不对称PCR反应液；以乳液-不对称PCR反应液配置乳化液，进行乳液不对称PCR扩增，得到无副产物的目的产物，目的产物含生物素标记的dsDNA和无生物素标记的ssDNA；然后通过与链霉亲和素磁珠结合，将无生物素标记的产物分离出来，即为次级ssDNA文库；本发明建立的基于乳液不对称PCR的次级文库的制备方法，克服了其它方法的副产物问题，使PCR扩增步骤简单方便，同时由于没有副产物干扰，使下游的分离步骤变得简单高效。

Description

基于乳液不对称PCR的ssDNA次级文库的制备方法

技术领域

本发明涉及生物医学与临床医学技术领域，特别是一种基于乳液不对称PCR的ssDNA次级文库的制备方法。

背景技术

适配子是一种ssDNA或RNA分子，它能高亲和力高特异性结合多种靶分子，如：蛋白质、氨基酸、药物、金属离子、细胞等。适配子类似于抗体，但比抗体更易合成和保存，因此适配子有代替抗体用于基础研究和临床诊疗的潜力。

适配子是通过SELEX技术筛选获得。ssDNA次级文库的制备是SELEX技术的关键步骤。目前ssDNA次级文库制备的方法主要有：不对称PCR，生物素链霉亲和素分离法，核酸外切酶消化法等。

不对称PCR扩增产物含目的ssDNA、dsDNA和副产物。需要通过变性聚丙烯酰氨凝胶电泳分离，把目的ssDNA与dsDNA和副产物分离开，在胶回收纯化过程中会导致目的ssDNA的大量丢失；同时如果副产物较多，易与目的ssDNA融合形成涂抹带，不能把ssDNA分离开，从而得不到较纯的目的ssDNA次级文库。

生物素链霉亲和素分离法是使用生物素标记其中一条引物进行PCR扩增，扩增产物通常含生物素标记的dsDNA，生物素标记的副产物和无生物素标记的副产物。扩增产物与链霉亲和素磁珠结合，将生物素标记的产物分离出来，再通过碱变性使未标记生物素的ssDNA分离出来。该法的缺点是分离出的ssDNA含有一定量的副产物，同时分离出的ssDNA在高pH值的碱溶液中，回收纯化可导致ssDNA的损失。

核酸外切酶消化法是利用核酸外切酶消化PCR扩增产物，使dsDNA转化成ssDNA，消化结束后，用变性聚丙烯酰氨凝胶电泳分离，纯化回收。在纯化回收的过程中易导致目的ssDNA大量丢失。

以上三种方法还有一个重要的共同缺点：在这些方法中PCR扩增是的一个关键步骤，PCR扩增产物的质量直接影响到次级ssDNA文库的质量。PCR扩增随机ssDNA不仅优化过程繁琐，而且不可避免的产生副产物，不仅使扩增效率下降，还造成潜在的高质量的适配子丢失。

传统的PCR方法效率低下是由于随机寡核苷酸文库极为丰富多样，扩增时库容量为10⁹左右，不同产物间的杂交而形成非特异性扩增是PCR过程中一个难以避免的重要问题。随机文库PCR与只扩增一种目的模板的常规PCR差异巨大，Musheev等发现当产物达到峰值时，仅多扩增5个循环就能使目的产物完全转变为非特异性产物，而主要的非特异性产物可能是产物与产物间的杂交，形成ssDNA-dsDNA，产物和产物的杂交又可使潜在的高亲和力、高特异性适配子丢失而导致筛选失败。要减少非特异性产物的产生，传统方法只有优化PCR反应条件和设计好文库的固定序列，但这些方法只能使非特异性产物有所减少，使PCR循环达到产物量最大时停止扩增，而不能从根本上解决非特异性扩增，更不能阻止产物与产物间的杂交。

总之传统PCR扩增随机ssDNA文库的缺点是：1、不同产物间的杂交和非特异性扩增无法避免。2、PCR生成的目的产物会转化为副产物，且随循环数的增加而增加，直至全部转化为副产物。3、优化反应条件步骤繁琐，且不能完全避免副产物生成。因此传统PCR用于ssDNA次级文库的制备的效率低下且不可避免导致潜在的适配子丢失。

本发明建立的乳液不对称PCR方法可彻底解决传统PCR的缺点，乳液不对称PCR通过乳液颗粒把约10⁹个不同的模板间隔开，分别在不同的乳液颗粒中扩增，因此它们的产物不会相互杂交而产生副产物。该法不仅提高了产物量，解决了副产物问题，还不需要循环数优化，可直接扩增到35-50个循环，简单高效。

发明内容

本发明为克服现有技术中存在的缺陷，提供一种基于乳液不对称PCR的ssDNA次级文库的制备方法，该制备方法不仅提高产物量，解决现有技术副产物问题，而且不需要循环数优化，可直接扩增到35-50个循环，简单高效。

为解决上述技术问题，本发明提供一种基于乳液不对称PCR的ssDNA次级文库的制备方法，包括如下步骤：

S1.合成引物和随机ssDNA文库，其中上游引物无生物素标记，下游引物有生物素标记；所述随机ssDNA文库长度为90bp，两端各为长19bp的固定序列，中间为52bp的随机序列。随机ssDNA文库序列为：

5′-GAACATTGGCGTCCGTGAG-N52-CACTTCCTCAAACGCCCAA-3′；

上游引物为5′-GAACATTGGCGTCCGTGAG-3′，

下游引物为5′-biotin-TTGGGCGTTTGAGGAAGTG-3′。

S2.配置乳液-不对称PCR反应液：

以步骤S1中随机ssDNA文库和引物为模板和引物配置乳液-不对称PCR反应液。

所述乳液-不对称PCR反应液100μL体系含50mmol/LKCl、10mmol/LpH8.6的Tris-HCl、2.5mmol/LMgCl₂、0.5mmol/LdNTP、0.6μmol/L上引、0.03μmol/L下引、0.04μg/mL模板和100U/mLpfuDNA聚合酶。

S3.乳化液的制备：

以步骤S2中的乳液-不对称PCR反应液配置乳化液，其中水相为乳液-不对称PCR反应液，油相组成为4.5%(v/v)Span80、0.4%(v/v)Tween80、0.05%(v/v)TritonX-100，其余为mineraloil（矿物油）；然后进行乳化液的制作：把水相以每滴8~10μL的速度匀速滴入含油相的2mL平底冷冻管中，同时用搅拌子为8×1.5mm的磁力搅拌器以1500rpm的速度搅拌，当水相加完后继续搅拌20min，得到0.3mL的乳化液，分装入PCR反应管中；

其中水相与油相的体积比为1:2；所述匀速滴入的时间为每0.1mL的水相滴入0.2mL油相的时间控制在1分钟左右。

S4.乳液不对称PCR扩增：

把步骤S3中的分装的装有乳化液的PCR反应管，置入PCR仪中进行扩增；反应条件为94℃变性30s，然后进入40个循环94℃变性40s、60℃退火30s、72℃延伸30s，最后延伸3min。

S5.PCR产物纯化：将步骤S4得到的PCR产物进行纯化，得到目标ssDNA次级文库和生物素标记dsDNA的混合物。

（1）用型号为28004的QIAGEN纯化试剂盒纯化产物，把步骤S4中扩增结束PCR反应管，以13000rpm转速，离心10分钟，去除上层油相；

（2）在剩余反应液中加入5倍体积的PBbuffer至PCR产物中，混匀，加1μL冰醋酸使溶液变为黄色，转移至回收柱中，13000rpm离心1min，弃液；

（3）加入750μLPEbuffer至回收柱中，13000rpm离心1min，弃液，再次离心1min；

（4）将柱子转移至新的2mL离心管，加入30~50μLEBbuffer，室温静置1min后，13000rpm离心1min，得到纯化产物为目标ssDNA次级文库和生物素标记dsDNA混合物；

S6.链霉亲和素磁珠分离步骤S5中得到的目标ssDNA次级文库和生物素标记的dsDNA：

（1）用型号为65001的invitrogen磁珠分离，取6～7×10⁷个链霉亲和素磁珠混悬液，加入1.5mL离心管，用含10mMTris-HClpH7.5，1MmEDTA，2MNaCl的2×B&W缓冲液洗涤磁珠一次，上磁力架1～2min，吸弃洗涤液；

（2）加入含5mMTris-HClpH7.5，0.5MmEDTA，1MNaCl的1×B&W缓冲液重悬磁珠；

（3）加入等体积纯化的步骤S5中得到的PCR纯化产物，室温下摇床结合15min左右，上磁力架1～2min，含生物素的dsDNA与链霉亲和素磁珠结合并吸附在管壁上，不含生物素的ssDNA游离于上清中；

（4）吸取上清，即为ssDNA次级文库。

S7.结果检测：

（1）浓度检测，使用核酸蛋白定量仪检测得到的次级文库浓度；

（2）纯度检测，使用尿素变性聚丙烯酰氨凝胶电泳银染检测。

本发明的有益效果：

本发明首先建立乳液不对称PCR方法，应用该法扩增出无副产物的目的产物，目的产物含生物素标记的dsDNA和无生物素标记的ssDNA；然后通过与链霉亲和素磁珠结合，将无生物素标记的产物分离出来，即为次级ssDNA文库。

本发明建立的基于乳液不对称PCR的次级文库的制备方法，克服了其它方法的副产物问题，使PCR扩增步骤简单方便，同时由于没有副产物干扰，使下游的分离步骤变得简单高效。

本发明方法的优点主要表现在以下几个方面：

1.乳液不对称PCR扩增产物无副产物，不需要聚丙烯酰氨凝胶电泳分离目的ssDNA，因而不易丢失ssDNA；

2.分离简单方便：乳液不对称PCR扩增产物只有两种：生物素标记的dsDNA和无生物素标记的ssDNA。应用链霉亲和素磁珠结合生物素标记的dsDNA，可一步法分离出ssDNA即为次级文库，ssDNA在缓冲液中无需纯化回收，可直接用于下一轮的适配子筛选；而生物素链霉亲和素分离法则是先分离出生物素标记的dsDNA，再用碱变性从生物素标记的dsDNA分离出ssDNA，不仅使用磁珠量多，产量少，而且分离出的ssDNA在高pH值的碱溶液中，需要进一步处理才能用于下一轮适配子筛选；

3.本法得到ssDNA次级文库纯度高，接近原始文库，如附图2；

4．步骤简单，如附图1。

附图说明

图1为实施例1的基于乳液不对称PCR的ssDNA次级文库的制备方法流程图。

图2为实施例1中制备的次级文库与原始合成文库的对比；其中，1为原始合成文库，2为制备文库，M为marker。

图3为实施例1中制备的次级文库过程中乳液不对称PCR扩增过程图，从10个循环扩增到50个循环；其中，C为原始文库对照，M为marker。

图4为现有技术中的常规不对称PCR扩增过程图，分别从10个循环扩增到50个循环；其中，C为原始文库对照，M为marker。

具体实施方式

实施例1：

本实施例1提供了一种基于乳液不对称PCR的ssDNA次级文库的制备方法，其制备流程，如图1所示，包括如下步骤：

S1.合成引物和随机ssDNA文库：

随机ssDNA文库长度为90bp，两端各为长19bp的固定序列，中间为52bp的随机序列：5′-GAACATTGGCGTCCGTGAG-N52-CACTTCCTCAAACGCCCAA-3′，上游引物为5′-GAACATTGGCGTCCGTGAG-3′，下游引物为5′-biotin-TTGGGCGTTTGAGGAAGTG-3′，文库由IDT公司合成，引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。

S2.配置乳液-不对称PCR反应液：

以步骤1中ssDNA文库和引物为模板和引物配置乳液不对称PCR反应液，100μL体系含50mmol/LKCl、10mmol/LpH8.6的Tris-HCl、2.5mmol/LMgCl₂、0.5mmol/LdNTP、0.6μmol/L上引、0.03μmol/L下引、0.04μg/mL模板和100U/mLpfuDNA聚合酶。

S3.乳化液的制备：

以步骤2中的反应液配置乳化液，水相为PCR反应液，油相组成为4.5%(v/v)Span80、0.4%(v/v)Tween80、0.05%(v/v)TritonX-100，其余为mineraloil。油包水乳液颗粒（也就是乳化液）的制作：把0.1mL的PCR反应液，以每滴8~10μL的速度匀速滴入含0.2ml油相的2mL平底冷冻管中，滴入时间控制在1分钟左右，同时用搅拌子为8×1.5mm的磁力搅拌器以1500rpm的速度搅拌，当水相加完后继续搅拌20min，得到0.3ml的乳化液，分装入3管PCR反应管中。

S4.乳液不对称PCR扩增：

把步骤3中的分装的装有乳化液的PCR反应管，置入PCR仪中进行扩增；反应条件为94℃变性30s，然后进入40个循环94℃变性40s、60℃退火30s、72℃延伸30s，最后延伸3min。

S5.纯化产物：

（1）用型号为28004的QIAGEN纯化试剂盒纯化产物，把步骤4中扩增结束PCR反应管，以13000rpm转速，离心10分钟，去除上层油相；

（2）在剩余反应液中加入5倍体积的PBbuffer至PCR产物中，混匀，加1μL冰醋酸使溶液变为黄色，转移至回收柱中，13000rpm离心1min，弃液；

（3）加入750μLPEbuffer至回收柱中，13000rpm离心1min，弃液，再次离心1min；

（4）将柱子转移至新的2mL离心管，加入30~50μlEBbuffer，室温静置1min后，13000rpm离心1min，得到纯化产物为目标ssDNA次级文库和生物素标记dsDNA混合物。

S6.链霉亲和素磁珠分离步骤5中的目标ssDNA次级文库和生物素标记dsDNA：

（1）用型号为65001的invitrogen磁珠分离，取6～7×10⁷个链亲和素磁珠混悬液，加入1.5ml离心管，用含10mMTris-HClpH7.5，1MmEDTA，2MNaCl的2×B&W缓冲液洗涤磁珠一次，上磁力架1～2min，吸弃洗涤液；

（2）加入含5mMTris-HClpH7.5，0.5MmEDTA，1MNaCl的1×B&W缓冲液重悬磁珠；

（3）加入等体积纯化的步骤5中的PCR纯化产物，室温下摇床结合15min左右，上磁力架1～2min，含生物素的dsDNA与链亲和素磁珠结合并吸附在管壁上，不含生物素的ssDNA游离于上清中；

（4）吸取上清，即为ssDNA次级文库。

S7.结果检测：

（1）浓度检测，使用核酸蛋白定量仪检测得到的次级文库浓度；

（2）纯度检测，使用尿素变性聚丙烯酰氨凝胶电泳银染检测。

在上述步骤S7的浓度检测中，使用核酸蛋白定量仪检测得到的次级文库浓度为6.55μg/ml，换算到原始PCR反应体系为13.1μg/mL，即473.64pmol/mL；

在上述步骤S7的纯度检测中，使用尿素变性聚丙烯酰氨凝胶电泳银染检测得到的次级文库纯度，其步骤如下：

（1）制备12%7M尿素变性PAGE凝胶：40%丙烯酰胺凝胶3ml，5×TBE2mL，尿素4.2g，10%过硫酸胺33μL，去离子水1.5mL，TEMED7.5μL；

（2）加样：取PCR产物4μL与电泳上样缓冲液4μL混匀，加入凝胶样孔中；

（3）垂直电泳：电压设定于150V。当指示剂到达凝胶的下1/3时，停止电泳，小心取下凝胶；

（4）银染：用含10%无水乙醇和0.5%乙酸固定液中固定10~15min，蒸馏水冲洗3次；用0.2%硝酸银染色10min，蒸馏水冲洗3次；用含1.5%氢氧化钠和0.4%甲醛显色液中显色，直至出现清晰的DNA条带后，清水中漂洗3min；

（5）拍照。

结果分析：

浓度检测结果：实施例1中得到的ssDNA浓度为473.64pmol/mL，说明本发明方法能制备浓度较高的次级ssDNA文库；

电泳分析结果：从图2可以看出实施例1中回收产物无副产物，与原始文库接近；从图3可以看出实施例1在整个乳液不对称PCR扩增循环中均无副产物出现；从图4可以看出现有技术中的常规不对称PCR扩增25个循环即有副产物出现，30个循环时副产物大量出现。说明本发明方法能得到高纯度高质量的次级ssDNA文库。

Claims (8)

1.一种基于乳液不对称PCR的ssDNA次级文库的制备方法，其特征在于，按照以下步骤进行：

S1.合成引物和随机ssDNA文库：其中下游引物有生物素标记；

S2.配置乳液-不对称PCR反应液：以步骤S1中随机ssDNA文库和引物为模板和引物配置乳液-不对称PCR反应液；

S3.乳化液的制备：以步骤S2中的乳液-不对称PCR反应液配置乳化液，其中乳化液中的水相为乳液-不对称PCR反应液；油相为Span80、Tween80、TritonX-100和mineraloil的混合液;

S4.乳液不对称PCR扩增：把步骤S3中的分装的装有乳化液的PCR反应管，置入PCR仪中进行扩增；

S5.PCR产物纯化：将步骤S4得到的PCR产物进行纯化，得到目标ssDNA次级文库和生物素标记dsDNA的混合物；

S6.链霉亲和素磁珠分离步骤S5中得到的目标ssDNA次级文库和生物素标记的dsDNA；

S7.结果检测：对得到的目标ssDNA次级文库的浓度和纯度进行检测。

2.根据权利要求1所述的一种基于乳液不对称PCR的ssDNA次级文库的制备方法，其特征在于，步骤S1中所述的引物为：

上游引物为5′-GAACATTGGCGTCCGTGAG-3′，

下游引物为5′-biotin-TTGGGCGTTTGAGGAAGTG-3′。

3.根据权利要求1所述的一种基于乳液不对称PCR的ssDNA次级文库的制备方法，其特征在于，步骤S1中所述的随机ssDNA文库长度为90bp，两端各为长19bp的固定序列，中间为52bp的随机序列；其中随机ssDNA文库序列为：

5′-GAACATTGGCGTCCGTGAG-N52-CACTTCCTCAAACGCCCAA-3′。

4.根据权利要求1所述的一种基于乳液不对称PCR的ssDNA次级文库的制备方法，其特征在于，步骤S2中所述乳液-不对称PCR反应液100μL体系含50mmol/LKCl、10mmol/LpH8.6的Tris-HCl、2.5mmol/LMgCl₂、0.5mmol/LdNTP、0.6μmol/L上引、0.03μmol/L下引、0.04μg/mL模板和100U/mLpfuDNA聚合酶。

5.根据权利要求1所述的一种基于乳液不对称PCR的ssDNA次级文库的制备方法，其特征在于，步骤S3中所述乳化液中的油相组成为4.5%(v/v)Span80、0.4%(v/v)Tween80、0.05%(v/v)TritonX-100，其余为mineraloil。

6.根据权利要求1所述的一种基于乳液不对称PCR的ssDNA次级文库的制备方法，其特征在于，所述乳化液是把水相以每滴8~10μL的速度匀速滴入含油相的平底冷冻管中，同时用磁力搅拌器搅拌，当水相加完后继续搅拌20min，得到乳化液，分装入PCR反应管中。

7.根据权利要求6所述的一种基于乳液不对称PCR的ssDNA次级文库的制备方法，其特征在于，所述乳化液中水相与油相的体积比为1:2；所述匀速滴入的时间为每0.1mL的水相滴入0.2mL油相的时间控制在1分钟左右。

8.根据权利要求1所述的一种基于乳液不对称PCR的ssDNA次级文库的制备方法，其特征在于，步骤S4中所述PCR扩增的反应条件为94℃变性30s，然后进入40个循环94℃变性40s、60℃退火30s、72℃延伸30s，最后延伸3min。