CN105296369A - 一株具有陈酿风格的酿酒酵母及其在葡萄酒酿造中的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及微生物技术领域，具体涉及一种具有陈酿风格的酿酒酵母及其在葡萄酒酿造中的应用。为了逐渐改变我国葡萄酿酒酵母长期依赖进口的被动局面，解决国产葡萄酒质量的同质化问题，提供一种具有陈酿风格的酿酒酵母及其在葡萄酒酿造中的应用。酿酒酵母NX11424，保藏于“中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心”，保藏编号为CGMCC？NO.10050，其具有优秀的颜色和香气浸提能力，能充分挖掘和展现葡萄品种本真的典型特征，能赋予葡萄酒更为完美的骨架感和结构感，在酒精发酵后即让葡萄新酒呈现出独特的烘焙、烧烤及咖啡等陈酿特征，此外，酿酒酵母NX11424所酿造的干红葡萄酒非常适合橡木桶陈酿，并表现出较明显的陈酿潜力，是一株非常优秀的具有陈酿风格的干红葡萄酒酿酒酵母。
Description
一、技术领域：
本发明涉及微生物技术领域，具体涉及一种具有陈酿风格的酿酒酵母及其在葡萄酒酿造中的应用。
二、背景技术：
葡萄酒是世界上仅次于啤酒的第二大酒精饮料，在世界区域经济和国际贸易中占有重要比重。近年来，我国葡萄酒产业以每年15-20％的速度递增，但其质量与国际先进水平还存在着较大差距。在影响葡萄酒质量的诸多因素中，除了生态条件、葡萄品种、以及工艺设备外，发酵微生物对葡萄酒的质量和感官风格起着决定性作用。
葡萄酒酿造实质上就是在微生物作用下所进行的生物发酵过程，酵母菌是葡萄酒酿造中起最主要作用的微生物。然而，目前我国葡萄酒厂发酵所用的酵母几乎全部进口国外选育的葡萄酒商业酵母，再加上各地酿酒的葡萄品种大多集中于少数几个广适性品种，如赤霞珠、品丽珠、霞多丽、雷司令等，其栽培管理和酿酒工艺、酿酒设备均十分相似，酒种单一，造成我国葡萄酒质量同质化现象日趋严重！这种情形若不尽快改变，就有可能对我国蓬勃发展的葡萄酒产业造成无可挽回的不良影响，使我国葡萄酒产业彻底丧失国际竞争力！
一般而言，工业生产区比传统生产区的酵母多样性明显减少(Ganga&Martines,2004)；商业酵母与本地自然发酵酵母进行竞争，而且很多商业酵母带有嗜杀活性(Rogeretal,2001)，连续和长期使用单一商业酵母菌株发酵，会降低酵母的多样性和本土酵母作用的重要性(Gangaetal,2004；Blancoetal,2008)，使接种酵母取代本土酵母成为酒厂表面及环境的优势菌种而完成自然发酵，从而影响酒厂通过自然发酵选育酵母菌的有效性(Cianietal,2004；Mercadoetal,2007)。使用进口商业酵母，会导致决定特定生态条件下葡萄酒香气特征的物质丧失(Mendesetal,2001；Romanoetal,2003)，使葡萄酒缺乏典型性和风格(DiMaroetal,2007)。国外也发现，从本土酵母中选出的优良菌系的发酵性能明显优于从国外引进的商业酵母(Lopesetal,2007Lopandic)。用进口商业酵母进行接种发酵，使我国葡萄酒工业每年需花费外汇高达500万美金，而且随着葡萄酒产量的增加还会进一步加大。换句话说，中国葡萄酒行业的发展，由于缺乏自主知识产权的酿酒酵母，一直都在为国外支付巨额学费！因此，发掘中国产区特色葡萄酿酒酵母菌资源，为我国葡萄酒自然发酵及酵母选育种提供物种资源储备，逐渐改变我国葡萄酿酒酵母长期依赖进口的被动局面，为改变国产葡萄酒质量的同质化，提高我国葡萄酒国际竞争力奠定基础。
三、发明内容
本发明的目的为了逐渐改变我国葡萄酿酒酵母长期依赖进口的被动局面，解决国产葡萄酒质量的同质化问题，提供一种具有陈酿风格的酿酒酵母及其在葡萄酒酿造中的应用。
为实现上述目的，本发明采用的技术方案为：一株酿酒酵母NX11424，保藏于“中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心”，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏日期：2014年11月25日，保藏编号为CGMCCNO.10050，分类命名：酿酒酵母Saccharomycescerevisiae。
所述的酿酒酵母NX11424，其特征在于：从宁夏广夏三基地葡萄园的赤霞珠葡萄自然发酵后期，经筛选、分离而为的纯培养物。
所述的酿酒酵母NX11424在红葡萄酒酿造中的应用。
与现有技术相比，本发明具有如下优点和效果：
本发明的酿酒酵母NX11424(保藏于“中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心”，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏日期：2014年11月25日，保藏编号为CGMCCNO.10050，分类命名：酿酒酵母Saccharomycescerevisiae)具有优秀的颜色和香气浸提能力，能充分挖掘和展现葡萄品种本真的典型特征，能赋予葡萄酒更为完美的骨架感和结构感，在酒精发酵后即让葡萄新酒呈现出独特的烘焙、烧烤及咖啡等陈酿特征。此外，酿酒酵母NX11424所酿造的干红葡萄酒非常适合橡木桶陈酿，并表现出较明显的陈酿潜力，是一株非常优秀的具有陈酿风格的干红葡萄酒酿酒酵母。
四、附图说明：
图1为酿酒酵母NX11424在YPD培养基上的菌落特征；
图2干红发酵工艺流程简图；
五、具体实施方式
下述实施例中的模拟葡萄汁培养基配方如下：
表1模拟葡萄汁及其配制
下述实施例中YEPD培养基配方如下：
蛋白胨2.0％，酵母浸粉1.0％，葡萄糖2.0％(自然pH值，121℃灭菌20min，可加入100mg/L氯霉素以抑制细菌生长，固体培养基添加琼脂2.0％)。
下述实施例中WLN培养基配方如下：
蛋白胨0.5％，酵母浸粉0.4％，葡萄糖5.0％，琼脂2.0％；储液A:40mL/L，储液B:1mL/L，储液C:1mL/L，调pH值至6.2。无机盐类储液配置：储液A(磷酸二氢钾0.0550％，氯化钾0.0425％，氯化钙0.0125％，硫酸镁0.0125％，高压灭菌后4℃保存)；储液B(氯化铁0.0025％，硫酸锰0.00025％，高压灭菌后4℃保存)；储液C(溴甲酚绿22mg/L，溶于50％酒精，配制溶液所用器皿和双蒸水都需经121℃高压灭菌)。配制培养基时在无菌操作台内，按比例加入储液A和储液B及其他培养基组分，加双蒸水至目标体积，调节pH至6.2。121℃灭菌20min后冷却至65℃加入储液C，混合均匀，制备平板(每板15mL～20mL)。
下述实施例的对照菌株均为法国LAFFORT公司生产的商业活性干酵母ZymafloraF15(以下均简写作F15)
实施例1、酿酒酵母NX11424(保藏于“中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心”，保藏编号为CGMCCNO.10050)的分离、纯化及其鉴定
采摘宁夏广夏三基地葡萄园赤霞珠葡萄，在自然发酵过程中取发酵液，在1mL发酵液样品中加入9mL无菌水进行梯度稀释，涂布WLN固体培养基平板，在温度为28℃下培养5d，根据酿酒酵母在WLN培养基上的菌落特征(参照图1)：选择表面光滑奶油色，中央锥形突起，四周有暗黄色或浅绿色环，不透明，奶油状的单菌落，挑取酿酒酵母单菌落进一步在WLN培养基上划线纯化，然后在纯化后WLN培养基上挑取酿酒酵母单菌落转接入YEPD液体培养基中，在温度为28℃下培养2d后，将酿酒酵母菌株采用甘油冷冻法保藏备用。同时，用接种环将YEPD培养液在YEPD固体培养基上划线，28℃下培养3d后，提取酵母菌落DNA，对rRNA基因的26SD1/D2区进行聚合酶链式反应(PCR)扩增，对PCR扩增产物(即rRNA基因的26SD1/D2区)进行测序，测序结果与NCBI上的Nucleotidecollection(nr/nt)数据库进行序列比对，鉴定为酿酒酵母菌株，得到酿酒酵母菌株。将保藏备用的酿酒酵母菌株进行活化后接入模拟葡萄汁中，筛选出能够快速、彻底完成发酵的酿酒酵母。将经过模拟葡萄汁筛选后的酿酒酵母，再经过2L葡萄汁发酵小试，并通过感官品评，最终筛选出酿酒酵母NX11424。
经过反复筛选、验证和葡萄酒酿造小试、中试研究，从宁夏广夏三基地葡萄园的赤霞珠葡萄自然发酵后期分离得到的酿酒酵母NX11424，具有可靠的酿酒品质，包括快速启酵，发酵过程平稳彻底，挥发酸低，低产泡，高絮凝，低产硫化氢，并具有良好自溶能力，具有较强的高糖完整发酵能力，发酵酒度可超过16％。
酿酒酵母NX11424(保藏于“中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心”，保藏编号为CGMCCNO.10050)的26SrRNA鉴定结果如下：
26SD1-D2区序列(580bp)：
CCCACAACGGGGATTGCTTAGTACGGCGAGTGAAGCGGCAAAAGCTCAAATTTGAAATCTGGTACCTTCGGTGCCCGAGTTGTAATTTGGAGAGGGCAACTTTGGGGCCGTTCCTTGTCTATGTTCCTTGGAACAGGACGTCATAGAGGGTGAGAATCCCGTGTGGCGAGGAGTGCGGTTCTTTGTAAAGTGCCTTCGAAGAGTCGAGTTGTTTGGGAATGCAGCTCTAAGTGGGTGGTAAATTCCATCTAAAGCTAAATATTGGCGAGAGACCGATAGCGAACAAGTACAGTGATGGAAAGATGAAAAGAACTTTGAAAAGAGAGTGAAAAAGTACGTGAAATTGTTGAAAGGGAAGGGCATTTGATCAGACATGGTGTTTTGTGCCCTCTGCTCCTTGTGGGTAGGGGAATCTCGCATTTCACTGGGCCAGCATCAGTTTTGGTGGCAGGATAAATCCATAGGAATGTAGCTTGCCTCGGTAAGTATTATAGCCTGTGGGAATACTGCCAGCTGGGACTGAGGACTGCGACGTAAGTCAAGGATGCTGGCATAATGGTTATATGCCGCCCGTCTGAAA
与相关模式菌株酿酒酵母NL64相似性：99.6％，鉴定为酿酒酵母Saccharomycescerevisiae。
酿酒酵母NX11424(保藏于“中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心”，保藏编号为CGMCCNO.10050)的5.8S-ITS鉴定结果如下：
5.8S-ITS部分序列(816bp)：
CAAAAAACATCAATATTTTGAAATGGATTTTTTTGTTTTGGCAAGAGCATGAGAGCTTTTACTGGGCAAGAAGACAAGAGATGGAGAGTCCAGCCGGGCCTGCGCTTAAGTGCGCGGTCTTGCTAGGCTTGTAAGTTTCTTTCTTGCTATTCCAAACGGTGAGAGATTTCTGTGCTTTTGTTATAGGACAATTAAAACCGTTTCAATACAACACACTGTGGAGTTTTCATATCTTTGCAACTTTTTCTTTGGGCATTCGAGCAATCGGGGCCCAGAGGTAACAAACACAAACAATTTTATCTATTCATTAAATTTTTGTCAAAAACAAGAATTTTCGTAACTGGAAATTTTAAAATATTAAAAACTTTCAACAACGGATCTCTTGGTTCTCGCATCGATGAAGAACGCAGCGAAATGCGATACGTAATGTGAATTGCAGAATTCCGTGAATCATCGAATCTTTGAACGCACATTGCGCCCCTTGGTATTCCAGGGGGCATGCCTGTTTGAGCGTCATTTCCTTCTCAAACATTCTGTTTGGTAGTGAGTGATACTCTTTGGAGTTAACTTGAAATTGCTGGCCTTTTCATTGGATGTTTTTTTTCCAAAGAGAGGTTTCTCTGCGTGCTTGAGGTATAATGCAAGTACGGTCGTTTTAGGTTTTACCAACTGCGGCTAATCTTTTTTTATACTGAGCGTATTGGAACGTTATCGATAAGAAGAGAGCGTCTAGGCGAACAATGTTCTTAAAGTTTGACCTCAAATCAGGTAGGAGTACCCGCTGAACTTAAGCATATCAATAAAGCGGGAGGAAGG
与相关模式菌株酿酒酵母MUCL51208相似性：99.5％，鉴定为酿酒酵母Saccharomycescerevisiae。
实施例2、酿酒酵母NX11424和商业酵母F15中试酿酒比较实验
下述实施例的工艺流程见图2。
将采自宁夏御马的新鲜赤霞珠葡萄除梗破碎，添加50mg/L二氧化硫，30min后添加20mg/L果胶酶，混匀后，测定葡萄汁的总酸，总糖量。采用新鲜的葡萄汁进行菌株活化，将试验菌株以3％接种量接入到适量葡萄汁中，28℃恒温培养箱中培养24h后，将活化好的试验菌株以106cfu/mL的接种量加入到发酵罐中，菌株设2个平行。将发酵温度控制在22-25℃，发酵3d后，再次将温度调整到28-30℃进行发酵每日分早、中、晚三次对发酵罐进行压帽，并在压帽后取样监控发酵液的品温和比重，比重到0.990-0.996时，进行皮渣分离，并测还原糖，当还原糖含量小于2g/L时，添加60mg/L二氧化硫结束发酵(参照图2).酒精发酵结束后按GB/T15038-2006检测酒度、总糖、总酸、挥发酸及干浸出物。结果见表2。
表2测试菌株酒精发酵后葡萄酒样的理化指标*
注：*理化指标的检测均按照GB/T15038-2006操作
通过发酵试验发现NX11424的酿酒特性稳定，酒样的酒度≥11％(v/v)，总糖(不高于9g/L)与总酸(酒石酸计)的差值≤2，挥发酸≤1.2g/L，符合GB15037-2006对干型葡萄酒相关指标的要求。
2.12013年测试菌株中试所酿酒样品尝分析结果
下述由F15发酵所酿的葡萄酒用F15#表示，由酿酒酵母NX11424发酵所酿的葡萄酒用NX11424#表示。
经过严格专业训练的西北农林科技大学葡萄酒学院TastingPanel的21名成员，对2013年测试菌株所酿酒样进行了品评打分(表3)。
表3测试菌株所酿酒样TastingPanel的品尝结果
注：字母标记表示显著差异，显著水平为5％。
两款酒在打分上差异显著。两款酒在香气优雅度、浓郁度和协调性、质量上差异不显著，在酸度、酒体、浓郁度和状态上差异不显著，而在圆润度、单宁强度、质感、平衡性、层次性回味上有显著差异。
两款酒的感官特征见表4。
表4测试菌株所酿干红葡萄酒的感官特征
在口感方面，NX11424#要优于F15#，两款酒的酒体厚重，单宁结构强，延展性好。在香气方面，F15#有浓郁的青椒味，NX11424#主要有烟熏、黑醋栗和黑莓的味道。整体来说，NX11424#单宁强度、单宁质感、平衡性、协调性、延展度、层次感等方面显著优于F15#。
经过理化指标分析和对测试菌株中试酒样的感官评定，可以得出，酿酒酵母NX11424所发酵的葡萄酒不经过后期的橡木桶陈酿即具有烟熏等陈酿特征，是一株可用于优质干红葡萄酒酿造的菌株，具有极强的应用潜力。
2.22013年测试菌株中试所酿酒样橡木桶陈酿4个月后品尝分析
(1)品尝打分(表5)
表52013年测试菌株中试所酿酒样橡木桶陈酿4个月后品尝得分
将由优选酿酒酵母NX11424和对照酿酒酵母F15酿造的赤霞珠干红葡萄酒，分别用戴普斯橡木桶、Vicard橡木桶和圣哥安橡木桶陈酿4个月。品尝专家组分别对上述6个酒样进行品评，得分见表5。结果显示，由优选菌株NX11424所酿造的赤霞珠干红葡萄酒，在三种橡木桶中陈酿4个月后，品评得分均显著优于对照F15，其中，在圣哥安橡木桶中陈酿的酒样表现最为出色。
(2)风味分析
F15#的香气浓郁度、香气协调性较高，酒度较高，但在香气的优雅度等方面略有欠缺。NX11424#圆润度高，较强的单宁强度，单宁质感较好。综合来看，经过4个月的橡木桶陈酿，酿酒酵母NX11424发酵出的赤霞珠干红葡萄酒整体风味要好于F15，尤其是在酒体的圆润度、单宁强度等方面都要明显优于F15的酒样，具有较强的陈年潜力。
(3)品尝评语
表62013年测试菌株中试所酿酒样橡木桶陈酿4个月后酒评
2.32013年测试菌株中试所酿酒样橡木桶陈酿10个月后品尝分析
2013年御马陈酿10个月的酒样的品尝打分记录见表7。
表72013年测试菌株中试所酿酒样橡木桶陈酿10个月后品尝得分
2013测试菌株中试所酿酒样橡木桶陈酿10个月后品尝记录见表8。
表82013年测试菌株中试所酿酒样橡木桶陈酿10个月后酒评
由表7-8可以看出，经过10个月的橡木桶陈酿，由酿酒酵母F15酿造的赤霞珠干红葡萄酒，呈现中等丁香、烟熏、香草的香气，伴随有黑醋栗，黑莓等黑色浆果的果香。干型，高酸，很高的铺满口腔的单宁，重酒体。由本土酿酒酵母NX11424酿造的赤霞珠干红葡萄酒，呈现浓郁的香草、烟熏、黑巧克力的香气，伴随有黑醋栗的果香，很高的铺满口腔的有收敛感的单宁，重酒体，很好的陈年潜力。两款酒的风味各不相同，从感官评价的打分分析来看，NX11424#的得分要高于F15#，NX11424#在圣哥安橡木桶中陈酿的表现最好。
综上所述，优选菌株NX11424在酿造干红葡萄酒过程中，表现出良好的酿酒特性，所酿葡萄酒不经过后期的橡木桶陈酿即具有烟熏等陈酿特征，具有优良的陈酿潜力。经过4个月和10个月的橡木桶陈酿，所获得葡萄酒呈现出感官品质浓郁的香草、烟熏、黑巧克力的香气伴随着黑醋栗的果香，很高的铺满口腔的有收敛感的单宁，重酒体，具有很好的陈年潜力。因此，酿酒酵母NX11424是一株可用于生产优质干红葡萄酒的本土酿酒酵母菌株，具有极强的应用潜力。
SEQUENCELISTING
<110>西北农林科技大学
<120>一株具有陈酿风格的酿酒酵母及其在葡萄酒酿造中的应用
<130>2015
<160>2
<170>PatentInversion3.3
<210>1
<211>580
<212>DNA
<213>酿酒酵母NX11424
<400>1
CCCACAACGGGGATTGCTTAGTACGGCGAGTGAAGCGGCAAAAGCTCAAATTTGAAATCT60
GGTACCTTCGGTGCCCGAGTTGTAATTTGGAGAGGGCAACTTTGGGGCCGTTCCTTGTCT120
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CATTTGATCAGACATGGTGTTTTGTGCCCTCTGCTCCTTGTGGGTAGGGGAATCTCGCAT420
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<213>酿酒酵母NX11424
<400>2
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GCTGAACTTAAGCATATCAATAAAGCGGGAGGAAGG816
Claims (3)
1.一株酿酒酵母NX11424，保藏于“中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心”，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏日期：2014年11月25日，保藏编号为CGMCCNO.10050，分类命名：酿酒酵母Saccharomycescerevisiae。
2.如权利要求1所述的酿酒酵母NX11424，其特征在于：从宁夏广夏三基地葡萄园的赤霞珠葡萄自然发酵后期，经筛选、分离而为的纯培养物。
3.如1所述的酿酒酵母NX11424在红葡萄酒酿造中的应用。
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