CN105296513B

CN105296513B - 一种海洋酯酶及其编码基因e22与应用

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Publication number: CN105296513B
Application number: CN201510907341.1A
Authority: CN
Inventors: 陈秀兰; 姚琼琼; 李平; 李平一; 张袆; 张玉忠; 石梅; 解彬彬; 苏海楠; 周百成
Original assignee: CHINA OCEAN MINERAL RESOURCES R&D ASSOCIATION; Shandong University
Current assignee: CHINA OCEAN MINERAL RESOURCES R&D ASSOCIATION; Shandong University
Priority date: 2015-12-09
Filing date: 2015-12-09
Publication date: 2018-07-31
Anticipated expiration: 2035-12-09
Also published as: CN105296513A

Abstract

本发明涉及一种海洋酯酶及其编码基因E22与应用。一种海洋酯酶基因E22，核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。所述海洋酯酶基因E22编码的海洋酯酶E22，氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。本发明所述的海洋酯酶E22能高效选择性地降解手性酯，具有合成重要手性化合物的工业应用潜力。

Description

一种海洋酯酶及其编码基因E22与应用

技术领域

本发明涉及一种海洋酯酶及其编码基因E22与应用，属于生物技术技术领域。

背景技术

酯酶(esterase)，又称羧酸酯酶，是具有重要工业价值的生物催化剂之一，可以水解酯类底物产生酸类和醇类物质，也可以催化逆反应合成各种酯类。其通常作用于简单的酯类或低于10个碳原子的短链甘油酯。酯酶广泛存在于动物、植物和微生物中。相较于动植物来源的酯酶，微生物来源的酯酶不仅种类多、来源广、作用高效，而且具有便于工业化生产、易纯化及生产成本低等优点，因此，微生物酯酶在生物技术领域应用最多。酯酶催化的反应具有较高的底物专一性、区域选择性和对映选择性，是合成手性药物、农药、化妆品及精细化工品等手性化合物的高效生物催化剂，微生物酯酶在有机化学合成中的应用已成为研究的热点。

在药物生产中，主要应用酯酶从外消旋混合物中合成高纯的单一手性药物，这在提高药效的同时也极大地降低了副作用。通过酯酶合成的醇类、氨基类、羧酸类和酯类等手性分子，已被用于癌症、病毒感染、高脂血症、抑郁症及老年痴呆等疾病的治疗中。相较于化学合成，微生物酶制剂在手性化合物的合成中具有很多先天优势，包括反应条件温和(常温、常压)、设备简单、生产安全、反应速率快、反应步骤少、副反应少、收率高、产品光学纯度高以及环境友好等优点，已成为当前手性药物制备领域的新兴研究热点。

海洋约占地球表面积的7l％，是一个开放、多变、复杂的生态系统。海洋环境中物理、化学因素的特殊性和复杂性，造就了海洋微生物在物种资源、基因功能和生态功能上的多样性。海洋来源的酯酶通常具有与海洋环境相关的优良性质，包括温度稳定性、耐盐性、耐碱性、耐低温、以及优异的手性选择性等，因此，从海洋微生物中筛选出性质独特的具有工业潜力的新型酯酶就成了开发新型工业酶制剂的一个重要方向。

发明内容

本发明针对现有技术的不足，提供一种海洋酯酶及其编码基因E22与应用。

一种海洋酯酶基因E22，核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

上述基因编码的海洋酯酶E22，氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。

一种重组表达载体，该表达载体包含有如SEQ ID NO.1所示核苷酸序列的功能片断。

一种重组细胞，该宿主菌包含有上述重组表达载体或表达上述海洋酯酶E22。

上述海洋酯酶E22和/或上述海洋酯酶基因E22在手性化合物合成中的应用。

本发明海洋酯酶的基因E22来自大西洋位点TVG05和TVG07的混合海底表层沉积物宏基因组文库中大肠杆菌EPI300克隆子E22-3的大片段质粒fosmid DNA。通过构建E22-3克隆子中fosmid的亚克隆文库和后期测序，确定了该克隆子fosmid上携带的酯酶基因E22的核酸序列。根据E22基因序列设计特异性引物，利用PCR技术从E22-3克隆子的fosmid DNA克隆了编码海洋酯酶E22的基因，构建了含海洋酯酶基因E22的表达载体以及含有该表达载体的大肠杆菌重组细胞。

测序结果表明酯酶基因E22为一个含有1,437个核苷酸的开放阅读框架，该开放阅读框架共编码478个氨基酸的前体蛋白。N端测序及MALDITOF MS分析表明，成熟有活性的酯酶E22序列中缺少前体蛋白中N端1-102个氨基酸，因此，成熟有活性的酯酶E22是一个含有376个氨基酸的多肽。对多种手性酯底物的活性分析表明，酯酶E22能选择性降解2,3-O-异亚丙基甘油酸甲酯的对映异构体，其只能降解S构型的底物并生成S构型甘油醛缩丙酮的前体。S构型的甘油醛缩丙酮是一类重要的手性合成中间体和化工原料，已被广泛用于手性药物、化学品和天然产物的全合成中，因此，海洋酯酶E22具有合成重要手性化合物的工业应用潜力。

有益效果

1、本发明所述的海洋酯酶E22能高效选择性地降解手性酯，具有合成重要手性化合物的工业应用潜力。

2、本发明所述的海洋酯酶E22在常温下有较高酶活性，中高温下极不稳定，中温就可以使其完全失活，从而保证了其使用的安全性。

附图说明

图1、通过PCR扩增克隆的编码酯酶E22的基因片段的电泳结果照片；

其中：1、扩增的DNA片段，M、DNA分子量标记(marker)；

图2、在大肠杆菌中进行异源表达和纯化的酯酶E22电泳结果照片；

其中：1、经过镍柱亲和层析纯化后的纯酯酶E22电泳图，M、蛋白质分子量标记(marker)；

图3、酯酶E22的降解底物活性分析柱状图；

图4、酯酶E22的酶活温度曲线图；

其中：(A)温度对酶活性的影响曲线图，(B)温度对酶稳定性的影响曲线图；

图5、酯酶E22的酶活pH曲线图；

其中：(A)pH对酶活性的影响曲线图，(B)pH对酶稳定性的影响曲线图。

具体实施方式

下面结合附图和实施例对本发明做进一步说明，但本发明所保护范围不限于此。

培养基：

LB液体培养基：1wt％蛋白胨，0.5wt％酵母粉，1wt％NaCl，蒸馏水配制。

LB固体平板：1wt％蛋白胨，0.5wt％酵母粉，1wt％NaCl，1.5wt％琼脂，蒸馏水配制。

实施例1：海洋酯酶E22编码基因序列的获取及其序列分析

菌种来源：大西洋位点TVG05和TVG07的混合海底沉积物宏基因组文库中大肠杆菌EPI300克隆子E22-3。

具体步骤如下：

1.1亚克隆文库的构建

用OMEGA公司的BAC/PAC DNA提取试剂盒按照其说明提取大肠杆菌EPI300克隆子E22-3中的大片段质粒fosmid。然后用限制性内切酶Sau3AI(购自Fermentas公司)对提取到的fosmid进行部分消化，以获取2,000-5,000bp的DNA片段，将其连接到经BamHI消化及去磷酸化处理的pUC19质粒(购自NEB公司)上。连接反应液电转E.coli Top10感受态细胞，涂布含有100μg/ml氨苄青霉素和1％(v/v)三丁酸甘油酯(购自Sigma公司)的LB固体平板，37℃倒置培养12～16h，构建成克隆子E22-3的fosmid DNA的亚克隆文库。

1.2酯类水解酶基因序列的确定

选取固体平板上产生透明降解圈的亚克隆，提取质粒并进行测序。用NCBI ORFFinder软件预测DNA序列上可能的开放阅读框架。用BLASTX在NCBI nr库中对预测的开放阅读框架进行相似性搜索，以确定克隆子E22-3上携带的酯酶基因序列E22，基因E22共1,437bp，其中含有一个1,437bp的开放阅读框架，其编码海洋酯酶E22，起始密码子位于1bp，终止密码子位于1,435bp，共编码478个氨基酸的前体蛋白。获得的海洋酯酶E22编码基因E22的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。海洋酯酶E22前体蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。N端测序及MALDITOF MS分析表明，成熟有活性的酯酶E22序列中缺少前体蛋白中N端1-102个氨基酸。因此，成熟有活性的海洋酯酶E22是一个含有376个氨基酸的多肽。

1.3海洋酯酶E22的序列分析

GenBank中，与海洋酯酶E22最相似的序列为来源于Alteromonas macleodii的同丝氨酸乙酰基转移酶(WP_039225606.1)，序列相似性为95％。该蛋白是基于基因序列预测的，其生化性质尚未被研究。在已表征过的同源蛋白中，与海洋酯酶E22最相似的序列为来源于Bacillus Anthracis的同丝氨酸乙酰基转移酶(3I1I)，序列相似性仅为38％。为了确定海洋酯酶E22的进化位置，发明人从NCBI nr库中下载已报道酰基转移酶的代表序列以及酯酶E22的同源序列。通过CLUSTALX软件对获得的同源序列进行多重比对分析。选择JTT模型，用MEGA6.0构建微生物来源酯类水解酶的进化树。在进化树上，海洋酯酶E22及其同源序列与已报道的酰基转移酶序列形成不同的分支，这表明海洋酯酶E22所在的分支可能是酰基转移酶家族的一个新的亚类群，而海洋酯酶E22是该亚类群中第一个被研究的蛋白。

实施例2：海洋酯酶E22的克隆、异源表达及分离纯化

2.1利用PCR基因对E22序列进行扩增

(1)根据基因E22序列设计两条特异性引物：

22F：GGGAATTCCATATGATGAATTGGAACAAGTCG(SEQ ID NO.3)，用下划线标出的是NdeI酶切位点；SEQ ID NO.3

22R：CCGCTCGAGTTGCATTGCTGCCTTATC(SEQ ID NO.4)，用下划线标出的是XhoI酶切位点；SEQ ID NO.4

引物由上海生工生物技术有限公司合成。

(2)以22F和22R为引物，以基因E22所在的fosmid为模板，用FastPfu DNA聚合酶(购自Transgen公司)扩增目的基因片段；

PCR反应条件为：95℃预变性2min；然后95℃变性20sec，50℃退火20sec，72℃延伸1min，30个循环后；72℃延伸10min。

(3)对PCR扩增产物进行1wt％琼脂糖凝胶电泳，结果表明获得一条约1,500bp的DNA片段(如图1)。然后用Omega公司的DNA回收试剂盒按照其说明回收扩增DNA片段。

(4)用限制性内切酶NdeI和XhoI对回收片段和质粒pET22b分别进行双酶切反应。酶切结束后，对酶切产物进行1wt％琼脂糖凝胶电泳，然后用Omega公司的DNA回收试剂盒按照其说明回收扩增DNA片段和载体片段。将经过双酶切的E22基因片段连接到pET22b载体上，16℃过夜连接。

(5)按《分子克隆实验指南》上制备大肠杆菌感受态的方法制备大肠杆菌DH5α感受态。

(6)按《分子克隆实验指南》上的热激转化方法将连接好的重组pET22b载体转至大肠杆菌DH5α感受态。

(7)转化的大肠杆菌DH5α涂布于含100μg/ml氨苄青霉素的LB固体培养基，37℃过夜培养。挑选阳性克隆子，转接至LB液体培养基中培养，提取质粒，进行NdeI/XhoI双酶切，通过酶切验证正确的质粒送北京华大基因公司测序。

上述LB固体培养基组分如下：

1wt％蛋白胨，0.5wt％酵母粉，1wt％NaCl，1.5wt％琼脂，蒸馏水配制。

上述LB液体培养基组分如下：

1wt％蛋白胨，0.5wt％酵母粉，1wt％NaCl，蒸馏水配制。

2.2重组表达载体pET22b-E22转化到大肠杆菌BL21(DE3)中

(1)按《分子克隆实验指南》上制备大肠杆菌感受态的方法制备大肠杆菌BL21感受态；

(2)按《分子克隆实验指南》上的热激转化方法将测序正确的重组载体pET22b-E22转至大肠杆菌BL21感受态；

(3)将转化的大肠杆菌BL21涂于含100μg/ml氨苄青霉素的LB培养基中，37℃过夜培养。

2.3基因E22在大肠杆菌中诱导表达与纯化

(1)在平板上刮取大片菌苔，接于100ml含100μg/ml氨苄青霉素的LB液体培养基中，37℃培养2～3h；

(2)按1％(v/v)接种量转接到1,000ml含100μg/ml氨苄青霉素的LB液体培养基中，37℃培养至OD₆₀₀为0.6，加入IPTG至终浓度为0.5mM，继续在16℃摇床培养42h；

(3)收集经过IPTG诱导表达的LB培养液，9,000rpm离心5min，收集菌体；

(4)用含100mM NaCl的50mM Tris-HCl缓冲液(pH 8.0)悬浮菌体；

(5)将重新悬浮的菌液进行压力破碎；

(6)将破碎后的菌液12,000rpm离心1h，收集上清液；

(7)将上清液按照说明书的要求进行镍柱亲和层析；

(8)层析后收集的样品用SDS-PAGE检测纯度，证明已经获得海洋酯酶E22的电泳纯酶(如图2)。通过分子筛层析除去咪唑，最后置于-20℃保存备用。

实施例3：海洋酯酶E22的性质测定

3.1底物特异性分析

用异丙醇配制不同碳链长度的pNP酯底物，C2-C10(购自Sigma公司)。

标准反应为：

20μl 10mM pNPC4底物与960μl 50mM Tris-HCl(pH 8.0)混合液于60℃预热3min后，加入20μl稀释好的酶液并于60℃反应5min，立即加100μl 20wt％SDS(十二烷基硫酸钠)终止反应，测定OD₄₀₅值。以不加酶液的反应作为空白对照。标准曲线以不同浓度的pNP(购自Sigma公司)来绘制。

酶活力定义为，在一定温度下，每分钟催化pNP酯底物水解产生1μM pNP所需的酶量为一个酶活力单位(U)。结果表明，海洋酯酶E22能高效降解短链的pNP酯底物(C2～C6)，其中对C4底物的降解能力最强，比活力为344U/mg(如图3)。与已报道的同丝氨酸乙酰基转移酶相比，海洋酯酶E22表现出独特的底物特异性，即较强的酯酶活性和较弱的酰基转移酶活性。

3.2最适温度及温度稳定性分析

最适反应温度的测定：以pNPC4为底物，在50mM Tris-HCl(pH 8.0)缓冲液中，分别检测海洋酯酶E22在30℃、40℃、45℃、50℃、55℃、60℃、65℃、70℃和80℃下的酶活。最高酶活定义为100％。

结果表明该酶的最适酶活温度为60℃，其在40～65℃保留超过65％的高活力(如图4A)。

温度稳定性分析：酶液分别在40℃、45℃和50℃下温育，取相同的酶量温育不同的时间检测海洋酯酶E22在60℃、50mM Tris-HCl(pH 8.0)缓冲液中的残余活力。0℃酶活定义为100％。

结果表明，低于45℃条件下，海洋酯酶E22能稳定存在。E22在50℃条件下变得很不稳定，在50℃温育15min后，仅保留40％的酶活力(如图4B)。

3.3最适pH及pH稳定性分析

pNPC4底物在碱性条件下不稳定，酶反应完成后向反应体系中加入等体积的含2wt％SDS的2M Tris-HCl(pH 7.0)终止液以去除pH对反应的影响。

最适反应pH的测定：配制pH值在4.0～11.0范围内、间隔1个pH单位的Britton-Robinson缓冲液。测定海洋酯酶E22在60℃、不同pH条件下的酶活，最高酶活定义为100％。

结果表明海洋酯酶E22是碱性酯酶，其最适pH为9.0(如图5A)。

pH稳定性分析：取1μl纯酶，用50mM Tris-HCl(pH 8.0)稀释20倍后，取稀释后的酶液1μl，加入不同pH梯度的缓冲液199μl以配制不同pH的E22，40℃温育1h后检测E22的残余活力。最高酶活定义为100％。

结果表明E22在pH 5.0～10.0范围内表现出较强的稳定性(如图5B)。

3.4对手性酯底物的活性分析

用乙腈配制多种手性酯底物(购自Sigma公司)。标准反应为：

向200μl含0.455mM Phenol red的5mM EPPS缓冲液(pH 8.0)中加入15μl 143mM手性酯，再加入10μl 0.5mg/ml纯酶，40℃反应3h，检测OD₅₅₀。以不加酶液的反应作为对照。用对照和反应后OD₅₅₀的差值来反应酶活力的高低，差值越大，则酶活力越高。

结果表明，海洋酯酶E22能选择性降解乳酸甲酯、3-羟基丁酸甲酯及2,3-O-异亚丙基甘油酸甲酯的对映体，如表1所示：

表1

由上表可知，海洋酯酶E22具有合成重要手性化合物的工业应用潜力。

4.结果

通过构建亚克隆文库和后期测序，确定了大肠杆菌克隆子E22-3中fosmid上所携带的酯酶基因E22的核酸序列。根据E22基因序列设计特异性引物，利用PCR技术从E22-3克隆子的fosmid DNA克隆了编码海洋酯酶E22的基因片段(图1)，构建了含海洋酯酶基因E22的表达载体以及含有该表达载体的大肠杆菌重组细胞。

基因E22含有一个1,437的开放阅读框架，其编码新型海洋酯酶E22，起始密码子位于1bp，终止密码子位于1,435bp，共编码478个氨基酸的前体蛋白。将基因E22在大肠杆菌中进行异源表达和纯化，获得成熟有活性的酯酶E22(图2)。

N端测序及MALDITOF MS分析表明，成熟有活性的酯酶E22序列中缺少前体蛋白中N端1～102个氨基酸，因此，成熟有活性的酯酶E22是一个含有376个氨基酸的多肽。对纯化的酯酶E22进行性质测定。结果表明该酶对碳链长度在2～6个碳原子的短链酯类表现出较强的降解活性(图3)。其在40～65℃范围内保持很高的酶活力，且能在不高于45℃条件下稳定存在(图4)。最适pH为9.0，且在pH 5.0～10.0范围内稳定存在(图5)。对多种手性酯底物的活性分析表明，海洋酯酶E22对一些工业上的重要手性化合物前体表现出优异的手性选择性(表1)，这表明海洋酯酶E22具有合成重要手性化合物的工业应用潜力。

Claims

1.一种海洋酯酶基因E22，核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

2.权利要求1所述海洋酯酶基因E22编码的海洋酯酶E22，氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。

3.权利要求1所述海洋酯酶基因E22和/或权利要求2所述海洋酯酶E22在选择性降解S构型乳酸甲酯、R构型3-羟基丁酸甲酯和S构型2,3-O-异亚丙基甘油酸甲酯中的应用。

4.一种重组表达载体，该表达载体包含有如SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列。

5.一种重组细胞，该重组细胞表达权利要求2所述海洋酯酶E22或该重组细胞包含有权利要求4所述重组表达载体。