CN105246917A

CN105246917A - 生产单克隆IgA抗体的方法

Info

Publication number: CN105246917A
Application number: CN201480026684.0A
Authority: CN
Inventors: 新蔵礼子
Original assignee: Kansai Bunri Sogo Gakuen
Current assignee: Kansai Bunri Sogo Gakuen
Priority date: 2013-03-11
Filing date: 2014-03-10
Publication date: 2016-01-13
Also published as: JPWO2014142084A1; EP2995679A4; EP2995679A1; JP2016183153A; US20180009906A1; WO2014142084A1; US20160039944A1; JP5916946B2; US9765151B2

Abstract

本发明提供了改善或最优化活体内肠内环境或抑制肠内腐败，或抑制肠内细菌的异常增殖和/或病变的成分以及适用于治疗肠内疾病的有效成分。本发明提供了与丝氨酸羟甲基转移酶的第1～333位氨基酸结合的单克隆IgA抗体。

Description

生产单克隆IgA抗体的方法

技术领域

本发明涉及单克隆IgA抗体、包含该单克隆IgA抗体的经口或经肠道的组合物和包含该单克隆IgA抗体的药物组合物。

背景技术

对活体来说，肠道内与体外相当，总是暴露于很多种且大量的肠内固有细菌、病毒和来源于食物等的抗原。这些肠内固有细菌形成肠内细菌丛(下文中，有时将其称为“肠内细菌群”)。

众所周知，肠内细菌丛通过由肠上皮细胞等构成的粘膜面对活体履行各种功能，还已经发现当不存在肠内细菌时，肠道免疫系统不能正常发展(非专利文献1至3)。

如果肠内细菌丛发生变化，并且宿主和肠内细菌之间的共生关系被破坏，则肠道免疫系统会被过度刺激，而破坏肠道免疫系统的体内平衡，进而诱发炎症性肠病、结直肠癌、哮喘、变态反应和肥胖症等多种疾病。鉴于此，已知肠道免疫系统不仅在消除病原体等中起到重要作用，而且在维持整个免疫系统的体内平衡上也起到重要作用(非专利文献4至7)。

消化管的粘膜组织表面是固有细菌、病原性微生物和过敏原等抗原侵入活体的途径之一，它们作为来自外部环境的很多病原性微生物的侵入部位受到持续攻击，并且暴露于各种抗原。识别和/或应答以这些病原性微生物为主的外来抗原的系统被称为粘膜免疫系统。负责粘膜免疫系统的很多细胞存在于消化管的粘膜组织表面的正下方，这些细胞针对病原性微生物、食物抗原、过敏原、外源性外来抗原等进行免疫应答，形成动态的免疫组织。

粘膜免疫系统构成针对通过由肠上皮细胞构成的粘膜面吸收的外源性外来抗原以来源于肠道的IgA抗体为中心的独特的免疫系统。肠道来源的IgA抗体不仅以T细胞依赖的方式在特定组织内产生，而且由在肠道粘膜固有层中散布的产生抗体的细胞大量产生，其中特定组织是免疫应答的部位，诸如派伊尔氏淋巴集结(Peyer’spatches)、肠系膜淋巴结和孤立淋巴滤泡(isolatedlymphoidfollicles)(非专利文献8和9)。

肠道来源的IgA抗体的功能之一是消除病原体。被分泌到管腔侧的肠道来源的IgA抗体与肠腔中的病原体及它们的毒素结合，并且中和它们。或者，当肠道来源的IgA抗体自身被分泌到管腔侧时，肠道来源的IgA抗体与侵入肠上皮细胞内、粘膜固有层等的病原体、毒素等结合，中和它们，同时消除它们。肠道来源的IgA抗体的功能特点是，它们不引起炎症反应，这与普通抗体参与的全身免疫系统的反应不同(非专利文献10至12)。

肠道来源的IgA抗体的另一功能是维持肠内固有细菌与宿主之间的共生关系。肠道来源的IgA抗体不仅识别和结合病原体，而且也识别和结合固有细菌，以防止固有细菌过多地进入粘膜中。而且认为，不仅消除固有细菌而且与固有细菌结合的肠道来源的IgA抗体担载于上皮细胞上的粘液素层(mucinlayer)中，与固有细菌一起形成生物膜而防止病原体与上皮细胞接触或侵入上皮细胞中(非专利文献13和14)。

在这些肠道粘膜免疫系统，特别是体液免疫系统的构建中，已知抗体的体细胞突变和类型转换起到重要作用。体细胞突变是活体内提供的机制，以使产生抗体的B细胞的免疫球蛋白基因多样化并且产生高亲和性抗体。另一方面，抗体的类型转换是在抗体的可变区不变化，而使H链恒定区的结构发生改变的现象，即在活体内选择的产生IgM抗体的细胞中，改变类型以生成与该IgM具有相同的可变区的IgG抗体、IgE抗体、IgA抗体等其它类型的免疫球蛋白。通过组合这两种现象，产生具有多种抗原结合位点的多种抗体，并且相对于每一抗原结合位点产生每一种类型的抗体，从而可以适当地调节身体的免疫功能。

已知体细胞突变和类型转换都需要活化诱导胞苷脱氨酶(AID)蛋白质。已知AID蛋白质的N末端侧参与体细胞突变，同时C末端侧参与类型转换(非专利文献15和16)。在体细胞突变中，AID很有可能在抗体基因中引起DNA断裂，而DNA断裂会触动突变引入到抗体基因中(非专利文献17)。

此外，已知在AID蛋白质的N末端侧的第23位的甘氨酸替换成丝氨酸而引入突变的表达AID-G23S的小鼠(AIDG23S小鼠)中，由于发生类型转换，充分产生每一类型的抗体，但是不发生体细胞突变，降低了抗体的抗原结合性(非专利文献18)。

炎症性肠病难以治愈，因此被指定为难治的疾病。该疾病可举出由于宿主免疫系统和肠内细菌之间的平衡被破坏，即在肠内细菌的异常增殖、肠内细菌丛的病变所引起的疾病之一。在临床环境中，该疾病经类固醇和抗TNF抗体等免疫抑制剂的全身给药来治疗。但是，这些药物需要长期给药，其副作用成为较大问题。因此，期望开发出一种副作用少，且有效治疗或预防炎症性肠病的肠内疾病的医疗用药物。

现有技术文件

非专利文献

非专利文献1：Cerf-BensussanNandGaboriau-RouthiauV,NatRevImmunol2010；10:735

非专利文献2：HooperLVandMacphersonAJ,NatRevImmunol2010；10:159

非专利文献3：RoundJLandMazmanianSK,ProcNatlAcadSciUSA2010；107:12204

非专利文献4：Vijay-KumarMetal.,Science2010；328:228

非专利文献5：ShulzhenkoNetal.,NatMed2011；17:1585

非专利文献6：BryLetal.,Science1996；273:1380

非专利文献7：TurnbaughPJetal.,Nature2006；444:1027

非专利文献8：CeruttiAetal.,AnnNYAcadSci2011；1238:132

非专利文献9：FagarasanSetal.,AnnuRevImmunol2010；28:243

非专利文献10：FernandezMIetal.,Immunity2003；18:739

非专利文献11：MartinoliCetal.,Immunity2007；27:975

非专利文献12：BoullierSetal.,JImmunol2009；183:5879

非专利文献13：PhaliponAetal.,Immunity2002；17:107

非专利文献14：MacphersonAJandUhrT,Science2004；303:1662

非专利文献15：ShinkuraRetal.,NatImmunol2004；5:707

非专利文献16：TaVTetal.,NatImmunol2003；4:843

非专利文献17：ChaudhuriJetal.Nature2003；422:726

非专利文献18：WeiMetal.,NatureImmunology12(3),264-270,2011

发明内容

本发明的课题是提供一种具有如下效果的成分：改善或最优化活体内的肠内环境，抑制肠内腐败，或抑制肠内细菌的异常增殖和/或肠内细菌丛的病变。本发明的另一课题是提供一种适用于治疗肠内疾病的有效成分。

发明人为了解决上述课题进行了广泛研究，发现与具有特定氨基酸序列的蛋白质的特定部位特异性结合的单克隆IgA抗体抑制肠道免疫系统中的过度应答，具有从大肠的粘膜固有层的腺管降低中恢复的效果。单克隆IgA抗体的这些效果通过将抗体经口给予个体得以证实。

本发明基于上述发现而完成，包括下面描述的宽泛的实施方式。

项目1：一种单克隆IgA抗体，所述单克隆IgA抗体与丝氨酸羟甲基转移酶的第11～333位氨基酸结合。

另外，在项目1中描述的本发明的实施方式包括在以下项目1-1至1-17中描述的关于单克隆IgA抗体的实施方式。

项目1-1：根据项目1所述的单克隆IgA抗体，其中，所述单克隆IgA抗体与丝氨酸羟甲基转移酶的第25～44位氨基酸结合。

项目1-2：根据项目1所述的单克隆IgA抗体，其中，所述单克隆IgA抗体与丝氨酸羟甲基转移酶的第25～28位氨基酸结合。

项目1-3：根据项目1、1-1或1-2所述的单克隆IgA抗体，其中，所述单克隆IgA抗体包括重链可变区和/或轻链可变区，

该重链可变区包含：(1)由SEQIDNO:3、13、23、33或43所示的氨基酸序列组成的重链CDR1，(2)由SEQIDNO:4、14、24、34或44所示的氨基酸序列组成的重链CDR2，和(3)由SEQIDNO:5、15、25、35或45所示的氨基酸序列组成的重链CDR3；

该轻链可变区包含：(I)由SEQIDNO:8、18、28、38或48所示的氨基酸序列组成的轻链CDR1，(II)由SEQIDNO:9、19、29、39或49所示的氨基酸序列组成的轻链CDR2，和(III)由SEQIDNO:10、20、30、40或50所示的氨基酸序列组成的轻链CDR3。

项目1-4：根据项目1和1-1至1-3中任一项目所述的单克隆IgA抗体，其中，所述单克隆IgA抗体包括：由SEQIDNO:2、12、22、32或42所示的氨基酸序列组成的重链可变区，和/或由SEQIDNO:7、17、27、37或47所示的氨基酸序列组成的轻链可变区。

项目1-5：根据项目1和1-1至1-4中任一项目所述的单克隆IgA抗体，其中，所述单克隆IgA抗体包括：由SEQIDNO:1、11、21、31或41所示的氨基酸序列组成的重链，和/或由SEQIDNO:6、16、26、36或46所示的氨基酸序列组成的轻链。

项目1-6：根据项目1和1-1至1-5中任一项目所述的单克隆IgA抗体，其中，所述单克隆IgA抗体抑制至少两种肠内细菌的生长。

项目1-7：根据项目1和1-1至1-6中任一项目所述的单克隆IgA抗体，其中，肠内细菌是选自由以下细菌组成的组中的至少两种细菌：属于普氏菌(Prevotella)属的细菌、属于拟杆菌(Bacteroides)属的细菌、属于巨单胞菌(Megamonas)属的细菌、属于双歧杆菌(Bifidobacterium)属的细菌、属于柔嫩梭菌(Faecalibacterium)属的细菌、属于粪球菌(Coprococcus)属的细菌、属于瘤胃球菌(Ruminococcus)属的细菌、属于布劳迪亚菌(Blautia)属的细菌、属于真细菌(Eubacterium)属的细菌、属于罗氏菌(Roseburia)属的细菌、属于乳酸菌(Lactobacillus)属的细菌、属于梭菌(Clostridium)属的细菌、属于埃希氏菌(Escherichia)属的细菌、属于葡萄球菌(Staphylococcus)属的细菌、属于肠球菌(Enterococcus)属的细菌、属于假单胞菌(Pseudomonas)属的细菌和属于肠杆菌(Enterorhabdus)属的细菌。

项目1-8：根据项目1和1-1至1-7中任一项目所述的单克隆IgA抗体，其中，肠内细菌是选自由以下细菌组成的组中的至少两种细菌：产黑色普雷沃菌(Prevotellamelaninogenica)、普通拟杆菌(Bacteroidetesvulgatus)、单形巨单胞菌(Megamonasfuniformis)、超巨巨单胞菌(Megamonashypermegale)、两歧双歧杆菌(Bifidobacteriumbifidum)、普氏柔嫩梭菌(Faecalibacteriumprausnitzii)、规则粪球菌(Coprococcuseutactus)、卵形瘤胃球菌(Ruminococcusobeum)、延展布劳迪亚菌(Blautiaproductus)、拟球劳迪亚菌(Blautiacoccoides)、真肠真杆菌(Eubacteriumrectale)、肠性罗氏菌(Roseburiaintestinalis)、艰难梭菌(Clostridiumdifficile)、大肠杆菌(Escherichiacoli)、金黄色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)、鼠乳杆菌(Lactobacillusmurinus)、干酪乳杆菌(Lactobacilluscasei)、粪肠球菌(Enterococcusfaecalis)、黄褐假单胞菌(Pseudomonasfulva)和粘膜肠杆菌(Enterorhabdusmucosicola)。

项目1-9：根据项目1和1-1至1-8中任一项目所述的单克隆IgA抗体，其中，所述单克隆IgA抗体是IgA₁或IgA₂。

项目1-10：根据项目1和1-1至1-9中任一项目所述的单克隆IgA抗体，其中，所述单克隆IgA抗体是包含J链的多聚体。

项目1-11：根据项目1和1-1至1-10中任一项目所述的单克隆IgA抗体，其中，所述单克隆IgA抗体包含分泌因子。

项目1-12：根据项目1和1-1至1-11中任一项目所述的单克隆IgA抗体，其中，所述单克隆IgA抗体具有来源于相同物种的氨基酸序列。

项目1-13：根据项目1和1-1至1-12中任一项目所述的单克隆IgA抗体，其中，所述单克隆IgA抗体具有来源于小鼠、大鼠、仓鼠、兔、山羊、绵羊、驴、猪、牛、马、鸡、猴、黑猩猩或人的任意氨基酸的氨基酸序列。

项目1-14：根据项目1和1-1至1-11中任一项目所述的单克隆IgA抗体，其中，所述单克隆IgA抗体具有来源于不同物种的氨基酸序列。

项目1-15：根据项目1、1-1至1-11和1-14中任一项目所述的单克隆IgA抗体，其中，所述单克隆IgA抗体具有来源于选自由小鼠、大鼠、仓鼠、兔、山羊、绵羊、驴、猪、牛、马、猴、鸡、黑猩猩和人组成的组中的两种以上物种的氨基酸序列。

项目1-16：根据项目1、1-1至1-11、1-14和1-15中任一项目所述的单克隆IgA抗体，其中，所述单克隆IgA抗体是人源化抗体。

项目1-17：根据项目1、1-1至1-11、1-14和1-15中任一项目所述的单克隆IgA抗体，其中，所述单克隆IgA抗体是嵌合抗体。

项目2：一种项目1所述的单克隆IgA抗体的制造方法，其中，所述方法包括以下的工序1和工序2：

(1)工序1：将从肠道粘膜固有层收集的B细胞与其它类型的细胞混合并融合，制备杂交瘤；和

(2)工序2：培养在工序1中制备的该杂交瘤，确定产生与至少两种肠内细菌结合的单克隆IgA抗体的细胞，从该细胞中回收该IgA抗体。

另外，在项目2中描述的本发明的实施方式广泛地包括在以下项目2-1至2-18中描述的单克隆IgA抗体制造方法的实施方式。

项目2-1：根据项目2所述的制造方法，其中，所述B细胞是产生IgA抗体的细胞。

项目2-2：根据项目2或2-1所述的制造方法，其中，所述肠道粘膜固有层来源于小鼠、大鼠、仓鼠、兔、山羊、绵羊、驴、猪、牛、马、鸡、猴、黑猩猩或人。

项目2-3：根据项目2、2-1和2-2所述的制造方法，其中，其它细胞是骨髓瘤细胞。

项目2-4：根据项目2和2-1至2-3中任一项目所述的制造方法，其中，所述其它细胞来源于小鼠、大鼠、仓鼠、兔、山羊、绵羊、驴、猪、牛、马、鸡、猴、黑猩猩或人。

项目2-5：根据项目2和2-1至2-4中任一项目所述的制造方法，其中，肠内细菌是选自由以下细菌组成的组中的至少两种细菌：属于普氏菌(Prevotella)属的细菌、属于拟杆菌(Bacteroides)属的细菌、属于巨单胞菌(Megamonas)属的细菌、属于双歧杆菌(Bifidobacterium)属的细菌、属于柔嫩梭菌(Faecalibacterium)属的细菌、属于粪球菌(Coprococcus)属的细菌、属于瘤胃球菌(Ruminococcus)属的细菌、属于布劳迪亚(Blautia)属的细菌、属于真细菌(Eubacterium)属的细菌、属于罗氏菌(Roseburia)属的细菌、属于乳酸菌(Lactobacillus)属的细菌、属于梭菌(Clostridium)属的细菌，属于埃希氏菌(Escherichia)属的细菌、属于葡萄球菌(Staphylococcus)属的细菌、属于肠球菌(Enterococcus)属的细菌、属于假单胞菌(Pseudomonas)属的细菌和属于肠杆菌(Enterorhabdus)属的细菌。

项目2-6：根据项目2和2-1至2-5中任一项目所述的制造方法，其中，肠内细菌是选自由以下细菌组成的组中的至少两种细菌：产黑色普雷沃菌(Prevotellamelaninogenica)、普通拟杆菌(Bacteroidetesvulgatus)、单形巨单胞菌(Megamonasfuniformis)、超巨巨单胞菌(Megamonashypermegale)、两歧双歧杆菌(Bifidobacteriumbifidum)、普氏柔嫩梭菌(Faecalibacteriumprausnitzii)、规则粪球菌(Coprococcuseutactus)、卵形瘤胃球菌(Ruminococcusobeum)、延展布劳迪亚菌(Blautiaproductus)、拟球劳迪亚菌(Blautiacoccoides)、真肠真杆菌(Eubacteriumrectale)、肠性罗氏菌(Roseburiaintestinalis)、鼠乳杆菌(Lactobacillusmurinus)、干酪乳杆菌(Lactobacilluscasei)、艰难梭菌(Clostridiumdifficile)、大肠杆菌(Escherichiacoli)、金黄色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)、粪肠球菌(Enterococcusfaecalis)、黄褐假单胞菌(Pseudomonasfulva)和粘膜肠杆菌(Enterorhabdusmucosicola)。

项目2-7：根据项目2和2-1至2-6中任一项目所述的制造方法，其中，所述单克隆IgA抗体是IgA₁或IgA₂。

项目2-8：根据项目2和2-1至2-7中任一项目所述的制造方法，其中，所述单克隆IgA抗体为包含J链的多聚体。

项目2-9：根据项目2和2-1至2-8中任一项目所述的制造方法，其中，所述单克隆IgA抗体包含分泌因子。

项目2-10：根据项目2和2-1至2-9中任一项目所述的制造方法，其中，所述单克隆IgA抗体具有来源于相同物种的氨基酸序列。

项目2-11：根据项目2和2-1至2-10中任一项目所述的制造方法，其中，所述单克隆IgA抗体具有来源于小鼠、大鼠、仓鼠、兔、山羊、绵羊、驴、猪、牛、马、鸡、猴、黑猩猩或人的氨基酸序列。

项目2-12：根据项目2和2-1至2-9中任一项目所述的制造方法，其中，所述单克隆IgA抗体具有来源于不同物种的氨基酸序列。

项目2-13：根据项目2、2-1至2-9和2-12中任一项目所述的制造方法，其中，所述单克隆IgA抗体具有来源于选自由小鼠、大鼠、仓鼠、兔、山羊、绵羊、驴、猪、牛、马、鸡、猴、黑猩猩和人组成的组中的两种以上物种的氨基酸序列。

项目2-14：根据项目2、2-1至2-9、2-12和2-13中任一项目所述的制造方法，其中，所述单克隆IgA抗体是人源化抗体。

项目2-15：根据项目2、2-1至2-9、2-12和2-13中任一项目所述的制造方法，其中，所述单克隆IgA抗体是嵌合抗体。

项目2-16：根据项目2和2-1至2-15中任一项目所述的制造方法，其中，所述单克隆IgA抗体包括重链可变区和/或轻链可变区，

项目2-17：根据项目2和2-1至2-16中任一项目所述的制造方法，其中，所述单克隆IgA抗体包括：由SEQIDNO:2、12、22、32或42所示的氨基酸序列组成的重链可变区，和/或由SEQIDNO:7、17、27、37或47所示的氨基酸序列组成的轻链可变区。

项目2-18：根据项目2和2-1至2-17中任一项目所述的制造方法，其中，所述单克隆IgA抗体包括：由SEQIDNO:1、11、21、31或41所示的氨基酸序列组成的重链，和/或由SEQIDNO:6、16、26、36或46所示的氨基酸序列组成的轻链。

项目3：一种药物组合物，包含项目1所述的单克隆IgA抗体。

另外，在项目3中描述的本发明的实施方式广泛地包括在以下项目3-1至3-6中描述的药物组合物的实施方式。

项目3-1：根据项目3所述的药物组合物，其中，所述药物组合物用于治疗肠内疾病。

项目3-2：根据项目3或3-1所述的药物组合物，其中，所述肠内疾病为由肠内细菌的异常增殖和/或肠内细菌丛的病变引起的疾病。

项目3-3：根据项目3、3-1和3-2所述的药物组合物，其中，由肠内细菌的异常增殖和/或肠内细菌丛的病变引起的疾病选自由炎症性肠病、溃疡性结肠炎、克罗恩氏病、变态反应、哮喘、肥胖症和自身免疫性疾病组成的组。

项目3-4：根据项目3和3-1至3-3中任一项目所述的药物组合物，其中，肠内细菌是选自由以下细菌组成的组中的至少两种细菌：属于普氏菌(Prevotella)属的细菌、属于拟杆菌(Bacteroides)属的细菌、属于巨单胞菌(Megamonas)属的细菌、属于双歧杆菌(Bifidobacterium)属的细菌、属于柔嫩梭菌(Faecalibacterium)属的细菌、属于粪球菌(Coprococcus)属的细菌、属于瘤胃球菌(Ruminococcus)属的细菌、属于布劳迪亚(Blautia)属的细菌、属于真细菌(Eubacterium)属的细菌、属于罗氏菌(Roseburia)属的细菌、属于乳酸菌(Lactobacillus)属的细菌、属于梭菌(Clostridium)属的细菌、属于埃希氏菌(Escherichia)属的细菌、属于葡萄球菌(Staphylococcus)属的细菌、属于肠球菌(Enterococcus)属的细菌、属于假单胞菌(Pseudomonas)属的细菌和属于肠杆菌(Enterorhabdus)属的细菌。

项目3-5：根据项目3和3-1至3-4中任一项目所述的药物组合物，其中，所述肠内细菌是选自由以下细菌组成的组中的至少两种细菌：产黑色普雷沃菌(Prevotellamelaninogenica)、普通拟杆菌(Bacteroidetesvulgatus)、单形巨单胞菌(Megamonasfuniformis)、超巨巨单胞菌(Megamonashypermegale)、两歧双歧杆菌(Bifidobacteriumbifidum)、普氏柔嫩梭菌(Faecalibacteriumprausnitzii)、规则粪球菌(Coprococcuseutactus)、卵形瘤胃球菌(Ruminococcusobeum)、延展布劳迪亚菌(Blautiaproductus)、拟球劳迪亚菌(Blautiacoccoides)、真肠真杆菌(Eubacteriumrectale)、肠性罗氏菌(Roseburiaintestinalis)、鼠乳杆菌(Lactobacillusmurinus)、干酪乳杆菌(Lactobacilluscasei)、艰难梭菌(Clostridiumdifficile)、大肠杆菌(Escherichiacoli)、金黄色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)、粪肠球菌(Enterococcusfaecalis)、黄褐假单胞菌(Pseudomonasfulva)和粘膜肠杆菌(Enterorhabdusmucosicola)。

项目3-6：根据项目3和3-1至3-5中任一项目所述的药物组合物，其中，所述药物组合物经口或经肠道给药。

项目4：一种经口或经肠道的组合物，包含项目1所述的单克隆IgA抗体。

另外，在项目4中描述的本发明的实施方式广泛地包括在以下项目4-1至4-6中描述的经口或经肠道的组合物的实施方式。

项目4-1：根据项目4所述的经口或经肠道的组合物，其中，所述经口或经肠道的组合物抑制肠内细菌的异常增殖和/或肠内细菌丛的病变。

项目4-2：根据项目4或4-1所述的经口或经肠道的组合物，其中，肠内细菌是选自由以下细菌组成的组中的至少两种细菌：属于普氏菌(Prevotella)属的细菌、属于拟杆菌(Bacteroides)属的细菌、属于巨单胞菌(Megamonas)属的细菌、属于双歧杆菌(Bifidobacterium)属的细菌、属于柔嫩梭菌(Faecalibacterium)属的细菌、属于粪球菌(Coprococcus)属的细菌、属于瘤胃球菌(Ruminococcus)属的细菌、属于布劳迪亚(Blautia)属的细菌、属于真细菌(Eubacterium)属的细菌、属于罗氏菌(Roseburia)属的细菌、属于乳酸菌(Lactobacillus)属的细菌、属于梭菌(Clostridium)属的细菌、属于埃希氏菌(Escherichia)属的细菌、属于葡萄球菌(Staphylococcus)属的细菌、属于肠球菌(Enterococcus)属的细菌、属于假单胞菌(Pseudomonas)属的细菌和属于肠杆菌(Enterorhabdus)属的细菌。

项目4-3：根据项目4、4-1或4-2所述的经口或经肠道的组合物，其中，所述肠内细菌是选自由以下细菌组成的组中的至少两种细菌：产黑色普雷沃菌(Prevotellamelaninogenica)、普通拟杆菌(Bacteroidetesvulgatus)、单形巨单胞菌(Megamonasfuniformis)、超巨巨单胞菌(Megamonashypermegale)、两歧双歧杆菌(Bifidobacteriumbifidum)、普氏柔嫩梭菌(Faecalibacteriumprausnitzii)、规则粪球菌(Coprococcuseutactus)、卵形瘤胃球菌(Ruminococcusobeum)、延展布劳迪亚菌(Blautiaproductus)、拟球劳迪亚菌(Blautiacoccoides)、真肠真杆菌(Eubacteriumrectale)、肠性罗氏菌(Roseburiaintestinalis)、鼠乳杆菌(Lactobacillusmurinus)、干酪乳杆菌(Lactobacilluscasei)、艰难梭菌(Clostridiumdifficile)、大肠杆菌(Escherichiacoli)、金黄色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)、粪肠球菌(Enterococcusfaecalis)、黄褐假单胞菌(Pseudomonasfulva)和粘膜肠杆菌(Enterorhabdusmucosicola)。

项目4-4：根据项目4和4-1至4-3中任一项目所述的经口或经肠道的组合物，其中，所述经口或经肠道的组合物是改善肠内环境的组合物、最优化肠内环境的组合物或防止肠内腐败的组合物。

项目4-5：根据项目4和4-1至4-4中任一项目所述的经口或经肠道的组合物，其中，所述经口或经肠道的组合物是饮食品组合物。

项目4-6：根据项目4和4-1至4-5中任一项目所述的经口或经肠道的组合物，其中，所述经口或经肠道的组合物是饲料组合物。

项目5：一种编码项目1所述的单克隆IgA抗体的核酸。

项目6：一种产生项目1所述的单克隆IgA抗体的杂交瘤。

另外，在项目6中描述的本发明的实施方式广泛地包括在以下项目6-1至6-4中描述的杂交瘤的实施方式。

项目6-1：根据项目6所述的杂交瘤，其中，所述杂交瘤来源于相同物种。

项目6-2：根据项目6或6-1所述的杂交瘤，其中，所述杂交瘤来源于小鼠、大鼠、仓鼠、兔、山羊、绵羊、驴、猪、牛、马、鸡、猴、黑猩猩或人。

项目6-3：根据项目6所述的杂交瘤，其中，所述杂交瘤来源于不同的物种。

项目6-4：根据项目6或6-2所述的杂交瘤，其中，所述杂交瘤来源于选自由小鼠、大鼠、仓鼠、兔、山羊、绵羊、驴、猪、牛、马、鸡、猴、黑猩猩和人组成的组中的两种以上物种。

项目7：一种抑制至少两种肠内细菌增殖的方法，其中，所述方法包括使项目1所述的抗体与至少两种肠内细菌接触的工序。

另外，在项目7中描述的本发明的实施方式广泛地包括在以下项目7-1至7-3中描述的疾病治疗方法的实施方式。

项目7-1：根据项目7所述的方法，其中，抗体在肠内与肠内细菌接触。

项目7-2：根据项目7或7-1所述的治疗方法，其中，肠内细菌是选自由以下细菌组成的组中的至少两种细菌：属于普氏菌(Prevotella)属的细菌、属于拟杆菌(Bacteroides)属的细菌、属于巨单胞菌(Megamonas)属的细菌、属于双歧杆菌(Bifidobacterium)属的细菌、属于柔嫩梭菌(Faecalibacterium)属的细菌、属于粪球菌(Coprococcus)属的细菌、属于瘤胃球菌(Ruminococcus)属的细菌、属于布劳迪亚(Blautia)属的细菌、属于真细菌(Eubacterium)属的细菌、属于罗氏菌(Roseburia)属的细菌、属于乳酸菌(Lactobacillus)属的细菌、属于梭菌(Clostridium)属的细菌、属于埃希氏菌(Escherichia)属的细菌、属于葡萄球菌(Staphylococcus)属的细菌、属于肠球菌(Enterococcus)属的细菌、属于假单胞菌(Pseudomonas)属的细菌和属于肠杆菌(Enterorhabdus)属的细菌。

项目7-3：根据项目7、7-1或7-2中任一项目所述的治疗方法，其中，所述肠内细菌是选自由以下细菌组成的组中的至少两种细菌：产黑色普雷沃菌(Prevotellamelaninogenica)、普通拟杆菌(Bacteroidetesvulgatus)、单形巨单胞菌(Megamonasfuniformis)、超巨巨单胞菌(Megamonashypermegale)、两歧双歧杆菌(Bifidobacteriumbifidum)、普氏柔嫩梭菌(Faecalibacteriumprausnitzii)、规则粪球菌(Coprococcuseutactus)、卵形瘤胃球菌(Ruminococcusobeum)、延展布劳迪亚菌(Blautiaproductus)、拟球劳迪亚菌(Blautiacoccoides)、真肠真杆菌(Eubacteriumrectale)、肠性罗氏菌(Roseburiaintestinalis)、鼠乳杆菌(Lactobacillusmurinus)、干酪乳杆菌(Lactobacilluscasei)、艰难梭菌(Clostridiumdifficile)、大肠杆菌(Escherichiacoli)、金黄色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)、粪肠球菌(Enterococcusfaecalis)、黄褐假单胞菌(Pseudomonasfulva)和粘膜肠杆菌(Enterorhabdusmucosicola)。

项目8：一种治疗方法，为肠内疾病的治疗方法，其中，所述方法包括将有效量的项目1所述的抗体给药至患肠内疾病的人的工序。

另外，在项目8中描述的本发明的实施方式广泛地包括在以下项目8-1至8-5中描述的疾病治疗方法的实施方式。

项目8-1：根据项目8所述的治疗方法，其中，所述肠内疾病为由肠内细菌的异常增殖和/或肠内细菌丛的病变引起的疾病。

项目8-2：根据项目8或8-1所述的治疗方法，其中，由肠内细菌的异常增殖和/或肠内细菌丛的病变引起的疾病选自由炎症性肠病、溃疡性结肠炎、克罗恩氏病、变态反应、哮喘、肥胖症和自身免疫性疾病组成的组。

项目8-3：根据项目8、8-1或8-2所述的治疗方法，其中，肠内细菌是选自由以下细菌组成的组中的至少两种细菌：属于普氏菌(Prevotella)属的细菌、属于拟杆菌(Bacteroides)属的细菌、属于巨单胞菌(Megamonas)属的细菌、属于双歧杆菌(Bifidobacterium)属的细菌、属于柔嫩梭菌(Faecalibacterium)属的细菌、属于粪球菌(Coprococcus)属的细菌、属于瘤胃球菌(Ruminococcus)属的细菌、属于布劳迪亚(Blautia)属的细菌、属于真细菌(Eubacterium)属的细菌、属于罗氏菌(Roseburia)属的细菌、属于乳酸菌(Lactobacillus)属的细菌、属于梭菌(Clostridium)属的细菌、属于埃希氏菌(Escherichia)属的细菌、属于葡萄球菌(Staphylococcus)属的细菌、属于肠球菌(Enterococcus)属的细菌、属于假单胞菌(Pseudomonas)属的细菌和属于肠杆菌(Enterorhabdus)属的细菌。

项目8-4：根据项目8和8-1至8-3中任一项目所述的治疗方法，其中，肠内细菌是选自由以下细菌组成的组中的至少两种细菌：产黑色普雷沃菌(Prevotellamelaninogenica)、普通拟杆菌(Bacteroidetesvulgatus)、单形巨单胞菌(Megamonasfuniformis)、超巨巨单胞菌(Megamonashypermegale)、两歧双歧杆菌(Bifidobacteriumbifidum)、普氏柔嫩梭菌(Faecalibacteriumprausnitzii)、规则粪球菌(Coprococcuseutactus)、卵形瘤胃球菌(Ruminococcusobeum)、延展布劳迪亚菌(Blautiaproductus)、拟球劳迪亚菌(Blautiacoccoides)、真肠真杆菌(Eubacteriumrectale)、肠性罗氏菌(Roseburiaintestinalis)、鼠乳杆菌(Lactobacillusmurinus)、干酪乳杆菌(Lactobacilluscasei)、艰难梭菌(Clostridiumdifficile)、大肠杆菌(Escherichiacoli)、金黄色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)、粪肠球菌(Enterococcusfaecalis)、黄褐假单胞菌(Pseudomonasfulva)和粘膜肠杆菌(Enterorhabdusmucosicola)。

项目8-5：根据项目8和8-1至8-4中任一项目所述的治疗方法，其中，所述给药为经口给药或经肠道给药。

项目9：一种在肠内疾病的治疗方法中使用的项目1所述的单克隆IgA抗体。

另外，在项目9中描述的本发明的实施方式包括在以下项目9-1至9-5中描述的单克隆IgA抗体的实施方式。

项目9-1：根据项目8所述的单克隆IgA抗体，其中，肠内疾病为由肠内细菌的异常增殖和/或肠内细菌丛的病变引起的疾病的治疗方法。

项目9-2：根据项目8或8-1所述的单克隆IgA抗体，其中，由肠内细菌的异常增殖和/或肠内细菌丛的病变引起的疾病选自由炎症性肠病、溃疡性结肠炎、克罗恩氏病、变态反应、哮喘、肥胖症和自身免疫性疾病组成的组。

项目9-3：根据项目9、9-1或9-2所述的单克隆IgA抗体，其中，肠内细菌是选自由以下细菌组成的组中的至少两种细菌：属于普氏菌(Prevotella)属的细菌、属于拟杆菌(Bacteroides)属的细菌、属于巨单胞菌(Megamonas)属的细菌、属于双歧杆菌(Bifidobacterium)属的细菌、属于柔嫩梭菌(Faecalibacterium)属的细菌、属于粪球菌(Coprococcus)属的细菌、属于瘤胃球菌(Ruminococcus)属的细菌、属于布劳迪亚(Blautia)属的细菌、属于真细菌(Eubacterium)属的细菌、属于罗氏菌(Roseburia)属的细菌、属于乳酸菌(Lactobacillus)属的细菌、属于梭菌(Clostridium)属的细菌、属于埃希氏菌(Escherichia)属的细菌、属于葡萄球菌(Staphylococcus)属的细菌、属于肠球菌(Enterococcus)属的细菌、属于假单胞菌(Pseudomonas)属的细菌和属于肠杆菌(Enterorhabdus)属的细菌。

项目9-4：根据项目9和9-1至9-3中任一项目所述的单克隆IgA抗体，其中，肠内细菌是选自由以下细菌组成的组中的至少两种细菌：产黑色普雷沃菌(Prevotellamelaninogenica)、普通拟杆菌(Bacteroidetesvulgatus)、单形巨单胞菌(Megamonasfuniformis)、超巨巨单胞菌(Megamonashypermegale)、两歧双歧杆菌(Bifidobacteriumbifidum)、普氏柔嫩梭菌(Faecalibacteriumprausnitzii)、规则粪球菌(Coprococcuseutactus)、卵形瘤胃球菌(Ruminococcusobeum)、延展布劳迪亚菌(Blautiaproductus)、拟球劳迪亚菌(Blautiacoccoides)、真肠真杆菌(Eubacteriumrectale)、肠性罗氏菌(Roseburiaintestinalis)、鼠乳杆菌(Lactobacillusmurinus)、干酪乳杆菌(Lactobacilluscasei)、艰难梭菌(Clostridiumdifficile)、大肠杆菌(Escherichiacoli)、金黄色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)、粪肠球菌(Enterococcusfaecalis)、黄褐假单胞菌(Pseudomonasfulva)和粘膜肠杆菌(Enterorhabdusmucosicola)。

项目9-5：根据项目9和9-1至9-4中任一项目所述的单克隆IgA抗体，其中，所述单克隆IgA抗体通过经口给药或经肠道给药来使用。

项目10：项目1所述的单克隆IgA抗体在制造用于治疗肠内疾病的药物中的应用。

另外，在项目10中描述的本发明的实施方式包括在以下项目10-1至10-5中描述的单克隆IgA抗体的应用的实施方式。

项目10-1：根据项目10所述的应用，其中，肠内疾病是由肠内细菌的异常增殖和/或肠内细菌丛的病变引起的疾病。

项目10-2：根据项目10或10-1所述的应用，其中，由肠内细菌的异常增殖和/或肠内细菌丛的病变引起的疾病选自由炎症性肠病、溃疡性结肠炎、克罗恩氏病、变态反应、哮喘、肥胖症和自身免疫性疾病组成的组。

项目10-3：根据项目10、10-1或10-2所述的应用，其中，肠内细菌是选自由以下细菌组成的组中的至少两种细菌：属于普氏菌(Prevotella)属的细菌、属于拟杆菌(Bacteroides)属的细菌、属于巨单胞菌(Megamonas)属的细菌、属于双歧杆菌(Bifidobacterium)属的细菌、属于柔嫩梭菌(Faecalibacterium)属的细菌、属于粪球菌(Coprococcus)属的细菌、属于瘤胃球菌(Ruminococcus)属的细菌、属于布劳迪亚(Blautia)属的细菌、属于真细菌(Eubacterium)属的细菌、属于罗氏菌(Roseburia)属的细菌、属于乳酸菌(Lactobacillus)属的细菌、属于梭菌(Clostridium)属的细菌、属于埃希氏菌(Escherichia)属的细菌、属于葡萄球菌(Staphylococcus)属的细菌、属于肠球菌(Enterococcus)属的细菌、属于假单胞菌(Pseudomonas)属的细菌和属于肠杆菌(Enterorhabdus)属的细菌。

项目10-4：根据项目10和10-1至10-3中任一项目所述的应用，其中，所述肠内细菌是选自由以下细菌组成的组中的至少两种细菌：产黑色普雷沃菌(Prevotellamelaninogenica)、普通拟杆菌(Bacteroidetesvulgatus)、单形巨单胞菌(Megamonasfuniformis)、超巨巨单胞菌(Megamonashypermegale)、两歧双歧杆菌(Bifidobacteriumbifidum)、普氏柔嫩梭菌(Faecalibacteriumprausnitzii)、规则粪球菌(Coprococcuseutactus)、卵形瘤胃球菌(Ruminococcusobeum)、延展布劳迪亚菌(Blautiaproductus)、拟球劳迪亚菌(Blautiacoccoides)、真肠真杆菌(Eubacteriumrectale)、肠性罗氏菌(Roseburiaintestinalis)、鼠乳杆菌(Lactobacillusmurinus)、干酪乳杆菌(Lactobacilluscasei)、艰难梭菌(Clostridiumdifficile)、大肠杆菌(Escherichiacoli)、金黄色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)、粪肠球菌(Enterococcusfaecalis)、黄褐假单胞菌(Pseudomonasfulva)和粘膜肠杆菌(Enterorhabdusmucosicola)。

项目10-5：根据项目10和10-1至10-4中任一项目所述的应用，其中，所述应用是通过经口给药或经肠道给药来实现的应用。

附图说明

图1示出研究单克隆IgA对多种肠内细菌的结合能力的实验结果。在图1中，表中的行从上至下指示细菌：Escherichiacoli(DH5α菌株)、Escherichiacoli(来自小鼠肠内细菌的克隆菌株)、Staphylococcusaureus、Enterococcusfaecalis、Pseudomonasfulva、Lactobacillusmurinus、Enterorhabdusmucosicola、Lactobacilluscasei、Coprococcuseutactus、Blautiacoccoides、Megamonashypermegale、Eubacteriumrectale和Bifidobacteriumbifidum。此外，在图中，表中的横向项目表示各种克隆名称，从左至右依次为W1、W2、W3、W4、W6、W7、W11、W14、W24、W27、W28、W30、W32、W34、W37、W43和W45，接着是G1、G8、G9、G10、G12、G14、G15、G16、G18和G19。另外，图中的“N/A”表示“未被证实”。

图2示出评价单克隆IgA对多种肠内细菌的浓度依赖性结合能力的实验结果。从左至右，曲线依次例示了与Staphylococcusaureus、Escherichiacoli和Enterococcusfaecalis结合的结果。在图中，曲线的纵坐标表示OD(405nm)值，横坐标表示所使用的每一种IgA抗体的浓度(0.017、0.05、0.17、0.5、1.7、5.0、17和50μg/ml)。

图3示出评价单克隆IgA对多种肠内细菌的浓度依赖性结合能力的实验结果。左上的曲线表示与Enterococcusfaecalis结合的结果，右上的曲线表示与Staphylococcusaureus结合的结果，左下的曲线表示与Escherichiacoli结合的结果，且右下的曲线表示与Pseudomonasfulva结合的结果。在图中，曲线的纵坐标表示OD(405nm)值，横坐标表示所使用的每一种IgA抗体的浓度(0.017、0.05、0.17、0.5、1.7、5.0、17和50μg/ml)。

图4示出通过使用各种单克隆IgA抗体对来自多种肠内细菌的细胞提取物进行蛋白印记(Westernblot)分析的结果。图4(A)表示使用W27单克隆IgA抗体的实验结果，图4(B)表示使用W30单克隆IgA抗体的实验结果，图4(C)表示使用W45单克隆IgA抗体的实验结果。在各图中，各泳道从左至右依次表示Escherichiacoli(DH5α菌株，可在市场上购买的产品)、Escherichiacoli(来自小鼠肠内细菌的克隆菌株)、Pseudomonasfulva和Staphylococcusaureus的提取物。图4(D)表示使用W27单克隆IgA抗体的实验结果。各泳道从左至右依次表示Eubacteriumrectale、Blautiacoccoides、Coprococcuseutactus、Megamonashypermegale、Lactobacilluscasei和Bifidobacteriumbifidum的提取物。

图5示出双向电泳的结果。左上段表示蛋白印记的结果，右上段表示MemCode可逆蛋白染色的结果，下段表示银染色的结果。斑点(箭头)被证实在所有图中都位于同一位置，割出凝胶并且进行MS分析。

图6示出G23S小鼠大肠的经HE染色的切片。

图7示出当W27单克隆IgA抗体经口给药至小鼠时，测量派伊尔氏淋巴集结生发中心B细胞的数量的实验结果。

图8是示出当W27单克隆IgA抗体经口给药至小鼠时，体内动力学的实验结果的曲线图。曲线图中的纵坐标指示粪便中的IgA抗体的抗体滴度(μg/ml)。

图9示出使用多种单克隆IgA抗体进行蛋白印记的结果。这些多反应性IgA抗体大多数都识别丝氨酸羟甲基转移酶(SHMT)。

图10示出使用各种丝氨酸羟甲基转移酶的突变体，来鉴定各种单克隆IgA抗体的表位的实验结果。

图11示出G23S小鼠大肠的经HE染色的切片。这示出了当服用W27单克隆IgA抗体时腺管的状态。通过服用W27抗体，在G23S小鼠大肠中观察到的腺管萎缩正常化。

图12是示出本发明的单克隆IgA抗体对大肠杆菌的增殖抑制效果的曲线图。

具体实施方式

单克隆IgA抗体

本发明的单克隆IgA抗体与丝氨酸羟甲基转移酶的第11～333位氨基酸序列特异性结合。第11或25位至第28、37、44、250或330位中的任一段的氨基酸序列(第11～250位、第11～44位、第11～37位、第11～28位、第25～333位、第25～250位、第25～44位、第25～37位或第25～28位)是优选的，并且氨基酸序列的第25～44位氨基酸更优选，并且氨基酸序列的第25～28位氨基酸最优选。

丝氨酸羟甲基转移酶的分子量为约45至50kDa，其等电点为约4.3至4.7。具体地，当它来源于例如大肠杆菌时，则丝氨酸羟甲基转移酶是具有例如在NCBI网站上示出的登记号J01620J01621；版本J01620.1GI:146216的氨基酸序列的蛋白质。更具体地，该蛋白质具有由SEQIDNO:74所示的氨基酸序列。该蛋白质是具有如下功能的酶：可逆地使L-丝氨酸转化成甘氨酸，同时可逆地使四氢叶酸转化成5,10-亚甲基四氢叶酸。该酶的构象在大肠杆菌和哺乳动物中是高度保守的。

表1

此外，如表1所示，基于以上述SEQIDNO:74所示的氨基酸序列为基础进行的比对，与大肠杆菌来源的丝氨酸羟甲基转移酶的第25～26位氨基酸(RQ)、第31～44位氨基酸，特别是第31～37位氨基酸(ELIASEN)相当的氨基酸序列在上述大量物种中是高度保守的。如下面的实施例所述，这些氨基酸序列包含认为是本发明的单克隆IgA抗体结合的大肠杆菌来源的丝氨酸羟甲基转移酶表位的氨基酸序列的最小单位。因此，认为，除了氨基酸序列的第25～28位氨基酸之外，本发明的单克隆IgA抗体的表位还包括如下区域：包含由SEQIDNO:74所示的氨基酸序列的第25～26位氨基酸和第31～44位氨基酸的区域。

除了大肠杆菌之外，与本发明的单克隆IgA抗体结合的丝氨酸羟甲基转移酶的来源可举出：属于假单胞菌(Pseudomonas)属的细菌，诸如Pseudomonasfulva；葡萄球菌(Staphylococci)，诸如Staphylococcusaureus；Eubacteriumrectale、流感嗜血杆菌(Haemophilusinfluenzae)、肺炎克雷伯氏菌(Klebsiellapneumoniae)、嗜肺军团菌(Legionellapneumophila)、甲型副伤寒沙门菌(SalmonellaparatyphiA)、鼠伤寒沙门氏菌(Salmonellatyphimurium)、弗氏志贺菌(Shigellaflexneri)、鼠疫耶尔森氏菌(Yersiniapestisbv.Antique)、鼻疽伯克霍尔德氏菌(Burkholderiamallei)等等，但不限于此。

另一方面，本发明的单克隆IgA抗体不与上述以外来源的丝氨酸羟甲基转移酶结合，或者即使结合，也倾向于立即解离。这样的来源没有特别限定，例如可举出来源于Lactobacilluscasei、Bifidobacteriumbifidum等乳酸菌、Blautiacoccoides、Coprococcuseutactus、Megamonashypermegale和副百日咳博多氏杆菌(Bordetellaparapertussis)、酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae)、粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomycespompe)、阿拉伯芥(Arabidopsisthaliana)、兔、小鼠、人等真核生物等的丝氨酸羟甲基转移酶。通过使用本发明的单克隆IgA抗体对多种培养细胞的裂解液进行蛋白印记，来确认这些结合是否存在及其倾向。

如上所述，通过例如在本申请说明书的实施例中所述的以下方式，丝氨酸羟甲基转移酶上与本发明的单克隆IgA抗体特异性结合的特定位点(表位)产生丝氨酸羟甲基转移酶的截短型突变体，并且使用蛋白印记法等已知的免疫化学技术来确认其是否与本发明的单克隆IgA抗体结合所产生的截短型突变体蛋白。

除此以外，可制作突变体，在该突变体中，将上述可确认与本发明的单克隆IgA抗体结合的来源于例如大肠杆菌的野生型丝氨酸羟甲基转移酶中的一部分氨基酸序列替换成如上述与本发明的单克隆IgA抗体不结合或者即使结合也立即分离的例如乳酸菌来源的丝氨酸羟甲基转移酶的与上述一部分氨基酸序列对应的氨基酸序列，当该突变体不能与本发明的单克隆IgA抗体结合，或与野生型丝氨酸羟甲基转移酶相比结合能力降低时，可确定上述一部分氨基酸序列是本发明的单克隆IgA抗体特异性结合的丝氨酸羟甲基转移酶中的氨基酸序列。可适当地使用公知的免疫化学技术确认是否结合、结合能力是否降低等等。

本说明书中使用的术语“单克隆”是表示从基本均一的抗体群获得的抗体等的特征的修饰词。除了可能存在少量的天然发生的突变之外，在该抗体群中的单个抗体都相同。

本发明的单克隆IgA抗体是免疫球蛋白的一种类型，可举出具有重链可变区和/或轻链可变区的实施方式。其中，分别更优选具有进一步含恒定区的重链和/或轻链的实施方式。更优选具有重链和轻链的实施方式。

这种重链和轻链主要由多肽链构成，并且重链和轻链各自包含被称为可变区的区域，该可变区识别抗原(通常分别称为“重链可变区”和“轻链可变区”。)。

上述可变区中，从氨基末端开始顺序地包含进一步特定为识别抗原的区域的被称为CDR1至CDR3的区域。另外，这些CDR1至CDR3更具体地称为重链CDR1、重链CDR2、重链CDR3、轻链CDR1、轻链CDR2、轻链CDR3等。此外，重链和轻链的CDR1至CDR3之外的区域从氨基末端开始依次分别称为重链FR1至FR4和轻链FR1至FR4。

本发明的单克隆IgA抗体的可变区并非在重链可变区和轻链可变区必须分别包含所有的CDR1至CDR3，可包含CDR1至CDR3中的至少一个CDR。其中，优选包含CDR3。

构成这种重链CDR1至CDR3和轻链CDR1至CDR3的多肽的氨基酸序列不受特殊限制，例如可举出：

作为重链CDR1，由SEQIDNO:3、13、23、33或43中任一条所示的氨基酸序列等；

作为重链CDR2，由SEQIDNO:4、14、24、34或44中任一条所示的氨基酸序列等；

作为重链CDR3，由SEQIDNO:5、15、25、35或45中任一条所示的氨基酸序列等；

作为轻链CDR1，由SEQIDNO:8、18、28、38或48中任一条所示的氨基酸序列等；

作为轻链CDR2，由SEQIDNO:39、19、29、39或49中任一条所示的氨基酸序列等；和

作为轻链CDR3，由SEQIDNO:10、20、30、40或50中任一条所示的氨基酸序列等。

本发明的单克隆IgA抗体的重链可变区不受特别限制，只要是例如包含CDR1至CDR3的实施方式的重链可变区，则

(1)由SEQIDNO:3、13、23、33或43中任一条所示的氨基酸序列组成的重链CDR1，

(2)由SEQIDNO:4、14、24、34或44中任一条所示的氨基酸序列组成的重链CDR2，和

(3)由SEQIDNO:5、15、25、35或45中任一条所示的氨基酸序列组成的重链CDR3。

此外，例如包含CDR1至CDR3实施方式的轻链可变区不受特别限制，例如可举出从氨基末端开始顺序包含以下的(I)至(III)的轻链可变区：

(I)由SEQIDNO:8、18、28、38或48中任一条所示的氨基酸序列组成的轻链CDR1，

(II)由SEQIDNO:9、19、29、39或49中任一条所示的氨基酸序列组成的轻链CDR2，和

(III)由SEQIDNO:10、20、30、40或50中任一条所示的氨基酸序列组成的轻链CDR3。

包含CDR1至CDR3的更优选实施方式的重链可变区可举出：

从氨基末端开始顺序包含由SEQIDNO:3所示的氨基酸序列组成的重链CDR1，由SEQIDNO:4所示的氨基酸序列组成的重链CDR2，和由SEQIDNO:5所示的氨基酸序列组成的重链CDR3的重链可变区；

从氨基末端开始顺序包含由SEQIDNO:13所示的氨基酸序列组成的重链CDR1，由SEQIDNO:14所示的氨基酸序列组成的重链CDR2，和由SEQIDNO:15所示的氨基酸序列组成的重链CDR3的重链可变区；

从氨基末端开始顺序包含由SEQIDNO:23所示的氨基酸序列组成的重链CDR1，由SEQIDNO:24所示的氨基酸序列组成的重链CDR2，和由SEQIDNO:25所示的氨基酸序列组成的重链CDR3的重链可变区；

从氨基末端开始顺序包含由SEQIDNO:33所示的氨基酸序列组成的重链CDR1，由SEQIDNO:34所示的氨基酸序列组成的重链CDR2，和由SEQIDNO:35所示的氨基酸序列组成的重链CDR3的重链可变区；或

从氨基末端开始顺序包含由SEQIDNO:43所示的氨基酸序列组成的重链CDR1，由SEQIDNO:44所示的氨基酸序列组成的重链CDR2，和由SEQIDNO:45所示的氨基酸序列组成的重链CDR3的重链可变区。

更优选的重链可变区是：从氨基末端开始顺序包含由SEQIDNO:3所示的氨基酸序列组成的重链CDR1，由SEQIDNO:4所示的氨基酸序列组成的重链CDR2，和由SEQIDNO:5所示的氨基酸序列组成的重链CDR3的重链可变区。

此外，包含CDR1至CDR3的更优选实施方式的轻链可变区可举出：

从氨基末端开始顺序包含由SEQIDNO:8所示的氨基酸序列组成的轻链CDR1，由SEQIDNO:9所示的氨基酸序列组成的轻链CDR2，和由SEQIDNO:10所示的氨基酸序列组成的轻链CDR3的轻链可变区；

从氨基末端开始顺序包含由SEQIDNO:18所示的氨基酸序列组成的轻链CDR1，由SEQIDNO:19所示的氨基酸序列组成的轻链CDR2，和由SEQIDNO:20所示的氨基酸序列组成的轻链CDR3的轻链可变区；

从氨基末端开始顺序包含由SEQIDNO:28所示的氨基酸序列组成的轻链CDR1，由SEQIDNO:29所示的氨基酸序列组成的轻链CDR2，和由SEQIDNO:30所示的氨基酸序列组成的轻链CDR3的轻链可变区；

从氨基末端开始顺序包含由SEQIDNO:38所示的氨基酸序列组成的轻链CDR1，由SEQIDNO:39所示的氨基酸序列组成的轻链CDR2，和由SEQIDNO:40所示的氨基酸序列组成的轻链CDR3的轻链可变区；或

从氨基末端开始顺序包含由SEQIDNO:48所示的氨基酸序列组成的轻链CDR1，由SEQIDNO:49所示的氨基酸序列组成的轻链CDR2，和由SEQIDNO:50所示的氨基酸序列组成的轻链CDR3的轻链可变区。

更优选的轻链可变区是：从氨基末端开始顺序包含由SEQIDNO:8所示的氨基酸序列组成的轻链CDR1，由SEQIDNO:9所示的氨基酸序列组成的轻链CDR2，和由SEQIDNO:10所示的氨基酸序列组成的轻链CDR8的轻链可变区。

在上述的重链可变区中，由SEQIDNO:2、12、22、32或42所示的氨基酸序列组成的重链可变区是更优选的，由SEQIDNO:2所示的氨基酸序列组成的重链可变区是最优选的。

在上述的轻链可变区中，由SEQIDNO:7、17、27、37或47所示的氨基酸序列组成的轻链可变区是更优选的，由SEQIDNO:7所示的氨基酸序列组成的轻链可变区是最优选的。

本发明的单克隆IgA抗体还可为具有适当组合上述重链可变区和/或轻链可变区的结构的实施方式。这种实施方式的单克隆IgA抗体具有被称为例如F(ab')₂、Fab、Fv、scFv、scFv-Fc和微抗体(minibody)的结构。

本发明的单克隆IgA抗体中的更优选实施方式可举出：在上述的重链可变区和/或轻链可变区中包括进一步含有恒定区的重链和/或轻链的单克隆IgA抗体。

这样的单克隆IgA不受特别限制，例如可举出以下单克隆IgA抗体，该单克隆IgA抗体包括：由SEQIDNO:1、11、21、31或41所示的氨基酸序列组成的重链，和/或由SEQIDNO:6、16、26、36或46所示的氨基酸序列组成的轻链。

包括由SEQIDNO:1、11、21、31或41所示的氨基酸序列组成的重链和由SEQIDNO:6、16、26、36或46所示的氨基酸序列组成的轻链的单克隆IgA抗体是更优选的。

更优选的实施方式可举出：

包括由SEQIDNO:1所示的氨基酸序列组成的重链和由SEQIDNO:6所示的氨基酸序列组成的轻链的单克隆IgA抗体；

包括由SEQIDNO:11所示的氨基酸序列组成的重链和由SEQIDNO:16所示的氨基酸序列组成的轻链的单克隆IgA抗体；

包括由SEQIDNO:21所示的氨基酸序列组成的重链和由SEQIDNO:26所示的氨基酸序列组成的轻链的单克隆IgA抗体；

包括由SEQIDNO:31所示的氨基酸序列组成的重链和由SEQIDNO:36所示的氨基酸序列组成的轻链的单克隆IgA抗体；

包括由SEQIDNO:41所示的氨基酸序列组成的重链和由SEQIDNO:46所示的氨基酸序列组成的轻链的单克隆IgA抗体。

其中，包括由SEQIDNO:1所示的氨基酸序列组成的重链和由SEQIDNO:6所示的氨基酸序列组成的轻链的单克隆IgA抗体是更优选的。

上述单克隆IgA抗体可以是单体或多聚体，优选是二聚体。另外，当上述单克隆抗体是多聚体时，该单克隆抗体包含下面描述的J链。

J链是包括不含抗原识别位点的氨基酸序列的肽，并且是包括与上述重链和轻链不同的氨基酸序列的肽。该氨基酸序列的具体可举出：来源于小鼠的氨基酸序列，诸如在生物技术信息国家中心(NCBI)网站(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)上示出的登记号AAA38673；版本AAA38673.1GI:196379的氨基酸序列等；来源于人的氨基酸序列，诸如在NCBI网站上示出的登记号NP_653247；版本NP_653247.1GI:21489959的氨基酸序列等等。该J链通过二硫键与单克隆IgA抗体单体结合。

另外，在本说明书中描述的单克隆IgA抗体的功能、效果等不降低的范围内，限定上述单克隆IgA抗体的氨基酸序列可适当地进行突变。引入突变的确切数量也不受特别限制，通常可为如下方式的引入突变的数量，使得到的突变体的氨基酸序列与突变之前的氨基酸序列具有85％以上、优选90％以上、更优选95％以上并且最优选99％以上的同一性。

本说明书中使用的术语“同一性”指在两条以上的可对比的氨基酸序列或碱基序列的彼此相同的氨基酸序列或碱基序列的程度。因此，两条氨基酸序列或碱基序列之间的同一性越高，这些序列的同一性或类似性也越高。通常使用例如FASTA(序列分析工具)基于缺省参数确定氨基酸序列或碱基序列的同一性水平。

或者，可使用Karlin和Altschul的BLAST算法确定同一性的水平(例如KarlinS,AltschulSF,ProcNatlAcadSciUSA.87:2264-2268(1990)和KarlinS.AltschulSF,NatlAcadSciUSA,90:5873-7(1993))。已经开发了这种基于BLAST算法的程序，诸如BLASTN和BLASTX(例如AltschulSF,GishW.MillerW,MyersEW,LipmanDJ,JMolBiol,215:403-10(1990))。这些分析方法的详细程序是已知的，可参考NCBI的网站。

上面的突变引入为替换、缺失、插入等。对于具体的突变引入可使用已知方法，没有特别限制，但例如为替换时，可使用保守替换。

本说明书中使用的术语“保守替换”是指氨基酸残基被具有类似侧链的氨基酸残基替换。

例如，保守替换指具有碱性侧链的氨基酸残基(诸如赖氨酸、精氨酸和组氨酸)之间替换的技术。此外，保守替换还包括：具有酸性侧链的氨基酸残基(诸如天冬氨酸和谷氨酸)之间的替换；具有不带电荷的极性侧链的氨基酸(甘氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸和半胱氨酸)之间的替换；具有非极性侧链的氨基酸残基(诸如丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸和色氨酸)之间的替换；具有β-支化侧链的氨基酸残基(诸如苏氨酸、缬氨酸和异亮氨酸)之间的替换；和具有芳香族侧链的氨基酸残基(酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸和组氨酸)之间的替换。

上述单克隆IgA抗体的子类不受特别限制，可以例如是IgA₁和IgA₂。

本发明的单克隆IgA抗体可包含分泌因子。该分泌因子与上述的J链一样，是包含无抗原识别位点的氨基酸序列的肽，通常是经糖链修饰的包含与上述重链和轻链的氨基酸序列不同的氨基酸序列的肽。

作为该氨基酸序列，若来源于小鼠，具体可举出：在NCBI网站上示出的登记号070570，版本070570.1GI:6225856的多聚免疫球蛋白受体的氨基酸序列等中的相当于胞外结构域的氨基酸序列等。如果是上述示例，则第19～638位氨基酸序列相当于分泌因子。

如果是来源于人，则可举出在NCBI网站上示出的登记号P01833，版本P01833.4GI:150421625的多聚免疫球蛋白受体的氨基酸序列中的相当于胞外结构域的氨基酸序列等。如果是上述示例，则第19～645位氨基酸序列相当于分泌因子。

为了制造包含上述分泌因子的单克隆IgA抗体，可包括如下工序：进一步将具有编码多聚免疫球蛋白受体的分泌因子的碱基序列的核酸引入到在上述工序1中获得的杂交瘤中。具体的基因引入方法可对已知方法进行适当地修改，不受特别限制。

上述单克隆IgA抗体可具有来源于相同物种的氨基酸序列，或者可具有来源于不同物种的氨基酸序列。来自相同物种的情况下，可举出来源于人、小鼠、大鼠、仓鼠、兔、山羊、驴、猪、牛、马、鸡、猴、黑猩猩等。

来自不同物种的情况下，没有特别限制，例如可举出来自选自人、小鼠、大鼠、仓鼠、兔、山羊、驴、猪、牛、马、鸡、猴、黑猩猩等中的两种以上物种的单克隆IgA抗体。

进而，具有来源具体不同物种的氨基酸序列的单克隆IgA抗体的实施方式为具有来源于人的氨基酸序列和来源于非人的动物物种的氨基酸序列的单克隆IgA抗体，可举出具有整个重链和轻链的可变区都来源于非人的动物物种的氨基酸序列而其它区域来源于人的氨基酸序列的实施方式的单克隆IgA抗体。该单克隆IgA抗体有时被特别称为嵌合抗体。

本发明的单克隆IgA抗体抑制至少两种肠内细菌的生长。

本说明书中使用的术语“肠内细菌”只要它们是在活体肠内的固有细菌，就不受特别的限制。这种肠内细菌可举出在活体内形成肠内细菌丛，参与维持肠道免疫系统的体内平衡的细菌。

具体的肠内细菌没有特别限制，例如可举出：属于普氏菌(Prevotella)属的细菌、属于拟杆菌(Bacteroides)属的细菌、属于巨单胞菌(Megamonas)属的细菌、属于双歧杆菌(Bifidobacterium)属的细菌、属于柔嫩梭菌(Faecalibacterium)属的细菌、属于粪球菌(Coprococcus)属的细菌、属于瘤胃球菌(Ruminococcus)属的细菌、属于布劳迪亚(Blautia)属的细菌、属于真细菌(Eubacterium)属的细菌、属于罗氏菌(Roseburia)属的细菌、属于乳酸菌(Lactobacillus)属的细菌、属于梭菌(Clostridium)属的细菌、属于埃希氏菌(Escherichia)属的细菌、属于葡萄球菌(Staphylococcus)属的细菌、属于肠球菌(Enterococcus)属的细菌、属于假单胞菌(Pseudomonas)属的细菌、属于肠杆菌(Enterorhabdus)属的细菌等。

在这些细菌之中，可举出以下的细菌：Prevotellamelaninogenica、Bacteroidetesvulgatus、Megamonasfuniformis、Megamonashypermegale、Bifidobacteriumbifidum、Faecalibacteriumprausnitzii、Coprococcuseutactus、Ruminococcusobeum、Blautiaproductus、Blautiacoccoides、Eubacteriumrectale、Roseburiaintestinalis、Lactobacillusmurinus、Lactobacilluscasei、Clostridiumdifficile、Escherichiacoli、Staphylococcusaureus、Enterococcusfaecalis、Pseudomonasfulva、Enterorhabdusmucosicola等。

此外，本发明的单克隆抗体具有如在下面的实施例中描述的使大肠粘膜固有层的腺管减少或萎缩恢复的效果。大肠粘膜固有层中的腺管减少是对由肠内疾病，特别是肠内细菌的异常增殖和/或肠内细菌丛的病变引起的肠内疾病看到的组织病理学结果。此外，是在普通溃疡性结肠炎的慢性病变中常见的病变。

因此，本发明的单克隆IgA抗体预期具有抑制肠内细菌的异常增殖和/或肠内细菌丛的病变的效果，并且进一步预期具有治疗例如由肠内细菌的异常增殖和/或肠内细菌丛的病变引起的例如肠内疾病的效果，该肠内疾病诸如炎症性肠病、溃疡性结肠炎、克罗恩氏病、变态反应、哮喘、肥胖症和自身免疫性疾病。

上述肠内细菌的异常增殖不受特别限制，是指例如存在于肠内的细菌数量异常增加的状态。

肠内细菌丛的病变不受特别限制，是指由于例如构成肠内细菌丛的肠内细菌的种类和各种肠内细菌的比例发生变化而在维持与宿主共生关系的体内平衡上产生异常的状态。

而且，肠内细菌的异常增殖和/或肠内细菌丛的病变不必然限制为受到肠内疾病影响的状态，还可以是具有诱导肠内疾病的要因的状态。

在本说明书中使用的术语“治疗”指达到期望的药理学和/或生理学效果。该效果包括部分或完全治愈疾病和/或由疾病引起的不利影响(例如病症和症状)。此外，这些效果还包括：抑制或延迟疾病和/或由疾病引起的不利影响(例如病症和症状)的发展的效果；减轻病症和症状(即改善疾病或症状，或引起疾病或症状发展的逆转)的效果；和防止疾病复发的效果。

此外，上述效果还包括如下效果：在具有疾病和/或由疾病引起的不利影响(例如病症和症状)的诱因但还没有诊断为具有的个体中，部分或完全防止疾病的发作和/或由疾病引起的不利影响(例如病症和症状)。因此，术语“治疗”还包括“缓解”、“防止复发”、“预防”等意思。

如上所述，本发明的单克隆IgA抗体预期通过用于治疗肠内疾病而发挥优异的效果。这种效果是通过将该单克隆抗体经口或经肠道给药至个体而实现的效果。这证实了本发明的单克隆IgA抗体可用作经口或经肠道的组合物、药物组合物的有效成分。

核酸

本发明的核酸编码本发明的单克隆IgA抗体。更具体地，本发明的核酸具有编码由SEQIDNO:1至SEQIDNO:50中任一条所示的氨基酸序列的碱基序列。该核酸可以是核糖核苷酸或脱氧核糖核苷酸。此外，该核酸的形式不受特别地限制，可以是单链或双链。

编码上述氨基酸序列的碱基序列不限于相对于一个氨基酸序列由一种碱基序列构成的核酸，根据核酸的使用目的，可以通过适当地选择编码该氨基酸的各种密码子来确定碱基序列。作为使用目的，例如可举出使用该碱基序列表达本发明的单克隆IgA抗体，对其制造等。具体地，可考虑与制造时使用的宿主细胞种类对应的密码子频率选择各种密码子。

可通过使用已知程序“在硅片上”容易地确定这样的碱基序列。此外，本发明的核酸可具有对SEQIDNO:1至SEQIDNO:50实施如在“单克隆IgA抗体”部分详细描述的突变的氨基酸序列进行编码的碱基序列。

这种具体的碱基序列没有特别限制，例如可举出SEQIDNO:51至SEQIDNO:60所示的碱基序列。下面的表2能够说明这些碱基序列和在“单克隆IgA抗体”中详述的SEQIDNO:1至SEQIDNO:50的氨基酸序列之间的对应关系。

表2

单克隆IgA抗体的制造方法

本发明的单克隆IgA抗体的制造方法是上述“单克隆IgA”的制造方法，其特征在于，该方法包括下面的工序1和工序2。

工序1

工序1是将从肠道粘膜固有层收集的B细胞与其它类型的细胞混合并融合，制备杂交瘤的工序。

工序2

工序2是培养在工序1中制备的杂交瘤，确定产生与至少两种肠内细菌结合的IgA抗体的细胞，从该细胞回收IgA抗体的工序。

为了获得如后述的重链可变区和/或轻链可变区根据需要进行了适当组合的结构，本发明的单克隆IgA抗体的制造方法可在工序2之后进一步包括例如使用IgA特异性蛋白酶等进行处理的工序、引入能形成二硫键等化学键的官能团的工序以及随后经由前述官能团形成化学键的工序。

下面详细描述本发明的单克隆IgA抗体的制造方法中的工序1和工序2。

工序1

本发明的单克隆IgA抗体的制造方法中的工序1为将从肠道粘膜固有层收集的B细胞与其它类型的细胞混合并融合，制备杂交瘤的工序。

在工序1中使用的B细胞位于肠道粘膜固有层中。此外，只要它们具有产生IgA抗体的功能，则B细胞不一定限于包含编码IgA抗体的DNA或mRNA，并且通过mRNA的翻译产生IgA抗体的B细胞。上述B细胞还包括如下细胞：在该细胞中，与IgA抗体不同的子类的IgG抗体、IgM抗体等的免疫球蛋白进行类型转换而成为IgA抗体，在该细胞内产生IgA抗体。

肠道粘膜固有层不受特别限制，例如为存在于食道、胃、小肠(包括十二指肠、空肠、回肠等)和大肠(包括盲肠、结肠、直肠等)中的构成粘膜的层之一，可为位于上皮细胞层和粘膜肌层之间的层。其中，优选存在于小肠中，且包含淋巴组织、毛细血管、淋巴管等的肠道粘膜固有层。

从肠道粘膜固有层收集B细胞的方法不受特别限制，例如可举出如下方法，收集肠，冲洗之后切开获得的肠以露出粘膜层，然后在含适当浓度的EDTA的盐水中摇动以释放和去除上皮细胞。随后，通过使用适当浓度的消化酶(诸如胶原酶)进行处理，收集B细胞。除了上述方法之外，还可使用任意已知的方法来收集B细胞。也可以使用市场上购买的来源于肠道粘膜固有层的B细胞。

肠道粘膜固有层的来源(即B细胞的来源)不受特别限制，例如可举出小鼠、大鼠、仓鼠、兔、山羊、绵羊、驴、猪、牛、马、鸡、猴、黑猩猩、人等。

上述之外的细胞种类(在本说明书中有时称为“其它细胞”)为前述B细胞以外种类的细胞，只要是通过与B细胞接触，融合并形成杂交瘤，且该杂交瘤不失去上述的B细胞发挥的产生IgA抗体的功能即可。

上述其它细胞优选与前述B细胞融合形成杂交瘤且该杂交瘤具有永生化功能的细胞，具体可举出癌细胞，尤其是来源于骨髓的骨髓瘤细胞等。其它细胞优选是骨髓瘤细胞。

其它细胞的来源不受特别限制，例如可举出小鼠、大鼠、仓鼠、兔、山羊、绵羊、驴、猪、牛、马、鸡、猴、黑猩猩、人等。

融合是指B细胞和其它细胞不能分离地成为一体。在此，不能分离地成为一体排除了在融合后细胞增殖时发生的细胞分裂现象。这样，作为本说明书中的杂交瘤的一例可举出融合的细胞。

混合和融合的条件不受特别限制，在融合细胞的方法中通常使用的条件都可以适当使用。例如，可以适当改变用于培养B细胞或其它细胞的条件。作为上述方法可举出：在适当的培养基中混合B细胞和除了B细胞之外的其它细胞，以在例如聚乙二醇的存在下彼此接触的方法；在上述混合之后，进一步包括施加电刺激的方法；和在使用仙台病毒等病毒的方法之后，在5％的二氧化碳、37℃的条件下孵育得到的产物的方法。

融合的时间也不受特别限制，完成融合本身所需的时间可进行适当地设定。确认融合完成的方法可通过适当修改融合细胞时经常使用的已知方法来进行。上述方法可举出例如在显微镜下观察融合发展程度的方法。还可以适当选择和使用已知的试剂盒，以在其使用条件下进行细胞融合。

工序2

本发明的单克隆IgA抗体的制造方法的工序2包括：培养在工序1中制备的杂交瘤，确定产生与至少两种肠内细菌结合的IgA抗体的细胞，从该细胞回收前述抗体。

在本发明的工序2之前，在工序1中获得的杂交瘤可进行例如亚克隆工序，诸如有限稀释法等，其中亚克隆工序通常用于制造单克隆抗体。

如下面的实施例中所述，可例如利用ELISA、EIA、RIA、FLISA、FIA等，使用可识别该IgA抗体的抗IgA抗体(需要时可用放射性同位素、荧光或着色剂标记)，利用FACS等，来确定产生与至少两种肠内细菌结合的IgA抗体的杂交瘤。

用于确定“产生与至少两种肠内细菌结合的IgA抗体的杂交瘤”的具体方法没有特别限制，可举出例如使用上述抗IgA抗体的以下两种类型的方法等。这两种类型的方法也可适当地组合使用。

第一种确定方法可举出包括如下工序的方法：

(A)在上述工序1中获得的杂交瘤中，确定产生与一种肠内细菌结合的IgA抗体的杂交瘤的工序；和

(B)在工序A中确定的杂交瘤中，确认由其产生的IgA抗体是否与不同于上述肠内细菌的其它肠内细菌结合，确定产生与两种肠内细菌都结合的IgA抗体的杂交瘤的工序。

在这种情况中，例如当使用ELISA方法时，工序A可以以下的方式进行：对在工序1中获得的杂交瘤的培养上清液进行取样，并且使取样物在第一种肠内细菌被固定的例如多孔板的一个孔中与该第一种肠内细菌接触，通过确认前述取样物中存在与肠内细菌结合的IgA抗体，从而确定杂交瘤是产生Ig抗体的杂交瘤。

或者，工序B可以以下方式进行：使用在工序A中已确定产生IgA抗体的杂交瘤的培养上清液的取样物，或者根据需要再次对在工序A中确定的杂交瘤的培养上清液进行取样，然后将该取样物与在不同于第一种肠内细菌的其它(第二种)肠内细菌被固定的例如多孔板的一个孔中与该肠内细菌接触，通过确认取样物中存在与该肠内细菌结合的IgA抗体，从而确定杂交瘤是产生与至少两种肠内细菌结合的Ig抗体的杂交瘤。

当然，可包括在工序B中使用与上述第一种肠内细菌和第二种肠内细菌不同的第三种以上的肠内细菌作为上述的其它肠内细菌继续重复工序。

当使用诸如EIA、RIA、FLISA、FIA等方法时，与上述ELISA一样，第一种和第二种(和需要时的第三种)肠内细菌可被分别固定在孔或与其类似的实验装置中。

当选择FACS法时，可施用以下方法：将上述取样物与多种肠内细菌混合；然后，得到的混合物进一步与抗IgA抗体接触，适当地检测出各种肠内细菌、与其结合的Ig抗体以及抗IgA抗体形成的复合物，确定产生与肠内细菌结合的IgA抗体的杂交瘤。

第二种方法可举出包括如下工序的方法：分别使用检测IgA抗体与每一种不同的肠内细菌结合的系统，在上述工序1获得的杂交瘤中，确定产生与至少两种肠内细菌结合的IgA抗体的杂交瘤。

关于上述内容，当例如使用利用ELISA法的方法时，可举出下面的方法：在上述第一种方法的工序A中，两种(需要时三种以上)不同的肠内细菌被固定在例如多孔板的两个不同孔(基于肠内细菌的种类数量为三个以上)中，在工序1中获得的杂交瘤的培养上清液的取样物与在各孔中的上述两种(或三种以上)不同的肠内细菌接触，通过确认在上述取样物中存在与上述两种(或三种以上)肠内细菌都结合的IgA，来同时确定产生与至少两种肠内细菌结合的IgA的杂交瘤。

当使用诸如EIA、RIA、FLISA、FIA等方法时，与使用ELISA法的情况一样，第一种和第二种(需要时的第三种以上)肠内细菌可分别固定在孔或与其类似的实验装置中。

当选择FACS法时，将取样物分别与各种肠内细菌混合后，进一步与抗IgA抗体接触，适当地检测出多种肠内细菌、与该多种肠内细菌结合的Ig抗体以及抗IgA抗体形成的复合物，来确定产生与肠内细菌结合的IgA抗体的杂交瘤。

此外，在根据上述方法确定产生与至少两种肠内细菌结合的IgA抗体的杂交瘤之后，可包括如下工序，通过使用例如在上制造单克隆抗体的方法中使用的有限稀释，来进一步克隆产生与至少两种肠内细菌结合的IgA抗体的杂交瘤。

当进行此克隆时，可使用两种特定的肠内细菌，重复进行确定杂交瘤的上述工序，该两种特定的肠内细菌与确定杂交瘤产生与至少两种肠内细菌结合中所使用的肠内细菌相同。

在工序2中的回收方法在细节上不受到特别限制，例如可举出：回收产生IgA抗体的细胞的培养基上清液的方法；和回收细胞裂解液的方法。可适当地使用诸如超声和弗氏压碎器(Frenchpress)的已知机械手段，和/或使用去污剂、细胞壁消化酶和细胞膜消化酶的已知化学处理方法的组合，通过细胞裂解获得细胞裂解液，之后，回收在固体-液体分离工序之后获得的液相部分，从而可制造本发明的单克隆IgA抗体。

此外，在从杂交瘤中回收IgA之前，杂交瘤可在合适的培养基中培养特定的时间段，然后可进行如上所述的回收它的上清液的方法或者从细胞裂解液回收IgA的方法。除此以外，回收可通过如下过程进行：将杂交瘤给予能被移植该杂交瘤来源的免疫缺陷型小鼠等个体动物腹膜内，并且从该个体动物的腹水中回收IgA。

以上述方式收集的单克隆IgA抗体可合适地进行已知的纯化工序。纯化手段在细节上不受到特别地限制，可适当地组合使用已知的蛋白纯化手段，诸如通过使用例如丙酮和硫酸铵的沉淀进行的纯化；和通过例如亲和、阴离子交换、阳离子交换、尺寸排阻(sizeexclusion)或反相柱色谱进行的纯化。

本发明的单克隆IgA抗体的制造方法还包括如下方式的制造方法。例如，可举出如下方法：将在上文“核酸”部分中详细描述的核酸引入到能产生单克隆IgA抗体的细胞中，培养该细胞，并且从细胞提取物或培养上清液中回收单克隆IgA抗体，需要时进行纯化。

能产生单克隆IgA抗体的细胞不受到特别地限制，只要它是能产生来自哺乳动物的多种蛋白质的细胞，该多种蛋白常常在折叠成高级结构时行使功能。细胞可适当地选自已知细胞，包括：哺乳动物来源的细胞，诸如COS细胞、HEK细胞、HELA细胞和CHO细胞等；和昆虫来源的细胞，诸如Sf9等。

引入核酸的详细方法，培养其中引入核酸的细胞的条件、回收方法和纯化方法不受到特别的限制，并且取决于例如所使用的细胞类型的不同而不同，通过已知方法可适当地进行修改并且进行组合，可制造本发明的单克隆IgA抗体。

关于上述核酸，当本发明的单克隆IgA抗体是嵌合抗体时，制成具有编码重链可变区的碱基序列的核酸和具有编码不同物种的重链恒定区的碱基序列的核酸，以及具有编码轻链可变区的碱基序列的核酸和具有编码不同物种的轻链恒定区的碱基序列的核酸。接着，产生的具有编码重链可变区的碱基序列的核酸与具有编码重链恒定区的碱基序列的核酸结合，而具有编码轻链可变区的碱基序列的核酸与具有编码轻链恒定区的碱基序列的核酸结合。然后，可将得到的核酸引入到如上所述能产生单克隆IgA抗体的细胞中。

本发明的单克隆IgA抗体为重链和/或轻链的CDR1至CDR3具有小鼠来源的氨基酸序列且除了CDR之外的其它区域具有人源的氨基酸序列(这种抗体有时被称为“人源化抗体”)的抗体的情况下，可以与上述嵌合抗体的情况一样，产生具有编码重链和/或轻链的CDR1至CDR3的碱基序列的核酸和具有编码除它们之外的其它区域的碱基序列的核酸，以构成重链和轻链的方式再结合核酸，将得到的核酸引入到如上所述能产生单克隆IgA抗体的细胞中。为了保持抗体的结合能力，可能需要将一些碱基替换成其它碱基。

作为本发明的单克隆IgA抗体包含J链时的制造方法，可通过将具有编码单克隆IgA抗体的碱基序列的核酸和具有编码J链的碱基序列的核酸引入到如上所述能产生单克隆IgA抗体的细胞中，产生本发明的单克隆IgA抗体。

如在上文“单克隆IgA抗体”部分中描述的，基于在NCBI网站上示出的J链氨基酸序列，可通过使用已知的方法适当地确定编码J链的碱基序列。基于确定的碱基序列，可使用已知的方法产生核酸。

当本发明的单克隆IgA抗体包含分泌因子时，可通过将具有编码单克隆IgA抗体的碱基序列的核酸和具有编码J链的碱基序列的核酸，以及具有编码分泌因子的碱基序列的核酸，引入到如上所述能产生单克隆IgA抗体的细胞中，产生本发明的单克隆IgA抗体。这样的方法公开在例如LiCetal.,ShengWuGongChengXueBao.2011Feb；27(2):219-25中。可基于其公开内容或通过对公开内容进行适当修改，产生本发明的包含分泌因子的单克隆IgA抗体。

如在上文“单克隆IgA抗体”部分中描述的，基于例如在NCBI网站上示出的多聚免疫球蛋白受体的氨基酸序列，通过使用已知方法，可适当地确定包含编码分泌因子的碱基序列的核酸。基于确定的碱基序列，可使用已知的方法制造该核酸。

杂交瘤

本发明的杂交瘤产生本发明的单克隆IgA抗体。

杂交瘤具体地是在上文“单克隆IgA抗体的制造方法”部分中所述的工序1中获得的杂交瘤。即，通过混合并融合本发明的单克隆IgA抗体的制造方法的工序1中所述的B细胞与其它类型(即除了B细胞之外的种类)的细胞获得的细胞。

杂交瘤可来源于相同物种或来源于不同的物种。在上文“单克隆IgA抗体的制造方法”部分中，来源于相同物种的杂交瘤可通过将B细胞的来源设置成与除了B细胞之外的其它细胞的来源相同来获得，而来源于不同物种的杂交瘤可通过将B细胞的来源设置成与除了B细胞之外的其它细胞的来源不同来获得。

为了获得来源于相同物种的杂交瘤，B细胞的来源和除了B细胞之外的其它细胞的来源适当地选自，例如在上文“产生单克隆IgA抗体的方法”部分中描述的工序1中提到的来源，以便它们的来源彼此重叠。来源于相同物种的杂交瘤的来源例如可举出人、小鼠、大鼠、仓鼠、兔、山羊、驴、猪、牛、马、鸡、猴、黑猩猩等。

为了获得来源于不同物种的杂交瘤，B细胞的来源和除了B细胞之外的其它细胞的来源可适当地选自，例如在上文“产生单克隆IgA抗体的方法”部分中描述的工序1中提到的来源，并且进行组合。来源于不同物种的杂交瘤的来源例如可举出人、小鼠、大鼠、仓鼠、兔、山羊、驴、猪、牛、马、鸡、猴、黑猩猩等。

药物组合物

本发明的药物组合物包含本发明的单克隆IgA抗体。

本发明的药物组合物不受到特别限制，并且合适地用于治疗例如肠内疾病。本发明的药物组合物更优选用于治疗由肠内细菌的异常增殖和/或肠内细菌丛的病变引起的肠内疾病。肠内细菌的异常增殖和/或肠内细菌丛的病变如在上文“单克隆IgA抗体”部分中所述。

由肠内细菌的异常增殖和/或肠内细菌丛的病变引起的肠内疾病不受到特别限制，例如可举出炎症性肠病、溃疡性结肠炎、克罗恩氏病、变态反应、哮喘、肥胖症和自身免疫性疾病等，其中，炎症性肠病是优选的。

本发明的药物组合物只要包含有效量的本发明的单克隆IgA抗体即可，例如，考虑到例如目标肠内疾病的类型、剂型、给药方法、给药对象、给药对象的症状程度和通过给药实现的效果程度，可适当设置使100wt％药物组合物中的本发明的抗体的含量在0.001wt％至99.99wt％的范围内。

本说明书中使用的术语“有效量”指使本发明的单克隆IgA抗体能发挥治疗肠内疾病效果的量，或能实现上述期望的药理学和/或生理学效果(肠内疾病的治疗效果)的量。

与本发明的单克隆IgA抗体一起，药学上可接受的载剂或添加剂可被并入到本发明的药物组合物中。在此使用的词语“药学上可接受的载剂或添加剂”指可选的载剂、稀释剂、赋形剂(excipient)、悬浮剂、润滑剂、佐剂、赋形药(vehicle)、递送系统、乳化剂、崩解剂、吸收剂、防腐剂、去污剂、着色剂、香料或甜味剂。可使用已知的载剂或添加剂。

本发明的药物组合物适用于治疗肠内疾病的方法，包括将该组合物给予患上述肠内疾病的个体。本发明的药物组合物适用于肠内疾病的预防方法，其中该预防方法包括将该组合物给予还没有发展成上述肠内疾病的病状或症状，但可能具有肠内疾病的诱因的个体。这些个体可用作本发明的药物组合物的给药对象。

用作给药对象的个体不受到特别限制，例如可举出人、小鼠、大鼠、豚鼠、兔、仓鼠、狗、猫、鼬鼠等。

根据作为给药对象的个体所患的肠内疾病的类型、性别、种属、年龄、一般状态(generalconditions)、疾病的严重程度和期望的效果程度等，可适当地确定药物组合物的剂量和给药方法。剂量可被适当地设置在0.001mg/kg/天至100mg/kg/天的范围内。

给药方法不受到特别限制。直接给药到胃肠道中是优选的。给药方法的实例包括经口给药、经鼻给药、粘膜给药、经肠道给药等。

经肠道给药不限制于通过肛门给药，例如在胃瘘中，经肠道给药包括通过从个体外插入到胃肠道中的管道等给药。插入消化道中的位置不限于肠道，可举出食道、胃、小肠(包括十二指肠、空肠、回肠等)、大肠(包括盲肠、结肠、直肠等)等等。

上述剂量的本发明的药物组合物可以每天单一剂量或多次剂量的形式给药。给药间隔可以是每天一次、每隔一天一次、每星期一次、每隔一星期一次、每隔2至3星期一次、每个月一次或每隔2至3个月一次，只要能实现治疗上述疾病的效果。

经口或经肠道的组合物

本发明的经口或经肠道的组合物包含本发明的单克隆IgA抗体。经口或经肠道的组合物的应用实现了抑制肠内细菌的异常增殖和/或肠内细菌丛的病变的效果。肠内细菌的异常增殖和/或肠内细菌丛的病变如在上文“单克隆IgA抗体”部分中所述。

在经口或经肠道的组合物中包含的单克隆IgA抗体的混合比率不受到特别限制，并且可以根据经口或经肠道的组合物的形式、用法等进行适当地调节，基于经口或经肠道的组合物的总量，混合比率通常可以是约0.001wt％至99wt％。

作为本发明的经口或经肠道的组合物在其中使用的对象的个体不受到特别限制，例如可举出人、小鼠、大鼠、豚鼠、兔、仓鼠、狗、猫、鼬鼠等。

如上所述，在本发明的经口或经肠道的组合物中包含的单克隆IgA抗体具有抑制肠内细菌的异常增殖和/或肠内细菌丛的病变的效果，因此可具体用作控制肠道功能的组合物、改善肠内环境的组合物、使肠内环境最优化的组合物或者防止肠内腐败的组合物。

只要在经口或经肠道的组合物能发挥效果的范围内，则本发明的经口或经肠道的组合物的剂量不受到特别限制，并且可以根据摄取该经口或经肠道的组合物的个体的物种、目标效果、实现效果的目标程度、其它多种条件等进行设置。具体地，该剂量可以转换成本发明的单克隆IgA抗体的量，通常是0.001mg/kg/天至100mg/kg/天，该量可以每天一次或几次来摄取。

如在上文“药物组合物”部分中所述，经肠道给药不限于通过肛门给药。例如，本发明的肠内组合物可与已知组分调配在一起，以用作肠灌洗液。

本发明的经口或经肠道的组合物包含本发明的单克隆IgA抗体，其中本发明的单克隆IgA抗体实现抑制肠内细菌的异常增殖和/或肠内细菌丛的病变的效果。在期望实现这样的效果的情况下，本发明的经口或经肠道的组合物可适当地用在食物或饲料的领域中。因此，本发明的经口或经肠道的组合物可用作食物组合物或饲料组合物。

作为食物组合物，本发明的经口或经肠道的组合物专门适用于食物领域中。这样的食物组合物可被提供为表现出能控制肠道功能、改善肠内环境、使肠内环境最优化、防止肠内腐败等的食物组合物。

作为上述食物组合物，除了普通的食品之外，可举出包含有条件的特定保健用食物的特定保健用食物、营养补充食物、功能性食物、医疗食物等。

食物组合物的特定形式不受到特别地限制，例如可举出：饮料，诸如软饮料、碳酸饮料、能量饮料、果汁饮料、乳酸饮料和乳饮料；冷冻甜食，诸如冰淇淋、冰冻果子露和刨冰；蜜饯，诸如糖果、口香糖、巧克力、压片糖果、零食蜜饯(snackconfectionery)、饼干、果冻、果酱、奶油、烧烤蜜饯；面条，诸如荞麦面、小麦面粉面条、粉丝、中华面和方便面；鱼和牲畜的加工食品，诸如蒲鉾(鱼香肠)、火腿和香肠；乳制品，诸如经加工的奶产品和经发酵的奶产品；油和脂肪的加工食品，诸如色拉油、天麸罗、人造黄油、蛋黄酱、起酥油、生奶油和调料(dressing)；调味品，诸如蘸酱和其它调味酱；和，汤、炖菜、沙拉、日常菜肴、米饭调味品、腌菜、面包、谷类食品等等。特定保健用食物、营养补充食物、功能型食物等的形式可以是粉末、颗粒、胶囊、锭剂、片剂、糖浆等。

作为饲料组合物，本发明的经口或经肠道的组合物专门适用于饲料领域中。这样的饲料组合物可被提供为表现出能控制肠道功能、改善肠内环境、使肠内环境最优化、防止肠内腐败等的饲料组合物。

只要能实现上述本发明的饲料组合物的效果，饲料组合物的特定形式就不受到特别限制，并且可以是例如与常用饲料混合，可选地与能与常用饲料调配在一起的组分混合，以获得饲料组合物，还可以使用饲料组合物本身作为饲料。

疾病的治疗方法

根据本发明的疾病的治疗方法是肠内疾病的治疗方法，其中该方法包括：将有效量的本发明的单克隆IgA抗体、本发明的药物组合物或本发明的经口的组合物给予患肠内疾病的人。

患肠内疾病的人可以是上文“药物组合物”部分中提到的给药对象。特定的给药方法和剂量也可以如上文“药物组合物”部分中所述。

实施例

下面将对本发明进行更详细地描述，但是本发明当然并不限于下面的实施例。

实施例1：抗体的制备

1-1：肠道粘膜固有层细胞的分离

在长滨生物科学技术大学(NagahamaInstituteofBio-ScienceandTechnology)的实验设施中，将8周龄野生型C57BL/6小鼠(CLEAJapan,Inc.)饲养至20周龄，在这一期间，小鼠可自由获得食物和水。随后，使用二氧化碳对小鼠实施安乐死，然后进行剖腹手术以移出整个小肠。从移出的小肠样品中移除结缔组织和派伊尔氏淋巴集结之后，纵向切开小肠，并在充满PBS的10cm平皿中洗掉肠道内容物。通过进一步更换PBS三次至四次，对小肠进行充分清洗。

与野生型C57BL/6小鼠一样，还从表达在AID蛋白质的N末端侧引入突变的AIDG23S的小鼠(AIDG23S小鼠)中收集小肠。这样的AIDG23S小鼠可使用已知的方法产生，例如在非专利文献18中公开的方法。

接着，将含有1mMEDTA的50mlPBS放入50ml的管子中。将清洗过的小肠切成0.5至1cm的长度，添加到管子中。在37℃摇动20分钟，将小肠片段收集到滤网中，然后丢弃PBS。进一步，将小肠片段放入如上所述的管子中。在剧烈摇动10秒之后，再次将小肠片段收集到滤网中，然后以相同方式丢弃PBS。使用50mlPBS对小肠剧烈摇动10秒，重复两次。

之后，将加热至37℃的50ml消化酶溶液放入50ml的管子中，其中50ml消化酶溶液使用500mlRPMI1640、25mlFCS(终浓度为5％)、2μl2-巯基乙醇(终浓度为55μM)、0.75g胶原酶和5ml分散酶(终浓度为1U/ml)制得。使用剪刀将小肠片段进一步切成小块，并且添加到管子中。在37℃摇动60分钟之后，使管子静止10秒，以使小肠组织下沉。然后将上清液转移到新的50ml的管子中。这种使用消化酶液体进行消化的过程进行两次。

在消化过程中分离的上清液在4℃、1,500rpm离心5分钟，丢弃上清液。得到的沉淀物进一步被悬浮在1ml含有2％FCS的RPMI1640中。使悬浮液通过过滤器，以去除组织部分，将得到的细胞悬浮液储存在冰上。

在上述的第二次酶反应进行60分钟之后，以相同的方式回收细胞悬浮液。两种细胞悬浮液(即在第一次酶反应之后获得的细胞悬浮液和在第二次酶反应之后获得的细胞悬浮液)合起来，得到的悬浮液用作肠道粘膜固有层细胞。

产生IgA的杂交瘤的制备

在“肠道粘膜固有层细胞的分离”部分中获得的肠道粘膜固有层细胞与小鼠的骨髓瘤NS1细胞融合，制备杂交瘤。在细胞融合之前进行NS1细胞的培养和维持。细胞融合使用由STEMCELLTechnologies提供的ClonaCell(注册商标)-HY杂交瘤克隆试剂盒的试剂，按照试剂盒的方案进行。

然后，使获得的杂交瘤在含甲基纤维素的培养基中生长，以按照试剂盒的方案进行克隆。之后，从生长的杂交瘤中分离来源于每一个亚克隆的上清液。对包含在上清液中的抗体，进行ELISA，以检测产生的抗体是否是IgA，以测量上清液中的IgA的抗体滴度。然后，分离产生IgA的杂交瘤克隆。因此，证实一共建立了37个克隆。

使用IsogenII(NipponGeneCo.,Ltd.)从每一个克隆中提取RNA，并且使用RNA作为模板合成cDNA。然后，使用抗体Vh区域的7种引物(MH1至MH7)和Cα区域特异性引物(IgAR)进行RT-PCR。表3示出这些引物的具体的碱基序列。

表3

引物名称	碱基序列
		MH1(SEQ ID NO:61)	SARGTNMAGCTGSAGTC
MH2(SEQ ID NO:62)	SARGTNMAGCTGSAGSAGTCWGG
		MH3(SEQ ID NO:63)	CAGGTTACTCTGAAAGWTSTG
MH4(SEQ ID NO:64)	GAGGTCCARCTGCAACARTC
		MH5(SEQ ID NO:65)	CAGGTCCAACTVCAGCARCC
MH6(SEQ ID NO:66)	GAGGTGAASSTGGTGGAATC
		MH7(SEQ ID NO:67)	GATGTGAACTTGGAAGTGTC
IgAR(SEQ ID NO:68)	GATGGTGGGATTTCTCGCAGAC

*在表中的碱基序列中，S表示G或C；R表示A或G；N表示A、C、G或T；M表示A或C；W表示A或T；以及，V表示G、C或A。

对VDJ区域扩增的PCR产物进行直接测序，以分析突变和VDJ使用的数量。分析显示，获得17种产生IgA的杂交瘤作为独立的克隆。这些独立的克隆被分别称为W1、W2、W3、W4、W6、W7、W11、W14、W24、W27、W28、W30、W32、W34、W37、W43和W47。

通过以相同方式进行试验，从G23S小鼠获得10种独立的产生IgA的杂交瘤克隆。这些克隆被分别称为G1、G8、G9、G10、G12、G14、G15、G16、G18和G19。

1-2：IgA抗体的制备

将在上述“产生IgA的杂交瘤的制备”部分中获得的27个产生IgA抗体的杂交瘤克隆大规模分别培养在含10％FCS的RPMI1640中，并且通过离心收集培养上清液。随后，使获得的培养上清液通过0.22μm过滤器，然后进行硫酸铵沉淀和对PBS的透析，从而部分纯化27种单克隆IgA抗体(在下面的实施例中也被称为前面加有克隆名称的“单克隆IgA抗体”)。

在另一方法中，将在形成产生IgA的杂交瘤的部分中获得的27种杂交瘤克隆的每一种单独腹腔内注射到免疫缺陷小鼠中，该免疫缺陷小鼠饲养10天至21天，然后从小鼠收集腹水。在收集的腹水进行硫酸铵沉淀之后，使用PD-10柱将缓冲液替换成PBS。从而部分纯化27种单克隆IgA抗体。

使用ELISA，测量通过上述方法制备的27种单克隆IgA抗体的每一种的浓度。在测量中，山羊抗小鼠IgA(SouthernBiotech)用作以2μg/ml的量涂敷至固层上的抗体，而ALP标记的山羊抗小鼠IgA(SouthernBiotech)用作以0.5μg/ml的量进行检测的抗体。小鼠IgAκ(ImmunologyConsultantsLaboratory)用作标准样品。

1-3：肠内固有细菌的制备

将喂养在NagahamaInstituteofBio-ScienceandTechnology的实验设施的SPF室中的野生型小鼠的粪便悬浮在PBS中，将稀释的悬浮液涂布在血琼脂平板上，并且在37℃培养48小时至72小时。之后，对获得的克隆直接进行16SrRNA基因的PCR。得到的PCR产物进行测序，以鉴定出每一菌落的细菌。以这样的方式，克隆六种小鼠肠内细菌。

克隆的小鼠固有的肠内细菌具体是如下六个细菌物种：Enterorhabdusmucosicola、Escherichiacoli、Staphylococcusaureus、Lactobacillusmurinus、Enterococcusfaecalis、Pseudomonasfulva。

1-4：对肠内细菌的结合能力和特异性的研究

在最佳条件下培养一共13种肠内细菌(即上述六种固有肠内细菌的克隆物种和下面在市场上购买的细菌)，并且通过离心收集细菌细胞：Escherichiacoli(DH5α菌株：获自TOYOBOCo.,Ltd.)、Lactobacilluscasei(获自ATCC)、Coprococcuseutactus(获自ATCC)、Blautiacoccoides(获自ATCC)、Megamonashypermegale(获自ATCC)、Eubacteriumrectale(获自ATCC)和Bifidobacteriumbifidum(获自ATCC)。

具体地，将每一种细菌物种悬浮在0.05MNa₂CO₃缓冲液中，并且使用每一个细菌溶液单独涂敷ELISA平板。在通过已知方法进行封闭之后，单独添加上述27种单克隆IgA抗体(浓度为1.4μg/ml)，以测量这些单克隆IgA抗体针对13种肠内细菌的结合能力和特异性。然后，根据已知的ELISA法，检测细菌和抗体之间的结合。用于检测的抗体与上面的相同。

图1示出了结果。结果显示，在27种单克隆IgA中，22种单克隆IgA(来源于野生型小鼠的W1、W3、W4、W6、W7、W11、W14、W24、W27、W30、W32、W34、W43和W45单克隆IgA抗体；来源于G23S小鼠的G1、G9、G10、G12、G14、G15、G18和G19单克隆IgA抗体)与两种以上肠内细菌物种结合。

随后，通过改变所使用的抗体的浓度，进行实验来对比上述单克隆IgA抗体针对肠内细菌的结合强度。具体地，使用上述ELISA的测量方法来进行实验。使用的单克隆IgA抗体是W27、G15和G19单克隆IgA抗体。W2单克隆IgA抗体用作阴性对照。

使用的肠内固有细菌是Staphylococcusaureus、Escherichiacoli和Enterococcusfaecalis。

图2示出了结果。可知，W27单克隆IgA抗体以浓度依赖的方式最有效地与几种肠内细菌结合。

使用W27单克隆IgA抗体、W27单克隆IgA抗体结合分泌因子的W27SC3F单克隆IgA抗体、W11单克隆IgA抗体、W34单克隆IgA抗体、W43单克隆IgA抗体和G15单克隆IgA抗体进行相同的实验。W2单克隆IgA抗体用作阴性对照。

如下制造W27SC3F单克隆IgA抗体。首先，从约1cm的野生型小鼠的小肠片段中提取RNA。通过由Invitrogen生产的SuperScriptIII，使用RNA进行逆转录反应以获得cDNA。使用cDNA作为模板，并且使用两种引物(EcoRISCF:5’-gaattcaccatgaggctctacttg-3’，SEQIDNO:69和FlagSC3R:5’-ctcgagtcacttgtcgtcatcgtctttgtagtccccgggatt-3’，SEQIDNO:70)，通过PCR扩增多聚免疫球蛋白受体的细胞外结构域。在扩增中，将FLAG标签的碱基序列添加到反向引物中，从而可以使用抗FLAG抗体来检测其蛋白在细胞中的表达。扩增的DNA碱基序列编码在SEQIDNO:71中示出的氨基酸序列。将FLAG标签的序列添加到C末端(mSC3F-FLAG)。

获得的PCR产物经限制性酶处理，并且被克隆到pcDNA3.1(+)载体(Invitrogen)中。下面，将完成的表达载体称为“pcDNA3.1(+)/mSC3F”。由Escherichiacoli制备pcDNA3.1(+)/mSC3F的质粒DNA，并且使用Nucleofector(AMAXA)转染到产生W27单克隆抗体的杂交瘤中。然后使用G418进行选择。根据上述从杂交瘤回收单克隆IgA抗体的方法，从由此选择的杂交瘤获得W27SC3F单克隆IgA抗体。

而且，所使用的肠内固有细菌是Enterococcusfaecalis、Staphylococcusaureus、Escherichiacoli和Pseudomonasfulva。

图3示出了结果。这一实验还表明，W27单克隆IgA抗体以浓度依赖的方式最有效地与每一种肠内细菌结合。

1-5：使用单克隆IgA抗体对细菌进行的蛋白印记分析

Escherichiacoli(DH5α；可在市场上购买)、Escherichiacoli(来自小鼠肠道内容物的克隆菌株)、Pseudomonasfulva、Staphylococcusaureus和Eubacteriumrectale用作肠内细菌，并且每一种肠内细菌都在适于每一种细菌物种的条件下，在10mlLB或最佳培养基中进行震荡培养。在通过离心收集细菌细胞之后，将它们悬浮在含1％NP-40的PBS中，在冰上进行声处理，并且在冰上静止30分钟。然后通过离心获得悬浮液。将SDS缓冲液(含2-ME)添加到上清液中，并且通过在95℃进行10分钟热处理，来进行蛋白变性。进行8％SDS-PAGE，然后将蛋白质转移至过滤器。在封闭之后，进行蛋白印记法，以通过Odyssey(LI-COR)检测信号，在该蛋白印记法中，使用W27、W30和W45单克隆IgA抗体(2μg/ml)进行反应，然后使用山羊抗小鼠IgA(1μg/ml)(SouthernBiotechnology)和IR800抗山羊IgG(0.2μg/ml)(Rockland)进行反应，并且如果需要，使用经标记的抗山羊IgG进行反应。

图4示出了结果。结果显示，W27、W30和W45单克隆IgA抗体与所有上述的细菌提取物结合。因此，实验结果暗示W27、W30和W45单克隆IgA抗体识别肠内细菌的组成蛋白质之一为抗原。进一步，显示该组成蛋白质的分子量是约45kDa至50kDa。

进一步，以与上述相同的方式，使用Eubacteriumrectale、Blautiacoccoides、Coprococcuseutactus、Megamonashypermegale、Lactobacilluscasei和Bifidobacteriumbifidum进行实验。所使用的单克隆IgA抗体是W27。图4示出了结果。结果显示，W27单克隆IgA抗体不与除了Eubacteriumrectale之外的其它细菌的提取物中的蛋白质结合。

1-6：对各种单克隆IgA抗体的氨基酸序列的分析

在通过上述方法获得的单克隆IgA抗体中，使用已知方法，来分析被证实与两种以上肠内细菌结合的五种单克隆IgA抗体的氨基酸序列，即W27、W30、W34、W43和W11单克隆IgA抗体。

使用已知方法来分析氨基酸序列。具体地，进行5’RACE和3’RACE反应，以获得全长的碱基序列。根据In-Fusion(注册商标)SMARTerTMDirectionalcDNA文库构建试剂盒(Clontech)的程序，进行RACE法。对于重链，使用试剂盒中包括的引物和上述引物的组合来进行序列分析。对于轻链，使用以下引物的组合来进行序列分析。

CkR:5’-AACGTGAGGGTGCTGCTCATG-3’(SEQIDNO:72)

degVk:5’-GGCTGCAGSTTCAGTGGCAGTGGRTCWGGRAC-3’(SEQIDNO:73)

表4至8示出了结果。在这些表的“全长序列”中的加下划线部分表示可变区域，而“全长序列”和“可变区域”中的粗体部分以从前至后的顺序(从N末端开始)表示CDR1、CDR2和CDR3。

此外，编码这些氨基酸的核酸序列如下：

·W27单克隆IgA抗体；重链：SEQIDNO:51,轻链：SEQIDNO:52；

·W30单克隆IgA抗体；重链：SEQIDNO:53,轻链：SEQIDNO:54；

·W34单克隆IgA抗体；重链：SEQIDNO:55,轻链：SEQIDNO:56；

·W43单克隆IgA抗体；重链：SEQIDNO:57,轻链：SEQIDNO:58；

·W11单克隆IgA抗体；重链：SEQIDNO:59,轻链：SEQIDNO:60

表4

表5

表6

表7

表8

实施例2：鉴定单克隆IgA抗体的抗原的实验

2-1：免疫沉淀实验

在通过上面的1-5部分中所述的方法，从三种细菌(即Escherichiacoli(DH5α)、Pseudomonasfulva和Staphylococcusaureus)制备细胞提取成分之后，添加2-ME(终浓度为300mM)和SDS(终浓度为1％)，并且在95℃进行10分钟热变性。之后，在每一个溶液中，将2-ME浓度调节至60mM，并且将SDS浓度调节至0.2％。首先，将100μl已经冲洗的ProteinGSepharose4FastFlow(GE)添加到胞提取成分，得到的混合物在4℃通过倒转混合30分钟。然后，通过离心去除与ProteinGSepharose非特异性结合的成分。将5μgW27单克隆IgA抗体添加到在预净化之后获得的细胞提取成分中，得到的混合物在冰上静止30分钟。之后，添加5μg山羊抗小鼠IgA，得到的混合物再在冰上静止30分钟。随后，添加30μl已经冲洗的ProteinGSepharose4FastFlow(GE)，得到的混合物在4℃通过倒转混合15小时。在使用含1％NP-40的PBS冲洗四次之后，将SDS缓冲液(含2-ME)添加到ProteinGSepharose，并且通过在95℃热处理10分钟(免疫沉淀样品)来进行蛋白质变性。这些样品进行8％SDS-PAGE，然后上述蛋白印记证明在部分1-5中检测到的蛋白质被浓缩(图5)。

2-2：双向电泳和MS分析

对上述免疫沉淀样品都进行丙酮沉淀，并且溶解在双向电泳的缓冲液中。在第一向中使用的凝胶是琼脂凝胶(pH为3至8；ATTO)。在第二向中，进行6％SDS-PAGE。每次都制备重复样品，并且同时在两个凝胶上进行电泳。然后，一个样品进行上述蛋白印记，以证实凝胶中靶蛋白的位置。具体地，在蛋白转移至过滤器之后，转移的蛋白经MemCodeTM可逆蛋白染色试剂盒(ThermoScientific)染色，来获得染色的图像(图5)。

随后，在漂白之后，进行上述普通蛋白印记来获得图像，以证实靶蛋白的位置(图5)。两个图像鉴定出靶蛋白在双向中的斑点。其它样品的凝胶进行银染(Sil-BestStain；NacalaiTesque)，以使所有蛋白质都显现出来。靶蛋白基于从第一凝胶获得的位置信息鉴定出来，并且从第二凝胶上切下来。

切下来的凝胶使用胰蛋白酶，在37℃进行15小时的胶内酶消化。

使用LCMS-IT-TOF(ShimadzuCorporation)进行MS分析。分析结果显示，在斑点中的蛋白质是作为抗原的丝氨酸羟甲基转移酶。

随后，将由氨基酸序列(SEQIDNO:74，在C末端带有c-Myc标签)所示的丝氨酸羟甲基转移酶的全长表达在Escherichiacoli(DH5α)中。通过蛋白印记检验上述抗体(W11、W27、W30、W34和W43单克隆IgA抗体)中的每一种与丝氨酸羟甲基转移酶的结合。图9示出了结果。

结果表示，不仅W27单克隆IgA抗体，而且W11、W30、W34和W43单克隆IgA抗体都识别丝氨酸羟甲基转移酶作为抗原。

2-3：表位鉴定试验

接下来，将丝氨酸羟甲基转移酶的多种突变体和野生型表达在Escherichiacoli细胞和293T细胞中。进行实验来研究上述单克隆抗体的表位。

制备的突变体具有在SEQIDNO:74所示的氨基酸序列中的以下位置处的氨基酸序列：

(1)由氨基酸1至417所示的序列(全长；野生型)，

(2)由氨基酸11至417所示的序列(Δ2-10)，

(3)由氨基酸26至417所示的序列(Δ2-25)，

(4)由氨基酸29至417所示的序列(Δ2-28)，

(5)由氨基酸1至333所示的序列(Δ334-417)，和

(6)由氨基酸1至250所示的序列(Δ251-417)。

每条序列都在C末端添加有Myc标签(40aa)。

含有丝氨酸羟甲基转移酶的这些野生型和突变的细胞裂解液以与上述相同的方式进行蛋白印记。所使用的抗体是W27单克隆IgA抗体。图10示出了结果。

在图10中示出的结果显示，W27单克隆IgA抗体与Δ2-25突变体结合，但不与Δ2-28突变体结合。这一事实从使用293T系统的实验中是清楚的，其中认为该293T系统不受到来源于Escherichiacoli的内源性野生型丝氨酸羟甲基转移酶的影响。还显示，W27单克隆IgA抗体与Δ251-417突变体和Δ334-417突变体结合。

实施例3：W27单克隆IgA抗体的经口给药实验

3-1：G23S小鼠的疾病模型的分析

制备AIDG23S小鼠的大肠组织切片，并且使用HE进行染色，以研究炎症程度。结果发现，与野生型小鼠相比，甚至在13至16周龄的小鼠中就观察到腺管显著减少或萎缩。尤其在40周龄或更老时，观察到腺管的显著减少或萎缩，并且大肠的炎症细胞侵入到粘膜内。免疫染色示出，存在量比野生型小鼠大的CD11b⁺细胞、IL-6阳性细胞、IL-6、IL-17和类炎症细胞。

进一步，通过使用定量PCR的方法，测量TNFα、IFNγ、IL-1β、IL-17、IL-6和类炎性细胞因子的表达水平的结果显示，与野生型小鼠相比，在AIDG23S小鼠的大肠组织中存在更大数量的炎症细胞。上述事实显示，AIDG23S小鼠适用作炎症性肠病、溃疡性结肠炎和相似疾病的小鼠模型。

3-2：W27单克隆IgA抗体的效果

将W27单克隆IgA抗体经口给予处于肠免疫系统过度反应状态的小鼠。在小鼠的肠组织中，观察到派伊尔氏淋巴集结生发中心增生和炎性细胞因子产生增加。

在实验中，使用10周龄至12周龄的雄性AIDG23S小鼠(Balb/c背景)。将W27单克隆IgA抗体以25μg/ml的浓度添加到喂食的饮用水中，并且将得到的饮用水经口给予AIDG23S小鼠，持续28天。作为阴性对照，进行其中仅将水给予AIDG23S小鼠的实验和其中仅将水同样地给予野生型小鼠的实验。

在日常喂养时，还以相同的方式，将饲料给予所有小鼠。

在开始给予W27单克隆IgA抗体之后一个月，对小鼠实施安乐死，并且从测试小鼠的小肠中切出派伊尔氏淋巴集结。通过载玻片将派伊尔氏淋巴集结分离成单个细胞，然后使用下述抗体对细胞的表明抗原进行染色。使用流式细胞分析来确定显示B220⁺PNA^高的生发中心B细胞部分的细胞数量的百分比，以研究生发中心自身是否会因为W27单克隆IgA抗体的给予而发生退化。

在流式细胞术中使用的抗体如下：

·经PE-Cy7标记的抗小鼠B220(eBioscience)；

·生物素化的花生凝集素(Biotinylatedpeanutagglutininn)(VECTORlaboratories)；

·链霉亲和素APC(eBioscience).

进行方差分析和t-测试，以确定派伊尔氏淋巴集结生发中心B细胞的百分比在给药组和两个阴性对照组之间的显著性差异。具体地，分析每一组的派伊尔氏淋巴集结生发中心B细胞的百分比，和每一组的派伊尔氏淋巴集结生发中心B细胞的数量。图7示出了结果。

在未经W27单克隆IgA抗体治疗的AIDG23S小鼠中，派伊尔氏淋巴集结生发中心B细胞的数量显著增加。相比之下，显示在经W27单克隆IgA抗体治疗的AIDG23S小鼠中，派伊尔氏淋巴集结生发中心B细胞的数量显著降低至与经口给予W27单克隆IgA抗体的野生型小鼠类似的水平。

如上所述，清楚的是AIDG23S小鼠适于用作炎症性肠病、溃疡性结肠炎和相似疾病的小鼠模型。此外，派伊尔氏淋巴集结生发中心B细胞在AIDG23S小鼠中过度增殖。肠免疫系统中的IgA抗体在派伊尔氏淋巴集结生发中心B细胞中产生。因此，B细胞的过度增加示出IgA抗体在肠免疫系统中过度产生。这意味着未应对肠内细菌侵入肠道粘膜中的状态。如上所述，为了改善这样的状态，T细胞在肠免疫系统中被互补地活化，这导致引起炎症的炎性细胞因子产生增加。

因此，W27单克隆IgA抗体可以使肠免疫细胞正常化，并且抑制例如T细胞的功能，从而消除炎症，其中W27单克隆IgA抗体具有降低派伊尔氏淋巴集结生发中心B细胞数量的效果。这明确暗示，W27单克隆IgA抗体有效抵抗由肠内细菌的异常增殖和/或肠内细菌丛的病变所引起的疾病，诸如炎症性肠病和溃疡性结肠炎，以及其它肠内疾病。

图11示出13周龄至15周龄的野生型小鼠以及进行四周W27单克隆IgA抗体经口给药的G23S小鼠和未经处理的G23S小鼠的大肠粘膜组织的腺管减少或萎缩病变的分析结果。去除整个大肠的内容物，并且使用盐清洗大肠，环绕牙签，包埋在OCT化合物中，并且进行冷冻。之后，制备厚度为6微米的冷冻切片，并且进行苏木精-伊红染色。指定病理部分，显微镜下观察到在该病理部分中的腺管减少，并且对整个大肠中的病理部分的程度进行量化，并且总结在图11a中的柱状图中。典型的组织图像示于图11b中。

3-3：W27单克隆IgA抗体在经口给药的体内的动力学实验

在经口给药之后，通过实验来证实W27单克隆IgA抗体是否经由消化道到达肠。在实验中使用AID敲除小鼠，该AID敲除小鼠不产生IgA。

以与上述的经口给药实验中的相同剂量和方法，将W27单克隆IgA抗体经口给予AID敲除小鼠。具体地，将W27单克隆IgA抗体以25μg/ml的浓度添加到饮用水中，并且将得到的饮用水通过口服给予AIDG23S小鼠，持续28天。在第2天，收集粪便。将100mg收集的粪便悬浮在0.9mlPBS中,悬浮液进行离心以收集上清液。通过ELISA测量上清液中的IgA浓度。

图8示出了结果。从粪便中检测到W27单克隆IgA抗体。这一事实显示，在经口给药之后，W27单克隆IgA抗体到达肠，并且不影响例如胃肠道中的消化酶。这暗示，W27单克隆IgA抗体充分显示出作为经口的组合物的功能。

3-4：使用单克隆IgA抗体的细菌细胞增殖抑制效果

将Escherichiacoli菌株DH5α添加到LB液体培养基中，在37℃振荡培养过夜。第二天，对得到的Escherichiacoli液体进行适当稀释，接种到LB平板上，在37℃培养过夜。第二天，通过对平板上的菌落数量进行计数，来计算Escherichiacoli液体中的Escherichiacoli的数量。将获得的数量定义为在生长抑制实验开始时的Escherichiacoli数量。

在将Escherichiacoli液体接种在LB平板上的同时，将稀释在LB液体培养基中的50μlEscherichiacoli添加到96孔板中。进一步，以1.6mg/ml的终浓度分别添加W27单克隆IgA抗体、W27SC3F单克隆IgA抗体和W2单克隆IgA抗体。

96孔板在37℃静置培养7小时。7小时之后，对得到的Escherichiacoli液体分别进行适当稀释，接种到LB平板上，并且在37℃培养过夜。第二天，对每一个LB平板上的菌落数量进行计数，以测量Escherichiacoli的数量。将在上述实验开始时计算的细菌细胞的数量定义为1。使用这种标准，对与IgA抗体孵育之后的细菌细胞数量进行计算，并且绘制成增殖率的图(图12的纵坐标)。图12示出了结果。

从图12示出的结果可以发现，Escherichiacoli的增殖率在经W2单克隆IgA抗体处理和经W27单克隆IgA抗体处理之间存在显著差异。尽管具体机制不清楚，但是上述实施例的结果阐明W2单克隆IgA抗体似乎不与Escherichiacoli结合。因此，上述结果暗示W27单克隆IgA抗体与Escherichiacoli结合，从而抑制Escherichiacoli的生长。

进一步，W27SC3F单克隆IgA抗体(是分泌IgA)显示出最有效的抑制效果。这一事实暗示，实际上被分泌到肠内的分泌IgA二聚体在体内识别并且结合细菌，并且显示出独特的效应子功能，从而抑制Escherichiacoli的生长。这暗示，当使用单克隆IgA抗体来控制肠内细菌时，优选为分泌IgA的形式。

Claims

1.一种单克隆IgA抗体，其特征在于，所述单克隆IgA抗体与丝氨酸羟甲基转移酶的第11～333位氨基酸结合。

2.根据权利要求1所述的单克隆IgA抗体，其中，所述单克隆IgA抗体包括重链可变区和/或轻链可变区，

该重链可变区包含：(1)由SEQIDNO:3、13、23、33或43所示的氨基酸序列组成的重链CDR1；(2)由SEQIDNO:4、14、24、34或44所示的氨基酸序列组成的重链CDR2；和(3)由SEQIDNO:5、15、25、35或45所示的氨基酸序列组成的重链CDR3；

该轻链可变区包含：(I)由SEQIDNO:8、18、28、38或48所示的氨基酸序列组成的轻链CDR1；(II)由SEQIDNO:9、19、29、39或49所示的氨基酸序列组成的轻链CDR2；和(III)由SEQIDNO:10、20、30、40或50所示的氨基酸序列组成的轻链CDR3。

3.根据权利要求1或2所述的单克隆IgA抗体，其中，所述单克隆IgA抗体包括由SEQIDNO:2、12、22、32或42所示的氨基酸序列组成的重链可变区和/或由SEQIDNO:7、17、27、37或47所示的氨基酸序列组成的轻链可变区。

4.根据权利要求1至3中任一项所述的单克隆IgA抗体，其中，所述单克隆IgA抗体包括由SEQIDNO:1、11、21、31或41所示的氨基酸序列组成的重链和/或由SEQIDNO:6、16、26、36或46所示的氨基酸序列组成的轻链。

5.根据权利要求1至4中任一项所述的单克隆IgA抗体，其中，所述单克隆IgA抗体抑制至少两种肠内细菌的生长。

6.根据权利要求1至5中任一项所述的制造方法，其中，肠内细菌是选自由以下细菌组成的组中的至少两种细菌：属于普氏菌(Prevotella)属的细菌、属于拟杆菌(Bacteroides)属的细菌、属于巨单胞菌(Megamonas)属的细菌、属于双歧杆菌(Bifidobacterium)属的细菌、属于柔嫩梭菌(Faecalibacterium)属的细菌、属于粪球菌(Coprococcus)属的细菌、属于瘤胃球菌(Ruminococcus)属的细菌、属于布劳迪亚(Blautia)属的细菌、属于真细菌(Eubacterium)属的细菌、属于罗氏菌(Roseburia)属的细菌、属于乳酸菌(Lactobacillus)属的细菌、属于梭菌(Clostridium)属的细菌、属于埃希氏菌(Escherichia)属的细菌、属于葡萄球菌(Staphylococcus)属的细菌、属于肠球菌(Enterococcus)属的细菌、属于假单胞菌(Pseudomonas)属的细菌和属于肠杆菌(Enterorhabdus)属的细菌。

7.根据权利要求1至6中任一项所述的制造方法，其中，肠内细菌是选自由以下细菌组成的组中的至少两种细菌：Prevotellamelaninogenica、Bacteroidetesvulgatus、Megamonasfuniformis、Megamonashypermegale、Bifidobacteriumbifidum、Faecalibacteriumprausnitzii、Coprococcuseutactus、Ruminococcusobeum、Blautiaproductus、Blautiacoccoides、Eubacteriumrectale、Roseburiaintestinalis、Lactobacillusmurinus、Lactobacilluscasei、Clostridiumdifficile、Escherichiacoli、Staphylococcusaureus、Enterococcusfaecalis、Pseudomonasfulva和Enterorhabdusmucosicola。

8.根据权利要求1至7中任一项所述的单克隆IgA抗体，其中，所述单克隆IgA抗体是IgA₁或IgA₂。

9.根据权利要求1至8中任一项所述的单克隆IgA抗体，其中，所述单克隆IgA抗体是含J链的多聚体。

10.根据权利要求1至9中任一项所述的单克隆IgA抗体，其中，所述单克隆IgA抗体包含分泌因子。

11.根据权利要求1至10中任一项所述的制造方法，其中，所述单克隆IgA抗体是人源化抗体。

12.根据权利要求1至11中任一项所述的制造方法，其中，所述单克隆IgA抗体是嵌合抗体。

13.一种权利要求1至12中任一项所述的单克隆IgA抗体的制造方法，其特征在于，所述方法包括以下的工序1和工序2：

(2)工序2：对工序1中制备的所述杂交瘤进行培养，确定产生与至少两种肠内细菌结合的单克隆IgA抗体的细胞，从该细胞中回收IgA抗体。

14.一种药物组合物，其特征在于，所述药物组合物包含权利要求1至12中任一项所述的单克隆IgA抗体。

15.根据权利要求14所述的药物组合物，其中，所述药物组合物用于治疗肠内疾病。

16.根据权利要求14或15所述的药物组合物，其中，肠内疾病是由肠内细菌的异常增殖和/或肠内细菌丛的病变引起的疾病。

17.根据权利要求14至16中任一项所述的药物组合物，其中，由肠内细菌的异常增殖和/或肠内细菌丛的病变引起的疾病选自由炎症性肠病、溃疡性结肠炎、克罗恩氏病、变态反应、哮喘、肥胖症和自身免疫性疾病组成的组。

18.一种经口或经肠道的组合物，其特征在于，所述经口或经肠道的组合物包含权利要求1至12中任一项所述的单克隆IgA抗体。

19.根据权利要求18所述的经口或经肠道的组合物，其中，所述经口或经肠道的组合物是改善肠内环境的组合物、最优化肠内环境的组合物或防止肠内腐败的组合物。

20.根据权利要求18或19所述的经口或经肠道的组合物，其中，所述经口或经肠道的组合物是饮食品组合物或饲料组合物。

21.一种编码权利要求1至12中任一项所述的单克隆IgA抗体的核酸。

22.一种产生权利要求1至12中任一项所述的单克隆IgA抗体的杂交瘤。

23.一种抑制至少两种肠内细菌增殖的方法，其特征在于，所述方法包括使权利要求1至12中任一项所述的抗体与至少两种肠内细菌接触的工序。

24.一种治疗方法，为肠内疾病的治疗方法，其特征在于，所述治疗方法包括将有效量的权利要求1至12中任一项所述的抗体给药至患肠内疾病的人的工序。

25.一种在肠内疾病的治疗方法中使用的权利要求1至12中任一项所述的单克隆IgA抗体。

26.一种权利要求1至12中任一项所述的单克隆IgA抗体在制造用于治疗肠内疾病的药物中的应用。