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CN105263961A - 用于预防、诊断或者治疗癌症或血管发生相关疾病的抗vegf抗体和含有所述抗体的药物组合物 - Google Patents

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CN105263961A CN201480030403.9A CN201480030403A CN105263961A CN 105263961 A CN105263961 A CN 105263961A CN 201480030403 A CN201480030403 A CN 201480030403A CN 105263961 A CN105263961 A CN 105263961A
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Abstract

本发明涉及：对血管内皮生长因子(VEGF)具有强结合亲和力并能够体内抑制肿瘤生长的新抗VEGF抗体；以及包含所述抗体的用于治疗癌症的组合物。本发明的抗体表现出对人VEGF和小鼠VEGF的明显结合特性，抑制人脐静脉内皮细胞(HUVEC)的增殖和渗透性并可阻抑肿瘤生长，因此可用作用于治疗癌症的抗体。

Description

用于预防、诊断或者治疗癌症或血管发生相关疾病的抗VEGF抗体和含有所述抗体的药物组合物
技术领域
本发明涉及：与血管内皮生长因子(VEGF)结合的新抗体，以及包含所述新抗体的药物组合物；所述新抗体具有对VEGF的强结合亲和力并因此可用于治疗癌症或血管发生相关疾病。
背景技术
众所周知，血管发生参与多种疾病的发病机制，所述疾病包括实体瘤、与眼的新血管生成有关的增殖性视网膜病变或年龄相关的黄斑变性(AMD)等。
已经在对血管发生的研究中鉴定了多种诱导因子，例如aFGF、bFGF、TGF-α、TGF-β、HGF、TNF-β和血管生成素。血管发生抑制剂可包括血小板反应蛋白(thrombospondin)(16kDa的促乳素N端片段(Clapp等，Endocrinology，133：1292-1299(1993))、制管张素(angiostatin)和内皮抑制素(endostatin)等。
诱导还是抑制血管发生取决于血管发生诱导物和抑制物之间的平衡(folkman，J，等，J.Biol.Chem.，267，10931-10934(1992))。
在血管发生诱导物中，血管内皮生长因子(vascularendothelialgrowthfactor，VEGF)参与血管和淋巴管的发育和稳态，并且还对神经细胞表现出显著作用。在低氧情况下或者响应于通过细胞生长因子(例如TGF、白细胞介素和PDGF)的刺激，主要在血管内皮细胞、造血细胞和基质细胞中产生VEGF。VEGF与VEGF受体结合，并且VEGF的每一种同种型结合特异性受体，这诱导受体的同源或异源缀合物形成，从而活化每个信号转导通路(KarsanA.，IntJ.Mol.Med.，5(5)：447-56(2000))。VEGF受体的信号转导特异性受到共同受体(例如神经毡蛋白(neuriphilin)、硫酸肝素(heparinsulfate)、整联蛋白(integrin)、钙黏着蛋白(cadherin)等)更精细的调节(ZacharyIC，等，Mol.Biol.Cell.，22(15)：2766-76(2011))。已知VEGF是肿瘤和眼中血管发生相关疾病的重要介体。另外，在被调查的大多数对象中，肿瘤过表达VEGFmRNA(Berkman等，J.Clin.Invest.，91：153-159(1993))。由于癌症为了其生长需要新的毛细血管作为用于营养物供应和废物排出的通道以用于其成长，癌症细胞及其基质细胞持续分泌VEGF，其扩散到整个组织并刺激血管内皮细胞的迁移(Ferrara.N等，Nat.Rev.Cancer，2：795-803，(2002))。与正常形成的毛细血管相比，由癌症细胞诱导的新脉管系统的特征在于不完整，因为它们独立于周围的细胞。尽管VEGF与受体VEGFR1、VEGFR2和VEGFR3结合，但VEGF通过VEGFR2来递送信号，从而导致内皮细胞的增殖、迁移和渗透性(ZengH.等，J.Biol.Chem.，276：26969-26976(2001))。因此，通过使用靶向VEGF的药物控制血管发生，可治疗癌细胞的增殖以及与血管发生相关的疾病。其中，与VEGF结合的抗体可用于药物，其经历人源化过程以提高对VEGF的结合亲和力并降低抗体的免疫原性。人源化的抗体描述于文献(Bending，Methods：Comp.Meth.Enzy.，8：83-93(1995))中。抗VEGF中和抗体在裸鼠中阻抑多种人肿瘤细胞系的生长(Kim等，Nature.，362：841-844(1993)；Warren等，J.Clin.Invest.，95：1789-1797(1995)；Borgstroem等，CancerRes.，56：4032-4039(1996)；和Melnyk等，CancerRes.，56：921-924(1996))，并在视网膜的缺血性血管病症模型中阻抑眼内血管发生(Adamis等，Arch.Ophtalmol.，114：66-71(1996))。抗VEGF抗体可以以有效降低VEGF之活性的浓度局部地施用到眼中。这样的缺血性视网膜病症可包括糖尿病性视网膜病变或年龄相关的黄斑变性。
目前所开发的抗VEGF中和抗体包括贝伐单抗(bevacizumab，阿瓦斯汀(AvastinTM)，Genentech/Roche)，其被FDA于2004年2月批准用于结肠直肠癌。贝伐单抗的适应症已经拓展至总共六种类型的进行性肿瘤的治疗，所述肿瘤包括转移性结肠直肠癌和进行性卵巢癌。另外，设计成与VEGF结合的阿柏西普(Aflibercept)(BayerHealthCare)的上市许可申请于2011年被FDA批准用于黄斑变性的治疗。然而，FDA于2011年撤回了阿瓦斯汀的乳腺癌相关适应症，因为与安慰剂相比，其未能在乳腺癌患者中表现出总生存率的显著提高。随后的报告指出，阿瓦斯汀提高了乳腺癌患者中心力衰竭的风险，表明需要改进之前开发的抗VEGF中和抗体，并需要确定其在临床前阶段的精确功效。因为阿瓦斯汀不结合小鼠VEGF，所以难以准确确定其在使用小鼠的临床前模型中的功效。因此，本发明的一个目的是开发与小鼠VEGF和人VEGF二者结合的抗体，从而获得临床前模型中结果的可靠性；以及提高抗体对VEGF的结合亲和力，从而改进抗肿瘤效果。
通过生物淘选和亲和力提高，本发明人已经开发了包含之前未知的新互补决定区(CDR)的抗体，并且通过其与VEGF的特异性结合所述抗体能够治疗肿瘤和多种眼内新生血管性病症。
发明概述
因此，本发明的一个目的是提供特异性结合VEGF的抗体。
本发明的另一个目的是提供包含上述抗体的药物组合物。
为实现本发明如上所述的目的，提供了与血管内皮生长因子(VEGF)结合的抗体，所述抗体包含：
1)轻链可变区，其包含互补决定区(CDR)1、CDR2和CDR3，其中CDR2由SEQIDNO1的氨基酸序列示出；并且CDR3由SEQIDNO2的氨基酸序列示出；以及
2)重链可变区，其包含CDR1、CDR2和CDR3，其中所述CDR3由SEQIDNO3的氨基酸序列示出。
为实现本发明如上所述的另一个目的，提供了包含上述抗体的药物组合物，其用于预防、诊断或者治疗由VEGF过表达引起的血管发生相关病症或癌症。
本发明的抗体表现出对人VEGF和小鼠VEGF的明显结合特性，阻抑人脐静脉内皮细胞(HUVEC)的增殖和渗透性并抑制肿瘤生长，因此可用作用于预防、诊断或者治疗癌症或血管发生相关病症的抗体。
附图说明
当结合附图时，根据本发明的以下描述，本发明的以上以及其他目的和特征将变得明显。
图1示出克隆HF2-11与VEGF的结合与解离的传感图。
图2是示出本发明抗体抑制VEGF与VEGFR2之结合，而不抑制VEGF与VEGFR1之结合的图。
图3是示出本发明抗体与人和小鼠VEGF-A特异性结合的图。
图4示出HF2-11克隆的SDS-PAGE结果。
图5示出抗体HF2-4的重链(a)和轻链(b)的质量分析结果。
图6示出HF2-8克隆的尺寸排阻色谱法(SEC)的结果。
图7和8示出通过ELISA测量的本发明抗体和阿瓦斯汀与人和小鼠VEGF抗体的结合特性的结果。
图9示出本发明抗体和阿瓦斯汀对人脐静脉内皮细胞(HUVEC)增殖之阻抑活性的测试结果。
图10示出本发明抗体(a)和阿瓦斯汀(b)对HUVEC渗透性之阻抑活性的测试结果。
图11示出本发明抗体对HUVEC迁移之阻抑活性的测试结果。
图12示出本发明抗体在植入HT29的动物模型中对肿瘤生长的抑制活性。
图13示出本发明抗体对脉络膜血管发生的阻抑活性。
发明详述
在本发明中，提供了与VEGF结合的抗体(下文称作“抗VEGF抗体”)，所述抗体包含1)轻链可变区，其包含CDR1、CDR2和CDR3，其中所述CDR2由SEQIDNO1的氨基酸序列示出；并且CDR3由SEQIDNO2的氨基酸序列示出；以及2)重链可变区，其包含CDR1、CDR2和CDR3，其中所述CDR3由SEQIDNO3的氨基酸序列示出。
在下表1中示出根据本发明之抗体的轻链可变区的CDR1、CDR2和CDR3(下文分别称作LCDR1、LCDR2和LCDR3)的氨基酸序列；以及根据本发明之抗体的重链可变区的CDR1、CDR2和CDR3(下文分别称作HCDR1、HCDR2和HCDR3)的氨基酸序列的列表。
[表1]轻链和重链可变区的CDR1、CDR2和CDR3的氨基酸序列
根据本发明的与VEGF结合的抗体可包含：1)轻链可变区，其包含选自SEQIDNO4至14的氨基酸序列示出的CDR1、由SEQIDNO1的氨基酸序列示出的CDR2和由SEQIDNO2的氨基酸序列示出的CDR3；以及2)重链可变区，其包含由选自SEQIDNO15至34的氨基酸序列示出的CDR1、由选自SEQIDNO35至50的氨基酸序列示出的CDR2和由SEQIDNO3的氨基酸序列示出的CDR3。
根据本发明的一个实施方案的抗VEGF抗体可包含：1)轻链可变区，其包含由SEQIDNO4的氨基酸序列示出的CDR1、由SEQIDNO1的氨基酸序列示出的CDR2和由SEQIDNO2的氨基酸序列示出的CDR3；以及2)重链可变区，其包含由SEQIDNO15的氨基酸序列示出的CDR1、由SEQIDNO35的氨基酸序列示出的CDR2和由SEQIDNO3的氨基酸序列示出的CDR3。
根据本发明的一个实施方案的抗VEGF抗体可包含：1)轻链可变区，其包含由SEQIDNO5的氨基酸序列示出的CDR1、由SEQIDNO1的氨基酸序列示出的CDR2和由SEQIDNO2的氨基酸序列示出的CDR3；以及2)重链可变区，其包含由SEQIDNO16的氨基酸序列示出的CDR1、由SEQIDNO36的氨基酸序列示出的CDR2和由SEQIDNO3的氨基酸序列示出的CDR3。
根据本发明的一个实施方案的抗VEGF抗体可包含：1)轻链可变区，其包含由SEQIDNO5的氨基酸序列示出的CDR1、由SEQIDNO1的氨基酸序列示出的CDR2和由SEQIDNO2的氨基酸序列示出的CDR3；以及2)重链可变区，其包含由SEQIDNO17的氨基酸序列示出的CDR1、由SEQIDNO37的氨基酸序列示出的CDR2和由SEQIDNO3的氨基酸序列示出的CDR3。
根据本发明的一个实施方案的抗VEGF抗体可包含：1)轻链可变区，其包含由SEQIDNO5的氨基酸序列示出的CDR1、由SEQIDNO1的氨基酸序列示出的CDR2和由SEQIDNO2的氨基酸序列示出的CDR3；以及2)重链可变区，其包含由SEQIDNO18的氨基酸序列示出的CDR1、由SEQIDNO38的氨基酸序列示出的CDR2和由SEQIDNO3的氨基酸序列示出的CDR3。
根据本发明的一个实施方案的抗VEGF抗体可包含：1)轻链可变区，其包含由SEQIDNO5的氨基酸序列示出的CDR1、由SEQIDNO1的氨基酸序列示出的CDR2和由SEQIDNO2的氨基酸序列示出的CDR3；以及2)重链可变区，其包含由SEQIDNO19的氨基酸序列示出的CDR1、由SEQIDNO39的氨基酸序列示出的CDR2和由SEQIDNO3的氨基酸序列示出的CDR3。
根据本发明的一个实施方案的抗VEGF抗体可包含：1)轻链可变区，其包含由SEQIDNO5的氨基酸序列示出的CDR1、由SEQIDNO1的氨基酸序列示出的CDR2和由SEQIDNO2的氨基酸序列示出的CDR3；以及2)重链可变区，其包含由SEQIDNO20的氨基酸序列示出的CDR1、由SEQIDNO40的氨基酸序列示出的CDR2和由SEQIDNO3的氨基酸序列示出的CDR3。
根据本发明的一个实施方案的抗VEGF抗体可包含：1)轻链可变区，其包含由SEQIDNO6的氨基酸序列示出的CDR1、由SEQIDNO1的氨基酸序列示出的CDR2和由SEQIDNO2的氨基酸序列示出的CDR3；以及2)重链可变区，其包含由SEQIDNO21的氨基酸序列示出的CDR1、由SEQIDNO38的氨基酸序列示出的CDR2和由SEQIDNO3的氨基酸序列示出的CDR3。
根据本发明的一个实施方案的抗VEGF抗体可包含：1)轻链可变区，其包含由SEQIDNO6的氨基酸序列示出的CDR1、由SEQIDNO1的氨基酸序列示出的CDR2和由SEQIDNO2的氨基酸序列示出的CDR3；以及2)重链可变区，其包含由SEQIDNO22的氨基酸序列示出的CDR1、由SEQIDNO38的氨基酸序列示出的CDR2和由SEQIDNO3的氨基酸序列示出的CDR3。
根据本发明的一个实施方案的抗VEGF抗体可包含：1)轻链可变区，其包含由SEQIDNO7的氨基酸序列示出的CDR1、由SEQIDNO1的氨基酸序列示出的CDR2和由SEQIDNO2的氨基酸序列示出的CDR3；以及2)重链可变区，其包含由SEQIDNO23的氨基酸序列示出的CDR1、由SEQIDNO41的氨基酸序列示出的CDR2和由SEQIDNO3的氨基酸序列示出的CDR3。
根据本发明的一个实施方案的抗VEGF抗体可包含：1)轻链可变区，其包含由SEQIDNO6的氨基酸序列示出的CDR1、由SEQIDNO1的氨基酸序列示出的CDR2和由SEQIDNO2的氨基酸序列示出的CDR3；以及2)重链可变区，其包含由SEQIDNO24的氨基酸序列示出的CDR1、由SEQIDNO38的氨基酸序列示出的CDR2和由SEQIDNO3的氨基酸序列示出的CDR3。
根据本发明的一个实施方案的抗VEGF抗体可包含：1)轻链可变区，其包含由SEQIDNO6的氨基酸序列示出的CDR1、由SEQIDNO1的氨基酸序列示出的CDR2和由SEQIDNO2的氨基酸序列示出的CDR3；以及2)重链可变区，其包含由SEQIDNO25的氨基酸序列示出的CDR1、由SEQIDNO38的氨基酸序列示出的CDR2和由SEQIDNO3的氨基酸序列示出的CDR3。
根据本发明的一个实施方案的抗VEGF抗体可包含：1)轻链可变区，其包含由SEQIDNO8的氨基酸序列示出的CDR1、由SEQIDNO1的氨基酸序列示出的CDR2和由SEQIDNO2的氨基酸序列示出的CDR3；以及2)重链可变区，其包含由SEQIDNO26的氨基酸序列示出的CDR1、由SEQIDNO42的氨基酸序列示出的CDR2和由SEQIDNO3的氨基酸序列示出的CDR3。
根据本发明的一个实施方案的抗VEGF抗体可包含：1)轻链可变区，其包含由SEQIDNO6的氨基酸序列示出的CDR1、由SEQIDNO1的氨基酸序列示出的CDR2和由SEQIDNO2的氨基酸序列示出的CDR3；以及2)重链可变区，其包含由SEQIDNO27的氨基酸序列示出的CDR1、由SEQIDNO38的氨基酸序列示出的CDR2和由SEQIDNO3的氨基酸序列示出的CDR3。
根据本发明的一个实施方案的抗VEGF抗体可包含：1)轻链可变区，其包含由SEQIDNO9的氨基酸序列示出的CDR1、由SEQIDNO1的氨基酸序列示出的CDR2和由SEQIDNO2的氨基酸序列示出的CDR3；以及2)重链可变区，其包含由SEQIDNO28的氨基酸序列示出的CDR1、由SEQIDNO43的氨基酸序列示出的CDR2和由SEQIDNO3的氨基酸序列示出的CDR3。
根据本发明的一个实施方案的抗VEGF抗体可包含：1)轻链可变区，其包含由SEQIDNO5的氨基酸序列示出的CDR1、由SEQIDNO1的氨基酸序列示出的CDR2和由SEQIDNO2的氨基酸序列示出的CDR3；以及2)重链可变区，其包含由SEQIDNO29的氨基酸序列示出的CDR1、由SEQIDNO44的氨基酸序列示出的CDR2和由SEQIDNO3的氨基酸序列示出的CDR3。
根据本发明的一个实施方案的抗VEGF抗体可包含：1)轻链可变区，其包含由SEQIDNO10的氨基酸序列示出的CDR1、由SEQIDNO1的氨基酸序列示出的CDR2和由SEQIDNO2的氨基酸序列示出的CDR3；以及2)重链可变区，其包含由SEQIDNO30的氨基酸序列示出的CDR1、由SEQIDNO45的氨基酸序列示出的CDR2和由SEQIDNO3的氨基酸序列示出的CDR3。
根据本发明的一个实施方案的抗VEGF抗体可包含：1)轻链可变区，其包含由SEQIDNO11的氨基酸序列示出的CDR1、由SEQIDNO1的氨基酸序列示出的CDR2和由SEQIDNO2的氨基酸序列示出的CDR3；以及2)重链可变区，其包含由SEQIDNO31的氨基酸序列示出的CDR1、由SEQIDNO42的氨基酸序列示出的CDR2和由SEQIDNO3的氨基酸序列示出的CDR3。
根据本发明的一个实施方案的抗VEGF抗体可包含：1)轻链可变区，其包含由SEQIDNO11的氨基酸序列示出的CDR1、由SEQIDNO1的氨基酸序列示出的CDR2和由SEQIDNO2的氨基酸序列示出的CDR3；以及2)重链可变区，其包含由SEQIDNO20的氨基酸序列示出的CDR1、由SEQIDNO39的氨基酸序列示出的CDR2和由SEQIDNO3的氨基酸序列示出的CDR3。
根据本发明的一个实施方案的抗VEGF抗体可包含：1)轻链可变区，其包含由SEQIDNO11的氨基酸序列示出的CDR1、由SEQIDNO1的氨基酸序列示出的CDR2和由SEQIDNO2的氨基酸序列示出的CDR3；以及2)重链可变区，其包含由SEQIDNO32的氨基酸序列示出的CDR1、由SEQIDNO46的氨基酸序列示出的CDR2和由SEQIDNO3的氨基酸序列示出的CDR3。
根据本发明的一个实施方案的抗VEGF抗体可包含：1)轻链可变区，其包含由SEQIDNO5的氨基酸序列示出的CDR1、由SEQIDNO1的氨基酸序列示出的CDR2和由SEQIDNO2的氨基酸序列示出的CDR3；以及2)重链可变区，其包含由SEQIDNO33的氨基酸序列示出的CDR1、由SEQIDNO45的氨基酸序列示出的CDR2和由SEQIDNO3的氨基酸序列示出的CDR3。
根据本发明的一个实施方案的抗VEGF抗体可包含：1)轻链可变区，其包含由SEQIDNO5的氨基酸序列示出的CDR1、由SEQIDNO1的氨基酸序列示出的CDR2和由SEQIDNO2的氨基酸序列示出的CDR3；以及2)重链可变区，其包含由SEQIDNO34的氨基酸序列示出的CDR1、由SEQIDNO47的氨基酸序列示出的CDR2和由SEQIDNO3的氨基酸序列示出的CDR3。
根据本发明的一个实施方案的抗VEGF抗体可包含：1)轻链可变区，其包含由SEQIDNO6的氨基酸序列示出的CDR1、由SEQIDNO1的氨基酸序列示出的CDR2和由SEQIDNO2的氨基酸序列示出表的CDR3；以及2)重链可变区，其包含由SEQIDNO25的氨基酸序列示出的CDR1、由SEQIDNO48的氨基酸序列示出的CDR2和由SEQIDNO3的氨基酸序列示出的CDR3。
根据本发明的一个实施方案的抗VEGF抗体可包含：1)轻链可变区，其包含由SEQIDNO12的氨基酸序列示出的CDR1、由SEQIDNO1的氨基酸序列示出的CDR2和由SEQIDNO2的氨基酸序列示出的CDR3；以及2)重链可变区，其包含由SEQIDNO31的氨基酸序列示出的CDR1、由SEQIDNO38的氨基酸序列示出的CDR2和由SEQIDNO3的氨基酸序列示出的CDR3。
根据本发明的一个实施方案的抗VEGF抗体可包含：1)轻链可变区，其包含由SEQIDNO9的氨基酸序列示出的CDR1、由SEQIDNO1的氨基酸序列示出的CDR2和由SEQIDNO2的氨基酸序列示出的CDR3；以及2)重链可变区，其包含由SEQIDNO31的氨基酸序列示出的CDR1、由SEQIDNO46的氨基酸序列示出的CDR2和由SEQIDNO3的氨基酸序列示出的CDR3。
根据本发明的一个实施方案的抗VEGF抗体可包含：1)轻链可变区，其包含由SEQIDNO10的氨基酸序列示出的CDR1、由SEQIDNO1的氨基酸序列示出的CDR2和由SEQIDNO2的氨基酸序列示出的CDR3；以及2)重链可变区，其包含由SEQIDNO17的氨基酸序列示出的CDR1、由SEQIDNO42的氨基酸序列示出的CDR2和由SEQIDNO3的氨基酸序列示出的CDR3。
根据本发明的一个实施方案的抗VEGF抗体可包含：1)轻链可变区，其包含由SEQIDNO13的氨基酸序列示出的CDR1、由SEQIDNO1的氨基酸序列示出的CDR2和由SEQIDNO2的氨基酸序列示出的CDR3；以及2)重链可变区，其包含由SEQIDNO34的氨基酸序列示出的CDR1、由SEQIDNO49的氨基酸序列示出的CDR2和由SEQIDNO3的氨基酸序列示出的CDR3。
根据本发明的一个实施方案的抗VEGF抗体可包含：1)轻链可变区，其包含由SEQIDNO14的氨基酸序列示出的CDR1、由SEQIDNO1的氨基酸序列示出的CDR2和由SEQIDNO2的氨基酸序列示出的CDR3；以及2)重链可变区，其包含由SEQIDNO17的氨基酸序列示出的CDR1、由SEQIDNO50的氨基酸序列示出的CDR2和由SEQIDNO3的氨基酸序列示出的CDR3。
根据本发明的与VEGF结合的抗体可包含：1)由选自SEQIDNO54至65的氨基酸序列示出的轻链可变区；以及2)由选自SEQIDNO78至104的氨基酸序列示出的重链可变区(参见表2)。
根据本发明的一个实施方案的抗VEGF抗体可包含：1)由SEQIDNO54的氨基酸序列示出的轻链可变区；以及2)由SEQIDNO78的氨基酸序列示出的重链可变区。
根据本发明的一个实施方案的抗VEGF抗体可包含：1)由SEQIDNO55的氨基酸序列示出的轻链可变区；以及2)由SEQIDNO79的氨基酸序列示出的重链可变区。
根据本发明的一个实施方案的抗VEGF抗体可包含：1)由SEQIDNO55的氨基酸序列示出的轻链可变区；以及2)由SEQIDNO80的氨基酸序列示出的重链可变区。
根据本发明的一个实施方案的抗VEGF抗体可包含：1)由SEQIDNO56的氨基酸序列示出的轻链可变区；以及2)由SEQIDNO81的氨基酸序列示出的重链可变区。
根据本发明的一个实施方案的抗VEGF抗体可包含：1)由SEQIDNO55的氨基酸序列示出的轻链可变区；以及2)由SEQIDNO82的氨基酸序列示出的重链可变区。
根据本发明的一个实施方案的抗VEGF抗体可包含：1)由SEQIDNO55的氨基酸序列示出的轻链可变区；以及2)由SEQIDNO83的氨基酸序列示出的重链可变区。
根据本发明的一个实施方案的抗VEGF抗体可包含：1)由SEQIDNO57的氨基酸序列示出的轻链可变区；以及2)由SEQIDNO84的氨基酸序列示出的重链可变区。
根据本发明的一个实施方案的抗VEGF抗体可包含：1)由SEQIDNO57的氨基酸序列示出的轻链可变区；以及2)由SEQIDNO85的氨基酸序列示出的重链可变区。
根据本发明的一个实施方案的抗VEGF抗体可包含：1)由SEQIDNO58的氨基酸序列示出的轻链可变区；以及2)由SEQIDNO86的氨基酸序列示出的重链可变区。
根据本发明的一个实施方案的抗VEGF抗体可包含：1)由SEQIDNO57的氨基酸序列示出的轻链可变区；以及2)由SEQIDNO87的氨基酸序列示出的重链可变区。
根据本发明的一个实施方案的抗VEGF抗体可包含：1)由SEQIDNO57的氨基酸序列示出的轻链可变区；以及2)由SEQIDNO88的氨基酸序列示出的重链可变区。
根据本发明的一个实施方案的抗VEGF抗体可包含：1)由SEQIDNO59的氨基酸序列示出的轻链可变区；以及2)由SEQIDNO89的氨基酸序列示出的重链可变区。
根据本发明的一个实施方案的抗VEGF抗体可包含：1)由SEQIDNO57的氨基酸序列示出的轻链可变区；以及2)由SEQIDNO90的氨基酸序列示出的重链可变区。
根据本发明的一个实施方案的抗VEGF抗体可包含：1)由SEQIDNO60的氨基酸序列示出的轻链可变区；以及2)由SEQIDNO91的氨基酸序列示出的重链可变区。
根据本发明的一个实施方案的抗VEGF抗体可包含：1)由SEQIDNO55的氨基酸序列示出的轻链可变区；以及2)由SEQIDNO92的氨基酸序列示出的重链可变区。
根据本发明的一个实施方案的抗VEGF抗体可包含：1)由SEQIDNO61的氨基酸序列示出的轻链可变区；以及2)由SEQIDNO93的氨基酸序列示出的重链可变区。
根据本发明的一个实施方案的抗VEGF抗体可包含：1)由SEQIDNO62的氨基酸序列示出的轻链可变区；以及2)由SEQIDNO94的氨基酸序列示出的重链可变区。
根据本发明的一个实施方案的抗VEGF抗体可包含：1)由SEQIDNO62的氨基酸序列示出的轻链可变区；以及2)由SEQIDNO95的氨基酸序列示出的重链可变区。
根据本发明的一个实施方案的抗VEGF抗体可包含：1)由SEQIDNO62的氨基酸序列示出的轻链可变区；以及2)由SEQIDNO96的氨基酸序列示出的重链可变区。
根据本发明的一个实施方案的抗VEGF抗体可包含：1)由SEQIDNO55的氨基酸序列示出的轻链可变区；以及2)由SEQIDNO97的氨基酸序列示出的重链可变区。
根据本发明的一个实施方案的抗VEGF抗体可包含：1)由SEQIDNO55的氨基酸序列示出的轻链可变区；以及2)由SEQIDNO98的氨基酸序列示出的重链可变区。
根据本发明的一个实施方案的抗VEGF抗体可包含：1)由SEQIDNO57的氨基酸序列示出的轻链可变区；以及2)由SEQIDNO99的氨基酸序列示出的重链可变区。
根据本发明的一个实施方案的抗VEGF抗体可包含：1)由SEQIDNO63的氨基酸序列示出的轻链可变区；以及2)由SEQIDNO100的氨基酸序列示出的重链可变区。
根据本发明的一个实施方案的抗VEGF抗体可包含：1)由SEQIDNO60的氨基酸序列示出的轻链可变区；以及2)由SEQIDNO101的氨基酸序列示出的重链可变区。
根据本发明的一个实施方案的抗VEGF抗体可包含：1)由SEQIDNO61的氨基酸序列示出的轻链可变区；以及2)由SEQIDNO102的氨基酸序列示出的重链可变区。
根据本发明的一个实施方案的抗VEGF抗体可包含：1)由SEQIDNO64的氨基酸序列示出的轻链可变区；以及2)由SEQIDNO103的氨基酸序列示出的重链可变区。
根据本发明的一个实施方案的抗VEGF抗体可包含：1)由SEQIDNO65的氨基酸序列示出的轻链可变区；以及2)由SEQIDNO104的氨基酸序列示出的重链可变区。
本发明的抗体可包含轻链恒定区和重链恒定区，所述轻链恒定区和重量恒定区可以是公众已知的人抗体的轻链恒定区和重链恒定区(URutishauser等，PNAS，61(4)：1414-1421(1968)；和TakahashiN.，等，Cell，29：671-679(1982))。
根据本发明的抗体可以是人抗体或人源化抗体。
根据本发明的抗体可以包括免疫球蛋白IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1、IgA2、IgD、IgE或IgM，以及可以为与VEGF结合的抗体，或者其组合或变体。
根据本发明的抗体的形式可以为Fab、Fab′、F(ab′)2、Fv、dAb、scFv或骨架缀合物，其中所述抗体的CDR是用于与VEGF结合的主要部分。
另外，在本发明中，提供了选自SEQIDNO66至77的碱基序列，其编码由选自SEQIDNO54至65的氨基酸序列示出的轻链可变区。
在本发明中，提供了选自SEQIDNO105至131的碱基序列，其编码由选自SEQIDNO78至104的氨基酸序列示出的重链可变区。
以下在表2中示出了本发明抗体的轻链和重链之可变区的氨基酸序列和对应碱基序列的列表。
[表2]
另外，在本发明中，提供了编码与VEGF结合之抗体的轻链可变区的DNA，所述轻链可变区包含由SEQIDNO1的氨基酸序列示出的CDR2；以及由SEQIDNO2的氨基酸序列示出的CDR3。
编码由SEQIDNO1的氨基酸序列示出之CDR2的DNA可以由SEQIDNO51的碱基序列示出；并且编码由SEQIDNO2的氨基酸序列示出之CDR3的DNA可以由SEQIDNO52的碱基序列示出。
因此，编码本发明抗体之轻链可变区的DNA序列可包含编码LCDR2的SEQIDNO51的碱基序列；以及编码LCDR3的SEQIDNO52的碱基序列.
在本发明中，提供了编码与VEGF结合之抗体的重链可变区的DNA，所述重链可变区包含由SEQIDNO3的氨基酸序列示出的CDR3。
编码由SEQIDNO3的氨基酸序列示出之CDR3的DNA可以由SEQIDNO53的碱基序列示出。
编码抗VEGF抗体的重链可变区的DNA可包含编码HCDR3之SEQIDNO53的碱基序列。
在本发明中，提供了包含编码抗体轻链可变区之DNA的表达载体，所述载体表达与VEGF结合之抗体的轻链可变区。
优选地，提供了包含以下的表达载体：编码由SEQIDNO1的氨基酸序列示出之CDR2的SEQIDNO51的碱基序列；和编码由SEQIDNO2的氨基酸序列示出之CDR3的SEQIDNO52的碱基序列。
另外，在本发明中，提供了包含编码抗VEGF抗体之重链可变区的DNA的表达载体，所述载体表达与VEGF结合之抗体的重链可变区。
优选地，提供了包含编码由SEQIDNO3的氨基酸序列示出之CDR3的碱基序列的表达载体，所述载体表达与VEGF结合之抗体的重链可变区。
可以将本发明的表达载体转染到动物细胞系中，例如CHO细胞、HEK细胞或NS0细胞，但不限于此。
另外，在本发明中，提供了包含编码抗体之轻链可变区的DNA的表达载体，所述载体表达与VEGF结合之抗体的轻链可变区。
血管发生指从先前存在的毛细血管形成新的毛细血管。本文所用的“血管发生相关疾病”涵盖由VEGF过表达引起的与血管发生相关的所有疾病或病症。“血管发生相关疾病”可以包括多种癌症和眼部病症等，但不限于此。在本发明中，由VEGF过表达引起的血管发生相关疾病或癌症可以选自：选自结肠直肠癌、胰腺癌、肾癌、肺癌、乳腺癌、卵巢癌和脑癌的癌症；以及选自黄斑变性、糖尿病性视网膜病变和缺血性视网膜病变的眼部病症；等等。
临床实践中，抗VEGF抗体可以与药物组合使用，所述药物例如，基于氟嘧啶的药物、紫杉醇、基于铂的药物、干扰素α-2a、卡铂等(FDAUSBL125085阿瓦斯汀标签)。
除了以上抗体之外，本发明的药物组合物还可以与选自以下的药物组合使用：基于氟嘧啶的药物、紫杉醇、基于铂的药物、干扰素α-2a、卡铂、多柔比星(doxorubicin)、顺铂、吉西他滨、5-氟尿嘧啶、甲酰四氢叶酸、伊立替康、奥沙利铂卡培他滨和多西他赛，但不限于此。
显示出抗癌活性的任何化学治疗剂均可以与本发明的药物组合物组合使用。化学治疗剂可以选自烷基化剂、抗代谢物、叶酸同系物、嘧啶同系物、嘌呤同系物和相关抑制剂，长春花生物碱、表鬼臼毒素、抗生素、L-天冬酰胺酶、拓扑异构酶抑制剂、干扰素、铂配合物、蒽二酮取代的尿素、甲基肼衍生物、肾上腺皮质抑制剂、肾上腺皮质类固醇、孕激素、雌激素、抗雌激素、雄激素、抗雄激素和促性腺激素释放激素同系物。
在本发明中，提供了用于癌症或由VEGF过表达引起的血管发生相关疾病的诊断试剂盒，所述试剂盒包含与VEGF结合的抗体。血管发生相关疾病的实例如上所述。
根据本发明的抗体不影响VEGF与VEGF受体Flt-1(VEGFR-1)之间的结合，但选择性地抑制VEGF与VEGF受体KDR(VEGFR-2)之间的结合(图2)。另外，所述抗体根本不结合人VEGF-B、人VEGF-C、人VEGF-D或人胎盘生长因子(PIGF)，但对人VEGF-A和小鼠VEGF-A显示出高的结合特异性(图3)。
通过酶联免疫吸附测定(ELISA)来评估本发明的抗体对人血管内皮生长因子的结合亲和力。结果，所述抗体显示出对人VEGF的浓度依赖性结合(图7)。与之前的现有抗VEGF抗体阿瓦斯汀(其不显示出对小鼠VEGF的结合)相比，所述抗体还显示出对小鼠VEGF的优异结合，表明本发明的抗体适合用于使用小鼠的临床前研究(图8)。
此外，本发明的抗体阻抑人脐静脉内皮细胞(HUVEC)的增殖(VEGF刺激HUVEC渗透性和HUVEC迁移)，其程度等于或大于阿瓦斯汀(图9至11)，并且在植入人结肠癌细胞系的小鼠中阻抑肿瘤生长，其程度远远超过阿瓦斯汀(图12)。与对照组相比，本发明的抗体还显著阻抑脉络膜血管发生模型中的血管发生(图13)。因此，本发明的人(或人源化的)抗体可以用于治疗癌症或血管发生相关疾病，并且因此本发明提供了用于预防和治疗癌症或血管发生相关疾病之包含上述抗体的组合物。
定义
在本发明中，“VEGF”不仅指165-氨基酸人血管内皮生长因子以及相关的121-氨基酸、189-氨基酸和206-氨基酸血管内皮生长因子，也指天然人血管内皮生长的等位基因形式或经修饰的形式(参见[Leung等，Science.，246：1306(1989)；和Houck等，Mol.Endocrin.，5：1806(1991)])。
在本发明中，“抗VEGF抗体”指通过阻碍VEGF与VEGF受体结合来使VEGF活化细胞失活或者在VEGF已经与VEGF受体结合之后抑制血管内皮细胞之活化而发挥作用的抗体。
在本发明中，“抗体”指显示出与某些抗原特异性结合的糖蛋白。“人源化”形式的非人(例如啮齿类动物)抗体是包含来自非人免疫球蛋白之最小序列的嵌合抗体。大多数情况下，通过用具有期望特异性、亲和力和能力的小鼠、大鼠、兔、鸡或非人灵长类动物的高变区残基替换人免疫球蛋白的高变区残基来构建人源化抗体。在一些情况下，用对应的非人残基替代人免疫球蛋白的框架区(FR)残基。
在本发明中，“单链Fv”或“scFv”抗体片段包含存在于单个多肽链中的抗体的VH和VL结构域。一般而言，Fv多肽还包含帮助scFv形成与抗原结合之适当结构的VH和VL结构域之间的多肽接头。
在本发明中，“Fab抗体片段”是通过用木瓜蛋白酶消化抗体获得的片段，其中抗体的VH和VL结构域，以及CH1和CL结构域通过S-S键连接，并且其具有抗原结合功能。
在本发明中，“F(ab′)2抗体片段”指不包含Fc(CH2和CH3)片段的抗体部分。F(ab′)2抗体片段可以通过在其铰链区下对抗体进行切割构建。
在本发明中，“Fab′”是铰链区切掉的F(ab′)2抗体片段的形式；并具有两个-SH基团。
在本发明中，“Fv”指抗体的可变区，而“dAb”指单个结构域抗体片段。
在本发明中，“VEGF受体”指VEGF的细胞受体，一般而言，指能够与hVEGF结合的细胞表面受体或其变体。VEGF受体的一个实例是酪氨酸激酶的跨膜受体，特别是fms型酪氨酸激酶(flt)(参见[DeVries等，Science.，255：989(1992)；Shibuya等，Oncogene.，5；519(1990)])。Flt受体包含胞外结构域、跨膜结构域和具有酪氨酸激酶活性的细胞内结构域。虽然胞外结构域与VEGF结合有关，而细胞内结构域与信号转导相关。VEGF受体的另一个实例是flk-1受体(下文被称为“KDR”)(参见[Matthews等，Proc.Nat.Acad.Sci.，88：9026(1991)；Terman等，Oncogene.，6：1677(1991))。
下文中，将用以下实施例更加详细地描述本发明。提供以下实施例来举例说明本发明，但本发明的范围不限于此。
实施例1.VEGF免疫和cDNA文库构建
为了选择特异性结合VEGF的抗体，从免疫的动物构建抗体文库。通过从用抗原免疫的动物的免疫细胞获得mRNA来构建文库，通过使用抗体基因之引物组合的PCR扩增抗体基因，并将这些基因克隆到用于噬菌体展示的载体中。
具体地，将人VEGF和小鼠VEGF(R&DSystems，美国)与弗氏完全佐剂(completeFreund′sadjuvant)和弗氏不完全佐剂(Sigma，美国)混合，并将其混合物以3周的间隔皮下注射到3只白色来航鸡中5次。获得经免疫动物的血清，使用PBSB(含3％牛血清蛋白的磷酸盐缓冲液)以1∶100、1∶500、1∶2500和1∶12500稀释并储存，然后通过酶免疫测定来评估其与人VEGF和小鼠VEGF的结合。对于ELISA板，分别用0.2μg/mL人VEGF(VEGF-165，R&DSystems，美国)和小鼠VEGF(VEGF-164，R&DSystems，美国)各自在4℃下包被过夜，然后添加上述稀释的血清，并进行反应2小时。用PBST(含0.1％tween-20的PBS)洗涤3次后，添加抗鸡免疫球蛋白辣根过氧化物酶(horseradishperoxidase，HRP)(1∶3000)并进行反应1小时。用PBST洗涤3次后，添加超TMB(Thermo，美国)并允许显色7分钟，使用微板阅读仪(microplatereader)测量在650nm下的吸光度。免疫前的血清不结合VEGF，并且选择产生强烈结合人VEGF和小鼠VEGF二者之血清的动物。
在最后一次注射后5天，从所选的鸡收集骨髓、脾和腔上囊组织。将组织与10mLTRI试剂(MolecularResearchCenter，美国)混合，匀浆，然后添加20mLTRI试剂，离心以获得上清液。添加3mL的1-溴-3-氯丙烷(1-bromo-3-chloropropane，BCP)之后，离心后获得上清液。通过用15mL异丙醇处理来沉淀总RNA。使用SuperScript转录系统(Invitrogen，美国)和随机六聚体(randomhexamer)作为引物，进行逆转录反应(65℃，5分钟；4℃，5分钟；50℃，50分钟；85℃，5分钟；以及4℃)。将5μL的反应溶液(含有从逆转录反应得到的cDNA)上样到1％琼脂糖凝胶并进行电泳，并且验证具有多种长度的cDNA带。
实施例2.抗体文库的构建
(2-1)免疫抗体基因的扩增
为扩增鸡抗体的重链可变区和轻链可变区(VH和VL结构域)，如下进行PCR反应。
使用实施例1中制备的cDNA作为模板，设计用于VH和VL以及连接VH和VL之单链Fv(scFv)的引物组合，进行PCR反应。将0.5μLVH和VL的各cDNA文库，30pmole正向引物，30pmole反向引物，10×PCR缓冲液，200μMdNTP和0.5μLTaqDNA聚合酶混合至50μL的终体积。将混合物在94℃反应5分钟，然后重复以下反应30个循环：94℃，15秒；56℃，30秒和72℃，90秒。
[表3]PCR反应中使用的引物
将PCR扩增的抗体DNA在1％琼脂糖凝胶上进行电泳，以根据大小分离每种扩增的DNA，并使用凝胶提取试剂盒(Gelextractionkit，Qiagen，美国)进行纯化。
为获得scFvDNA，使用50ng的各自经纯化的VH和VLDNA作为模板，其与30pmole正向引物和30pmole反向引物(表3)、10×PCR缓冲液、200μMdNTP以及0.5μLTaqDNA聚合酶混合至终体积50μL。对混合物进行PCR反应，94℃，5分钟；随后如下进行20个循环：94℃，30秒；56℃，30秒和72℃，2分钟。将PCR扩增的抗体DNA在1％琼脂糖凝胶上进行电泳以根据大小分离每种扩增的DNA，然后使用凝胶提取试剂盒(Qiagen，美国)进行纯化。
(2-2)通过限制性酶切割抗体DNA
通过限制性酶SfiI(Roche，美国)切割上述制备的scFv和噬菌粒载体pComb3X(theScrippsResearchInstitute，CA，美国)。
将10μg编码scFv的PCR片段，360单位的SfiI(Roche，美国)以及20μg的10×缓冲液混合至终体积200μL，并在50℃反应过夜。
此外，将20μg的pComb3X载体，120单位的SfiI和20μL的10×缓冲液混合至终体积200μL，并在50℃反应过夜。对通过限制性酶切割获得的片段进行电泳，然后使用凝胶提取试剂盒(Qiagen，美国)进行纯化。
(2-3)抗体DNA的连接和文库的制备
为了将scFv片段插入到pComb3X载体中，将在(2-2)中使用SfiI切割的700ng编码scFv的PCR片段，与1.4μg的pComb3X混合。添加T4DNA连接酶(Invitrogen，美国)后，将混合物在16℃反应过夜。通过乙醇沉淀来纯化连接混合物。然后，通过电穿孔用混合物转化大肠杆菌ER2738(NewEnglandBiolab，美国)，并在46μg/mL羧苄青霉素和70μg/mL卡那霉素的存在下进行培养，以制备复杂性为1.5×109的文库。
实施例3.选择含有抗VEGFscFv的噬菌体克隆
从实施例2中获得的含有scFv形式之随机化重链和轻链的文库中，使用固体固定的VEGF选择与人VEGF和小鼠VEGF二者都结合的抗体。
(3-1)选择与VEGF结合的抗体
首先，将10ug人VEGF(R&Dsystems，美国)和小鼠VEGF(R&Dsystems，美国)各自缀合到磁珠。
将实施例2中获得的抗体文库DNA(其被构建以使得scFv形式的抗体以与噬菌体外壳蛋白PIII融合的形式展示)通过电穿孔转染到大肠杆菌ER2738(NewEnglandBiolab)中，然后将其在37℃培养。添加VCSM13辅助嗜菌体(Stratagene，美国)之后，进一步添加46ug/ml羧苄青霉素和70ug/ml卡那霉素，随后在SB培养基(30g/L胰蛋白胨，20g/L酵母提取物和10g/LMOPS，pH7.0)中培养过夜。
将上述获得的含有大肠杆菌和噬菌体的培养基离心以移除大肠杆菌沉淀。回收上清液之后，添加40mg/ml的聚乙二醇8000和30mg/ml的NaCl，随后离心以收集PEG沉淀的噬菌体，其在PBS中重悬。
与磁珠缀合的人VEGF或小鼠VEGF与噬菌体在室温下反应两小时以允许对VEGF有亲和力的噬菌体结合，然后将所得的样品用含有0.5％Tween20的PBS洗涤，用0.1M甘氨酸(pH2.2)洗脱，并用2Mtris溶液中和。为了下一轮的淘选(panning)，用洗脱的噬菌体感染大肠杆菌ER2738并培养过夜。通过重复该过程4次来进行淘选。
随着淘选的循环逐渐增加，洗涤的次数增加，导致具有高结合亲和力的噬菌体累积。为了发现人VEGF和小鼠VEGF二者的结合物，使用仅人VEGF或交替的人VEGF和小鼠VEGF作为抗原。
在100ug/ml羧苄青霉素、70ug/ml卡那霉素以及VCSM13辅助嗜菌体(1∶1000)存在下，将从每个第四轮淘选输出选择的单个克隆在96深孔板中在37℃培养过夜，从而诱导表达抗体的噬菌体增殖。
因此离心所获得的培养液以获取含有噬菌体的培养物上清液。将所获取的培养物上清液添加到用VEGF包被的ELISA板并在37℃孵育2小时。使用HRP缀合的抗M13抗体作为二抗通过ELISA鉴定与VEGF结合的抗体。
(3-2)所选抗体的测序
将在实施例3-1中选择的含有对人VEGF和小鼠VEGF二者显示出阳性信号之克隆的ER2738在SB培养基中培养过夜，并离心以获得大肠杆菌。使用DNA微型制备试剂盒(GeneAll，韩国)来获得质粒DNA并分析其碱基序列。使用在表4中示出的测序引物(SEQIDNO138和139)来确定碱基序列。所选择的克隆被称为“克隆F”。在表1中示出了克隆F抗体的详细碱基序列信息。
[表4]
正向(SEQ ID NO 138) ACA CTT TAT GCT TCC GGC TC
反向(SEQ ID NO 139) CAA AAT CAC CGG AAC CAG AG
实施例4.人源化和亲和力改进
将从动物免疫抗体文库获得的抗体克隆F的框架转变成人抗体框架，同时不改变对抗原结合重要的一些残基(Nishibori等，MolecularImmunology，43(2006))。
为了亲和力改进，对重链和轻链的CDR序列进行随机化以产生新的噬菌体文库。通过在实施例2中所示的相同方法，将所获得的噬菌体文库与10μg固定到磁珠的10ug人VEGF在室温反应2小时并用含0.5％Tween20的PBS洗涤5次。洗涤之后，用0.1M甘氨酸(pH2.2)溶液洗脱与抗原结合的噬菌体并用2Mtris溶液中和。在第二轮淘选中，将样品用含有Tween20的PBS洗涤10次，并且在第三轮淘选中用含有Tween20的PBS洗涤20次以提高选择压力。
经过以上过程的克隆F的变体克隆被称为“HF2-1至HF2-26”，并且通过ELISA和BIAcore来验证其结合亲和力。结果，确认从以上过程获得的与人VEGF和小鼠VEGF结合的抗体具有比母代克隆F高至少10倍的亲和力，其中一些克隆显出出高至少100倍的亲和力。
实施例5.抗体的生产
为了上述获得之抗体的亲和力测量和活性分析，产生scFv或免疫球蛋白(IgG)蛋白。
为了scFv蛋白产生，用含有所选克隆之DNA的pComb3X质粒转化大肠杆菌HB2151，随后纯化所表达的scFv。
具体地，当O.D.值达到1时添加1mM异丙基β-D-1-硫代吡喃半乳糖苷(IPTG)，随后在37℃培养过夜。然后通过离心分离大肠杆菌和培养基。为了纯化结合C末端His标签的scFv，将scFv蛋白质与镍NTA柱(GE，美国)结合，用250-300mM咪唑溶液洗脱并在PBS缓冲液中透析过夜。
为了IgG产生，通过使用实施例2中的条件和表5中所示的引物组合进行PCR来从含有scFv的pComb3x获得重链和轻链的可变区以及恒定区的片段。
通过使用表5中的HC和LC引物组合进行PCR获得重链和轻链的可变区以及恒定区(CH和Ck)，并使用克隆试剂盒和克隆试剂盒(Invitrogen，美国)转移到哺乳动物细胞表达质粒。将1μL的每种载体(载体和pOptiTM载体)以及片段添加至含有200mM之NaCl和10mM之MgCl2的缓冲液，至总体积为6μL，并在室温下反应5分钟。通过施加热激来转化DH5a大肠杆菌感受态细胞并且将这样获得的集落在大规模上培养以获得质粒。
用上述制备的质粒转染HEK293F细胞(Invitrogen，美国)，并使用蛋白A柱(GE，美国)纯化培养7天后所获得的抗体。将培养基上样至柱以允许培养基中的抗体(IgG)结合蛋白A。然后用20mM柠檬酸钠缓冲液(pH3.0)洗脱抗体。轻链和重链的分子量与理论上计算的值一致，并且通过SDS-PAGE确认了高度的纯度。
[表5]
实施例6.结合亲和力的测量
分别用0.2μg/ml的人VEGF和小鼠VEGF(R&Dsystems，美国)包被ELISA板，并以系列稀释浓度孵育由HB2151表达之scFv形式的实施例5中获得的纯化蛋白质或者由293F细胞表达的IgG。结果，在实施例3-2中获得的克隆F以及通过亲和力改进获得的其变体显示出与人VEGF和小鼠VEGF以浓度依赖性方式的良好结合。
期间，按照制造商的说明书，将人VEGF和小鼠VEGF与羧甲基化葡聚糖生物传感器芯片(CM5，GE)偶联以测量亲和力。为了测量结合和解离速率，将IgG蛋白系列稀释2倍至5nM、2.5nM、1.25nM、0.625nM、0.313nM和0.156nM并进行注射。
通过结合与解离传感图表示结合与解离速率并使用简单地1∶1Langmuir结合模型(BIAcoreX100评估软件，2.0版)计算。按照解离速率常数(Kd)除以结合速率常数(Ka)计算的平衡解离常数(KD)在指示高亲和力的亚纳摩尔水平得到确认。在表6中示出了抗体HF2-1至HF2-11、HF2-13和HF2-14针对人VEGF(hVEGF)的测量值，并且在图1中示出作为一个代表性实例的HF2-11的传感图。
[表6]
克隆 结合分子 Ka(1/Ms) Kd(1/s) KD(M)
HF2-1 hVEGF 2.5X106 ＜1X10-6 ＜1X10-12
HF2-2 hVEGF 1.1X106 ＜1X10-6 ＜1X10-12
HF2-3 hVEGF 1.3X106 ＜1X10-6 ＜1X10-12
HF2-4 hVEGF 1.6X106 3.1X10-6 1.9X10-12
HF2-5 hVEGF 1.3X106 2.6X10-5 1.9X10-11
HF2-6 hVEGF 1.6X106 ＜1X10-6 ＜1X10-12
HF2-7 hVEGF 1.6X106 2.7X10-5 1.6X10-11
HF2-8 hVEGF 1.5X106 5.7X10-5 3.6X10-11
HF2-9 hVEGF 1.7X106 3.2X10-5 1.8X10-11
HF2-10 hVEGF 1.6X106 ＜1X10-6 ＜1X10-12
HF2-11 hVEGF 1.4X106 6.8X10-6 4.7X10-12
HF2-13 hVEGF 1.4X106 1X10-5 9.0X10-12
HF2-14 hVEGF 1.3X106 ＜1X10-6 ＜1X10-12
实施例7.抑制配体-受体结合的验证
为了验证本发明所选的抗体(HF2-1、HF2-5、HF2-9和HF2-11)对VEGF与VEGF受体KDR(下文称为VEGFR2)或VEGF受体Flt-1(下文称为VEGFR1)之结合的抑制作用，如下进行实验。
将0.5μg/ml的人VEGF包被到96孔ELISA板并用含3％BSA和0.05％Tween20的PBS溶液封闭。将6nM的Flt-1ECDIgG-Fc融合蛋白(27-687，R&Dsystems，美国)或9nM的KDRECDIgG-Fc融合蛋白(R&Dsystems，美国)与系列稀释(0.01nM、0.1nM、0.3nM、1nM、3nM、10nM和100nM)的每种抗体HF2-1、HF2-5、HF2-9和HF2-11一起添加至每个孔，并在37℃孵育1小时。尽管抗体抑制Flt-1ECDIgGFc融合蛋白和KDRECDIgG-Fc融合蛋白结合，然而使用抗人IgG-Fc抗体HRP缀合物(JacksonImmunoresearch，美国)，随后通过ABTS显色和在405nm测量吸光度检测结合。
结果，如图2所示，本发明的抗体以浓度依赖性方式抑制VEGF与KDR(VEGFR2)的结合，但不抑制VEGF与Flt-1(VEGFR1)的结合。因此，确认本发明所选的抗体选择性地抑制VEGF与VEGF受体的结合。
实施例8.结合特异性的验证
为测量本发明所选的抗体HF2-1、HF2-5、HF2-9和HF2-11对人VEGF-A(hVEGF-A)、小鼠VEGF-A(mVEGF-A)、人VEGF-B(hVEGF-B)、人VEGF-C(hVEGF-C)、人VEGF-D(hVEGF-D)和人胎盘生长因子(PlGF)的结合特异性，如下进行实验。
分别用0.2μg/ml各蛋白质(hVEGF-A、mVEGF-A、hVEGF-B、hVEGF-C、hVEGF-D和PlGF)(R&Dsystems)各自包被ELISA板的孔。在用含有3％BSA和0.05％Tween20的PBS在37℃封闭30分钟后，将提高浓度的抗体克隆蛋白在37℃孵育2小时。然后用含有3％BSA和0.05％Tween20的PBS洗涤孔3次，向其添加抗人IgG-Fab-HRP缀合物(JacksonImmunoresearch，美国)并在室温下孵育1小时。然后将它们用含有3％BSA和0.05％Tween20的PBS洗涤3次，并使用TMB显色，在650nm下测量吸光度。使用阿瓦斯汀(Roche，瑞士)作为对照。
如图3中所示，本发明的抗体克隆良好结合hVEGF-A和mVEGF-A，而根本不结合VEGF-B、VEGF-C、VEGF-D或PIGF，表明对VEGF的高特异性。
实施例9.物理化学特征的分析
对本发明抗体的物理化学特征进行分析。
在DTT存在以移除二硫键的还原条件下和在不存在DTT处理的非还原条件下，使用NuPAGE4-12％Bis-Tris凝胶(InvitrogenCo.)、SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)分析确认整个抗体的轻链和重链的存在。在图4中示出作为一个示例性实例的HF2-11的分子量测量结果。
如图4所示，在非还原条件(NR，5μg)下分析的试样显示出在116kDa大小标记和205kDa大小标记之间的主带，确认了对应于整个抗体之大小的条带的存在。在还原条件(R，2μg)下分析试样显示出分别在55kDa和20.1kDa大小标记附近的主带，确认了对应于抗体的重链和轻链之条带的存在。因此，通过SDS-PAGE鉴定了对应于整个抗体、重链和轻链的条带，并且未发现其他主要的杂质条带。
另外，使用液相色谱/质谱法(LC/MS)确认了HF2-4的分子量，及其与理论氨基酸序列的估计值一致。在图5(a)和(b)中示出了作为一个代表性实例的HF2-4之重链和轻链的质量分析结果。
在部分还原试样后，分析重链和轻链的质量。重链显示的主峰为50.6kDa大小而轻链显示的主峰为23.3kDa大小，这与估计的分子量值一致。另外，观察到的小峰似乎是翻译后修饰(例如糖基化)的结果。
此外，使用TSKgelG3000SWxl柱(TosohCo.)通过尺寸排阻色谱法(SEC)分析本发明抗体HF2-8的聚集状态(即，可溶聚集体，一种类型的杂质)，并且在图6中示出结果。通过用100mM磷酸盐缓冲液(pH6.6)作为移动相的等度洗脱来分离，并在280nm监测，观察到单体峰面积为总峰面积的98％或以上，然而聚集体所占的峰面积小于2％，表明高的纯度。
实施例10.与人VEGF或小鼠VEGF结合的抗体的分析
使用ELISA方法来验证本发明抗体(HF2-1至HF2-26)与人血管内皮生长因子(VEGF)的结合特性。
将稀释在150μL缓冲液中的1.5ng人VEGF置于96孔免疫板(Nunc，美国)中，并在4℃吸附过夜，随后用含有0.1％Tween20的缓冲液洗涤3次。然后将它们与含有1％牛血清白蛋白(Sigma，美国)的缓冲液在室温下反应1小时，并洗涤3次。然后将每个孔用150μL系列稀释的抗体(1ng/mL、10ng/mL、30ng/mL、100ng/mL、1000ng/mL和3000ng/mL)处理。允许它们在室温下反应1小时，以使得抗原可与抗体结合，随后用缓冲液洗涤3次。
用1∶20000稀释的抗人免疫球蛋白Fc-HRP抗体(AbSerotec，美国)以150μL/孔处理每个孔，并允许在室温下反应1小时。在反应完成后，用缓冲液进行3次洗涤，随后添加150μL的TMB(Sigma，美国)并显色10分钟。用1N的硫酸溶液终止该反应，并使用分光光度计(MolecularDevice，美国)在450nm测量吸光度。结果在图7中示出。将阿瓦斯汀用作对照组，以相同方式测量其吸光度。
如图7所示，确认HF克隆(b)(其是克隆F(a)的人源化克隆)的结合特性通过亲和力改进过程而提高。发现相比于阿瓦斯汀，这些HF克隆(HF2-1至HF2-26)的大多数显示出对VEGF更高的结合特性。
通过ELISA以上文所述的相同方式验证抗体对小鼠VEGF的结合特性。在图8中示出的结果表明，与阿瓦斯汀不同，本发明的抗体HF2-1、HF2-5、HF2-8和HF2-9结合小鼠VEGF以及人VEGF，表明本发明的抗体适用于使用小鼠的临床前研究。
实施例11.确认本发明抗体对VEGF诱导之HUVEC增殖的阻抑活性
确认本发明抗体对VEGF诱导之HUVEC增殖的阻抑活性。
通过离心人脐静脉内皮细胞(HUVEC，Clonetics，美国)获得沉淀，然后将其在不包含生长因子和牛血清的EBM-2基础培养基(Clonetics，美国)中悬浮。将细胞悬浮液铺板到96孔细胞培养板上(每孔的细胞数目相同)，将其在恒温加湿培养箱中孵育24小时。孵育完成后，弃掉培养基，并用以系列浓度(30ng/mL、60ng/mL、100ng/mL、150ng/mL、200ng/mL、300ng/mL、1000ng/mL和3000ng/mL)稀释的各个抗体与以30～90ng/mL的某浓度稀释的人VEGF的混合溶液处理孔。将用抗原和抗体处理的细胞在恒温加湿培养箱中培养4天，然后用刃天青溶液(Invitrogen，美国)以每孔10μL处理。3～4小时后，在530nm/590nm测量荧光。使用阿瓦斯汀作为对照，并且相对于仅用VEGF处理的孔的荧光值定量抗体对细胞增殖的阻抑作用。在图9(b)中示出了当用抗体HF-1、HF-4、HF-5和HF-8处理时，HUVEC增殖速率的结果，而图9(c)和(d)中示出了用抗体HF-1至HF-5、HF-9和HF-11处理时，细胞存活率的结果。
如图9中所示，本发明的抗体HF2-5阻抑VEGF诱导的HUVEC增殖，程度上类似于阿瓦斯汀(图9(b)和(d))。另外，示出通过F克隆的人源化(a)和亲和力改进(b、c、d)提高了抗体的活性。
实施例12.确认本发明抗体对VEGF诱导的HUVEC渗透性的阻抑活性
评估本发明抗体对VEGF诱导的HUVEC(Clonetics，美国)渗透性的阻抑活性。
测试前一天，用胶原蛋白溶液(Sigma，美国)处理具有0.4μm微多孔膜的Transwell以促进细胞附着。使用胰蛋白酶收集细胞，并以5×104细胞/mL的浓度悬浮。将Transwell中的胶原蛋白溶液弃掉，并用缓冲溶液洗涤Transwell一次。将100ul的细胞悬浮液分散到每个孔中。向底室添加600μL体积的EGM-2培养基(Clonetics，美国)。形成单层内皮细胞后，将含有稀释的抗体(HF2-5、HF2-9、HF2-11或阿瓦斯汀(对照)，各自以1×或10×)和稀释到30ng/mL至90ng/mL的人VEGF的混合溶液分别以100μL和600μL的体积添加至Transwell和底室，并允许在培养箱中反应过夜。在反应完成后，移除Transwell中的溶液，并且用100μL的葡聚糖-FITC溶液处理Transwell。1小时后，在490nm/520nm测量荧光以检测通过Transwell的葡聚糖。使用不合有VEGF的EBM培养基作为对照。
如图10中所示，本发明的抗体以浓度依赖性的模式阻抑由VEGF导致的内皮细胞渗透性增强(a)，这与阳性对照阿瓦斯汀类似(b)。
实施例13.确认本发明抗体对VEGF诱导的HUVEC迁移的阻抑活性
评估本发明抗体HF2-4和HF2-8对VEGF诱导的HUVEC(Clonetics，美国)迁移特性的阻抑活性。
为了定量评估内皮细胞的迁移特性，使用具有3μm微多孔膜的Transwell进行Boyden室测试。为提高VEGF的反应性，测试前，将在烧瓶中培养的细胞于含有0.1％BSA的EBM-2基础培养基中饥饿4小时以上。将细胞悬浮液以100μL体积中每孔50,000个细胞置于上室中，而含有稀释在基础培养基中3ng/mL的VEGF以及9ng/mL或90ng/mL抗体(HF2-4或HF2-8)的混合溶液以600μL体积置于下室。
孵育24小时后，使用胰蛋白酶分开已经随VEGF的浓度梯度迁移到Transwell的相对侧的细胞。通过离心收集分开的细胞，然后用裂解缓冲液(Invitrogen，美国)裂解。用DNA染料(Invitrogen，美国)染色经裂解细胞中的DNA，并且在480nm/520nm测量荧光。在图11中示出结果。
图11中的结果表明内皮细胞的迁移特性被人VEGF增强，并且增强的迁移特性可被抗体HF2-4和HF2-8以浓度依赖性方式阻抑。
实施例14：确认本发明抗体对肿瘤生长的阻抑活性
为评估抗体对肿瘤生长的阻抑活性，将本发明的抗体注射到裸鼠中，在裸鼠中已经通过植入人癌细胞来形成肿瘤。
具体地，将在含有10％FBS和1％青霉素链霉素的McCoy的5A培养基中培养的2～5×106个HT-29细胞(人结肠癌细胞系HTB-38，ATCC)皮下注射到BALB/c裸鼠(OrientBio)中。当小鼠中的肿瘤充分生长至约200～300mm3的平均体积时，分别将抗体HF2-1、HF2-5、HF2-9和HF2-11注射到划分的组中。以3mg/kg或10mg/kg的剂量一周两次腹膜内注射抗体。在不同的时间点(第7天、第14天、第21天、第28天和第35天)测量肿瘤的体积(mm3)。使用缓冲液(PBS)作为阴性对照组，并且在阳性对照组中施用阿瓦斯汀。结果在图12中示出。
如图12中所示，与对照组相比，注射抗体的小鼠中，肿瘤生长被显著阻抑。特别地，与注射阿瓦斯汀的组相比，注射抗体的组显示出优越得多的肿瘤生长阻抑作用。
实施例15：确认本发明抗体对视网膜新血管形成的阻抑活性
为了确认本发明抗体对视网膜新血管形成的阻抑活性，如下进行实验。
首先，为了诱导视网膜中的新血管形成，在实验的第0天使用光凝结器(viridislaser，Quantel，法国)向小鼠的右眼施加150mW且530nm的激光，持续0.1秒。损伤后将投影调整至0.1uM。在第0天和第7天，将抗体HF2-4和HF2-11分别以1ug和5ug的剂量注射到右眼球中。在第7天和第14天进行眼底荧光素血管造影术以评估眼底血管发生的程度。使用PBS作为阴性对照组(载剂)，并且使用阿柏西普(Bayerhealthcare)作为阳性对照组(参照药物)。通过dunnett的多重比较检验分析眼底血管造影评分，结果在图13中示出。
如图13中所示，与阴性对照组相比，注射本发明抗体的组显示出对脉络膜血管发生的优越阻抑作用，并且至少等于市售的比较药物。
虽然已经参照以上具体实施方案描述了本发明，然而应当认识到本领域技术人员可以对本发明进行多种修饰和改变，其也落入由所述权利要求所限定之本发明的范围内。

Claims (46)

1.与血管内皮生长因子(VEGF)结合的抗体，所述抗体包含：
1)轻链可变区，其包含互补决定区(CDR)1、CDR2和CDR3，其中所述CDR2由SEQIDNO1的氨基酸序列示出；并且CDR3由SEQIDNO2的氨基酸序列示出；以及
2)重链可变区，其包含CDR1、CDR2和CDR3，其中所述CDR3由SEQIDNO3的氨基酸序列示出。
2.权利要求1所述的与VEGF结合的抗体，其中所述抗体包含：
1)轻链可变区，其包含：
由选自SEQIDNO4至14的氨基酸序列示出的CDR1；由SEQIDNO1的氨基酸序列示出的CDR2；和由SEQIDNO2的氨基酸序列示出的CDR3；以及
2)重链可变区，其包含：
由选自SEQIDNO15至34的氨基酸序列示出的CDR1；由选自SEQIDNO35至50的氨基酸序列示出的CDR2；和由SEQIDNO3的氨基酸序列示出的CDR3。
3.权利要求1所述的与VEGF结合的抗体，其中所述抗体包含：
1)轻链可变区，其由选自SEQIDNO54至65的氨基酸序列示出；以及
2)重链可变区，其由选自SEQIDNO78至104的氨基酸序列示出。
4.权利要求2所述的与VEGF结合的抗体，其中所述抗体包含：
1)轻链可变区，其包含：
由SEQIDNO4的氨基酸序列示出的CDR1；由SEQIDNO1的氨基酸序列示出的CDR2；和由SEQIDNO2的氨基酸序列示出的CDR3；以及
2)重链可变区，其包含：
由SEQIDNO15的氨基酸序列示出的CDR1；由SEQIDNO35的氨基酸序列示出的CDR2；和由SEQIDNO3的氨基酸序列示出的CDR3。
5.权利要求2所述的与VEGF结合的抗体，其中所述抗体包含：
1)轻链可变区，其包含：
由SEQIDNO5的氨基酸序列示出的CDR1；由SEQIDNO1的氨基酸序列示出的CDR2；和由SEQIDNO2的氨基酸序列示出的CDR3；以及
2)重链可变区，其包含：
由SEQIDNO16的氨基酸序列示出的CDR1；由SEQIDNO36的氨基酸序列示出的CDR2；和由SEQIDNO3的氨基酸序列示出的CDR3。
6.权利要求2所述的与VEGF结合的抗体，其中所述抗体包含：
1)轻链可变区，其包含：
由SEQIDNO5的氨基酸序列示出的CDR1；由SEQIDNO1的氨基酸序列示出的CDR2；和由SEQIDNO2的氨基酸序列示出的CDR3；以及
2)重链可变区，其包含：
由SEQIDNO17的氨基酸序列示出的CDR1；由SEQIDNO37的氨基酸序列示出的CDR2；和由SEQIDNO3的氨基酸序列示出的CDR3。
7.权利要求2所述的与VEGF结合的抗体，其中所述抗体包含：
1)轻链可变区，其包含：
由SEQIDNO5的氨基酸序列示出的CDR1；由SEQIDNO1的氨基酸序列示出的CDR2；和由SEQIDNO2的氨基酸序列示出的CDR3；以及
2)重链可变区，其包含：
由SEQIDNO18的氨基酸序列示出的CDR1；由SEQIDNO38的氨基酸序列示出的CDR2；和由SEQIDNO3的氨基酸序列示出的CDR3。
8.权利要求2所述的与VEGF结合的抗体，其中所述抗体包含：
1)轻链可变区，其包含：
由SEQIDNO5的氨基酸序列示出的CDR1；由SEQIDNO1的氨基酸序列示出的CDR2；和由SEQIDNO2的氨基酸序列示出的CDR3；以及
2)重链可变区，其包含：
由SEQIDNO19的氨基酸序列示出的CDR1；由SEQIDNO39的氨基酸序列示出的CDR2；和由SEQIDNO3的氨基酸序列示出的CDR3。
9.权利要求2所述的与VEGF结合的抗体，其中所述抗体包含：
1)轻链可变区，其包含：
由SEQIDNO5的氨基酸序列示出的CDR1；由SEQIDNO1的氨基酸序列示出的CDR2；和由SEQIDNO2的氨基酸序列示出的CDR3；以及
2)重链可变区，其包含：
由SEQIDNO20的氨基酸序列示出的CDR1；由SEQIDNO40的氨基酸序列示出的CDR2；和由SEQIDNO3的氨基酸序列示出的CDR3。
10.权利要求2所述的与VEGF结合的抗体，其中所述抗体包含：
1)轻链可变区，其包含：
由SEQIDNO6的氨基酸序列示出的CDR1；由SEQIDNO1的氨基酸序列示出的CDR2；和由SEQIDNO2的氨基酸序列示出的CDR3；以及
2)重链可变区，其包含：
由SEQIDNO21的氨基酸序列示出的CDR1；由SEQIDNO38的氨基酸序列示出的CDR2；和由SEQIDNO3的氨基酸序列示出的CDR3。
11.权利要求2所述的与VEGF结合的抗体，其中所述抗体包含：
1)轻链可变区，其包含：
由SEQIDNO6的氨基酸序列示出的CDR1；由SEQIDNO1的氨基酸序列示出的CDR2；和由SEQIDNO2的氨基酸序列示出的CDR3；以及
2)重链可变区，其包含：
由SEQIDNO22的氨基酸序列示出的CDR1；由SEQIDNO38的氨基酸序列示出的CDR2；和由SEQIDNO3的氨基酸序列示出的CDR3。
12.权利要求2所述的与VEGF结合的抗体，其中所述抗体包含：
1)轻链可变区，其包含：
由SEQIDNO7的氨基酸序列示出的CDR1；由SEQIDNO1的氨基酸序列示出的CDR2；和由SEQIDNO2的氨基酸序列示出的CDR3；以及
2)重链可变区，其包含：
由SEQIDNO23的氨基酸序列示出的CDR1；由SEQIDNO41的氨基酸序列示出的CDR2；和由SEQIDNO3的氨基酸序列示出的CDR3。
13.权利要求2所述的与VEGF结合的抗体，其中所述抗体包含：
1)轻链可变区，其包含：
由SEQIDNO6的氨基酸序列示出的CDR1；由SEQIDNO1的氨基酸序列示出的CDR2；和由SEQIDNO2的氨基酸序列示出的CDR3；以及
2)重链可变区，其包含：
由SEQIDNO24的氨基酸序列示出的CDR1；由SEQIDNO38的氨基酸序列示出的CDR2；和由SEQIDNO3的氨基酸序列示出的CDR3。
14.权利要求2所述的与VEGF结合的抗体，其中所述抗体包含：
1)轻链可变区，其包含：
由SEQIDNO6的氨基酸序列示出的CDR1；由SEQIDNO1的氨基酸序列示出的CDR2；和由SEQIDNO2的氨基酸序列示出的CDR3；以及
2)重链可变区，其包含：
由SEQIDNO25的氨基酸序列示出的CDR1；由SEQIDNO38的氨基酸序列示出的CDR2；和由SEQIDNO3的氨基酸序列示出的CDR3。
15.权利要求2所述的与VEGF结合的抗体，其中所述抗体包含：
1)轻链可变区，其包含：
由SEQIDNO8的氨基酸序列示出的CDR1；由SEQIDNO1的氨基酸序列示出的CDR2；和由SEQIDNO2的氨基酸序列示出的CDR3；以及
2)重链可变区，其包含：
由SEQIDNO26的氨基酸序列示出的CDR1；由SEQIDNO42的氨基酸序列示出的CDR2；和由SEQIDNO3的氨基酸序列示出的CDR3。
16.权利要求2所述的与VEGF结合的抗体，其中所述抗体包含：
1)轻链可变区，其包含：
由SEQIDNO6的氨基酸序列示出的CDR1；由SEQIDNO1的氨基酸序列示出的CDR2；和由SEQIDNO2的氨基酸序列示出的CDR3；以及
2)重链可变区，其包含：
由SEQIDNO27的氨基酸序列示出的CDR1；由SEQIDNO38的氨基酸序列示出的CDR2；和由SEQIDNO3的氨基酸序列示出的CDR3。
17.权利要求2所述的与VEGF结合的抗体，其中所述抗体包含：
1)轻链可变区，其包含：
由SEQIDNO9的氨基酸序列示出的CDR1；由SEQIDNO1的氨基酸序列示出的CDR2；和由SEQIDNO2的氨基酸序列示出的CDR3；以及
2)重链可变区，其包含：
由SEQIDNO28的氨基酸序列示出的CDR1；由SEQIDNO43的氨基酸序列示出的CDR2；和由SEQIDNO3的氨基酸序列示出的CDR3。
18.权利要求2所述的与VEGF结合的抗体，其中所述抗体包含：
1)轻链可变区，其包含：
由SEQIDNO5的氨基酸序列示出的CDR1；由SEQIDNO1的氨基酸序列示出的CDR2；和由SEQIDNO2的氨基酸序列示出的CDR3；以及
2)重链可变区，其包含：
由SEQIDNO29的氨基酸序列示出的CDR1；由SEQIDNO44的氨基酸序列示出的CDR2；和由SEQIDNO3的氨基酸序列示出的CDR3。
19.权利要求2所述的与VEGF结合的抗体，其中所述抗体包含：
1)轻链可变区，其包含：
由SEQIDNO10的氨基酸序列示出的CDR1；由SEQIDNO1的氨基酸序列示出的CDR2；和由SEQIDNO2的氨基酸序列示出的CDR3；以及
2)重链可变区，其包含：
由SEQIDNO30的氨基酸序列示出的CDR1；由SEQIDNO45的氨基酸序列示出的CDR2；和由SEQIDNO3的氨基酸序列示出的CDR3。
20.权利要求2所述的与VEGF结合的抗体，其中所述抗体包含：
1)轻链可变区，其包含：
由SEQIDNO11的氨基酸序列示出的CDR1；由SEQIDNO1的氨基酸序列示出的CDR2；和由SEQIDNO2的氨基酸序列示出的CDR3；以及
2)重链可变区，其包含：
由SEQIDNO31的氨基酸序列示出的CDR1；由SEQIDNO42的氨基酸序列示出的CDR2；和由SEQIDNO3的氨基酸序列示出的CDR3。
21.权利要求2所述的与VEGF结合的抗体，其中所述抗体包含：
1)轻链可变区，其包含：
由SEQIDNO11的氨基酸序列示出的CDR1；由SEQIDNO1的氨基酸序列示出的CDR2；和由SEQIDNO2的氨基酸序列示出的CDR3；以及
2)重链可变区，其包含：
由SEQIDNO20的氨基酸序列示出的CDR1；由SEQIDNO39的氨基酸序列示出的CDR2；和由SEQIDNO3的氨基酸序列示出的CDR3。
22.权利要求2所述的与VEGF结合的抗体，其中所述抗体包含：
1)轻链可变区，其包含：
由SEQIDNO11的氨基酸序列示出的CDR1；由SEQIDNO1的氨基酸序列示出的CDR2；和由SEQIDNO2的氨基酸序列示出的CDR3；以及
2)重链可变区，其包含：
由SEQIDNO32的氨基酸序列示出的CDR1；由SEQIDNO46的氨基酸序列示出的CDR2；和由SEQIDNO3的氨基酸序列示出的CDR3。
23.权利要求2所述的与VEGF结合的抗体，其中所述抗体包含：
1)轻链可变区，其包含：
由SEQIDNO5的氨基酸序列示出的CDR1；由SEQIDNO1的氨基酸序列示出的CDR2；和由SEQIDNO2的氨基酸序列示出的CDR3；以及
2)重链可变区，其包含：
由SEQIDNO33的氨基酸序列示出的CDR1；由SEQIDNO45的氨基酸序列示出的CDR2；和由SEQIDNO3的氨基酸序列示出的CDR3。
24.权利要求2所述的与VEGF结合的抗体，其中所述抗体包含：
1)轻链可变区，其包含：
由SEQIDNO5的氨基酸序列示出的CDR1；由SEQIDNO1的氨基酸序列示出的CDR2；和由SEQIDNO2的氨基酸序列示出的CDR3；以及
2)重链可变区，其包含：
由SEQIDNO34的氨基酸序列示出的CDR1；由SEQIDNO47的氨基酸序列示出的CDR2；和由SEQIDNO3的氨基酸序列示出的CDR3。
25.权利要求2所述的与VEGF结合的抗体，其中所述抗体包含：
1)轻链可变区，其包含：
由SEQIDNO6的氨基酸序列示出的CDR1；由SEQIDNO1的氨基酸序列示出的CDR2；和由SEQIDNO2的氨基酸序列示出的CDR3；以及
2)重链可变区，其包含：
由SEQIDNO25的氨基酸序列示出的CDR1；由SEQIDNO48的氨基酸序列示出的CDR2；和由SEQIDNO3的氨基酸序列示出的CDR3。
26.权利要求2所述的与VEGF结合的抗体，其中所述抗体包含：
1)轻链可变区，其包含：
由SEQIDNO12的氨基酸序列示出的CDR1；由SEQIDNO1的氨基酸序列示出的CDR2；和由SEQIDNO2的氨基酸序列示出的CDR3；以及
2)重链可变区，其包含：
由SEQIDNO31的氨基酸序列示出的CDR1；由SEQIDNO38的氨基酸序列示出的CDR2；和由SEQIDNO3的氨基酸序列示出的CDR3。
27.权利要求2所述的与VEGF结合的抗体，其中所述抗体包含：
1)轻链可变区，其包含：
由SEQIDNO9的氨基酸序列示出的CDR1；由SEQIDNO1的氨基酸序列示出的CDR2；和由SEQIDNO2的氨基酸序列示出的CDR3；以及
2)重链可变区，其包含：
由SEQIDNO31的氨基酸序列示出的CDR1；由SEQIDNO46的氨基酸序列示出的CDR2；和由SEQIDNO3的氨基酸序列示出的CDR3。
28.权利要求2所述的与VEGF结合的抗体，其中所述抗体包含：
1)轻链可变区，其包含：
由SEQIDNO10的氨基酸序列示出的CDR1；由SEQIDNO1的氨基酸序列示出的CDR2；和由SEQIDNO2的氨基酸序列示出的CDR3；以及
2)重链可变区，其包含：
由SEQIDNO17的氨基酸序列示出的CDR1；由SEQIDNO42的氨基酸序列示出的CDR2；和由SEQIDNO3的氨基酸序列示出的CDR3。
29.权利要求2所述的与VEGF结合的抗体，其中所述抗体包含：
1)轻链可变区，其包含：
由SEQIDNO13的氨基酸序列示出的CDR1；由SEQIDNO1的氨基酸序列示出的CDR2；和由SEQIDNO2的氨基酸序列示出的CDR3；以及
2)重链可变区，其包含：
由SEQIDNO34的氨基酸序列示出的CDR1；由SEQIDNO49的氨基酸序列示出的CDR2；和由SEQIDNO3的氨基酸序列示出的CDR3。
30.权利要求2所述的与VEGF结合的抗体，其中所述抗体包含：
1)轻链可变区，其包含：
由SEQIDNO14的氨基酸序列示出的CDR1；由SEQIDNO1的氨基酸序列示出的CDR2；和由SEQIDNO2的氨基酸序列示出的CDR3；以及
2)重链可变区，其包含：
由SEQIDNO17的氨基酸序列示出的CDR1；由SEQIDNO50的氨基酸序列示出的CDR2；和由SEQIDNO3的氨基酸序列示出的CDR3。
31.权利要求1所述的与VEGF结合的抗体，其中所述抗体是人抗体或人源化抗体。
32.权利要求1所述的与VEGF结合的抗体，其中所述抗体是IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1、IgA2、IgD、IgE、IgM或者其组合或变体。
33.权利要求32所述的与VEGF结合的抗体，其中所述抗体的形式为Fab、Fab′、F(ab′)2、Fv、dAb、scFv或骨架缀合物，其包含所述抗体的CDR作为用于与VEGF结合的主要部分。
34.编码与VEGF结合之抗体的轻链可变区的DNA，所述轻链可变区包含由SEQIDNO1的氨基酸序列示出的CDR2；和由SEQIDNO2的氨基酸序列示出的CDR3。
35.权利要求34所述的DNA，其包含：
SEQIDNO51的碱基序列，所述碱基序列编码由SEQIDNO1的氨基酸序列示出的CDR2；以及
SEQIDNO52的碱基序列，所述碱基序列编码由SEQIDNO2的氨基酸序列示出的CDR3。
36.编码与VEGF结合之抗体的重链可变区的DNA，所述重链可变区包含由SEQIDNO3的氨基酸序列示出的CDR3。
37.权利要求36所述的DNA，其包含SEQIDNO53的碱基序列，所述碱基序列编码由SEQIDNO3的氨基酸序列示出的CDR3。
38.包含权利要求34所述的DNA的表达载体，所述载体表达与VEGF结合之抗体的轻链可变区。
39.包含权利要求36所述的DNA的表达载体，所述载体表达与VEGF结合之抗体的重链可变区。
40.动物细胞系，其被权利要求38和39所述的表达载体转化。
41.权利要求40所述的动物细胞系，其中所述动物细胞系是CHO细胞、HEK细胞或NS0细胞。
42.用于预防、诊断或者治疗由VEGF过表达引起的血管发生相关疾病或癌症的药物组合物，所述组合物包含根据权利要求1所述的抗体。
43.权利要求42所述的药物组合物，其中所述由VEGF过表达引起的血管发生相关疾病或癌症选自：选自结肠直肠癌、胰腺癌、肾癌、肺癌、乳腺癌、卵巢癌和脑癌的癌症；以及选自黄斑变性、糖尿病性视网膜病变和缺血性视网膜病变的眼部疾病。
44.权利要求42所述的药物组合物，其中所述药物组合物与选自以下的化学治疗剂组合使用：烷基化剂、抗代谢物、叶酸同系物、嘧啶同系物、嘌呤同系物和相关抑制剂，长春花生物碱、表鬼臼毒素、抗生素、L-天冬酰胺酶、拓扑异构酶抑制剂、干扰素、铂配合物、蒽二酮取代的尿素、甲基肼衍生物、肾上腺皮质抑制剂、肾上腺皮质类固醇、孕激素、雌激素、抗雌激素、雄激素、抗雄激素和促性腺激素释放激素同系物。
45.权利要求42所述的药物组合物，其中所述药物组合物与选自以下的药物组合使用：基于氟嘧啶的药物、紫杉醇、基于铂的药物，干扰素α-2a、卡铂、多柔比星、顺铂、吉西他滨、5-氟尿嘧啶、甲酰四氢叶酸、伊立替康、奥沙利铂、卡培他滨、多西他赛及其混合物。
46.用于由VEGF过表达引起的血管发生相关疾病或癌症的诊断试剂盒，所述试剂盒包含根据权利要求1所述的与VEGF结合的抗体。
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Granted publication date: 20190827

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