CN105255953A - 物理-化学-生物预处理玉米秸秆的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种物理-化学-生物预处理玉米秸秆的方法，玉米秸秆先进行粉碎物理处理，再进行稀碱化学处理，最后利用黄孢原毛平革菌和纤维素降解菌对玉米秸秆进行生物处理。本发明采用稀碱处理有助于木质素的去除，采用混菌发酵有助于充分降解玉米秸秆，提高其利用率，预处理后的秸秆接入产乙醇微生物生产乙醇，或接入饲料酵母生产蛋白饲料。本发明工艺较为简单，便于实施。
Description
技术领域
本发明涉及秸秆的预处理方法，具体涉及一种物理-化学-生物预处理玉米秸秆的方法，属于生物化学技术领域。
背景技术
秸秆是一种非常丰富的可再生能源，主要由纤维素、半纤维素和木质素组成。其中木质素是一种高分子芳香族化合物，不能水解成糖，而纤维素和半纤维素都是潜在的可发酵糖的来源。将植物秸秆糖化（酶水解），转化为可发酵糖，通过微生物发酵生产燃料酒精、单细胞蛋白和有机酸被认为是利用植物秸秆的有效途径之一，但秸秆中纤维素、半纤维素和木质素互相交织在一起形成细胞壁结构，并把细胞黏合在一起，这种相互交织的结构决定了任何一类成分的降解必然会受到其它成分的制约，特别是木质素对纤维素的包覆作用。此外，纤维素大分子间通过大量的氢键连接在一起形成晶体结构的纤维束，这种特殊结构使得葡萄糖链有序且紧密的堆积，形成了高度结晶的结构。因此这些特点使许多纤维素分解菌降解秸秆效率低下。所以对秸秆进行有效预处理是秸秆资源化利用中最为重要的一个环节。常见的预处理方法为物理预处理(例如机械粉粹、研磨、蒸汽爆破、辐射处理、微波预处理、超声波预处理等)、化学预处理(稀酸、稀碱、氨水等)、生物预处理(复合菌剂、白腐真菌、酶等)和组合预处理(如超声波与碱法联合预处理等)。由于各个处理方法都有一定缺陷，比如化学、物理法处理有环境污染、能耗高的问题，而生物法处理周期长，效率低。
发明内容
本发明的目的是：提供一种物理-化学-生物预处理玉米秸秆的方法，采用复合技术即物理、化学和生物方法混合使用，弥补各自的不足，发挥最大的效应。
本发明的技术解决方案是该预处理玉米秸秆的方法包括以下步骤：
（1）物理处理：玉米秸秆先通过粉碎机进行粉碎，粉碎后过40目筛；
（2）化学处理：用质量浓度1.0%的NaOH溶液处理粉碎后的玉米秸秆，固液比为1：10，100℃1h，过滤，滤渣水洗至中性，烘干至恒重，作为发酵底物；
（3）生物处理：先制备每10mL含FeSO4·7H2O0.0005g、MnSO4·7H2O0.0016g、ZnSO4·7H2O0.0014g、CoCl20.002g的微量元素混合液；其次制备营养溶液，营养溶液中各组分的质量百分比浓度是：(NH4)2SO41%，KH2PO40.3%，MgSO40.05%，CaCl20.05%，其余是水；接着制备混合液，混合液由每100mL营养溶液中添加微量元素混合液1mL制得；向步骤（2）的发酵底物中依料液比为1:2.25加混合液，调节pH5.5，在121℃灭菌20min，得固态发酵培养基；将配制成菌浓度为106个/mL的黄孢原毛平革菌孢子悬浮液以质量10%的接种量接入固态发酵培养基中，发酵10d；再以质量10%-14%的接种量接入106个/mL的纤维素降解菌孢子悬浮液，28℃培养3-5d后，得到预处理产物。
其中，纤维素降解菌为黑曲霉、绿色木霉和Trichodermaasperelloides中的一种或几种；几种霉的混合比例分别为：黑曲霉:绿色木霉=1:1，黑曲霉:Trichodermaasperelloides=1:1，绿色木霉:Trichodermaasperelloides=1:1，黑曲霉:绿色木霉:Trichodermaasperelloides=1:1:1，黑曲霉:绿色木霉:Trichodermaasperelloides=2:1:1，黑曲霉:绿色木霉:Trichodermaasperelloides=1:2:1，黑曲霉:绿色木霉:Trichodermaasperelloides=1:1:2。
其中，所述黑曲霉和绿色木霉采用PDA固体培养基进行活化，PDA培养基的制备过程是：将马铃薯洗净去皮后称取200g马铃薯切成小块，加水煮烂，再用八层纱布过滤，加入15g琼脂，继续加热搅拌混匀，待琼脂溶解完后加入20g葡萄糖，搅拌均匀，稍冷却后再补足水分至1000mL。
其中，所述的Trichodermaasperelloides采用麦芽汁固体培养基进行活化，麦芽汁固体培养基的制备过程是：称取一定数量麦芽，粉碎，加4倍于麦芽量的水，在55-60℃保温糖化，不断搅拌，糖化程度用碘滴定，经3-4h后，将糖化液用4-6层纱布过滤；过滤液用鸡蛋清澄清，方法是将一个鸡蛋白加水约20mL，调匀至产生泡沫为止，然后倒入糖化液中搅拌，煮沸后再过滤，得澄清的麦芽汁；加水稀释成5-6°Bé的麦芽汁；麦芽汁中加16g琼脂，0.1MPa压力，灭菌15min，得麦芽汁固体培养基。
其中，所述的黄孢原毛平革菌利用综合PDA固体培养基进行活化，综合PDA培养基的制备过程是：在1LPDA固体培养基的基础上加入KH2PO43g、MgSO41.5g、维生素B10.001g。
其中，所涉及到的微生物孢子悬浮液的制备方法为：将活化好的菌株用无菌水洗涤孢子，置于含玻璃珠的三角瓶中，在28℃120r/min摇床振荡20min，用4层灭菌擦镜纸过滤振荡液，在显微镜下用血球计数板对滤液中孢子进行计数，调整其浓度至106个/mL，保存在4℃冰箱备用。
本发明的优点是：
1、本发明采用稀碱预处理、黄孢原毛平革菌发酵处理极大提高了秸秆中木质素的降解率。
2、本发明研究了混菌发酵对秸秆中木质素、半纤维素和纤维素降解率的影响，发现采用混菌发酵降解作物秸秆，不同微生物在降解中分泌互补性酶，在代谢中使秸秆得到充分降解，从而提高了秸秆纤维素的降解率。
3、本发明是在比较了不同预处理方法对秸秆中木质素、半纤维素、纤维素含量变化的影响后筛选出来的，采用稀碱处理去除部分木质素，利用高效降解微生物对秸秆进行生物预处理，预处理之后秸秆中木质素、半纤维素和纤维素的降解率分别达到95%、75%和35%以上，极大提高了秸秆的可利用效率，所需设备简单，工艺简便，经过此预处理的玉米秸秆可单独或配以麸皮、豆渣，利用接入产乙醇微生物生产乙醇或接入饲料酵母生产蛋白饲料等。解决了农作物秸秆难于降解再利用的难题，非常具有意义。
附图说明
图1为不同预处理方法对玉米秸秆中木质素、纤维素和半纤维素含量变化的影响。
图2为不同纤维素降解菌组合和接种比例对玉米秸秆中木质素、纤维素和半纤维素含量变化的影响。
图3为纤维素降解菌接种量对玉米秸秆中木质素、纤维素和半纤维素含量变化的影响。
图4为纤维素降解菌发酵天数对玉米秸秆中木质素、纤维素和半纤维素含量变化的影响。
具体实施方式
下面结合具体实施例进一步说明本发明的技术解决方案，这些实施例不能理解为是对技术方案的限制。
实施例1：依以下步骤预处理玉米秸秆
（1）玉米秸秆先通过粉碎机进行粉碎，粉碎后过40目筛；
（2）用质量浓度1.0%的NaOH溶液处理粉碎后的玉米秸秆，固液比为1：10，100℃1h，过滤，滤渣水洗至中性，烘干至恒重，作为发酵底物；
（3）先制备每10mL含FeSO4·7H2O0.0005g、MnSO4·7H2O0.0016g、ZnSO4·7H2O0.0014g、CoCl2.0.002g的微量元素混合液；其次制备营养溶液，营养溶液中各组分的质量百分比浓度是：(NH4)2SO41%，KH2PO40.3%，MgSO40.05%，CaCl20.05%，其余是水；接着制备混合液，混合液由每100mL营养溶液中添加微量元素混合液1mL制得；向步骤（2）的发酵底物中依料液比为1:2.25加混合液，调节pH5.5，在121℃下灭菌20min，得固态发酵培养基；将配制成菌浓度为106个/mL的黄孢原毛平革菌孢子悬浮液以质量10%的接种量接入固态发酵培养基中，发酵10d；再以质量10%的接种量接入106个/mL的黑曲霉孢子悬浮液，28℃培养3d，得到预处理产物。
如图1第8组所示，此时秸秆中木质素、半纤维素和纤维素的降解率分别为98.7%、81.6%和43.2%。
实施例2：步骤（1）、（2）同实施例1；步骤（3）混合液的配制同实施例1；向步骤（2）的发酵底物中依料液比为1:2.25加混合液，调节pH5.5，在121℃下灭菌20min，得固态发酵培养基；将配制成菌浓度为106个/mL的黄孢原毛平革菌孢子悬浮液以质量10%的接种量接入固态发酵培养基中，发酵10d；再以质量10%的接种量接入106个/mL的绿色木霉孢子悬浮液，28℃培养4d，得到预处理产物。
如图2第1组所示，此时秸秆中木质素、半纤维素和纤维素的降解率分别为98.1%、77.1%和41.6%。
实施例3：步骤（1）、（2）同实施例1；步骤（3）混合液的配制同实施例1；向步骤（2）的发酵底物中依料液比为1:2.25加混合液，调节pH5.5，在121℃下灭菌20min，得固态发酵培养基；将配制成菌浓度为106个/mL的黄孢原毛平革菌孢子悬浮液以质量10%的接种量接入固态发酵培养基中，发酵10d；再以质量10%的接种量接入106个/mL的Trichodermaasperelloides孢子悬浮液，28℃培养4d，得到预处理产物。
如图2第2组所示，此时秸秆中木质素、半纤维素和纤维素的降解率分别为98.8%、81.7%和44.2%。
实施例4：步骤（1）、（2）同实施例1；步骤（3）混合液的配制同实施例1；向步骤（2）的发酵底物中依料液比为1:2.25加混合液，调节pH5.5，在121℃下灭菌20min，得固态发酵培养基；将配制成菌浓度为106个/mL的黄孢原毛平革菌孢子悬浮液以质量10%的接种量接入固态发酵培养基中，发酵10d；再以质量10%的接种量接入106个/mL的纤维素降解菌孢子悬浮液，28℃培养4d，得到预处理产物；其中，纤维素降解菌孢子悬浮液中黑曲霉、绿色木霉两菌接种比例为1:1。
如图2第3组所示，此时秸秆中木质素、半纤维素和纤维素的降解率分别为99.1%、78.1%和45.9%。
实施例5：步骤（1）、（2）同实施例1；步骤（3）混合液的配制同实施例1；向步骤（2）的发酵底物中依料液比为1:2.25加混合液，调节pH5.5，在121℃下灭菌20min，得固态发酵培养基；将配制成菌浓度为106个/mL的黄孢原毛平革菌孢子悬浮液以质量10%的接种量接入固态发酵培养基中，发酵10d；再以质量10%的接种量接入106个/mL的纤维素降解菌孢子悬浮液，28℃培养4d，得到预处理产物；其中，纤维素降解菌孢子悬浮液中黑曲霉、Trichodermaasperelloides两菌接种比例为1:1。
如图2第4组所示，此时秸秆中木质素、半纤维素和纤维素的降解率分别为98.7%、81.3%和47.8%。
实施例6：步骤（1）、（2）同实施例1；步骤（3）混合液的配制同实施例1；向步骤（2）的发酵底物中依料液比为1:2.25加混合液，调节pH5.5，在121℃下灭菌20min，得固态发酵培养基；将配制成菌浓度为106个/mL的黄孢原毛平革菌孢子悬浮液以质量10%的接种量接入固态发酵培养基中，发酵10d；再以质量10%的接种量接入106个/mL的纤维素降解菌孢子悬浮液，28℃培养4d，得到预处理产物；其中，纤维素降解菌孢子悬浮液中绿色木霉、Trichodermaasperelloides两菌接种比例为1:1。
如图2第5组所示，此时秸秆中木质素、半纤维素和纤维素的降解率分别为99.3%、81.4%和47.5%。
实施例7：步骤（1）、（2）同实施例1；步骤（3）混合液的配制同实施例1；向步骤（2）的发酵底物中依料液比为1:2.25加混合液，调节pH5.5，在121℃下灭菌20min，得固态发酵培养基；将配制成菌浓度为106个/mL的黄孢原毛平革菌孢子悬浮液以质量10%的接种量接入固态发酵培养基中，发酵10d；再以质量10%的接种量接入106个/mL的纤维素降解菌孢子悬浮液，28℃培养4d，得到用于蛋白饲料生产的预处理产物；其中，纤维素降解菌孢子悬浮液中黑曲霉、绿色木霉、Trichodermaasperelloides三菌接种比例为1:1:1。
如图2第6组所示，此时秸秆中木质素、半纤维素和纤维素的降解率分别为98.6%、82.5%和49.9%。
实施例8：步骤（1）、（2）同实施例1；步骤（3）混合液的配制同实施例1；向步骤（2）的发酵底物中依料液比为1:2.25加混合液，调节pH5.5，在121℃下灭菌20min，得固态发酵培养基；将配制成菌浓度为106个/mL的黄孢原毛平革菌孢子悬浮液以质量10%的接种量接入固态发酵培养基中，发酵10d；再以质量10%的接种量接入106个/mL的纤维素降解菌孢子悬浮液，28℃培养4d，得到用于蛋白饲料生产的预处理产物；其中，纤维素降解菌孢子悬浮液中黑曲霉、绿色木霉、Trichodermaasperelloides三菌接种比例为2:1:1。
如图2第7组所示，此时秸秆中木质素、半纤维素和纤维素的降解率分别为98.2%、81.9%和48.7%。
实施例9：步骤（1）、（2）同实施例1；步骤（3）混合液的配制同实施例1；向步骤（2）的发酵底物中依料液比为1:2.25加混合液，调节pH5.5，在121℃下灭菌20min，得固态发酵培养基；将配制成菌浓度为106个/mL的黄孢原毛平革菌孢子悬浮液以质量10%的接种量接入固态发酵培养基中，发酵10d；再以质量10%的接种量接入106个/mL的纤维素降解菌孢子悬浮液，28℃培养4d，得到用于蛋白饲料生产的预处理产物；其中，纤维素降解菌孢子悬浮液中黑曲霉、绿色木霉、Trichodermaasperelloides三菌接种比例为1:2:1。
如图2第8组所示，此时秸秆中木质素、半纤维素和纤维素的降解率分别为99.2%、83.8%和48.1%。
实施例10：步骤（1）、（2）同实施例1；步骤（3）混合液的配制同实施例1；向步骤（2）的发酵底物中依料液比为1:2.25加混合液，调节pH5.5，在121℃下灭菌20min，得固态发酵培养基；将配制成菌浓度为106个/mL的黄孢原毛平革菌孢子悬浮液以质量10%的接种量接入固态发酵培养基中，发酵10d；再以质量12%的接种量接入106个/mL的纤维素降解菌孢子悬浮液，28℃培养4d，得到用于蛋白饲料生产的预处理产物；其中，纤维素降解菌孢子悬浮液中黑曲霉、绿色木霉、Trichodermaasperelloides三菌接种比例为1:1:2。
如图3所示，此时秸秆中木质素、半纤维素和纤维素的降解率分别为98%、84.3%和53.2%。
实施例11：步骤（1）、（2）同实施例1；步骤（3）混合液的配制同实施例1；向步骤（2）的发酵底物中依料液比为1:2.25加混合液，调节pH5.5，在121℃下灭菌20min，得固态发酵培养基；将配制成菌浓度为106个/mL的黄孢原毛平革菌孢子悬浮液以质量10%的接种量接入固态发酵培养基中，发酵10d；再以质量14%的接种量接入106个/mL的纤维素降解菌孢子悬浮液，28℃培养5d，得到用于蛋白饲料生产的预处理产物；其中，纤维素降解菌孢子悬浮液中黑曲霉、绿色木霉、Trichodermaasperelloides三菌接种比例为1:1:2。
如图4所示，此时秸秆中木质素、半纤维素和纤维素的降解率分别为98.6%、86.7%和58.3%。
图1为不同预处理方法对玉米秸秆中木质素、纤维素和半纤维素含量变化的影响；1表示粉碎+稀酸组，2表示粉碎+稀碱组，3表示粉碎+氨水组，4表示粉碎+微波+稀碱组，5表示粉碎+微波+氨水组，6表示粉碎+白腐菌+黑曲霉组，7表示粉碎+稀酸+白腐菌+黑曲霉组，8表示粉碎+稀碱+白腐菌+黑曲霉组，9表示粉碎+氨水+白腐菌+黑曲霉组，10表示粉碎+微波+稀碱+白腐菌+黑曲霉组，11表示粉碎+微波+氨水+白腐菌+黑曲霉组，最终选择第8组的原因，虽然第10组的纤维素降解率高于第8组，但是第10组纤维素的降解有一部分是发生在粉碎+微波+稀碱预处理阶段的，而此阶段纤维素的降解无法为酵母菌提供碳源，因为物理-化学预处理后，需要过滤，滤渣水洗至中性，烘干至恒重才作为发酵底物。因此相比较而言，第8组的预处理方案较好。
图2为不同纤维素降解菌组合和接种比例对玉米秸秆中木质素、纤维素和半纤维素含量变化的影响；实验组1为绿色木霉，实验组2为Trichodermaasperelloides，实验组3为黑曲霉:绿色木霉=1:1，实验组4为黑曲霉:Trichodermaasperelloides=1:1，实验组5为绿色木霉:Trichodermaasperelloides=1:1，实验组6为黑曲霉:绿色木霉:Trichodermaasperelloides=1:1:1，实验组7为黑曲霉:绿色木霉:Trichodermaasperelloides=2:1:1，实验组8为黑曲霉:绿色木霉:Trichodermaasperelloides=1:2:1，实验组9为黑曲霉:绿色木霉:Trichodermaasperelloides=1:1:2。
图3为纤维素降解菌接种量对玉米秸秆中木质素、纤维素和半纤维素含量变化的影响。
图4纤维素降解菌发酵天数对玉米秸秆中木质素、纤维素和半纤维素含量变化的影响。
Claims (6)
1.物理-化学-生物预处理玉米秸秆的方法，其特征是该预处理玉米秸秆的方法包括以下步骤：
（1）物理处理：玉米秸秆先通过粉碎机进行粉碎，粉碎后过40目筛；
（2）化学处理：用质量浓度1.0%的NaOH溶液处理粉碎后的玉米秸秆，固液比为1：10，100℃1h，过滤，滤渣水洗至中性，烘干至恒重，作为发酵底物；
（3）生物处理：先制备每10mL含FeSO4·7H2O0.0005g、MnSO4·7H2O0.0016g、ZnSO4·7H2O0.0014g、CoCl20.002g的微量元素混合液；其次制备营养溶液，营养溶液中各组分的质量百分比浓度是：(NH4)2SO41%，KH2PO40.3%，MgSO40.05%，CaCl20.05%，其余是蒸馏水；接着制备混合液，混合液由每100mL营养溶液中添加微量元素混合液1mL制得；向步骤（2）的发酵底物中依料液比为1:2.25加混合液，调节pH5.5，在121℃灭菌20min，得固态发酵培养基；将配制成菌浓度为106个/mL的黄孢原毛平革菌孢子悬浮液以质量10%的接种量接入固态发酵培养基中，发酵10d；再以质量10%-14%的接种量接入106个/mL的纤维素降解菌孢子悬浮液，28℃培养3-5d，得到预处理产物。
2.根据权利要求1所述的物理-化学-生物预处理玉米秸秆的方法，其特征是：纤维素降解菌为黑曲霉、绿色木霉和Trichodermaasperelloides中的一种或几种；几种霉的混合比例分别为：黑曲霉:绿色木霉=1:1，黑曲霉:Trichodermaasperelloides=1:1，绿色木霉:Trichodermaasperelloides=1:1，黑曲霉:绿色木霉:Trichodermaasperelloides=1:1:1，黑曲霉:绿色木霉:Trichodermaasperelloides=2:1:1，黑曲霉:绿色木霉:Trichodermaasperelloides=1:2:1，黑曲霉:绿色木霉:Trichodermaasperelloides=1:1:2。
3.根据权利要求2所述的物理-化学-生物预处理玉米秸秆的方法，其特征是：所述黑曲霉和绿色木霉采用PDA固体培养基进行活化，PDA培养基的制备过程是：将马铃薯洗净去皮后称取200g马铃薯切成小块，加水煮烂，再用八层纱布过滤，加入15g琼脂，继续加热搅拌混匀，待琼脂溶解完后加入20g葡萄糖，搅拌均匀，稍冷却后再补足水分至1000mL。
4.根据权利要求2所述的物理-化学-生物预处理玉米秸秆的方法，其特征是：所述的Trichodermaasperelloides采用麦芽汁固体培养基进行活化，麦芽汁固体培养基的制备过程是：称取一定数量麦芽，粉碎，加4倍于麦芽量的水，55-60℃保温糖化，不断搅拌，糖化程度用碘滴定，经3-4h后，将糖化液用4-6层纱布过滤；过滤液用鸡蛋清澄清，方法是将一个鸡蛋白加水约20mL，调匀至产生泡沫为止，然后倒入糖化液中搅拌，煮沸后再过滤，即得澄清的麦芽汁；加水稀释成5-6°Bé的麦芽汁；麦芽汁中加16g琼脂，0.1MPa压力，灭菌15min，得麦芽汁固体培养基。
5.根据权利要求1所述的物理-化学-生物预处理玉米秸秆的方法，其特征是：所述的黄孢原毛平革菌利用综合PDA固体培养基进行活化，综合PDA培养基的制备过程是：在1LPDA固体培养基的基础上加入KH2PO43g、MgSO41.5g、维生素B10.001g。
6.根据权利要求3、4或5所述的物理-化学-生物预处理玉米秸秆的方法，其特征是所涉及到的微生物孢子悬浮液的制备方法为：将活化好的菌株用无菌水洗涤孢子，置于含玻璃珠的三角瓶中，在28℃120r/min摇床振荡20min，用4层灭菌擦镜纸过滤振荡液，在显微镜下用血球计数板对滤液中孢子进行计数，调整其浓度至106个/mL，保存在4℃冰箱备用。
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