CN105283467B - 抗tnf-抗il-17双特异性抗体 - Google Patents

Abstract

提供了特异性结合肿瘤坏死因子α（TNFα）和白细胞介素‑17（IL‑17）两者的双特异性抗体。本发明的双特异性抗体可用于治疗多种自身免疫疾病，包括类风湿性关节炎（RA）、牛皮癣关节炎（PsA）和强直性脊柱炎（AS）。

Description

抗TNF-抗IL-17双特异性抗体

本发明处于医学领域，特别是针对肿瘤坏死因子α（TNFα）和白细胞介素-17（IL-17A）的双特异性抗体新领域。本发明的双特异性抗体预期可用于治疗类风湿性关节炎（RA）、牛皮癣关节炎（PsA）和强直性脊柱炎（AS）。

RA是全身性、慢性、炎性疾病。炎症主要由许多细胞因子包括TNFα和IL-17驱动。目前FDA批准的生物制品（例如与TNFα结合且中和TNFα的HUMIRA®已证实在患者子集中降低RA的体征与症状以及减慢RA进展中的功效。IL-17抗体也在用于多种自身免疫疾病（例如类风湿性关节炎）的临床试验中进行研究（secukinumab、ixekizumab和brodalumab）。然而，因为炎症由许多细胞因子驱动，所以在单一抗体中靶向两种细胞因子将是有利的。因此同时靶向TNFα和IL-17两者将是有利的，以减轻RA患者中的炎症且使免疫应答降到最低。

目前，TNFα抗体和IL-17抗体的共施用需要两种分开产品的注射或两种不同抗体的共同制剂的单一注射。两次注射允许剂量量和时机的灵活性，但出于顺应和疼痛两者对于患者是不方便的。共同制剂还可以提供剂量量的一些灵活性，但由于两种不同抗体的不同分子特征，发现允许两种抗体的化学和物理稳定性的配制条件是相当挑战性或不可能的。此外，共施用或共同制剂涉及两种不同药物疗法的累积成本，这可以增加患者和/或支付者成本，而单一双特异性抗体允许价格对于递送的利益最佳化。

WO2010/102251公开了结合TNFα和IL-17的双重可变结构域免疫球蛋白（“DVD-Ig”）。DVD-Ig是多特异性免疫球蛋白，其具有含相同特异性和相同CDR序列的两条相同的抗原结合臂，并且对于它与之结合的每种抗原是二价的。每个抗原结合臂具有串联连接的两条不同的可变结构域，而在可变结构域之间不含插入恒定区，并且每个可变结构域对于不同抗原具有特异性。WO1995/09917公开了通过产生与具有不同特异性的完整抗体融合的单链抗体，使用重组DNA技术用于产生双特异性、四价抗体的方法。这种基因融合物通过转染进行表达，导致具有双重特异性的四价抗体。美国专利号6,090,382公开了与hTNFα结合且中和hTNFα的人抗体。WO2007/070750公开了结合且中和人IL-17的抗IL-17抗体。

尽管上文公开内容，但当构建本发明的双特异性抗体时，遇到与化学和物理稳定性相关的显著问题。在起始双特异性抗体以充分克服无数问题中需要许多变化，包括稳定单链片段可变区的VH/VL界面，增加热稳定性，减少聚集，且重新平衡双特异性抗体的结合表面中的静电分布，全部同时维持对于两种抗原的结合亲和力。

因此，仍存在中和人TNFα和人IL-17两者的单一双特异性抗体的需要。期望提供双特异性抗体，其是热稳定的，物理稳定的，显示出低聚集，且中和人TNFα和人IL-17。还期望提供包括单一双特异性抗体的药物组合物，所述单一双特异性抗体中和人TNFα和人IL-17两者，从而避免发现配制条件的挑战，所述配制条件必须满足两种不同的分开抗体的不同分子特征。本发明因此寻求解决上述问题中的一个或多个。

本发明提供了包含第一多肽和第二多肽的双特异性抗体，其中所述第一多肽具有SEQ ID NO: 1的氨基酸序列，并且所述第二多肽具有SEQ ID NO: 2的氨基酸序列。

本发明提供了包含两条第一多肽和两条第二多肽的双特异性抗体，其中所述第一多肽具有SEQ ID NO: 1的氨基酸序列，并且所述第二多肽具有SEQ ID NO: 2的氨基酸序列。

本发明还提供了包含编码第一多肽的多核苷酸序列的DNA分子。

本发明进一步提供了包含编码第二多肽的多核苷酸序列的DNA分子。

本发明提供了包含编码第一多肽和第二多肽的多核苷酸序列的DNA分子。

本发明还提供了由一种或多种DNA分子转化的哺乳动物细胞，其中所述细胞能够表达包含第一多肽和第二多肽的双特异性抗体。

本发明提供了用于产生包含两条第一多肽和两条第二多肽的双特异性抗体的方法，该方法包括在条件下培养哺乳动物细胞，从而使得双特异性抗体被表达。

本发明进一步提供了通过所述方法产生的双特异性抗体。

本发明还提供了治疗类风湿性关节炎、牛皮癣关节炎或强直性脊柱炎的方法，其包括给有此需要的患者施用治疗有效量的根据本公开内容的双特异性抗体。

本发明提供了用于疗法中的根据本公开内容的双特异性抗体。

本发明进一步提供了根据本公开内容的双特异性抗体用于制造药剂的用途，所述药剂用于治疗类风湿性关节炎、牛皮癣关节炎或强直性脊柱炎。

本发明进一步提供了根据本公开内容的双特异性抗体，用于治疗类风湿性关节炎、牛皮癣关节炎或强直性脊柱炎。

本发明还提供了药物组合物，其包含本发明的双特异性抗体和一种或多种药学可接受的载体、稀释剂或赋形剂。

如本文使用的，术语“人IL-17”应理解为涵盖包含两条15 kD人IL-17A蛋白质的同二聚蛋白质（也称为“人IL-17A”），以及包含15 kD人IL-17A蛋白质和15 kD人IL-17F蛋白质的异二聚蛋白质（也称为“人IL-17A/F”）。

如本文使用的，术语“双特异性抗体”应理解为包含如本文描述的两条第一多肽和两条第二多肽。双特异性抗体结合两种不同抗原，对于每种抗原具有特异性。双特异性抗体能够单独结合每种抗原或同时结合每种抗原。进一步理解该术语涵盖对双特异性抗体的任何细胞翻译后修饰，包括但不限于糖基化概况。

本发明的双特异性抗体包含两条第一多肽和两条第二多肽。第一多肽之一与第二多肽之一形成链间二硫键。两条第一多肽各自彼此形成两条链间二硫键，并且第一多肽各自形成至少一个链内二硫键。多肽和二硫键的关系显示于下述简图中，仅用于举例说明性目的：

第一多肽的氨基酸序列是：

。

含有SEQ ID NO: 3的DNA序列的表达载体编码具有SEQ ID NO: 1的氨基酸序列的第一多肽。

第二多肽的氨基酸序列是：

。

含有SEQ ID NO: 4的DNA序列的表达载体编码具有SEQ ID NO: 2的氨基酸序列的第二多肽。

第一多肽之一和第二多肽之一的链间二硫键在SEQ ID NO: 1的半胱氨酸残基135和SEQ ID NO: 2的半胱氨酸残基214之间形成。一条第一多肽与另一条第一多肽形成两个链间二硫键。第一链间二硫键在SEQ ID NO: 1的第一多肽的半胱氨酸残基227和SEQ IDNO: 1的另一条多肽的半胱氨酸残基227之间形成。第二链间二硫键在SEQ ID NO: 1的第一多肽的半胱氨酸残基230和SEQ ID NO: 1的另一条多肽的半胱氨酸残基230之间形成。

至少一个链内二硫键在第一多肽各自中的SEQ ID NO: 1的半胱氨酸残基505和半胱氨酸残基705之间形成。

第一多肽包含第一重链可变区（HCVR1）、重链恒定区（CH）、第二重链可变区（HCVR2）和第二轻链可变区（LCVR2）。第二多肽包含第一轻链可变区（LCVR1）和轻链恒定区（CL）。HCVR和LCVR区可以进一步再分成称为互补决定区（CDR）的高变异性区域，由构架区（FR）间隔。每个HCVR和LCVR区由三个CDR和四个FR组成，从氨基末端到羧基末端以下述次序排列：FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、FR4。

HCVR1的3个CDR在本文中被称为CDRH1-1、CDRH1-2和CDRH1-3。HCVR2的3个CDR被称为CDRH2-1、CDRH2-2和CDRH2-3。同样地，LCVR1的3个CDR被称为CDRL1-1、CDRL1-2和CDRL1-3，并且LCVR2的3个CDR被称为CDRL2-1、CDRL2-2和CDRL2-3。

CH通过氨基酸接头（L1）融合至HCVR2。HCVR2通过氨基酸接头（L2）融合至LCVR2。

本发明还涵盖双抗体。双抗体是双特异性抗体，其中HCVR2和LCVR2区在单条多肽链上表达，但代替可变结构域与相同链的互补结构域配对，可变结构域与另一条链的互补结构域配对。例如，如果双特异性抗体包含两条第一多肽（为了方便起见，1A和1B）和两条第二多肽（为了方便起见，2A和2B）。1A多肽的HCVR2与1B多肽的LCVR2的互补结构域配对，而不是与1A多肽的LCVR2配对，并且反之亦然。如本文描述的双特异性双抗体维持对于人TNFα和人IL-17两者的结合亲和力和中和能力。

可替代地，从上文描述的双特异性抗体中纯化掉双抗体可以是有利的。在细胞表达后，双抗体含量可以高达17%，并且在纯化后，可以降低至小于1%。

多个区域和接头的关系如下，从氨基末端到羧基末端排列，根据Kabat编号约定：

双特异性抗体改造

当构建本发明的双特异性抗体时，遇到与化学和物理稳定性相关的显著问题。例如，亲本IL-17抗体显示出在高浓度下的物理稳定性局限性（例如相分离）。另外，由亲本IL-17抗体构建的双特异性抗体显示出浓度依赖性自聚集。因此在双特异性抗体的CDRL2-1和CDRH2-2部分中制备化学修饰，以改善化学和物理稳定性，且降低浓度依赖性聚集。与LC/MS组合的广泛蛋白质稳定性和可溶性研究鉴定CDRL2-1和CDRH2-2中的化学不稳定残基。使用通过密码子耗尽（codon depletion）构建的靶向文库，将这些易变残基替换为电荷中性的氨基酸。替换这些易变残基导致改善的化学稳定性。另外，计算双特异性抗体的静电表面且鉴定荷电贴片。破坏这些荷电贴片导致蛋白质自结合中的减少。因此，在双特异性抗体的CDRH2-1和CDRL2-1部分中鉴定了突变，其重新平衡表面静电分布，改善热稳定性，降低聚集，且改善化学稳定性（消除特异性脱酰胺和氧化位点）。上述修饰无一在亲本单一抗体的初始表征中得到鉴定。这些变化仅在构建双特异性抗体的背景下遇到，提示在单一抗体的突变区域周围的局部环境在双特异性抗体的背景下不同。

制备进一步的化学修饰，以降低双特异性抗体聚集。特别地，制备化学修饰以稳定双特异性抗体的IL-17部分中的VH/VL界面。为测定双特异性抗体聚集背后的驱动力而进行的研究显示：所观察到的蛋白质自结合不由个别VH或VL结构域的构象不稳定性驱动，而是由VH-VL界面的开放或“呼吸（breathing）”驱动，导致分子间蛋白质相互作用。因此，将多个链内二硫键引入双特异性抗体的IL-17部分的VH-VL界面内。一个此类链内二硫键在第一多肽各自中出现在SEQ ID NO: 1的半胱氨酸残基505和SEQ ID NO: 1的半胱氨酸残基705之间。该二硫键共价连接双特异性抗体的IL-17部分中的VH和VL界面，这稳定VH-VL界面，且降低分子间蛋白质相互作用，其可以导致物理不稳定性和不利的配制局限性。在测试的九个不同二硫键中，其中8个表达功能蛋白质，亲和力丧失量级范围为约2至约35倍。在SEQ IDNO: 1的半胱氨酸残基505和SEQ ID NO: 1的半胱氨酸残基705之间，在第一多肽各自中的链内二硫键最佳稳定VH/VL界面，同时维持对于IL-17的最佳结合亲和力。

另外，研究指示L1的接头长度影响双特异性抗体的功能活性，特别是结合动力学。动力学分析（通过表面等离子体共振）显示：与15氨基酸和20氨基酸接头相比较，10氨基酸接头引起慢2倍的K_on速率。因此，将最低限度接头长度15引入本发明的双特异性抗体内。

本发明的双特异性抗体还进行改造，以降低或消除经由与Fcγ受体的相互作用的免疫系统活化。免疫活化不是本发明的双特异性抗体的预期作用机制的一部分。为此，将本发明的双特异性抗体构建为IgG4同种型，其已知与Fcγ受体或补体系统的组分具有低结合能力。另外，在下铰链区中制备两个丙氨酸突变，以进一步降低这种结合潜力。

双特异性抗体结合

本发明的双特异性抗体结合人TNFα和人IL-17两者。本发明的双特异性抗体在体外或体内中和至少一种人TNFα生物活性和至少一种人IL-17生物活性。本发明的双特异性抗体是IL-17的体外有力抑制剂，并且是可溶性和膜结合TNFα两者的体外有力抑制剂。

本发明的双特异性抗体对于人TNFα具有在约30 pM至约1 pM范围内的结合亲和力（K_D），并且对于人IL-17A具有在约40 pM至约1 pM范围内的结合亲和力。进一步地，本发明的双特异性抗体对于人IL-17A/F异二聚体具有在约50 pM至约1 pM范围内的K_D。在一个方面，本发明的双特异性抗体对于人TNFα具有范围为约21 pM至约3 pM的K_D。在另一个方面，本发明的双特异性抗体对于人IL-17A具有范围为约8 pM至约10 pM的K_D。

双特异性抗体表达

能够指导它们与之可操作地连接的基因表达的表达载体是本领域众所周知的。表达载体可以编码信号肽，其促进一种或多种多肽从宿主细胞中分泌。信号肽可以是免疫球蛋白信号肽或异源信号肽。第一多肽和第二多肽可以独立地由不同启动子表达，它们在一个载体中与所述不同启动子可操作地连接，或可替代地，第一多肽和第二多肽可以独立地由不同启动子表达，它们在两个载体中与所述不同启动子可操作地连接 – 一个载体表达第一多肽，并且一个载体表达第二多肽。

宿主细胞包括用一种或多种表达载体稳定或瞬时转染、转化、转导或感染的细胞，所述表达载体编码本发明的第一多肽、第二多肽、或第一多肽和第二多肽两者。产生本发明的双特异性抗体的宿主细胞系的制备和分离可以使用本领域已知的标准技术来实现。哺乳动物细胞是用于表达双特异性抗体的优选宿主细胞。特定哺乳动物细胞是HEK 293、NS0、DG-44和CHO。优选地，双特异性抗体分泌到宿主细胞在其中培养的培养基内，从所述培养基中可以回收或纯化本发明的双特异性抗体。

本领域众所周知抗体的哺乳动物表达导致糖基化。通常，糖基化在抗体的Fc区中在高度保守的N糖基化位点处发生。N聚糖通常附着至天冬酰胺。第一多肽各自在SEQ IDNO: 1的天冬酰胺残基300处是糖基化的。

编码具有SEQ ID NO: 1的氨基酸序列的第一多肽的特定DNA多核苷酸序列是：

。

编码具有SEQ ID NO: 2的氨基酸序列的第二多肽的特定DNA多核苷酸序列是：

。

双特异性抗体已分泌到其内的培养基可以通过常规技术进行纯化。例如，使用常规方法，可以将培养基施加于蛋白A或G柱且从其中洗脱。可溶性聚集物和多聚体可以通过常见技术有效去除，所述常见技术包括尺寸排阻、疏水作用、离子交换或羟磷灰石层析。产物可以例如在-70℃下立即冷冻或可以是冻干的。

可能存在降低培养基中存在的双抗体水平的需要。例如含有双抗体的培养基可以施加于强阳离子交换树脂且从其中洗脱。例如，SP-Sepharose HP强阳离子交换树脂用于纯化正确折叠的双特异性抗体与双抗体。使用20 mM Bicine，将含有双抗体的培养基的pH调整至pH 8.1。将培养基装载到SP-Sepharose HP柱上，用2柱体积的20 mM Bicine（pH 8.1）洗涤，且用20 mM Bicine和100 mM NaCl（pH 8.1）经过20柱体积（10-90 mM NaCl）洗脱。收集的库可以就高分子量相对于主峰进行评价。通常结果是从约17%双抗体到小于1%双抗体的改善，具有约68%的回收。

任选地，双抗体可以根据下述非限制性操作进行纯化：双特异性抗体和双抗体已分泌到其内的澄清培养基可以施加于蛋白A亲和柱，所述蛋白A亲和柱已用相容缓冲液例如磷酸盐缓冲盐水（pH 7.4）平衡。柱可以进行洗涤以去除非特异性结合组分。结合的双特异性抗体和双抗体可以例如通过pH梯度（例如0.1 M磷酸钠缓冲液pH 6.8至0.1 M柠檬酸钠缓冲液pH 2.5）进行洗脱。双特异性双抗体级分可以通过下述进行检测：在Fc区和ScFv/双抗体区之间切割的有限赖氨酰内肽酶（LysC）消化，随后为反相HPLC定量分析。简言之，15 µg样品可以在37℃下用0.2 µg LysC（Wako，P/N 125-05061）在总体积为50 µL的20 mM TrispH 8.0 + 0.1 mg/mL碘乙酰胺中消化大约20小时。样品可以通过在PLRP-S 50x2.1 mm反相柱（Varian P/N PL1912-1802）上注射20 µL（6 µg）进行分析。流速可以是0.6 mL/分钟，柱温可以是80℃，检测可以在214 nm处，缓冲液A可以是0.05% TFA水溶液，并且缓冲液B可以是0.04% TFA乙腈溶液。ScFv和双抗体峰（先前通过LC-MS鉴定）可以通过整合适当峰进行测定。含有双特异性抗体的来自阳离子交换（CEX）层析的材料可以合并且渗滤（di-filtered）到PBS，pH 7.0内。为了去除高分子量聚集物，可以将合并物在PBS，pH7中置于以7 mL/分钟运行的Superdex 200 50/60 SEC柱上。双特异性双抗体库可以通过SDS-PAGE和分析型SEC分析进行测定。SEC库随后可以5倍稀释到下述缓冲系统内：3.3 mM MES、3.3 mM Hepes、3.3mM Tris、3.3 mM Bis-Tris丙烷、3.3 mM CHES、3.3 mM CAPS，pH 5.8。稀释的蛋白质库随后可以以15 mL/分钟装载到制备型ProPAC WCX-10 BioLC阳离子交换柱（22 x 250 mm制备规模）上。使用先前描述的缓冲系统，通过使用从pH 8.4到pH 11的线性pH梯度洗脱，双特异性双抗体可以与双特异性抗体分离，经过45分钟收集7.5 mL级分。制备ProPac 合并物可以基于分析型SEC（TSK3000）、分析型CEX（ProPac WCX-10）、凝胶分析（使用MES缓冲系统的NuPAGE）和Lys C消化，以测量每个级分中的双抗体含量。最终ProPac 合并物可以透析到PBS，pH7内。

这个纯化过程可以使双抗体含量从高达12%双抗体去除降低到小于5%双抗体。

药物组合物和治疗用途

本发明的双特异性抗体预期治疗类风湿性关节炎、牛皮癣关节炎和强直性脊柱炎。“患者”指患有疾病、病症或状况的哺乳动物，优选人，其将获益于TNF和/或IL-17的水平减少或者TNF和/或IL-17的生物活性减少。

“治疗（Treatment）”和/或“治疗（treating）”意指其中可以存在本文描述的病症进展的减慢、中断、阻止、控制或停止的所有过程，但不一定指示所有病症症状的完全消除。治疗包括本发明的双特异性抗体的施用，用于治疗哺乳动物特别是人中的疾病或状况，并且包括（a）抑制疾病的进一步进展，即阻止其发展；和（b）缓解疾病，即促使疾病或病症消退，或者减轻其症状或并发症。

本发明的双特异性抗体可以掺入适合于施用于受试者的药物组合物内。通常，药物组合物包含本发明的双特异性抗体和药学可接受的载体。如本文使用的，“药学可接受的载体”包括生理学相容的任何和所有溶剂、分散介质、包衣、抗菌剂和抗真菌剂、等渗剂和吸收延迟剂等。药学可接受的载体可以进一步包含少量辅助物质，其增强双特异性抗体的贮存期限或有效性。

本发明的组合物可以采取多种形式。优选形式取决于预期施用模式和治疗应用。通常的优选组合物采取可注射或可输注溶液的形式，例如类似于用于用其他抗体被动免疫接种人的那些的组合物。优选施用模式是肠胃外的（例如静脉内、皮下、腹膜内、肌内）。在一个实施方案中，双特异性抗体通过皮下注射进行施用。然而，如本领域技术人员应当理解的，施用途径和/或模式将取决于所需结果而改变。

本发明的药物组合物可以包括“治疗有效量”的本发明的双特异性抗体。“治疗有效量”指在所需剂量和时间段有效实现所需治疗结果的量。根据诸如下述因素：例如个体的疾病状态、年龄、性别和重量，以及双特异性抗体在个体中引发所需应答的能力，双特异性抗体的治疗有效量可以改变。治疗有效量也是其中双特异性抗体的任何有毒或有害效应被治疗有利效应超过的量。

剂量方案可以进行调整，以提供最佳所需应答（例如治疗应答）。例如，可以施用单次推注，可以随着时间过去施用几个分份剂量，或剂量可以如通过治疗情况的紧迫指示的按比例降低或增加。

剂量值可以随待减轻状况的类型和严重性而改变。应进一步理解对于任何特定受试者，根据个体需要和施用或监督组合物施用的个人的专业判断，具体剂量方案应随着时间过去进行调整。

在另一个实施方案中，本发明提供了用于治疗自身免疫疾病的方法，所述自身免疫疾病特别是与炎症相关的那些，例如类风湿性关节炎、牛皮癣关节炎和强直性脊柱炎。通常，双特异性抗体全身施用，尽管对于某些病症，双特异性抗体在炎症部位处的局部施用可以是有利的。

本发明通过下述非限制性实施例进一步举例说明。

实施例

双特异性抗体的表达和纯化

双特异性抗体可以基本上如下进行表达和纯化。含有SEQ ID NO: 3（编码具有SEQID NO: 1的氨基酸序列的第一多肽）和SEQ ID NO: 4（编码SEQ ID NO: 2的轻链氨基酸序列）的DNA的谷氨酰胺合成酶（GS）表达载体，通过电穿孔用于转染中国仓鼠细胞系，CHOK1SV（Lonza Biologics PLC，Slough，英国）。表达载体编码SV早期（猿猴病毒40E）启动子和GS的基因。GS的表达允许谷氨酰胺的生物化学合成，所述谷氨酰胺是CHOK1SV细胞需要的氨基酸。转染后，细胞经历用50 µM L-甲硫氨酸亚砜亚胺（MSX）的混合选择（bulk selection）。通过MSX抑制GS用于增加选择的严格性。具有表达载体cDNA整合到宿主细胞基因组的转录活性区域内的细胞针对CHOK1SV野生型细胞进行选择，所述CHOK1SV野生型细胞表达内源水平的GS。将经转染的库以低密度铺平板，以允许稳定表达细胞的接近于克隆长出（close-to-clonal outgrowth）。主孔（masterwells）就双特异性抗体表达进行筛选，且随后在无血清、悬浮培养中扩大，以用于生产。将双特异性抗体已分泌到其内的澄清培养基施加于蛋白A亲和柱，所述蛋白A亲和柱已用相容缓冲液例如磷酸盐缓冲盐水（pH 7.4）平衡。柱进行洗涤以去除非特异性结合组分。结合的双特异性抗体例如通过pH梯度（例如0.1 M磷酸钠缓冲液pH 6.8至0.1 M柠檬酸钠缓冲液pH 2.5）进行洗脱。双特异性抗体级分例如通过SDS-PAGE或分析型尺寸排阻进行检测，且随后合并。可溶性聚集物和多聚体可以通过常见技术有效去除，所述常见技术包括尺寸排阻、疏水作用、离子交换或羟磷灰石层析。双特异性抗体可以使用常见技术进行浓缩和/或无菌过滤。在这些层析步骤后，双特异性抗体的纯度是大于98%。双特异性抗体可以例如在-70℃下立即冷冻或在4℃下贮存几个月。

与TNFα和IL-17的结合亲和力

TNFα

使用阻断剂酪蛋白的PBS溶液（Pierce）作为运行缓冲液和样品稀释剂，使用在37℃下在Sapidyne KinExA 3000仪器上的溶液平衡结合测定，来确定双特异性抗体与人TNFα的结合亲和力。人TNFα通过标准胺偶联化学固定到NHS琼脂糖上。通过将双特异性抗体以20pM的固定浓度与以200、100、50、25、12.5、6.25、3.13、1.56、0.78、0.39和0（空白）pM浓度的人TNFα混合，来制备样品。在分析前，将样品在37℃下温育18小时，以达到平衡。每个分析循环由下述组成：（1）通过以1 mL/分钟注射367 µL珠，填充人TNFα珠的柱，（2）以0.5 mL/分钟将10 mL（20分钟）双特异性抗体/人TNFα复合物注射到柱上，（3）以0.25 mL/分钟注射0.5mL（2分钟）缓冲液，以洗掉未结合的样品，（4）注射1 mL（30秒）500 ng/mL DyLight-649兔抗人IgG检测抗体（Jackson ImmunoResearch），（5）以1.5 mL/分钟注射2.25 mL（90秒）缓冲液，以洗掉未结合的检测抗体，和（6）用1N NaOH的1 mL（60秒）注射，随后为回洗，来清洁该系统。使用KinExA Pro软件，版本2.0.1.14，使用两次重复实验的N曲线分析，来拟合数据。由游离双特异性抗体百分比计算平衡解离常数（K_D）。本发明的双特异性抗体显示对于人TNFα 4.4 pM的K_D（0.6至16.3 pM的95%置信区间）。

IL-17

使用在Biacore T200仪器上，由HBS-EP+（GE Healthcare，10 mM Hepes pH7.4 +150 mM NaCl + 3 mM EDTA + 0.05%表面活性剂P20）运行缓冲液引发和设为37℃的分析温度的表面等离子体共振测定，来确定双特异性抗体与人IL-17的结合亲和力。在所有四个流动池（Fc）上含有固定的蛋白A（使用标准NHS-EDC胺偶联生成）的CM4芯片用于采用捕获方法。通过稀释到运行缓冲液内，制备以4 µg/mL的抗体样品。通过稀释到运行缓冲液内，制备以80.0、40.0、20.0、10.0、5.0、2.5、1.25和0（空白）nM最终浓度的人IL-17。每个分析循环由下述组成：（1）在分开的流动池（Fc2、Fc3和Fc4）上捕获抗体样品，（2）以100 µL/分钟将200µL（120秒）人IL-17注射到所有流动池上，（3）将缓冲液流返回20分钟，以监控解离相，（4）用甘氨酸，pH 2.0的10 µL（20秒）注射再生芯片表面。使用Biacore T200 Evaluation软件，版本1.0，使用与1:1结合模型的标准双重参考和拟合来加工数据，以测定结合速率（k_on）和解离速率（k_off）。如由关系K_D = k_off/k_o计算平衡解离常数（K_D）。

表1：通过双特异性抗体与人IL-17的结合亲和力

这些结果证实本发明的双特异性抗体分开地可以结合人TNFα和人IL-17。

与人TNFα和人IL-17的同时结合

Biacore T200仪器用于确定人TNFα和人IL17是否可以同时与双特异性抗体结合。所有Biacore试剂和材料均购自Biacore，除非另有说明。所有测量均在25℃下执行。HBS-EP+缓冲液（150 mM氯化钠、3 mM EDTA、0.05%（w/v）表面活性剂P-20和10 mM Hepes，pH 7.4）用作运行缓冲液和样品缓冲液。使用胺偶联试剂盒，将蛋白A固定到CM4传感器芯片的流动池1和2上。稀释至3 µg/mL的双特异性抗体首先在流动池2上捕获，使用以30 µL/分钟的35秒注射，获得165共振单位（RU）的捕获抗体。这种捕获随后为35秒的缓冲液注射。流速随后增加至100 µL/分钟，并且将流动导向流动池1（Fc1）和流动池2（Fc2）上。为了饱和TNFα结合，将50 nM人TNFα注射2分钟。收集扣除参考的数据作为Fc2-Fc1。观察到45 RU的结合信号。在人TNFα注射后，将80 nM人IL-17注射另外2分钟，以饱和IL-17结合。再次，收集扣除参考的数据作为Fc2-Fc1。观察到37 RU的另外结合信号。随后使用10 mM甘氨酸，pH 1.5再生芯片表面。这些结果证实本发明的双特异性抗体可以同时结合人TNFα和人IL17，如通过来自与双特异性抗体结合的两种配体的共振单位中的增加（来自TNFα的初始45 RU，随后来自人IL-17的另外37 RU）显示的。

IL-17诱导的来自HT-29细胞的体外CXCL1生产的抑制

HT-29细胞是人结肠直肠腺癌上皮细胞，其天然表达IL-17受体。HT-29细胞与人IL-17一起温育导致CXCL1的产生，所述CXCL1可以使用商购可得的ELISA进行测量。

评估从20 pM到10 nM的双特异性抗体剂量范围（双特异性抗体的MW为200 kDa）。将双特异性抗体的每个测试浓度加入（50 µL）含有50 µL 2 nM（最终浓度）重组IL-17的孔中。测试以一式两份孔/处理进行。测定培养基用于“单独的培养基”和“单独的IL-17”对照。IL-17中和抗体（美国专利号7,838,638）用作测定中的阳性对照。对照抗体以与双特异性抗体相同的摩尔范围进行测试。含有IL-17和抗体混合物的板在组织培养处理的96孔板中温育60至90分钟（在37℃、95%相对湿度、5% CO₂下）。

HT-29细胞照常规在测定培养基（含有10% FBS、青霉素G（0.2 U/mL）和链霉素（0.2µg/mL）的McCoy’s 5A）中进行培养。在测定日前一天收获细胞。将细胞用1x PBS清洗，并且用细胞解离缓冲液、无酶、PBS，从培养瓶中脱离。将完全测定培养基加入脱离的细胞中。细胞随后以310Xg在室温下离心5分钟。将细胞团块重悬浮于测定培养基中。用InvitrogenCountess测量细胞密度，并且将20,000 HT-29细胞（在100 µL中）加入96孔板各自中。将96孔板置于组织培养温箱（37℃、95%相对湿度、5% CO₂）中过夜。将抗体/IL-17混合物（100 µL）加入HT-29细胞中，且温育（37℃、95%相对湿度、5% CO₂）24-48小时。

在测定结束时，将板离心（在室温下500Xg共5分钟），并且将细胞培养基转移至聚丙烯96孔板，将其密封且在-80℃下冷冻。在通过ELISA测量CXCL1当天时，将板在室温下解冻。根据制造商的说明书，用CXCL1夹心ELISA（R&D Systems DuoSet #DY275）测量培养基中的CXCL1水平。在ELISA反应结束时，板在微板阅读器（Molecular Devices VersaMaxTunable）上在450 nm处进行阅读。结果表示为使用数据的4参数S形曲线拟合（GraphPadPrism）计算的，其中50% IL-17诱导的应答被双特异性抗体或阳性对照抑制的浓度（IC₅₀）。

结果证实本发明的双特异性抗体以浓度依赖性方式抑制IL-17诱导的通过HT-29细胞的CXCL1分泌。抑制与用阳性对照抗体观察到的那种可比较[其中双特异性抗体0.628+ 0.072 nM的IC₅₀，相对于阳性对照抗体0.614 + 0.099 nM的IC₅₀（3次独立实验的平均值+SEM）]，而阴性对照抗体不抑制CXCL1生产。本发明的双特异性抗体有效中和IL-17。

TNF诱导的来自HT-29细胞的体外CXCL1生产的抑制

HT-29细胞是人结肠直肠腺癌上皮细胞，其天然表达TNF受体。HT-29细胞与人TNFα一起温育导致CXCL1的产生，所述CXCL1可以使用商购可得的ELISA进行测量。

评估从0.5 pM到10 nM的双特异性抗体剂量范围（双特异性抗体的MW为200 kDa）。将双特异性抗体的每个测试浓度加入（50 µL）含有50 µL 30 pM（最终浓度）重组TNFα的孔中。测试以一式两份孔/处理进行。测定培养基用于“单独的培养基”和“单独的TNF”对照。TNF中和抗体（阿达木单抗）用作测定中的阳性对照。对照抗体以与双特异性抗体相同的摩尔范围进行测试。含有TNFα和抗体混合物的板在组织培养处理的96孔板中温育60至90分钟（在37℃、95%相对湿度、5% CO₂下）。

HT-29细胞照常规在测定培养基（含有10% FBS、青霉素G（0.2 U/mL）和链霉素（0.2mcg/mL）的McCoy’s 5A）中进行培养。在测定日前一天收获细胞。将细胞用1x PBS清洗，并且用细胞解离缓冲液、无酶、PBS，从培养瓶中脱离。将完全测定培养基加入脱离的细胞中。细胞随后以310Xg在室温下离心5分钟。将细胞团块重悬浮于测定培养基中。用InvitrogenCountess测量细胞密度，并且将20,000 HT-29细胞（在100 µL中）加入96孔板各自中。将96孔板置于组织培养温箱（37℃、95%相对湿度、5% CO₂）中过夜。将抗体/TNFα混合物加入HT-29细胞中，且温育（37℃、95%相对湿度、5% CO₂）24-48小时。

在测定结束时，将板离心（在室温下500xg共5分钟），并且将细胞培养基转移至聚丙烯96孔板，将其密封且在-80℃下冷冻。在通过ELISA测量CXCL1当天时，将板在室温下解冻。根据制造商的说明书，用CXCL1夹心ELISA（R&D Systems DuoSet #DY275）测量培养基中的CXCL1水平。在ELISA反应结束时，板在微板阅读器（Molecular Devices VersaMaxTunable）上在450 nm处进行阅读。结果表示为使用数据的4参数S形曲线拟合（GraphPadPrism）计算的，其中50% TNF诱导的应答被双特异性抗体或阳性对照抑制的浓度（IC₅₀）。

结果证实本发明的双特异性抗体以浓度依赖性方式抑制TNF诱导的通过HT-29细胞的CXCL1分泌。抑制与用阳性对照抗体观察到的那种可比较[其中双特异性抗体18.8 + 1pM的IC₅₀，相对于阳性对照抗体14.0 + 2 pM的IC₅₀（3次独立实验的平均值+ SEM）]，而阴性对照抗体不抑制CXCL1生产。本发明的双特异性抗体有效中和TNFα。

通过IL-17和TNF组合诱导的来自HT-29细胞的CXCL1生产的抑制

如上所述，HT-29细胞是人结肠直肠腺癌上皮细胞，其天然表达IL-17和TNF受体。HT-29细胞与人TNFα和人IL-17一起温育导致CXCL1的产生，所述CXCL1可以使用商购可得的ELISA进行测量。

抗体以4 nM的固定剂量进行测试（双特异性抗体的MW为200 kDa）。随后将双特异性抗体加入（50 µL）含有50 µL 3 pM重组TNFα和50 µL 200 pM 重组IL-17的孔中。测试以五个重复孔/处理进行。测定培养基用于“单独的培养基”和“单独的IL-17+TNF”。抗IL-17抗体（美国专利号7,838,638）；抗TNFα抗体（阿达木单抗）；以及抗IL-17抗体/抗TNF抗体的组合用作测定中的对照。对照抗体以与双特异性抗体相同的摩尔范围进行测试。含有TNF+IL-17和抗体混合物的板在组织培养处理的96孔板中温育60至90分钟（在37℃、95%相对湿度和5% CO₂下）。

HT-29细胞照常规在测定培养基[含有10% FBS、青霉素G（0.2 U/mL）和链霉素（0.2mcg/mL）的McCoy’s 5A]中进行培养。在测定日前一天收获细胞。将细胞用1x PBS清洗，并且用细胞解离缓冲液、无酶、PBS，从培养瓶中脱离。将完全测定培养基加入脱离的细胞中。HT-29细胞随后以310Xg在室温下离心5分钟。将细胞团块重悬浮于测定培养基中。用Invitrogen Countess测量细胞密度，并且将20,000 HT-29细胞（在100 µL中）加入96孔板各自中。将96孔板置于组织培养温箱（37℃、95%相对湿度、5% CO₂）中过夜。将双特异性抗体/IL-17/TNF混合物加入HT-29细胞中，且温育（37℃、95%相对湿度、5% CO₂）24-48小时。

在测定结束时，将板离心（在室温下500xg共5分钟），并且将细胞培养基转移至聚丙烯96孔板，将其密封且在-80℃下冷冻。在通过ELISA测量CXCL1当天时，将板在室温下解冻。根据制造商的说明书，用CXCL1夹心ELISA（R&D Systems DuoSet #DY275）测量培养基中的CXCL1水平。在ELISA反应结束时，板在微板阅读器（Molecular Devices VersaMaxTunable）上在450 nm处进行阅读。结果表示为在与不同抗体温育后剩下的人CXCL1百分比（其中单独的TNF + IL-17为100%）：双特异性抗体0.85 +/- 0.12 %； 抗TNFα 8.97 +/-2.65%； 抗IL-17 27 +/- 2.07 %； 抗TNFα + 抗IL-17 0.59 +/- 1.23 %。结果证实本发明的双特异性抗体比单独的单一试剂更好地抑制TNFα和IL-17同时诱导的通过HT-29细胞的CXCL1分泌。

在体外在L929细胞中可溶性TNFα诱导的细胞毒性的抑制

L929细胞是天然表达TNF受体的小鼠纤维肉瘤细胞。由于活性氧中间产物的过度形成，L929细胞与人TNFα一起温育导致快速细胞死亡。细胞死亡可以使用MTT细胞毒性测定进行测量，其中活细胞中的线粒体琥珀酸脱氢酶将四唑盐还原成甲䐶产物，其可以用荧光板阅读器进行检测。

评估从20 nM到10 pM的双特异性抗体剂量范围（双特异性抗体的MW为200 kDa）。将双特异性抗体的每个测试浓度（100 µL）、200 pg/mL重组人TNFα（100 µL）和6.25 µg/mL放线菌素-D（100 µL）加入含有L929细胞的孔中。测试以一式两份孔/处理进行。TNFα中和抗体（具有IgG4同种型的阿达木单抗）用作测定中的阳性对照。含有抗体混合物的板在室温下温育60分钟。

L929细胞照常规在测定培养基（1xDMEM Cellgro、10% FBS、1% Pen-Strep、1% MEM必需氨基酸、1% L-谷氨酰胺、1%丙酮酸钠）中进行培养。在测定当天时，将细胞用1x PBS（无Ca^++或Mg⁺⁺）清洗，并且用0.25%胰蛋白酶 + EDTA从培养瓶中脱离。胰蛋白酶被测定培养基失活。L929细胞以215xg在室温下离心5分钟。将细胞团块重悬浮于测定培养基中。用血球计数器测量细胞密度，并且将10,000 L929细胞（在100 µL中）加入96孔板中，并且置于组织培养温箱（37℃、95%相对湿度、5% CO₂）中过夜。将抗体/TNFα/放线菌素-D混合物转移至具有L929贴壁细胞的96孔板，且在37℃、95%相对湿度、5% CO₂下温育18小时。去除测定培养基，并且将MTT底物混合物加入孔中（120 µL）。将板在37℃、95%相对湿度、5% CO₂下放置3小时。通过在微板阅读器（Molecular Devices SpectraMax 190）上在490 nm处阅读板，来测定细胞死亡。结果表示为使用数据的4参数S形曲线拟合（GraphPad Prism）计算的，其中50% TNFα诱导的应答被双特异性抗体或阳性对照抗体抑制的浓度（IC₅₀）（四次独立实验的平均值+/- SEM）。

结果证实本发明的双特异性抗体以剂量依赖性方式抑制TNF诱导的L929细胞的杀死，具有226 +/- 52 pM的IC₅₀。这种抑制与用阳性对照抗体观察到的那种（IC₅₀ = 243 +/-49 pM）可比较，而阴性对照抗体不抑制人TNFα。本发明的双特异性抗体有效中和人TNFα。

在体外在L929细胞中膜结合的人TNFα诱导的细胞毒性的抑制

为了研究双特异性抗体抑制膜结合的TNFα的能力，使用一组突变使TNFα的已知切割位点失活，所述一组突变先前证实为在不存在TNF切割的情况下，允许生物活性的TNFα在细胞表面上的表达（Mueller等人1999）。将不可切割的TNFα构建体稳定转染至中国仓鼠卵巢（CHO）细胞。如通过流式细胞术显示的，这些细胞表达膜结合的TNFα。L929细胞与表达人不可切割的膜结合的TNFα的CHO细胞一起温育导致快速的L929细胞死亡。

表达膜结合的TNFα的CHO细胞照常规维持在选择培养基（AM2001培养基，不含MSX、8 mM谷氨酰胺、GS补充物、具有500 µg/mL G418的HT补充物的内部CHO生长培养基）中。在测定当天时，将细胞计数，用1x PBS（无Ca^++或Mg⁺⁺）清洗，以215xg离心5分钟，且以50,000细胞/mL连同放线菌素-D（6.25 µg/mL）一起重悬浮于L929测定培养基中。将500个细胞（在10 µL中）的细胞悬浮液加入抗体混合物的每个浓度中，将其在37℃、95%相对湿度、5% CO₂下温育60分钟。将含有双特异性抗体、人不可切割的膜结合的TNFαCHO细胞和放线菌素-D的混合物转移至具有L929贴壁细胞的96孔板，且在37℃、95%相对湿度、5% CO₂下温育18小时。使用如上文对于可溶性TNFαL929测定描述的MTT细胞毒性测定，来测量细胞死亡。结果表示为其中50% TNFα诱导的应答被双特异性抗体或阳性对照抗体抑制的浓度（IC₅₀）（3次独立实验的平均值+/- SEM）。

结果证实本发明的双特异性抗体以剂量依赖性方式抑制通过人不可切割的膜结合的TNFαCHO细胞的L929细胞的杀死，具有646 +/- 89.5 pM的IC₅₀。这种抑制与用阳性对照抗体（具有IgG4同种型的阿达木单抗）观察到的那种（IC₅₀ = 669 +/- 134 pM）可比较，而阴性对照抗体不抑制人TNFα。本发明的双特异性抗体有效中和膜结合的人TNFα。

人IL-17或TNFα诱导的体内CXCL1生产的抑制

人IL-17或TNFα的注射导致循环中的小鼠CXCL1的快速和瞬时增加。常规C57BI/6J小鼠（n= 7/组）用下述进行皮下注射（16.7 nmol/kg）：（a）双特异性抗体，（b）阳性对照抗IL-17抗体（BAFF/IL-17双特异性抗体），（c）阳性对照抗TNFα抗体（具有IgG4同种型的阿达木单抗）；或（d）阴性对照抗体（人IgG4）。两天后，小鼠接受人IL-17（3 µg/小鼠）或人TNFα（1µg/小鼠）的单次腹膜内注射。细胞因子攻击后两小时，将小鼠处死，且使用商业ELISA就CXCL1分析血浆。

表2：人IL-17或TNFα诱导的体内CXCL1生产的平均抑制%

结果证实相对于接受阴性对照抗体的动物，本发明的双特异性抗体显著抑制人IL-17和TNFα诱导的CXCL1生产（p<0.001，通过ANOVA随后为Tukey’s多重比较检验计算的）。对于双特异性抗体的CXCL1生产降低与用阳性对照抗体观察到的那种可比较。因此，本发明的双特异性抗体有效中和在小鼠中由人IL-17和TNFα诱导的生物效应。

结合测定

CD16a、CD32a和C1q

用100 μL/板的在磷酸盐缓冲盐水（PBS）中以1 μg/mL的具有C末端10-His标签的CD32a（R&D Systems）或具有C末端6-His标签的重组人CD16a（R&D Systems），来包被96孔微板。用100 μL/板的在PBS中以2 μg/mL人C1q（MP Biologicals），来包被96孔微板。将板密封且在4℃下温育过夜。从每个孔中去除包被试剂，并且加入200 μL/孔的酪蛋白阻断试剂（Thermo）。将板密封且在室温（RT）下温育1小时。将每个孔用洗涤缓冲液（20 mM Tris、0.15M NaCl、0.1% Tween-20，pH 7.5）洗涤两次。将本发明的双特异性抗体、人IgG1阳性对照或人IgG4阴性对照的系列稀释物（全部在酪蛋白阻断试剂中稀释），加入每个孔中（100 μL/孔），并且在RT下温育2小时（抗体以两倍系列稀释用6.25 - 200 μg/mL的浓度范围进行测试）。测试在一式两份孔中执行。随后在添加100 μL/孔的在酪蛋白阻断试剂中1:12,500稀释的HRP缀合的山羊抗人IgG，F（ab'）2（Jackson ImmunoResearch目录109-036-097）前，将板用洗涤缓冲液洗涤三次，并且在RT下温育1小时。这种单克隆抗体识别人IgG1和IgG4两者（数据未示出）。将板用洗涤缓冲液洗涤四次，并且加入TMB底物（Pierce，100 μL/孔）。温育时间对于CD16a为4.5分钟，对于CD32a为9分钟，并且对于C1q为30分钟，全部在黑暗中和在RT下。最后，将100 μL 1.0 N HCl加入每个孔中。使用设为450 nm的比色微板阅读器立即测量光密度。

CD64

用100 μL/板的在PBS中以1 μg/mL的具有C末端6-His标签的CD64（R&D Systems），来包被96孔微板。将板密封且在4℃下温育过夜。从每个孔中去除包被试剂，并且加入200 μL/孔的酪蛋白阻断试剂。将板密封且在RT下温育1小时。将每个孔用洗涤缓冲液洗涤两次。将本发明的双特异性抗体、人IgG1阳性对照或人IgG4阴性对照的系列稀释物（全部在酪蛋白阻断试剂中稀释），加入每个孔中（100 μL/孔），并且在RT下温育1小时（抗体以4倍系列稀释用0.001 - 300 μg/mL的浓度范围进行测试）。测试在一式两份孔中执行。随后在添加100μL/孔的在酪蛋白阻断试剂中1:12,500稀释的HRP缀合的山羊抗人IgG，F（ab'）2前，将板用洗涤缓冲液洗涤三次，并且在RT下温育1小时。将板用洗涤缓冲液洗涤四次，并且加入100 μL/孔的TMB底物，并且在黑暗中在RT下温育4.5分钟，在这时，将100 μL 1.0 N HCl加入每个孔中。使用设为450 nm的比色微板阅读器立即测量光密度。

体外结合实验的结果显示本发明的双特异性抗体与CD16a、CD32a、CD64或C1q中的任一种的结合等于用人IgG4阴性对照抗体观察到的那种。人IgG1阳性对照抗体与测试的所有四种分子结合，证实测定的有效性。

CD4 T细胞和类风湿性关节炎滑膜细胞共培养物诱导的MMP-1、MMP-3、IL-8和G- CSF体外生产的抑制

活化的人CD4 T细胞与来自患有类风湿性关节炎的患者的人成纤维细胞样滑膜细胞（RA-FLS）一起温育，导致炎症介质例如MMP-1、MMP-3、IL-8和G-CSF的产生，以及软骨和骨的破坏。将本发明的双特异性抗体（双特异性）（30nM（基于200kDa的MW））或对照抗体（Ab）以50 μL加入含有50 μL CD4 T细胞（以1:1珠/细胞比用CD3/CD28 Dynabeads活化的50,000个T细胞）的孔中。随后将100 μL含或不含Ab的活化CD4 T细胞加到前一晚以100 μL铺平板的RA-FLS上。测试在8-9个重复孔/处理中进行。人IgG4同种型用作阴性对照。IL-17中和Ab和TNF中和Ab用作测定中的阳性对照。对照Ab以与双特异性抗体相同的摩尔浓度进行测试。

使用Ficoll-Paque方法从血沉棕黄层[Leuko Reduction System（LRS）室]中分离人PBMC，所述血沉棕黄层得自San Diego Blood Bank。用PBS使7 mL LRS产物达到140 mL。将35 mL血沉棕黄层/PBS覆盖到15 mL Ficoll/Histopaque Plus（GE Healthcare）上。将管平衡，并且以900xg在室温（RT）下不停止地（without brake）旋转30分钟。用血清吸管收集界间细胞，并且用PBS洗涤两次。将分离的PBMC在4℃下在Iscoves改良达尔贝科培养基中贮存过夜，所述培养基含有10% FBS、青霉素（100 U/mL）、链霉素（100 U/mL）、L-谷氨酰胺（100单位/mL）和5x10^-5 M 2-β巯基乙醇。根据制造商的说明书，通过负选择（Miltenyi Biotec分离试剂盒）来分离CD4 T细胞。

来自Cell Applications，Inc.的RA-FLS细胞照常规在来自Cell Applications，Inc的完全滑膜细胞生长培养基中培养。在测定日前一天收获RA-FLS。将细胞用1x PBS清洗，并且用胰蛋白酶-EDTA从培养瓶中脱离。将完全测定培养基加入脱离的细胞中。RA-FLS以310xg在RT下离心5分钟。将细胞团块重悬浮于测定培养基[测定培养基：含有10% FBS、青霉素G（100 U/mL）和链霉素（100U/mL）的达尔贝科改良伊格尔培养基]中。用InvitrogenCountess测量细胞密度，并且将10,000 RA-FLS细胞（在100 µL中）加入96孔板的每个孔中。将96孔平底板置于组织培养温箱（37℃、5%）中。

用包被有抗CD3 和抗CD28的Dynabeads（Gibco，Life Technologies）实现T细胞活化。在使用前，将Dynabeads用等量洗涤缓冲液（具有0.1%牛血清白蛋白和2 mM EDTA的PBS，pH 7.4）洗涤。将珠置于Dynamagnet上，并且在一分钟后，去除上清液。将珠从Dynamagnet处取出，且重悬浮于PBMC培养基[Iscoves改良达尔贝科培养基，含有10% FBS、青霉素（100 U/mL）、链霉素（100 U/mL）、L-谷氨酰胺（100单位/mL）和5x10^-5 M 2-β巯基乙醇]中，以获得4x10⁷珠/mL的最初珠浓度。将在1.25 μL中的50,000个洗涤的珠加入50,000个T细胞中。将本发明的双特异性抗体或对照抗体（Ab）加到具有CD3/CD28珠的CD4 T细胞上。将含或不含抗体的dynabead活化的CD4 T细胞加到含有RA-FLS的96孔板上。将板置于组织培养温箱（37℃、5% CO₂）中6天。

在测定结束时，将板离心（在RT下500xg共5分钟），并且将细胞培养基转移至聚丙烯96孔板且在-80℃下冷冻。在通过ELISA测量MMP-1、MMP-3、IL-8和G-CSF当天时，将板在RT下解冻。根据制造商的说明书，通过夹心ELISA（分别为R&D Systems DuoSet No. DY901、DY513、DY208、DY214），测量培养基中的MMP-1、MMP-3、IL-8和G-CSF水平。在ELISA反应结束时，板在微板阅读器（Molecular Devices VersaMax Tunable）上在450 nm处进行阅读。结果表示为以ng/mL的细胞因子生产。在活化的CD4 T细胞：RA-FLS共培养物中用本发明的双特异性抗体的细胞因子抑制显示为：与在不存在Ab处理的情况下，活化的CD4 T细胞：RA-FLS共培养物相比较剩下的细胞因子平均%。

相对于对照Ab，本发明的双特异性抗体抑制活化的CD4 T细胞：RA-FLS共培养物诱导的MMP-1、MMP-3、IL-8和G-CSF生产。测定执行三次，具有相似结果。

人源化的关节炎小鼠模型中的体内测试

人TNF的转基因表达引起小鼠中的自发性、进行性炎症性关节炎（Hayward M.D.等人BMC Physiology. Dec 10；7:13（2007））。用腺伴随病毒（AAV）在这些小鼠中另外表达人IL-17进一步恶化自发性、进行性多关节炎。雄性人TNF转基因小鼠（（B6.Cg（SJL）-Tg（TNF）N21,Taconic Farms，Georgetown，NY，模型1006）携带整个人TNFα基因，包括启动子和稳定的3’UTR，其导致人TNFα在所有组织中的低组成性表达。动物2只/笼进行饲养，具有对食物和水的自由接近。标准化的评分系统用于评分其在前爪和后爪中的关节炎疾病（前爪：0 =无变形或肿胀的证据，1 = 踝轻度肿胀，2 = 中度肿胀或轻度变形，3 = 重度肿胀或重度变形，4 = 重度肿胀和重度变形。后爪：0 = 无变形或肿胀的证据，1 = 轻度变形/不能将脚趾伸直，2 = 中度变形/不能伸展脚趾，3 = 重度内侧扭曲/轻度肿胀，4 = 重度内侧扭曲，伴随显著肿胀）。在8周龄时，小鼠用1x10¹⁰基因组拷贝的腺伴随病毒（AAV）进行静脉内注射（经由尾静脉100 uL/小鼠），所述腺伴随病毒携带人IL-17基因（n=32）或无关基因（lacz，n=8）。根据制造商的说明书，使用商业ELISA试剂盒（Meso Scale Discovery，Rockville，MD），在得自剪尾的小鼠血浆中检测到人IL-17的病毒表达。平均血浆水平为约500 pg/ml人IL-17。在12周龄时，基于其临床关节炎得分、人IL-17血浆水平和体重，将小鼠随机化到研究组内。在分组当天时起始用不同抗体的处理。动物每周皮下给药，共9周，使用2个不同剂量（20和3.3 nmol/kg）的本发明的双特异性抗体（双特异性），或TNF中和抗体（TNF Ab），或同种型对照抗体（阴性对照Ab）（20 nmol/kg）。临床关节炎得分照常规以设盲方式进行确定。在结束时，通过心脏穿刺获得血浆，在10%福尔马林中固定后足。将后足在EDTA中脱矿物质，修剪，以常规方式加工，在石蜡中包埋，切片且用苏木精和伊红染色。在0-5量表上对于下述范畴进行关节炎评分：炎症、骨再吸收、软骨损害和血管翳形成：0=正常，1=最低限度，2=轻度，3=中度，4=显著，5=重度，总共可能为20。

所有抗体均在PBS中以适当浓度进行配制，以得到200 uL/小鼠的皮下剂量。

在处理后的人TNF转基因/IL-17小鼠的后爪的平均组织学得分

*** p<0.001，** p< 0.01相对于阴性对照Ab（单向ANOVA）。组织学得分是四个不同参数（在0-5量表上评分的炎症、骨再吸收、软骨损害和血管翳形成）的累积。

该数据证实本发明的双特异性抗体在人细胞因子驱动的疾病的疾病模型中是有效的。

人源化的牛皮癣小鼠模型的体内测试

牛皮癣的人源化小鼠模型是涉及将来自牛皮癣患者的人非病灶皮肤活组织检查移植到免疫缺陷小鼠的背部皮肤上的模型。在人皮肤已移植后（3 - 4周后），将来自相同供体的T细胞活化的人外周血单核细胞（PBMC）皮内注射到移植物内，以诱导牛皮癣样表皮增厚（Wrone-Smith和Nickoloff J.，Clin Invest.15；98（8）:1878-87（1996））。

在PBMC注射前一天开始，用本发明的双特异性抗体（双特异性）（66.6、3.3或0.67nmol/kg）、TNF中和抗体（TNF Ab）（66.6或3.3 nmol/kg）、PBS或倍他米松（局部每天两次），将小鼠（10-27/组）每周处理一次。在三周后，对小鼠实施安乐死，分离移植的皮肤，并且测量表皮的厚度。

与PBS对照相比较，本发明的双特异性抗体（66.6 nmol/kg）显著降低人皮肤移植物中的表皮增厚（p=0.047）。本发明的双特异性抗体（66.6 nmol/kg）能够比TNF Ab（66.6nmol/kg）更好地降低人皮肤移植物中的表皮增厚（p=0.0057）。这些结果证实本发明的双特异性抗体在牛皮癣的人源化小鼠模型中的功效。

平均表皮厚度

稳定性分析

双特异性抗体在10 mM柠檬酸盐 + 150 mM NaCl，pH 6中进行配制。使用AmiconUltra-4 30,000 MWCO浓缩器（Millipore），将双特异性抗体浓缩为100 mg/mL。加入Tween-80至0.02%（v/v）的最终浓度。将浓缩样品贮存于25℃下经过4周时期。在时间零时、在1周后和在4周后，用尺寸排阻层析（SEC），就高分子量百分比（%HMW）分析样品。使用TSK G3000SW-XL（Tosoh Bioscience）柱，在Agilent 1100系统上执行SEC。50 mM 磷酸钠 + 0.35 MNaCl，pH 7.0用作移动相，以0.5 mL/分钟运行35分钟。将体积1 uL的浓缩双特异性抗体注射到柱内，并且在280 nm处进行监控。使用ChemStation分析层析图，并且使用在单体峰前洗脱的峰的AUC与总AUC的比来计算%HMW。在不同时间点贮存于25℃下的样品就%HMW进行分析。在时间零时，%HMW为1.52；在1周时，%HMW为2.01；并且在4周时，%HMW为2.37。

结果证实本发明的双特异性抗体是稳定的，因为在4周后，在可溶性聚集物中不存在显著变化。

序列表

<110> Eli Lilly and Company

<120> 抗TNF-抗IL-17双特异性抗体

<130> X19803

<150> 61/774909

<151> 2013-03-08

<160> 4

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 712

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成构建体

<400> 1

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Arg

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Asp Asp Tyr

20 25 30

Ala Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ser Ala Ile Thr Trp Asn Ser Gly His Ile Asp Tyr Ala Asp Ser Val

50 55 60

Glu Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Lys Val Ser Tyr Leu Ser Thr Ala Ser Ser Leu Asp Tyr Trp Gly

100 105 110

Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser

115 120 125

Val Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala

130 135 140

Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val

145 150 155 160

Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala

165 170 175

Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val

180 185 190

Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Lys Thr Tyr Thr Cys Asn Val Asp His

195 200 205

Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Ser Lys Tyr Gly

210 215 220

Pro Pro Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly Gly Pro Ser

225 230 235 240

Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg

245 250 255

Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro

260 265 270

Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala

275 280 285

Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val

290 295 300

Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr

305 310 315 320

Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr

325 330 335

Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu

340 345 350

Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys

355 360 365

Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser

370 375 380

Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp

385 390 395 400

Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser

405 410 415

Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala

420 425 430

Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Leu Gly Gly

435 440 445

Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gln Val Gln

450 455 460

Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser Ser Val Lys

465 470 475 480

Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Lys Phe Thr Asp Tyr His Ile His

485 490 495

Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Cys Leu Glu Trp Met Gly Val Ile

500 505 510

Asn Pro Thr Tyr Gly Thr Thr Asp Tyr Asn Gln Arg Phe Lys Gly Arg

515 520 525

Val Thr Ile Thr Ala Asp Glu Ser Thr Ser Thr Ala Tyr Met Glu Leu

530 535 540

Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Tyr

545 550 555 560

Asp Tyr Phe Thr Gly Thr Gly Val Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val

565 570 575

Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly

580 585 590

Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asp Ile Val Met Thr Gln Thr Pro

595 600 605

Leu Ser Leu Ser Val Thr Pro Gly Gln Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg

610 615 620

Ser Ser Arg Ser Leu Val His Ser Arg Gly Glu Thr Tyr Leu His Trp

625 630 635 640

Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser Pro Gln Leu Leu Ile Tyr Lys Val

645 650 655

Ser Asn Arg Phe Ile Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser

660 665 670

Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val

675 680 685

Gly Val Tyr Tyr Cys Ser Gln Ser Thr His Leu Pro Phe Thr Phe Gly

690 695 700

Cys Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys

705 710

<210> 2

<211> 214

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成构建体

<400> 2

Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly

1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Gly Ile Arg Asn Tyr

20 25 30

Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile

35 40 45

Tyr Ala Ala Ser Thr Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly

50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro

65 70 75 80

Glu Asp Val Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Arg Tyr Asn Arg Ala Pro Tyr

85 90 95

Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala

100 105 110

Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly

115 120 125

Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala

130 135 140

Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln

145 150 155 160

Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser

165 170 175

Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr

180 185 190

Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser

195 200 205

Phe Asn Arg Gly Glu Cys

210

<210> 3

<211> 2136

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成构建体

<400> 3

gaggtgcagc tggtggagtc tgggggaggc ttggtacagc ctgggaggtc cctgagactc 60

tcctgtgcag cctctggatt cacctttgat gactatgcca tgcactgggt ccgccaggct 120

ccagggaagg ggctggagtg ggtgtcagct attacttgga atagtggtca catagactac 180

gcagactccg tggagggccg gttcaccatc tccagagaca atgccaagaa ctccctgtat 240

ctgcaaatga acagcctgag agccgaggac acggccgtat attactgtgc gaaagtgagc 300

tacctgagta ctgcctccag cctggactac tggggccaag gaaccctggt caccgtctcc 360

tcagcctcca ccaagggccc atcggtcttc ccgctagcgc cctgctccag gagcacctcc 420

gagagcacag ccgccctggg ctgcctggtc aaggactact tccccgaacc ggtgacggtg 480

tcgtggaact caggcgccct gaccagcggc gtgcacacct tcccggctgt cctacagtcc 540

tcaggactct actccctcag cagcgtggtg accgtgccct ccagcagctt gggcacgaag 600

acctacacct gcaacgtaga tcacaagccc agcaacacca aggtggacaa gagagttgag 660

tccaaatatg gtcccccatg cccaccctgc ccagcacctg aggccgccgg gggaccatca 720

gtcttcctgt tccccccaaa acccaaggac actctcatga tctcccggac ccctgaggtc 780

acgtgcgtgg tggtggacgt gagccaggaa gaccccgagg tccagttcaa ctggtacgtg 840

gatggcgtgg aggtgcataa tgccaagaca aagccgcggg aggagcagtt caacagcacg 900

taccgtgtgg tcagcgtcct caccgtcctg caccaggact ggctgaacgg caaggagtac 960

aagtgcaagg tctccaacaa aggcctcccg tcctccatcg agaaaaccat ctccaaagcc 1020

aaagggcagc cccgagagcc acaggtgtac accctgcccc catcccagga ggagatgacc 1080

aagaaccagg tcagcctgac ctgcctggtc aaaggcttct accccagcga catcgccgtg 1140

gagtgggaaa gcaatgggca gccggagaac aactacaaga ccacgcctcc cgtgctggac 1200

tccgacggct ccttcttcct ctacagcagg ctaaccgtgg acaagagcag gtggcaggag 1260

gggaatgtct tctcatgctc cgtgatgcat gaggctctgc acaaccacta cacacagaag 1320

agcctctccc tgtctctggg aggcggagga tccgggggag ggggttccgg aggagggggc 1380

tcgcaggtgc agctggtgca gtctggggct gaggtgaaga agcctgggtc ctcagtgaag 1440

gtttcctgca aggcatctgg ttacaagttc actgactacc atattcattg ggtgcgacag 1500

gcccctggac aatgccttga gtggatggga gtaattaatc ctacttatgg tactactgac 1560

tacaatcagc ggttcaaagg ccgtgtcacc attaccgcgg acgaatccac gagcacagcc 1620

tacatggagc tgagcagcct gagatctgag gacacggccg tgtattactg tgcgagatat 1680

gattacttta ctgggacggg tgtgtactgg ggccaaggaa ccctggtcac cgtctcctca 1740

ggtggcggag gatctggtgg aggtggctca ggaggtggcg gaagcggcgg aggtggaagt 1800

gatattgtga tgactcagac tccactctcc ctgtccgtca cccctggaca gccggcctcc 1860

atctcctgca gatctagtag gagccttgta cacagtcgtg gagaaaccta tttacattgg 1920

tatctgcaga agccaggcca atctccacag ctcctaattt ataaagtttc caaccggttt 1980

attggggtcc cagacagatt cagcggcagt gggtcaggca cagatttcac actgaaaatc 2040

agcagggtgg aggccgaaga tgttggggtt tattactgct ctcaaagtac acatcttcca 2100

ttcacgtttg gctgcgggac caagctggag atcaaa 2136

<210> 4

<211> 642

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成构建体

<400> 4

gacatccaga tgacccagtc tccatcctcc ctgtctgcat ctgtaggaga cagagtcacc 60

atcacttgcc gggcgagtca gggcattcgc aattatttag cctggtatca gcagaaacca 120

gggaaagctc ctaagctcct gatctatgct gcatccactt tgcaatcagg ggtcccatct 180

cggttcagtg gcagtggatc tgggacagat ttcactctca ccatcagcag cctgcagcct 240

gaagatgttg caacttatta ctgtcaacgc tataaccgtg ccccttacac gttcggccaa 300

gggaccaagg tggaaatcaa acggactgtg gctgcaccat ctgtcttcat cttcccgcca 360

tctgatgagc agttgaaatc tggaactgcc tctgttgtgt gcctgctgaa taacttctat 420

cccagagagg ccaaagtaca gtggaaggtg gataacgccc tccaatcggg taactcccag 480

gagagtgtca cagagcagga cagcaaggac agcacctaca gcctcagcag caccctgacg 540

ctgagcaaag cagactacga gaaacacaaa gtctacgcct gcgaagtcac ccatcagggc 600

ctgagctcgc ccgtcacaaa gagcttcaac aggggagagt gc 642

Claims (10)

1.一种包含第一多肽和第二多肽的双特异性抗体，其中所述第一多肽具有SEQ ID NO:1的氨基酸序列，并且所述第二多肽具有SEQ ID NO: 2的氨基酸序列。

2.权利要求1的双特异性抗体，其包含两条第一多肽和两条第二多肽。

3.一种DNA分子，其包含编码具有SEQ ID NO: 1的氨基酸序列的多肽的多核苷酸序列。

4.一种DNA分子，其包含编码具有SEQ ID NO: 1的氨基酸序列的多肽的多核苷酸序列，并且包含编码具有SEQ ID NO: 2的氨基酸序列的多肽的多核苷酸序列。

5.一种包含权利要求4的DNA分子的哺乳动物细胞，其中所述细胞能够表达双特异性抗体，所述双特异性抗体包含具有SEQ ID NO: 1的氨基酸序列的第一多肽和具有SEQ ID NO:2的氨基酸序列的第二多肽。

6.一种用于产生双特异性抗体的方法，其包括在使得所述双特异性抗体被表达的条件下培养权利要求5的哺乳动物细胞，并且回收所述表达的双特异性抗体。

7.一种通过权利要求6的方法产生的双特异性抗体。

8.权利要求2或7的双特异性抗体在制备用于治疗类风湿性关节炎、牛皮癣关节炎或强直性脊柱炎的药物中的用途。

9.权利要求2或7的双特异性抗体在制备用于减少TNF和/或IL-17的水平或生物活性的药物中的用途。

10.一种药物组合物，其包含权利要求2或7的双特异性抗体和一种或多种药学可接受的载体、稀释剂或赋形剂。