CN105272838B - 巨大戟醇提取物的分离纯化方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及巨大戟醇提取物的分离纯化方法，属于中药提取分离领域。本发明所要解决的技术问题是提供巨大戟醇提取物的分离纯化方法。本发明巨大戟醇提取物的分离纯化方法，包括如下步骤：a、将巨大戟醇提取物加碱水解后，加酸中和后，浓缩得到膏状物；b、将步骤a得到的膏状物进行硅胶柱层析分离纯化；c、将步骤b收集得到的巨大戟醇‑乙酸乙酯溶液，减压浓缩，静置析出，过滤得巨大戟醇。本发明操作简单，避免了多步萃取操作，收率得到提高，同时实现了规模化连续生产。并且层析柱B中的硅胶可以重复使用2次以上，一定程度上减少了硅胶使用量和试剂消耗量，可大幅降低生产成本。
Description
技术领域
本发明涉及巨大戟醇提取物的分离纯化方法，属于中药提取分离领域。
背景技术
巨大戟醇(ingenol)是一种四环二萜类天然产物，其结构式如式Ⅰ所示，来源于大戟科大戟属植物，以其为母核的衍生物表现出较好的抗癌、抗HIV等生物活性，其中以巨大戟醇-3-当归酸酯为分子实体的新药Picato已于2012年被FDA批准上市，用于光化性角化病的治疗。
巨大戟醇结构新奇复杂，在过去的30多年里，其独特的结构和活性虽然引起了众多化学家的关注，也有相关全合成的报道，但合成路线大多步骤繁琐，得率低，难以适应日益增长的市场需求；LEO Pharma公司与Scripps Research Institute合作[Science341,878(2013)]，由(+)-3-蒈烯通过14步最终合成得到巨大戟醇，总收率达到1.2％，但其合成路线仍然处于实验室阶段，且合成过程中需要用到剧毒试剂四氧化锇和二氧化硒，该工艺用于放大生产还有待进一步验证。
目前市场上，巨大戟醇仍然主要来源于大戟科植物的提取分离。
中国专利CN 102126941A对提取浸膏采用萃取、反萃取、碱水解、调pH、减压浓缩，然后对浓缩后的浸膏采用硅胶柱层析，结合重结晶手段纯化得到高纯度的巨大戟醇，该方法前期有多次萃取操作，耗时长，转移率低，损失较大，且用到价格昂贵的有毒性的萃取试剂乙腈，成本高，不利于环保，也不适合规模化生产，而且硅胶柱层析采用了石油醚/乙酸乙酯(1:1)洗脱除杂，然后加入乙酸乙酯洗脱，在除杂的过程中由于乙酸乙酯的加入会将部分巨大戟醇化合物带出，降低产率。
专利CN 103694096A对提取浸膏同样采用了萃取操作，萃取物浓缩后先后经过硅胶柱层析和制备液相纯化，最终得到高纯度的巨大戟醇单体，由于千金子药材中巨大戟醇主要以其酯类衍生物形式存在，该纯化工艺未采用水解步骤，因而最终产品收率极低，难以满足规模化生产要求。
专利WO 2013050365 A1中对千金子药材粉末直接加碱搅拌水解，中和后再依次用石油醚和四氢呋喃萃取，然后采用硅胶柱层析纯化得到高纯度的巨大戟醇，该方法虽简化了纯化步骤，但因其用药材粉末直接加碱搅拌水解，无法保证药材里的巨大戟醇衍生物都能浸提出来并水解完全。
上述专利均采用了多步萃取操作，因千金子中富含油类成分，萃取时容易乳化，需大量溶剂多次萃取才能将目标成分萃取完全，萃取效率低，导致提取率低；萃取所用萃取剂石油醚沸点低，减压浓缩回收率低，也在一定程度上增加了生产成本；而且现有技术中柱层析大多采用石油醚和乙酸乙酯混合洗脱剂洗脱，虽然能够有效的除去极性小的杂质，由于混合洗脱剂中乙酸乙酯的加入，目标化合物巨大戟醇也会随着杂质被带出，降低了生产产率。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是提供巨大戟醇提取物的分离纯化方法。
本发明的技术方案：巨大戟醇提取物的分离纯化方法，包括如下步骤：
a、将巨大戟醇提取物加碱水解后，加酸中和，然后浓缩得到膏状物；
b、将步骤a得到的膏状物在硅胶柱层析装置中进行分离纯化，所述硅胶柱层析装置包括层析柱A和层析柱B，层析柱A和层析柱B之间采用三通阀进行连接；硅胶柱层析具体操作如下：调节三通阀，将层析柱A和层析柱B断开连接，在层析柱A中上样，然后，层析柱A采用石油醚洗脱除杂，调节三通阀，使层析柱A和层析柱B连接，向层析柱A中加入乙酸乙酯洗脱，收集巨大戟醇-乙酸乙酯混合液；
c、将步骤b得到的巨大戟醇-乙酸乙酯混合液减压浓缩后，静置析出，过滤得到巨大戟醇。
进一步地，优选步骤a中所述巨大戟醇提取物为大戟科大戟属植物药材采用提取溶剂提取得到；所述提取溶剂为甲醇、乙醇、丙酮、乙醚或氯仿。
进一步地，优选步骤a中所述巨大戟醇提取物的制备方法如下：取大戟科大戟属植物药材，粉碎或切段，按料液比1:5～20w/v加入提取溶剂进行回流提取，提取1～4次，每次0.5～2小时，合并提取液，减压浓缩得巨大戟醇提取物。其中，w/v的单位为kg/L。
进一步地，优选所述大戟科大戟属植物为甘遂、乳浆大戟、千金子或南欧大戟。
进一步地，优选步骤a所述碱水解、酸中和的操作如下：取巨大戟醇提取物，加入甲醇或无水乙醇稀释，甲醇或无水乙醇的体积为巨大戟醇提取物体积的0.5～2倍，加碱水解0.5～24小时，每升混合溶液中碱的含量为5～40g，水解完毕，加酸调节pH至7得到水解液，然后将水解液浓缩得膏状物。
进一步地，优选步骤a中所述碱为氢氧化钠、氢氧化钾、甲醇钠或乙醇钠；所述酸为磷酸、盐酸、醋酸或甲酸。
进一步地，优选步骤b中所述硅胶柱层析操作为：
调节三通阀，将层析柱A和层析柱B断开连接，装填层析柱A和层析柱B，层析柱A采用石油醚洗脱平衡至无气泡，层析柱B采用乙酸乙酯洗脱平衡至无气泡，然后上样，样品装入层析柱A，然后采用石油醚洗脱；洗脱完毕，调节三通阀，使层析柱A和层析柱B连接，向层析柱A中加入乙酸乙酯洗脱，得到巨大戟醇-乙酸乙酯混合液。
进一步地，优选步骤b中所述硅胶柱层析操作为：
调节三通阀，将层析柱A和层析柱B断开连接，层析柱A先装填0～1/2柱体积的层析用硅胶，并用石油醚洗脱平衡至无气泡，层析柱B装填1个柱体积层析用硅胶并用乙酸乙酯洗脱平衡至无气泡，另将拌样硅胶与步骤a得到的膏状物按质量比1～1.5:1混合拌匀，得到样品Ⅰ，取样品Ⅰ装入A柱，上样量为层析柱A柱体积的1/2～1，用2～6个柱体积的石油醚洗脱；然后，调节三通阀，使层析柱A和层析柱B连接，用2～6个柱体积的乙酸乙酯洗脱，收集巨大戟醇-乙酸乙酯混合液；
或调节三通阀，将层析柱A和层析柱B断开连接，层析柱A装填1个柱体积层析用硅胶并用石油醚洗脱平衡至无气泡；层析柱B装填1个柱体积层析用硅胶并用乙酸乙酯洗脱平衡至无气泡，另将步骤a得到的膏状物用石油醚稀释得到样品Ⅱ，石油醚的体积为膏状物体积的0.5～3倍，将1/2～1个柱体积的样品Ⅱ上样至层析柱A，用2～6个柱体积的石油醚洗脱；然后，调节三通阀，使层析柱A和层析柱B连接，用2～6个柱体积的乙酸乙酯洗脱，收集巨大戟醇-乙酸乙酯混合液。
硅胶柱层析中，优选最终收集合并巨大戟醇纯度≥80％的巨大戟醇-乙酸乙酯混合液。纯度是通过高效液相(HPLC)检测的。
进一步地，为了达到更好的柱层析效果，优选步骤b中各洗脱剂的洗脱速度为每小时0.5～5个柱体积。
进一步地，优选所述步骤b完成后，拆出层析柱A中硅胶，保留层析柱B中硅胶，重新装填层析柱A，然后取新的一批步骤a得到的膏状物按照步骤b的操作进行硅胶柱层析分离纯化，进行连续操作。
进一步地，优选步骤b中所述硅胶柱层析装置中层析柱A连接泵；更进一步地，优选湿法上样、洗脱溶剂石油醚或乙酸乙酯采用泵送加入。
硅胶柱层析湿法上样时可通过泵送加入。湿法上样即将膏状物加石油醚稀释后上样，即样品Ⅱ。
进一步地，优选步骤c中所述静置析出，优选在-20～5℃下静置0～24h。
本发明所具有的有益效果如下：
1、操作步骤简单，采用本发明方法石油醚洗脱除杂，然后采用乙酸乙酯洗脱得到目标化合物，不仅可以省去多步萃取操作，并且最终的巨大戟醇的纯度仍能将纯度提高到99.9％，由于萃取步骤的省去，操作更为简单、产品损失少，收率得到提高。
2、水解时间大为缩短，在0.5-24小时内，可大幅缩短产品的生产周期。
3、采用柱切换技术，操作更简单，一次完整的柱层析流程相当于将提取物进行了多次单柱柱层析，而且层析柱B中的硅胶可以重复使用2次以上，一定程度上减少了硅胶使用量和试剂消耗量，可大幅降低生产成本。
4、本发明采用单一洗脱剂石油醚洗脱除杂，然后采用乙酸乙酯洗脱得到目标化合物，采用的单一洗脱剂，洗脱剂易回收。
5、本发明采用附图1的装置，采用泵送加入溶剂，尤其适用于规模化连续生产。
附图说明
图1是本发明用到的装置连接示意图(1为层析柱A，2为层析柱B，3为三通阀，4为泵)；
图2是本发明制备得到的巨大戟醇TLC谱图(展开剂为石油醚:乙酸乙酯1:1；显色剂为2％香草醛-浓硫酸溶液)；
图3是本发明制备得到的巨大戟醇MS谱图；
图4是本发明制备得到的巨大戟醇1H-NMR谱图；
图5是本发明制备得到的巨大戟醇13C-NMR谱图；
图6是本发明制备得到的巨大戟醇HPLC谱图。
具体实施方式
本发明所要解决的技术问题是提供巨大戟醇提取物的分离纯化方法。
本发明的技术方案：巨大戟醇提取物的分离纯化方法，包括如下步骤：
a、将巨大戟醇提取物加碱水解后，加酸中和，然后浓缩得到膏状物；
b、将步骤a得到的膏状物在硅胶柱层析装置中进行分离纯化，所述硅胶柱层析装置包括层析柱A和层析柱B，层析柱A和层析柱B之间采用三通阀进行连接；硅胶柱层析具体操作如下：调节三通阀，将层析柱A和层析柱B断开连接，在层析柱A中上样，然后，层析柱A采用石油醚洗脱除杂，调节三通阀，使层析柱A和层析柱B连接，向层析柱A中加入乙酸乙酯洗脱，收集巨大戟醇-乙酸乙酯混合液；
c、将步骤b得到的巨大戟醇-乙酸乙酯混合液减压浓缩后，静置析出，过滤得到巨大戟醇。
进一步地，优选步骤a中所述巨大戟醇提取物为大戟科大戟属植物药材采用提取溶剂提取得到；所述提取溶剂为甲醇、乙醇、丙酮、乙醚或氯仿。
进一步地，优选步骤a中所述巨大戟醇提取物的制备方法如下：取大戟科大戟属植物药材，粉碎或切段，按料液比1:5～20w/v加入提取溶剂进行回流提取，提取1～4次，每次0.5～2小时，合并提取液，减压浓缩得巨大戟醇提取物。
其中，w/v的单位为kg/L。
进一步地，优选所述大戟科大戟属植物为甘遂、乳浆大戟、千金子或南欧大戟。
进一步地，优选步骤a所述碱水解、酸中和的操作如下：取巨大戟醇提取物，加入甲醇或无水乙醇稀释，甲醇或无水乙醇的体积为巨大戟醇提取物体积的0.5～2倍，加碱水解0.5～24小时，每升混合溶液中碱的含量为5～40g，水解完毕，加酸调节pH至7得到水解液，然后将水解液浓缩得膏状物。
进一步地，优选步骤a中所述碱为氢氧化钠、氢氧化钾、甲醇钠或乙醇钠；所述酸为磷酸、盐酸、醋酸或甲酸。
进一步地，优选步骤b中所述硅胶柱层析操作为：
调节三通阀，将层析柱A和层析柱B断开连接，装填层析柱A和层析柱B，层析柱A采用石油醚洗脱平衡至无气泡，层析柱B采用乙酸乙酯洗脱平衡至无气泡，然后上样，样品装入层析柱A，然后采用石油醚洗脱；洗脱完毕，调节三通阀，使层析柱A和层析柱B连接，向层析柱A中加入乙酸乙酯洗脱，得到巨大戟醇-乙酸乙酯混合液。
进一步地，优选步骤b中所述硅胶柱层析操作为：
调节三通阀，将层析柱A和层析柱B断开连接，层析柱A先装填0～1/2柱体积的层析用硅胶，并用石油醚洗脱平衡至无气泡，层析柱B装填1个柱体积层析用硅胶并用乙酸乙酯洗脱平衡至无气泡，另将拌样硅胶与步骤a得到的膏状物按质量比1～1.5:1混合，得到样品Ⅰ，取样品Ⅰ装入A柱，上样量为层析柱A柱体积的1/2～1，用2～6个柱体积的石油醚洗脱；然后，调节三通阀，使层析柱A和层析柱B连接，用2～6个柱体积的乙酸乙酯洗脱，收集巨大戟醇-乙酸乙酯混合液；
或调节三通阀，将层析柱A和层析柱B断开连接，层析柱A装填1个柱体积层析用硅胶并用石油醚洗脱平衡至无气泡；层析柱B装填1个柱体积层析用硅胶并用乙酸乙酯洗脱平衡至无气泡，另将步骤a得到的膏状物用石油醚稀释得到样品Ⅱ，石油醚的体积为膏状物体积的0.5～3倍，将1/2～1个柱体积的样品Ⅱ上样至层析柱A，用2～6个柱体积的石油醚洗脱；然后，调节三通阀，使层析柱A和层析柱B连接，用2～6个柱体积的乙酸乙酯洗脱，收集巨大戟醇-乙酸乙酯混合液。
硅胶柱层析中，优选最终收集合并巨大戟醇纯度≥80％的巨大戟醇-乙酸乙酯混合液。纯度是通过高效液相(HPLC)检测的。
进一步地，为了达到更好的柱层析效果，优选步骤b中各洗脱剂的洗脱速度为每小时0.5～5个柱体积。
进一步地，优选所述步骤b完成后，拆出层析柱A中硅胶，保留层析柱B中硅胶，重新装填层析柱A，然后取新的一批步骤a得到的膏状物按照步骤b的操作进行硅胶柱层析分离纯化，进行连续操作。
进一步地，优选步骤b中所述硅胶柱层析装置中层析柱A连接泵；更进一步地，优选湿法上样、洗脱溶剂石油醚或乙酸乙酯采用泵送加入。
硅胶柱层析湿法上样时可通过泵送加入。湿法上样即将膏状物加石油醚稀释后上样，即样品Ⅱ。
进一步地，优选步骤c中所述静置析出，优选在-20～5℃下静置0～24h。
下面结合实施例对本发明的具体实施方式做进一步的描述，并不因此将本发明限制在所述的实施例范围之中。
实施例1 巨大戟醇提取物的分离纯化方法
取甘遂饮片10kg，采用体积百分比浓度为95％的乙醇回流提取3次。第一次加入100L回流提取2小时，第二次加入80L回流提取1小时，第三次加入80L回流提取1小时，合并提取液，减压浓缩至浸膏状；
上述提取浸膏加甲醇稀释至5L，搅匀使充分溶解，然后加入25g氢氧化钾,，搅拌水解12小时，然后加盐酸调节pH至7以终止水解，水解液减压浓缩至浸膏状；
选取同等规格的层析柱A和B(10×100cm)，按图1所示连接，先调节三通阀，使层析柱A和B断开连接，层析柱B预装1.2kg层析用硅胶，并用乙酸乙酯洗脱平衡至无气泡，层析柱A预装600g层析用硅胶，并用石油醚洗脱平衡至无气泡，取1/2体积的上述浸膏加拌样硅胶350g拌样，烘干，将烘干的样品上样于层析柱A中，采用3个柱体积石油醚洗脱以除去非极性杂质；然后调节三通阀，使层析柱A和B串联，换4个柱体积乙酸乙酯洗脱；待巨大戟醇全部洗脱下来，拆出层析柱A中硅胶，保留层析柱B中填料，采用同样方法将剩余的浸膏拌样，上样洗脱，收集合并巨大戟醇洗脱部位；
将上述巨大戟醇部位减压浓缩后，置冰箱-5℃条件下24小时，析出，过滤，得到巨大戟醇晶体2.3g，经高效液相检测纯度达到99.9％以上。
实施例2 巨大戟醇提取物的分离纯化方法
取千金子50kg，碾碎，用甲醇回流提取3次。第一次加入400L回流提取2小时，第二次加入300L回流提取1.5小时，第三次加入300L回流提取1.5小时，合并提取液，减压浓缩至浸膏状；
上述提取浸膏加无水乙醇稀释至30L，搅匀使充分溶解，然后加入300g氢氧化钠，搅拌水解16小时，然后加磷酸调节pH至7以终止水解，水解液减压浓缩至浸膏状；
选取同等规格的层析柱A和B(20×60cm)，按图1所示连接，先调节三通阀，使层析柱A和B断开连接，层析柱B预装10kg层析用硅胶，并用乙酸乙酯洗脱平衡至无气泡，层析柱A预装10kg层析用硅胶，并用石油醚洗脱平衡至无气泡，取1/2上述浸膏加石油醚10L稀释溶解，将溶解好的样品上样于层析柱A中，采用5个柱体积石油醚洗脱以除去非极性杂质，调节三通阀，使层析柱A和B串联，换6个柱体积乙酸乙酯洗脱；待巨大戟醇全部洗脱下来，拆出层析柱A中硅胶，保留层析柱B中填料，采用同样方法将剩余的浸膏稀释溶解，上样洗脱，收集合并巨大戟醇洗脱部位；
将上述巨大戟醇部位减压浓缩后，置冰箱-5℃条件下24小时，析出，过滤，得到巨大戟醇晶体11g，经高效液相检测纯度达到99.9％以上。
实施例3 巨大戟醇提取物的分离纯化方法
取千金子200kg，碾碎，用甲醇回流提取3次。第一次加入1600L回流提取2小时，第二次加入1200L回流提取1.5小时，第三次加入1200L回流提取1.5小时，合并提取液，减压浓缩至浸膏状；
上述提取浸膏加甲醇稀释至80L，搅匀使充分溶解，然后加入2.4kg甲醇钠,搅拌水解16小时，然后加盐酸调节pH至7以终止水解，水解液减压浓缩至浸膏状；
选取同等规格的层析柱A和B(23×150cm)，按图1所示连接，先调节三通阀，使层析柱A和B断开连接，层析柱B预装20kg硅胶，并用乙酸乙酯洗脱平衡，层析柱A预装10kg硅胶，并用石油醚洗脱平衡，取1/2体积的上述浸膏加硅胶6kg拌样，烘干，将烘干的样品上样于层析柱A中，采用5个柱体积石油醚洗脱以除去非极性杂质；然后调节三通阀，使层析柱A和B串联，换6个柱体积乙酸乙酯洗脱；待巨大戟醇全部洗脱下来，拆出层析柱A中硅胶，保留层析柱B中填料，重新装填层析柱A，采用同样方法将剩余的一半浸膏拌样，上柱，洗脱，收集合并巨大戟醇洗脱部位；
将上述巨大戟醇部位减压浓缩后，置冰箱-5℃条件下24小时，析出，过滤，得到巨大戟醇晶体45g，经高效液相检测纯度达到99.9％以上。
实施例4 巨大戟醇提取物的分离纯化方法
取千金子300kg，碾碎，采用体积百分比浓度为95％的乙醇回流提取3次。第一次加入3000L回流提取2小时，第二次加入2400L回流提取1.5小时，第三次加入2400L回流提取1.5小时，合并提取液，减压浓缩至浸膏状；
上述提取浸膏加甲醇稀释至150L，搅匀使充分溶解，然后加入6kg氢氧化钠，搅拌水解16小时，然后加磷酸调节pH至7以终止水解，水解液减压浓缩至浸膏状；
选取同等规格的层析柱A和B(23×150cm)，按图1所示连接，先调节三通阀，使层析柱A和B断开连接，层析柱B预装20kg硅胶，并用乙酸乙酯洗脱平衡，层析柱A预装20kg硅胶，并用石油醚洗脱平衡，取1/3体积的上述浸膏加石油醚稀释1.5倍使溶解，将溶解好的样品上样于层析柱A中，采用4个柱体积的石油醚洗脱以除去非极性杂质；然后，调节三通阀，使层析柱A和B串联，换5个柱体积的乙酸乙酯洗脱；待巨大戟醇全部洗脱下来，拆出层析柱A中硅胶，保留层析柱B中填料，重新装填层析柱A，采用同样方法将剩余的浸膏分2次稀释溶解，上样，洗脱，收集合并巨大戟醇洗脱部位；
将上述巨大戟醇部位减压浓缩后，置冰箱-5℃条件下24小时，析出，过滤，得到巨大戟醇晶体72g，经高效液相检测纯度达到99.9％以上。
实施例5 巨大戟醇提取物的分离纯化方法
取乳浆大戟300kg，切段，采用体积百分比浓度为95％的乙醇回流提取3次。第一次加入3000L回流提取2小时，第二次加入2400L回流提取1.5小时，第三次加入2400L回流提取1.5小时，合并提取液，减压浓缩至浸膏状；
上述提取浸膏加甲醇稀释至150L，搅匀使充分溶解，然后加入6kg氢氧化钠，搅拌水解16小时，然后加磷酸调节pH至7以终止水解，水解液减压浓缩至浸膏状；
选取同等规格的层析柱A和B(23×150cm)，按图1所示连接，先调节三通阀，使层析柱A和B断开连接，层析柱B预装20kg硅胶，并用乙酸乙酯洗脱平衡，层析柱A预装20kg硅胶，并用石油醚洗脱平衡，取1/3体积的上述浸膏加石油醚稀释1.5倍使溶解，将溶解好的样品上样于层析柱A中，采用4个柱体积的石油醚洗脱以除去非极性杂质；然后，调节三通阀，使层析柱A和B串联，换5个柱体积的乙酸乙酯洗脱；待巨大戟醇全部洗脱下来，拆出层析柱A中硅胶，保留层析柱B中填料，重新装填层析柱A，采用同样方法将剩余的浸膏分2次稀释溶解，上样，洗脱，收集合并巨大戟醇洗脱部位；
将上述巨大戟醇部位减压浓缩后，置冰箱-5℃条件下24小时，析出，过滤，得到巨大戟醇晶体70g，经高效液相检测纯度达到99.9％以上。
实施例6 巨大戟醇提取物的分离纯化方法
取南欧大戟300kg，切段，采用体积百分比浓度为95％的乙醇回流提取3次。第一次加入3000L回流提取2小时，第二次加入2400L回流提取1.5小时，第三次加入2400L回流提取1.5小时，合并提取液，减压浓缩至浸膏状；
上述提取浸膏加甲醇稀释至150L，搅匀使充分溶解，然后加入6kg氢氧化钠，搅拌水解16小时，然后加磷酸调节pH至7以终止水解，水解液减压浓缩至浸膏状；
选取同等规格的层析柱A和B(23×150cm)，按图1所示连接，先调节三通阀，使层析柱A和B断开连接，层析柱B预装20kg硅胶，并用乙酸乙酯洗脱平衡，层析柱A预装20kg硅胶，并用石油醚洗脱平衡，取1/3体积的上述浸膏加石油醚稀释1.5倍使溶解，将溶解好的样品上样于层析柱A中，采用4个柱体积的石油醚洗脱以除去非极性杂质；然后，调节三通阀，使层析柱A和B串联，换5个柱体积的乙酸乙酯洗脱；待巨大戟醇全部洗脱下来，拆出层析柱A中硅胶，保留层析柱B中填料，重新装填层析柱A，采用同样方法将剩余的浸膏分2次稀释溶解，上样，洗脱，收集合并巨大戟醇洗脱部位；
将上述巨大戟醇部位减压浓缩后，置冰箱-5℃条件下24小时，析出，过滤，得到巨大戟醇晶体76g，经高效液相检测纯度达到99.9％以上。
上述原料甘遂、千金子、乳浆大戟和南欧大戟均为成都市荷花池药材市场购买所得。
Claims (24)
1.巨大戟醇提取物的分离纯化方法，其特征在于：包括如下步骤：
a、将巨大戟醇提取物加碱水解后，加酸中和，然后浓缩得到膏状物；
b、将步骤a得到的膏状物在硅胶柱层析装置中进行分离纯化，所述硅胶柱层析装置包括层析柱A和层析柱B，层析柱A和层析柱B之间采用三通阀进行连接；硅胶柱层析具体操作如下：调节三通阀，将层析柱A和层析柱B断开连接，在层析柱A中上样，然后，层析柱A采用石油醚洗脱除杂，调节三通阀，使层析柱A和层析柱B连接，向层析柱A中加入乙酸乙酯洗脱，收集巨大戟醇-乙酸乙酯混合液；
c、将步骤b得到的巨大戟醇-乙酸乙酯混合液减压浓缩后，静置析出，过滤得到巨大戟醇；
其中，步骤a中所述巨大戟醇提取物为大戟科大戟属植物药材采用提取溶剂提取得到；所述提取溶剂为甲醇、乙醇、丙酮、乙醚或氯仿；
步骤a所述碱水解、酸中和的操作如下：取巨大戟醇提取物，加入甲醇或无水乙醇稀释，甲醇或无水乙醇的体积为巨大戟醇提取物体积的0.5～2倍，加碱水解0.5～24小时，每升混合溶液中碱的含量为5～40g，水解完毕，加酸调节pH至7得到水解液，然后将水解液浓缩得膏状物。
2.根据权利要求1所述的巨大戟醇提取物的分离纯化方法，其特征在于：步骤a中所述巨大戟醇提取物的制备方法如下：取大戟科大戟属植物药材，粉碎或切段，按料液比1:5～20w/v加入提取溶剂进行回流提取，提取1～4次，每次0.5～2小时，合并提取液，减压浓缩得巨大戟醇提取物。
3.根据权利要求2所述的巨大戟醇提取物的分离纯化方法，其特征在于：所述大戟科大戟属植物为甘遂、乳浆大戟、千金子或南欧大戟。
4.根据权利要求1～3任一项所述的巨大戟醇提取物的分离纯化方法，其特征在于：步骤a中所述碱为氢氧化钠、氢氧化钾、甲醇钠或乙醇钠；所述酸为磷酸、盐酸、醋酸或甲酸。
5.根据权利要求1～3任一项所述的巨大戟醇提取物的分离纯化方法，其特征在于：步骤b中所述硅胶柱层析操作为：
调节三通阀，将层析柱A和层析柱B断开连接，装填层析柱A和层析柱B，层析柱A采用石油醚洗脱平衡至无气泡，层析柱B采用乙酸乙酯洗脱平衡至无气泡，然后上样，样品装入层析柱A，然后采用石油醚洗脱；洗脱完毕，调节三通阀，使层析柱A和层析柱B连接，向层析柱A中加入乙酸乙酯洗脱，得到巨大戟醇-乙酸乙酯混合液。
6.根据权利要求4所述的巨大戟醇提取物的分离纯化方法，其特征在于：步骤b中所述硅胶柱层析操作为：
调节三通阀，将层析柱A和层析柱B断开连接，装填层析柱A和层析柱B，层析柱A采用石油醚洗脱平衡至无气泡，层析柱B采用乙酸乙酯洗脱平衡至无气泡，然后上样，样品装入层析柱A，然后采用石油醚洗脱；洗脱完毕，调节三通阀，使层析柱A和层析柱B连接，向层析柱A中加入乙酸乙酯洗脱，得到巨大戟醇-乙酸乙酯混合液。
7.根据权利要求1～3或6任一项所述的巨大戟醇提取物的分离纯化方法，其特征在于：步骤b中各洗脱剂的洗脱速度为每小时0.5～5个柱体积。
8.根据权利要求4所述的巨大戟醇提取物的分离纯化方法，其特征在于：步骤b中各洗脱剂的洗脱速度为每小时0.5～5个柱体积。
9.根据权利要求5所述的巨大戟醇提取物的分离纯化方法，其特征在于：步骤b中各洗脱剂的洗脱速度为每小时0.5～5个柱体积。
10.根据权利要求1～3、6、8或9任一项所述的巨大戟醇提取物的分离纯化方法，其特征在于：所述步骤b完成后，拆出层析柱A中硅胶，保留层析柱B中硅胶，重新装填层析柱A，然后取新的一批步骤a得到的膏状物按照步骤b的操作进行硅胶柱层析分离纯化，进行连续操作。
11.根据权利要求4所述的巨大戟醇提取物的分离纯化方法，其特征在于：所述步骤b完成后，拆出层析柱A中硅胶，保留层析柱B中硅胶，重新装填层析柱A，然后取新的一批步骤a得到的膏状物按照步骤b的操作进行硅胶柱层析分离纯化，进行连续操作。
12.根据权利要求5所述的巨大戟醇提取物的分离纯化方法，其特征在于：所述步骤b完成后，拆出层析柱A中硅胶，保留层析柱B中硅胶，重新装填层析柱A，然后取新的一批步骤a得到的膏状物按照步骤b的操作进行硅胶柱层析分离纯化，进行连续操作。
13.根据权利要求7所述的巨大戟醇提取物的分离纯化方法，其特征在于：所述步骤b完成后，拆出层析柱A中硅胶，保留层析柱B中硅胶，重新装填层析柱A，然后取新的一批步骤a得到的膏状物按照步骤b的操作进行硅胶柱层析分离纯化，进行连续操作。
14.根据权利要求1～3、6、8、9或11～13任一项所述的巨大戟醇提取物的分离纯化方法，其特征在于：步骤b中所述硅胶柱层析装置中层析柱A连接泵，湿法上样、洗脱溶剂石油醚或乙酸乙酯均采用泵送加入。
15.根据权利要求4所述的巨大戟醇提取物的分离纯化方法，其特征在于：步骤b中所述硅胶柱层析装置中层析柱A连接泵，湿法上样、洗脱溶剂石油醚或乙酸乙酯均采用泵送加入。
16.根据权利要求5所述的巨大戟醇提取物的分离纯化方法，其特征在于：步骤b中所述硅胶柱层析装置中层析柱A连接泵，湿法上样、洗脱溶剂石油醚或乙酸乙酯均采用泵送加入。
17.根据权利要求7所述的巨大戟醇提取物的分离纯化方法，其特征在于：步骤b中所述硅胶柱层析装置中层析柱A连接泵，湿法上样、洗脱溶剂石油醚或乙酸乙酯均采用泵送加入。
18.根据权利要求10所述的巨大戟醇提取物的分离纯化方法，其特征在于：步骤b中所述硅胶柱层析装置中层析柱A连接泵，湿法上样、洗脱溶剂石油醚或乙酸乙酯均采用泵送加入。
19.根据权利要求1～3、6、8、9、11～13或15～18任一项所述的巨大戟醇提取物的分离纯化方法，其特征在于：步骤c中所述静置析出在-20～5℃下静置，0＜静置时间≤24h。
20.根据权利要求4所述的巨大戟醇提取物的分离纯化方法，其特征在于：步骤c中所述静置析出在-20～5℃下静置，0＜静置时间≤24h。
21.根据权利要求5所述的巨大戟醇提取物的分离纯化方法，其特征在于：步骤c中所述静置析出在-20～5℃下静置，0＜静置时间≤24h。
22.根据权利要求7所述的巨大戟醇提取物的分离纯化方法，其特征在于：步骤c中所述静置析出在-20～5℃下静置，0＜静置时间≤24h。
23.根据权利要求10所述的巨大戟醇提取物的分离纯化方法，其特征在于：步骤c中所述静置析出在-20～5℃下静置，0＜静置时间≤24h。
24.根据权利要求14所述的巨大戟醇提取物的分离纯化方法，其特征在于：步骤c中所述静置析出在-20～5℃下静置，0＜静置时间≤24h。
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