CN105246459A

CN105246459A - 治疗糖尿病的新的口服药用组合物

Info

Publication number: CN105246459A
Application number: CN201480031244.4A
Authority: CN
Inventors: S.E.拉斯穆斯森; F.胡贝勒克; A.鲍查德; A.马克洛夫; B.L.佩德森
Original assignee: Novo Nordisk AS
Current assignee: Novo Nordisk AS
Priority date: 2013-05-30
Filing date: 2014-05-30
Publication date: 2016-01-13
Also published as: EP3003267A1; US20160106814A1; JP2016524617A; WO2014191545A1

Abstract

本发明提供改进的固体口服药用组合物，其包含胰岛素肽或GLP-1肽和生产这样的肽的方法。

Description

治疗糖尿病的新的口服药用组合物

技术领域

本发明涉及新的包含胰岛素肽或GLP-1肽的口服药用组合物和生产这样的组合物的方法。

背景

口服途径是目前最广泛使用的给药途径。然而，由于几种屏障例如在胃肠(GI)道和肠粘膜中的酶降解，以及经由肠粘膜的不充分和易变化的吸收，肽和蛋白质的给予常常限于胃肠外途径，而非优选的口服给予。

为克服该屏障，蛋白水解酶的渗透促进剂和抑制剂通常包括在口服制剂中。

长期以来，已经提出了用于肽和蛋白质的包含渗透促进剂和蛋白酶抑制剂的口服制剂，使得药用活性肽或蛋白质例如胰岛素和GLP-1的口服吸收成为可能。然而，这并未证明开发和制备药品的口服固体制剂是无关紧要的。

为口服给予肽和蛋白质，已提议使用得自大豆的BowmanBirk(BBI)抑制剂作为有用的蛋白酶抑制剂。

用于口服递送蛋白质和肽的众所周知的渗透促进剂是癸酸或癸酸钠。

KyeongsoonParketal在"口服蛋白质递送：当前状态及未来展望(Oralproteindelivery:Currentstatusandfutureprospect)"，Reactive&FunctionalPolymers，vol.71，no.3，(2011)第280-287页中公开了用于开发口服蛋白质递送的技术的综述。WO09118722A2描述了包含蛋白质和至少两种蛋白酶抑制剂的组合物，US2005/232981描述了浸入含有流化剂的疏水媒介中的水溶性组合物。

然而，目前尚未提供关于如何通过使例如癸酸钠与蛋白酶抑制剂混合来生产功能性口服药用组合物的信息。因此，仍有对用于口服递送肽和蛋白质的口服药用组合物的需求，其在给予胃肠道时有效提供给受试者治疗有效血水平的治疗活性肽成分。

概述

本发明提供改进的固体口服药用组合物，其包含胰岛素肽或GLP-1肽。此外或备选地，本发明提供改进的固体口服药用组合物，其包含胰岛素肽或GLP-1肽、癸酸盐、Bowman-Birk抑制剂(BBI)和BBI增溶剂。

在一个方面，本发明提供改进的固体口服药用组合物，其包含胰岛素肽或GLP-1肽、至少10mg癸酸盐和至少1mgBBI。在一个方面，本发明的固体口服药用组合物包含10mg–400mgBBI增溶剂。

在本发明的一个方面，增溶剂是糖醇例如山梨醇。

在本发明的一个方面，BBI的纯度为至少90%。

本发明也可解决根据示例性方面的公开内容而变得显而易见的的其它问题。

描述

本发明涉及固体口服药用组合物，其包含药用活性肽或蛋白质成分例如例如胰岛素或GLP-1肽、癸酸盐例如癸酸钠、和Bowman-Birk抑制剂(BBI)。

如发明人在本申请中所述，BBI和癸酸盐的成功组合并不是无关重要的，因为渗透促进剂和蛋白酶抑制剂彼此相互作用，并且与治疗活性肽成分相互作用。

在一个方面，本发明涉及固体口服药用组合物，其包含：a)为胰岛素肽或GLP-1肽的活性肽成分，b)癸酸盐例如癸酸钠，c)Bowman-Birk抑制剂(BBI))，和d)BBI增溶剂，例如糖醇，例如山梨醇或甘露醇。

术语“癸酸”在此用来指式CH3(CH2)8COOH的饱和脂肪酸。癸酸的替代名称包括：十烷酸、正癸酸、正十烷酸、羊脂酸和正羊脂酸。

在本发明的一个方面，癸酸盐是癸酸钠。

在一个方面，癸酸盐是递送剂，即用来口服递送为肽或蛋白质的活性成分的吸收促进剂。

术语“递送剂”在此用来表示促进活性肽成分的肠道吸收，即增加渗透性差的肽药物的渗透性并由此改善口服药物生物利用度的生物制品或化学制品。因此，经口服途径递送药物主要受系统前降解和穿过肠道壁的差的渗透的限制。口服药物递送的主要挑战之一是开发促进渗透性差的药物穿过肠道上皮的吸收的新的剂型。

Bowman-Birk抑制剂(BBI)作为丝氨酸蛋白酶抑制剂是本领域技术人员已知的。因此已知植物可含有各种丝氨酸蛋白酶抑制剂，这些抑制剂可被分为不同的家族。Bowman-Birk抑制剂(BBI)属于被广泛研究的丝氨酸蛋白酶抑制剂家族，其富含于双子叶和单子叶植物中。

BBI以第一个从大豆分离和鉴定该家族的成员的科学家的名字命名(BowmanDE，大豆抗胰蛋白酶因子的区分(Differentiationofsoybeanantitrypticfactor)，ProcSocExpBiolMed63:547–550(1946);BirkY，GertlerA，KhalefS，一种从大豆分离的纯胰蛋白酶抑制剂(Apuretrypsininhibitorfromsoyabean)，BiochemJ87:281–284(1963))。BBI蛋白质例如已经在豆科植物(例如大豆、豌豆、扁豆、花生和鹰嘴豆)和在禾本科植物中发现。BBI家族的丝氨酸蛋白酶抑制剂通过采用典型的蛋白酶抑制剂构象的暴露的表面环与它们抑制的酶相互作用。产生的非共价复合物使蛋白酶失活。然而，Bowman–Birk抑制剂蛋白质的一个具体特征是，相互作用环(interactingloop)是一个特别明确地限定的、二硫键连接的、短的β链区域。BBI家族的典型成员含有两个这样的相互作用环，因而抑制至多两个丝氨酸蛋白酶。BBI家族蛋白质典型地由50-80个氨基酸组成，并含有七个具有保守的二硫化物模式的二硫键。

本文所用的术语”蛋白酶抑制剂”或”酶抑制剂”指抑制蛋白酶的功能的分子。在本发明的一个方面，蛋白酶抑制剂抑制来自丝氨酸蛋白酶类型的蛋白酶(丝氨酸蛋白酶抑制剂)。在本发明的一个方面，蛋白酶抑制剂抑制在哺乳动物胃肠道中发现的胰酶。

胰酶是存在于胰腺液中的酶，并包括脂肪酶、蛋白酶和淀粉酶，例如胰蛋白酶、糜蛋白酶、羧肽酶、弹性蛋白酶、胰脂肪酶、胆固醇酯酶、磷脂酶、各种核酸酶和胰淀粉酶。因此，抑制哺乳动物的胃肠道中发现的胰酶的蛋白酶抑制剂抑制酶，例如胰蛋白酶、糜蛋白酶、羧肽酶、弹性蛋白酶、胰脂肪酶、胆固醇酯酶、磷脂酶、各种核酸酶和/或胰淀粉酶。

在本发明的一个方面，蛋白酶抑制剂是以干扰肽/蛋白质的降解的方式结合蛋白水解酶的化合物。

一般来说，化合物可在许多不同的位点结合于蛋白水解酶，然而，在寻找蛋白水解的抑制剂时，干扰蛋白水解酶功能的结合才是引人关注的。寻找抑制剂的最好方法是检查潜在抑制剂的存在对由提及的蛋白酶催化的酶促反应的影响。酶动力学描述了化合物抑制酶的几种可能性，如本领域技术人员已知的。酶抑制可以是例如竞争性的、非竞争性的、混合的。区分不同种类的酶抑制的程序先前已见述于许多科学文章和大量的教科书，例如FundamentalsofEnzymeKinetics,AthelCornish-BowdenISBN-13:978-3527330744。除了酶动力学，蛋白水解酶与其抑制剂的相互作用通常通过许多不同的方法检查，例如，x-射线晶体学、NMR光谱、许多光谱技术(荧光、圆二色性，UV-VIS)、质谱、量热法等，如本领域技术人员已知的。化合物也可能强烈地结合酶，但不影响催化反应的速率。

BBI可通过本领域技术人员已知的各种方法获得，例如通过重组生产或通过从植物分离。

本文可互换使用的术语”BBI”、”BowmanBirk”或”BowmanBirk抑制剂”指来自丝氨酸蛋白酶抑制剂的BowmanBirk家族的抑制剂，例如但不限于：从栽培大豆(大豆)、其它豆科植物或禾本科植物分离的BowmanBirk抑制剂，或在细胞基系统(例如但不限于大肠杆菌(E.Coli)、枯草芽胞杆菌(Bacillussubtilis))或植物基细胞培养物中重组表达的BowmanBirk抑制剂。

在本发明的一个方面，BowmanBirk抑制剂从植物分离。在一个方面，BowmanBirk抑制剂从豆科植物中分离出来。在一个方面，BowmanBirk抑制剂从大豆或大豆部分分离。用于从例如大豆或大豆部分分离BBI的方法是本领域已知的(例如Gladysheva，IPetal.，从不同的来源分离和鉴定大豆Bowman-Birk抑制剂(IsolationandcharacterizationofsoybeanBowman-Birkinhibitorfromdifferentsources)，Biochemistry(Mosc)，65(2):198-203(2000);García，MCetal.，大豆和相关产品的组成和鉴定(CompositionandCharacterizationofSoybeanandRelatedProducts),CriticalReviewsinFoodScienceandNutrition，37(4):361-391(1997);Yeboah，NAetal.，使用疏水相互作用层析快速纯化大豆Bowman-Birk蛋白酶抑制剂的方法(ArapidpurificationmethodforsoybeanBowman-Birkproteaseinhibitorusinghydrophobic-interactionchromatography)，Proteinexpressionandpurification7(3):309-314(1996)，JP63051335-A、US4793996-A、WO2003007976-A、WO2011082338-A1)，或从商业来源购买。

本文所用的BBI的纯度是总BBI蛋白质浓度、比活性(如通过糜蛋白酶抑制剂单位/g蛋白质测量的)和不存在作为BBI、毒素的拮抗剂起作用的成分或具有不仅仅是稀释效率/每单位量的BBI的有害的作用的其它成分的函数。一般来说，本公开的BBI产品的总BBI蛋白质浓度为至少约90wt.%。典型地，本公开的BBI产品的总BBI蛋白质浓度为至少约90wt.%、至少约91wt.%、至少约92wt.%、至少约93wt.%、至少约94wt.%、至少约95wt.%、至少约96wt.%、至少约97wt.%、至少约98wt.%和至少约99wt.%。

在一个方面，当本发明使用时，BBI具有由总BBI蛋白质浓度代表的纯度，其为至少90wt.%，如至少92wt.%、94wt.%或95wt.%。在一个方面，BBI具有由总BBI蛋白质浓度代表的纯度，其为至少96wt.%，在一个方面，BBI具有为至少97wt.%、至少98wt.%或至少99wt.%的纯度。

在本发明的一个方面，总BBI蛋白质浓度包含截短形式的BBI。截短形式的BBI具有与BBI相同的序列，除了它们从其C-末端和/或N-末端起缺失1-15个氨基酸。在本发明的一个方面，总BBI蛋白质浓度无截短形式的BBI。

如何测量用于本发明的BBI的纯度，对于本领域技术人员而言将是显而易见的。纯度可例如在一或二维SDS-PAGE凝胶电泳后和/或在RP-HPLC分离后测量。纯度可如何测量的一个非限制性实例是例如在本文实施例2中说明的。

"纯"单体蛋白在一或二维SDS-PAGE凝胶电泳后会产生单一的条带，会从凝胶过滤、高效液相层析(HPLC)或离子交换柱作为单对称吸收峰洗脱，会产生单一组的质谱、核磁共振(NMR)或W吸收光谱信号，并且在适用时，会无污染酶活性。因为绝对纯度可能永远无法建立，通常使用一个简单的纯度标准，即在SDS-PAGE后无法检测到超过一个的单一蛋白条带(见Mohan，纯度和产率的测定(Determinationofpurityandyield).MethodsinMolecularBiology，11，307-323(1992))。

产品的BBI蛋白含量，即存在于本公开的产品中的BBI的量可通过本领域已知的常规方法测定，包括例如层析法(例如，反相高压液相层析(RP-HPLC)、尺寸排阻或凝胶渗透HPLC、离子交换HPLC等)和/或光谱法(例如NMR、UV-VIS、CD、IR等)和/或抗体基方法(例如ELISA、LOCI、RIA等)和/或一般蛋白含量方法(例如Bradford方法，Lowry方法，描述于Ohnishi，S.T.，和Barr，J.K.，一种使用双缩脲和苯酚试剂定量蛋白的简化方法(Asimplifiedmethodofquantitatingproteinsusingthebiuretandphenolreagents).Anal.Biochem.，86，193(1978)等)。通过一般蛋白含量方法获得的结果将反映产品中存在的蛋白质总量(也包含活性成分(API)，如果所述API来自蛋白质并且为了获得BBI蛋白含量，API的量需要从这些方法获得的结果中减去)。

在本发明的一个方面，BowmanBirk抑制剂在细胞基系统中重组表达。在本发明的一个方面，在细胞基系统(例如但不限于大肠杆菌、枯草芽胞杆菌)或植物基细胞培养物中重组表达BowmanBirk抑制剂。用于重组表达BBI的方法是本领域已知的(重组方法的非限制性实例例如公开于LiN.etal.，在大肠杆菌中表达的大米Bowman-Birk抑制剂的重折叠、纯化和活性分析(Therefolding,purification,andactivityanalysisofariceBowman-BirkinhibitorexpressedinEscherichiacoli).ProteinExprPurif.1999Feb;15(1):99-104或VogtentanzGetal.，ProteinExprPurif.2007Sep;55(1):40-52)。

在本发明的一个方面，固体口服药用组合物包含至少10mg癸酸盐。在本发明的一个方面，固体口服药用组合物包含至多450mg癸酸盐。在本发明的一个方面，固体口服药用组合物包含至多275mg癸酸盐。在本发明的一个方面，固体口服药用组合物包含至多200mg癸酸盐。在本发明的一个方面，固体口服药用组合物包含约275mg癸酸。在本发明的一个方面，固体口服药用组合物包含10mg和450mg之间的癸酸盐，在一个方面，包含10mg和350mg之间的癸酸盐，在一个方面，包含10mg和275mg之间的癸酸盐，和在一个方面，包含10mg和200mg之间的癸酸盐。

在本发明的一个方面，固体口服药用组合物包含至少1mgBBI。在一个方面，固体口服药用组合物包含约10mgBBI，在一个方面，包含约25mgBBI，在一个方面，包含约50mgBBI，和在一个方面，固体口服药用组合物包含约200mgBBI。在一个方面，固体口服药用组合物包含1mg和200mg之间的BBI，在一个方面，包含10mg和200mg之间的BBI，在一个方面，包含25mg和200mg之间的BBI，和在一个方面，固体口服药用组合物包含50mg和200mg之间的BBI。在一个方面，固体口服药用组合物包含1mg和50mg之间的BBI，在一个方面，包含1mg和25mg之间的BBI，和在一个方面，固体口服药用组合物包含1mg和10mg之间的BBI。在一个方面，固体口服药用组合物包含10mg和50mg之间的BBI，在一个方面，包含10mg和25mg之间的BBI，和在一个方面，固体口服药用组合物包含25mg和50mg之间的BBI。

本发明还覆盖BBI增溶剂(例如糖醇)在固体口服药用组合物中的用途。因此，发明人已出乎意料地发现，加入BBI增溶剂可增强体内作用。

术语“BBI增溶剂”在此用来指促进BBI在体内溶解的试剂。因此，所述试剂通过促进更有效的药物释放来提高活性肽成分在体内的生物利用度。

在本发明的一个方面，BBI增溶剂是糖醇。在一个方面，BBI增溶剂是山梨醇或甘露醇。

当在此使用时，术语“糖醇”意指具有通式H(HCHO)_n+1H的碳水化合物的氢化形式。因此糖醇是其羰基已被还原为伯或仲羟基的碳水化合物。示例性糖醇是例如山梨醇和甘露醇。

任何合适的糖醇可被包括在本发明的固体口服药用组合物中。如本文所用的，用于本发明的"糖醇"包括单糖、二糖和寡糖。示例性糖醇包括但不限于木糖醇、甘露醇、山梨醇、赤藓糖醇、乳糖醇、戊糖醇和己糖醇。示例性单糖包括但不限于葡萄糖、果糖，醛糖和酮糖。示例性二糖包括但不限于蔗糖、异麦芽酮糖醇(isomalt)、乳糖、海藻糖和麦芽糖。示例性寡糖包括但不限于麦芽三糖、棉子糖和麦芽四糖。在一个方面，糖醇是山梨醇、甘露醇或木糖醇。在一个方面，糖醇是山梨醇。在一个方面，糖醇是二糖。在一个方面，糖醇是蔗糖。

在本发明的一个方面，固体口服药用组合物包含至少10mgBBI增溶剂。在本发明的一个方面，固体口服药用组合物包含约275mgBBI增溶剂。在本发明的一个方面，固体口服药用组合物包含至多400mgBBI增溶剂。在本发明的一个方面，固体口服药用组合物包含10mg和400mg之间的BBI增溶剂，和在一个方面，包含10mg和275mg之间的BBI增溶剂。在本发明的一个方面，固体口服药用组合物包含275mg和400mg之间的BBI增溶剂。

在一个方面，本发明的固体口服药用组合物被包含在剂型中。在一个方面，包含本发明的固体口服药用组合物的剂型是胶囊。

“剂型”在此被理解为意指物理形式，其中药物被生产和分散，例如片剂、颗粒剂、多颗粒剂、胶囊、丸粒、迷你片、包封丸粒、包封迷你片、包封微粒、小粒或粘膜粘附剂形式(例如片剂或胶囊)。

在一个方面，包含本发明的固体口服药用组合物的剂型是片剂.

在本发明的一个方面，包含本发明的固体口服药用组合物的剂型包含具有肠溶衣的羟丙基甲基纤维素(HPMC)胶囊。

在本发明的一个方面，癸酸盐与BBI的比例(w/w)在300:1-1:1之间。

在本发明的一个方面，癸酸盐与BBI的比例(w/w)在45:1-1:1之间，30:1-1:1之间，9:1-1:1之间或5.5:1-1:1之间。

在本发明的一个方面，癸酸盐与BBI的比例(w/w)为约45:1，约30:1，约9:1，约5.5:1，或约1:1。

在本发明的一个方面，癸酸盐与BBI的比例(w/w)为约5.5:1。

固体口服药用组合物

本发明的固体口服药用组合物可包含包封成纳米颗粒、微米颗粒、小粒、丸粒或其它种类的多颗粒剂型的活性肽成分。上述口服药用组合物系统可配制成片剂或填充到合适的硬壳或软壳胶囊中，其可被包衣以便以受控方式或在优选的肠道部分释放活性肽成分。

在一个方面，固体口服药用组合物包含小粒。在一个方面，术语“颗粒”指一种或多种类型的小粒。在一个方面，术语“小粒”指聚集成较大颗粒的颗粒。

在一个方面，固体口服药用组合物呈现为固体剂型的形式。在一个方面，固体口服药用组合物呈现为片剂的形式。在一个方面，固体口服药用组合物呈现为胶囊的形式。在一个方面，固体口服药用组合物呈现为小药囊的形式。

在一个方面，固体口服药用组合物包含至少一种药学上可接受的赋形剂。

术语"赋形剂"，当在此使用时，广义上指任何非活性肽成分，即非胰岛素肽或GLP-1肽的成分。赋形剂可以是惰性物质，其在某种意义上说是惰性的，指它本身基本上没有任何治疗和/或预防作用。赋形剂可用于各种目的，例如作为递送剂、吸收促进剂、溶媒、增溶剂、填充剂(也称为稀释剂)、粘合剂、润滑剂、助流剂、崩解剂、结晶滞缓剂、酸化剂、碱化剂、抗氧化剂、缓冲剂、螯合剂、络合剂、表面活性剂、乳化剂和/或增溶剂、湿润剂、稳定剂、着色剂、调味剂和/或用于改善活性肽成分的给予和/或吸收。本领域技术人员可通过常规实验在无任何过度负担的情况下选择一种或多种具有固体口服剂型的特定期望性质的上述赋形剂。所用的各种赋形剂的量可在本领域的常规范围内变化。可被用来配制口服剂型的技术和赋形剂描述于HandbookofPharmaceuticalExcipients，第6版，Roweetal.，Eds.，AmericanPharmaceuticalsAssociationandPharmaceuticalPress，publicationsdepartmentoftheRoyalPharmaceuticalSocietyofGreatBritain(2009)；和Remington:theScienceandPracticeofPharmacy，第21版，Gennaro，Ed.，LippincottWilliams&Wilkins(2005)。

在一个方面，固体口服药用组合物包含粘合剂。在一个方面，固体口服药用组合物包含崩解剂。在一个方面，固体口服药用组合物包含润滑剂。在一个方面，固体口服药用组合物包含一种或多种选自结晶滞缓剂、增溶剂(也称为表面活性剂)、湿润剂、着色剂和/或pH控制剂的赋形剂。

在一个方面，包含本发明的固体口服药用组合物的胶囊是4号-000号胶囊，例如在1-00号胶囊范围内，其中尺寸根据两节式胶囊的标准尺寸定义测定。

根据本发明的药用组合物可以片剂、颗粒剂、多颗粒剂、胶囊、丸粒、迷你片、包封丸粒、包封迷你片、包封微粒或粘膜粘附剂形式(例如，片剂或胶囊)的剂型存在。

在一个方面，药用组合物可以无包衣的剂型(例如，胶囊或片剂)存在。在一个方面，药用组合物呈现为延迟释放剂型，其最大限度地减少活性肽成分和增强剂在胃中的释放，因此最大限度地减少其中的局部促进剂浓度稀释，并在肠道释放药物和促进剂。在其它方面，药用组合物以延迟释放快速起效剂型存在。这样一种剂型最小化活性肽成分和促进剂在胃中的释放，因此最小化其中的局部促进剂浓度稀释，但一旦到达肠道的适宜部位，则快速地释放活性肽成分和促进剂，通过最大化活性肽成分和促进剂在吸收部位的局部浓度来最大化渗透性差的活性肽成分的递送。

在一个方面，本发明的药用组合物可呈现为胶囊口服剂型的形式。在一个方面，胶囊剂型为肠溶衣胶囊剂型。在一个方面，胶囊剂型是具有肠特性的胶囊。

术语"胶囊"，当在此使用时，包括但不限于用来包封用于口服给予的药物制剂的相对稳定的壳。两种主要类型的胶囊是硬壳胶囊(其通常用于干燥的、粉末状成分、微型丸粒或迷你片)和软壳胶囊(主要用于油和溶于或悬浮于油中的活性成分)。硬壳和软壳胶囊二者均可从胶凝剂(例如动物蛋白质(例如明胶)或植物多糖或其衍生物(例如角叉菜胶和改性形式的淀粉和纤维素))的水溶液制得。其它成分可被加入到胶凝剂溶液中，例如增塑剂(例如甘油和/或山梨醇，用以降低胶囊的硬度)、着色剂、防腐剂、崩解剂、润滑剂和表面处理剂。

制备固体口服药用组合物的方法

本发明的固体口服药用组合物可如本领域已知地进行制备。在一个方面，固体口服药用组合物可如本文实施例中所述制备。

在一个方面，固体口服药用组合物以胶囊的形式存在。

在一个方面，本发明涉及一种制备包含粉末或颗粒的硬壳胶囊的方法，所述粉末或颗粒包含i)至多15%(w/w)的胰岛素或GLP-1肽，和ii)至少15%(w/w)的癸酸盐，所述方法包括填充所述硬壳胶囊的步骤。

在一个方面，混合组合物的两种或更多种成分。为了制备填充物质的干燥共混物，对各种成分称重，任选地碎块(delumped)，然后混合。可进行各成分的混合直至获得均匀的共混物。

在一个方面，至少一部分组合物被干法制粒或湿法制粒。颗粒可以本领域技术人员已知的方式产生，例如通过干法制粒技术，其中药用活性成分和/或递送剂与赋形剂一起被压实，形成较大的模块，例如小块或小条，其经研磨被粉碎，而磨碎的物质用作后来填充到胶囊中的填充物质。用于干法制粒的合适的设备包括但不限于得自Gerteis的碾压设备，如GerteisMINI-PACTOR(如由Gerteis在2013出售)。在一个方面，颗粒经碾压制备。在一个方面，得自碾压过程的模块被粉碎成小粒。在一个方面，术语"碾压力"意指当压实材料成连续的压制材料条时，如由压力传感器(其将液压压力转换为电信号)测定的辊压机的滚筒之间的力；碾压力可以千牛顿(kN)或以千牛顿/滚筒宽度(kN/cm)测量。

或者，制粒可经湿法制粒获得，这可通过将溶于水的药用活性肽成分与递送剂和任选的一种或多种赋形剂的干燥共混物混合后干燥颗粒来进行。

为将填充物质填充到固体口服剂型(例如硬壳胶囊)中，可使用填充设备。在填充设备中，填充物质被填充(例如强制填充或重力填充)到腔中。填充物质可以或可不经填充设备压制。随后，得到的硬壳胶囊可以或可不封口或密封。

物理特性和体外方法

应该意识到，本发明的固体口服药用组合物的物理特性应该是这样的，即固体口服药用组合物可以容易地处理，并且还含有最少量的赋形剂，使得可制备小的、易吞咽的剂型，这促进患者对高含量活性肽成分的接受度和依从性，并提供有良好的润湿性、崩解性、溶解性和最终的快速完全的药物释放特性的剂型。

技术人员将意识到，许多不同的参数影响固体口服药用组合物的溶出时间，包括：剂型(例如胶囊或片剂)、活性肽成分的特性、另外的成分(例如递送剂、崩解剂、助流剂、润滑剂、稀释剂)的特性、各成分的量(比例)、粒度和片剂硬度。

所谓"溶出时间"应理解为，给定量(或部分)的药物从固体剂型释放到溶液中所需的时间。在模拟体内发生的条件的条件下，在将药物在溶液中的量作为时间的函数测量的实验中体外测量溶出时间。

根据一方面，本发明的固体口服药用组合物具有高的口服生物利用度。

一般来说，术语生物利用度指活性药物成分(API)，如包含在本发明的固体口服药用组合物中的胰岛素肽或GLP-1达到无变化的系统循环的给予剂量的部分。按照定义，当API经静脉内给予时，其生物利用度为100%。然而，当它经由其它途径(如口服)给予时，其生物利用度降低(由于降解和/或不完全的吸收和首过代谢)。当计算用于非静脉途径给予的剂量时，有关生物利用度的知识是重要的。

血浆浓度对比时间作图在口服和静脉给予后进行。绝对生物利用度(F)是口服给予后获得的曲线下面积(AUC)/剂量除以静脉给予后获得的AUC/剂量。

在一个方面，当在犬中测量时，本发明的固体口服药用组合物具有的绝对口服生物利用度为至少2%，如至少3%、至少4%或至少5%。

本发明的固体口服药用组合物的口服生物利用度和吸收动力学可根据本文描述的测定(II)来测定。

在一个方面，本发明的固体口服药用组合物抑制至少1mg的糜蛋白酶。在一个方面，本发明的固体口服药用组合物抑制至少2mg的糜蛋白酶。在一个方面，本发明的固体口服药用组合物抑制至少3mg的糜蛋白酶。在一个方面，本发明的固体口服药用组合物抑制至少5mg的糜蛋白酶。在一个方面，本发明的固体口服药用组合物抑制至少10mg的糜蛋白酶。在一个方面，本发明的固体口服药用组合物抑制至少20mg的糜蛋白酶。在一个方面，本发明的固体口服药用组合物抑制至少30mg的糜蛋白酶。在一个方面，本发明的固体口服药用组合物抑制至少50mg的糜蛋白酶。在一个方面，本发明的固体口服药用组合物抑制至少100mg的糜蛋白酶。在一个方面，本发明的固体口服药用组合物抑制至少150mg的糜蛋白酶。

在一个方面，本发明的固体口服药用组合物抑制至少1mg的胰蛋白酶。在一个方面，本发明的固体口服药用组合物抑制至少2mg的胰蛋白酶。在一个方面，本发明的固体口服药用组合物抑制至少3mg的胰蛋白酶。在一个方面，本发明的固体口服药用组合物抑制至少5mg的胰蛋白酶。在一个方面，本发明的固体口服药用组合物抑制至少10mg的胰蛋白酶。在一个方面，本发明的固体口服药用组合物抑制至少20mg的胰蛋白酶。在一个方面，本发明的固体口服药用组合物抑制至少30mg的胰蛋白酶。在一个方面，本发明的固体口服药用组合物抑制至少50mg的胰蛋白酶。在一个方面，本发明的固体口服药用组合物抑制至少100mg的胰蛋白酶。在一个方面，本发明的固体口服药用组合物抑制至少150mg的胰蛋白酶。

在一个方面，本发明的固体口服药用组合物与含所述胰岛素肽但无BBI和癸酸钠的固体口服药用组合物比较，增加胰岛素肽在GI道至少2-倍的半寿期。在一个方面，本发明的固体口服药用组合物增加胰岛素肽在GI道至少3-倍的半寿期。在一个方面，本发明的固体口服药用组合物增加胰岛素肽在GI道至少5-倍的半寿期。在一个方面，本发明的固体口服药用组合物增加胰岛素肽在GI道至少10-倍的半寿期。

在一个方面，本发明的固体口服药用组合物与含所述GLP-1肽但无BBI和癸酸钠的固体口服药用组合物比较，增加GLP-1肽在GI道至少2-倍的半寿期。在一个方面，本发明的固体口服药用组合物增加GLP-1肽在GI道至少3-倍的半寿期。在一个方面，本发明的固体口服药用组合物增加GLP-1肽在GI道至少5-倍的半寿期。在一个方面，本发明的固体口服药用组合物增加GLP-1肽在GI道至少10-倍的半寿期。

测定(I)：溶出试验

溶出试验例如用仪器1(如在美国药典(USP)GeneralChapter<711>中详细说明的)，使用100rpm的篮子转速进行。可在37℃的温度下使用100mL的磷酸盐缓冲液(pH6.8)溶出媒介。肠溶衣制剂以两步法测试。第一个步骤是在类似于胃的酸性pH下1h，然后在模拟肠的中性pH下2h。中性pH可以是pH6.0、6.5、6.8、7.2或7.4。溶出媒介可具有0.1%吐温80的含量。在适当的时间间隔取出样品等分液。释放例如使用RP-HPLC方法测定。含量基于例如胰岛素肽或GLP肽峰在层析图中的峰面积相对于胰岛素肽或GLP-1肽参照的峰面积计算。HPLC方法可以基于在C18柱上的梯度洗脱。溶剂系统可以是在215nm进行UV检测的三氟乙酸和乙腈。

测定(II)：口服给予小猎兔犬

动物、给药和采集血样：小猎兔犬在研究期间称重为6-17kg，包括在该研究中。犬在空腹状态给药。固体口服药用组合物通过单一口服剂量给予每组8只犬的各犬。血样可在以下时间点采集：给药前、给药后0.25、0.5、0.75、1、1.5、2、2.5、3、4、6、8、10、24、48、72、96、120、144、168、192、216、240、264和288小时。i.v.溶液(例如20nmol/mL在包含0.1mg/ml吐温20、5.5mg/ml苯酚、1.42mg/mlNa2HPO4和14mg/ml丙二醇的pH7.4溶液中)在一个给药组(n=8)的同一犬群中，以0.1mL/kg的剂量体积给予。血样可在以下时间点采集：给药前、给药后0.083、0.167、0.25、0.5、0.75、1、1.5、2、2.5、3、4、6、8、10、24、48、72、96、120、144、168、192、216、240、264和288小时。

血浆的制备：所有的血样收集到含有用于稳定的EDTA的试管中并保持在冰上直到离心。通过离心从全血分离血浆，并将血浆于-20℃或更低温度下贮存直至分析。

血浆样本的分析：使用发光氧气通道免疫测定(LOCI)分析血浆的胰岛素肽或GLP-1肽。LOCI测定采用用链霉抗生物素包被的供体珠和与单克隆抗体缀合的受体珠，所述抗体结合到胰岛素肽或GLP-1肽的中间分子区域。其它对N-末端表位为特异性的单克隆抗体被生物素化。在该测定中，将3种反应物与形成双位点免疫复合物的胰岛素肽或GLP-1肽混合。复合物的发光从供体珠释放单态氧原子，其导入受体珠并触发在EnVision酶标仪中测量的化学发光。光的量与胰岛素肽或GLP-1肽的浓度成正比，且血浆中定量的低限(LLOQ)是100pM。或者，LC-MS方法被用来测定活性肽成分在血浆中的浓度。

测定(III)：酶抑制

显色底物监视蛋白水解酶的活性的用途是本领域已知的(例如DelMar，E.G.，etal.，Anal.Biochem.，99，316-320，(1979))。例如，N-琥珀酰-Ala-Ala-Pro-Phe-对硝基苯胺是通常用来测量糜蛋白酶活性的底物。4-硝基苯胺底物的酶裂解产生4-硝基苯胺(在碱性条件下呈黄色)。

使用VarioskanFlashMultimodeMeter(ThermoScientific)，在96孔格式板中建立监视作为时间的函数的395nm吸光度增加的测定。每孔含有70μlDulbecco磷酸缓冲盐水(Invitrogen目录号14190-094)、10μl在二甲亚砜(DMSO)中的N-琥珀酰-Ala-Ala-Pro-Phe-对硝基苯胺(Sigma目录号S7388)(采用不同的浓度以获得抑制常数)、10μl含有不同浓度的BBI的样品(例如溶解的固体剂型、BBI溶液等)和10μl糜蛋白酶的储备溶液。于37℃进行温育。在加入酶至96孔板后立即测量395nm吸光度，并且还每分钟测量持续随后的80分钟。优化酶的浓度以允许测定在加入和不加入抑制剂时初始吸光度增加的时间过程的斜率。斜率通过荧光迹线的线性部分的线性回归测定(例如，第一个10min的反应)。每次测定按一式两份进行，并且计算中包括2次迹线的平均值。抑制作用可表示为吸光度迹线的斜率等于50%的未抑制反应(EC50)时的样品浓度。这通过用不同的浓度的样品获得的斜率作为其浓度的函数作图并使用例如S型逻辑回归拟合实验结果进行(2参数，SigmaPlotv11)。本发明的BBI和蛋白水解酶之间的相互作用的抑制常数也可通过用不同浓度的抑制剂和底物进行上述测定并例如通过本领域技术人员已知的和例如在Hubalek，F.etalJ.Med.Chem.47，1760-1766(2004)中描述的双倒数转换分析结果而获得。当用N-(对-甲苯磺酰基)-Gly-Pro-Arg-对硝基苯胺(SigmaT1637)替代N-琥珀酰-Ala-Ala-Pro-Phe-对硝基苯胺时，测量对胰蛋白酶的抑制，和当用N-琥珀酰-Ala-Ala-Ala-对硝基苯胺(SigmaS4760)替代时，测量对弹性蛋白酶的抑制。

包封

本发明的固体口服药用组合物可被包封。固体口服药用组合物可用任何可获得的硬或软胶囊技术包封。

当在此使用时，术语“硬胶囊”与“软胶囊”分别涉及到胶囊技术时，被用来分别意指硬壳胶囊技术与软壳胶囊技术。

在一个方面，用于根据本发明的固体口服药用组合物的胶囊材料是羟丙基甲基纤维素(HPMC)。硬胶囊也可由明胶或适合于药物胶囊生产的其它材料制得。在一个方面，术语“肠硬胶囊”或“肠软胶囊”当用于胶囊技术时，指包含至少一个具有肠道性质的要素(例如至少一个肠溶衣层)的硬或软胶囊技术。

本发明的固体口服药用组合物可包含一种或多种肠或改性的释放包衣。除了硬或软胶囊技术外，固体口服药用组合物还可包含一种或多种肠或改性的释放包衣。在一个方面，肠或改性的释放包衣包含至少一种改变释放的聚合物，其可被用来控制胰岛素肽或GLP-1肽成分释放的部位。在一个方面，术语“肠溶衣”，当在此使用时，意指控制口服剂型的溶出和释放的聚合物包衣；固体剂型的溶出和释放的部位可根据目标区域的pH设计，在那里胰岛素肽或GLP-1肽成分的吸收是需要的，因此也包括耐酸的保护性包衣；该术语包括已知的肠溶衣，而且还包括具有肠特性的任何其它包衣，其中所述术语“肠特性”意指控制固体口服剂型(即根据本发明的固体口服药用组合物)的溶出和释放的特性。在一个方面，术语“改进的释放包衣”当在此使用时，指包含特定的赋形剂(例如聚合物)或由特殊的程序制备的，或二者的包衣，其被设计以改进活性肽成分释放的速率、地方或时间。在一个方面，改进的释放包衣包括延长释放包衣、延迟释放包衣和脉动释放包衣。改进的释放可经pH-依赖的或pH-非依赖的聚合物包衣而获得。

在本发明的一个方面，胶囊用聚(甲基丙烯酸-共聚-丙烯酸乙酯(商品名：EudragitL30D55?，由EvonikIndustriesAG在2013年出售)包衣。

包衣(如肠溶衣或改进的释放包衣)可根据本领域熟知的方法制备。

活性肽成分

如本文所用的，术语"治疗活性成分"，其与"活性成分"和“药用活性成分”可互换使用，指具有在治疗疾病或异常生理学病症中的有益生物学作用(优选治疗作用)的任何化合物、复合物或组合物。该术语也涵盖本文特别提及的那些活性剂的药学上可接受的药用活性衍生物，包括但不限于盐、酯、酰胺、前药、活性代谢物、异构体、片段、类似物等。当使用术语"治疗活性成分"或"活性成分"和当特定活性剂被具体鉴定时，应该理解申请人意欲包括活性剂本身以及药学上可接受的药用活性盐、酯、酰胺、前药、活性代谢物、异构体、片段、类似物等。

本发明的治疗活性成分包括适宜经由口服途径给予动物(包括人)的任何活性成分。

术语“活性肽成分”在此用来表示在药物中的任何药物物质，其以肽或蛋白质的形式存在并为生物学活性的，即在治愈、治疗或预防疾病中提供药理活性或其它直接作用或者影响人或动物体的结构或任何功能的肽或蛋白质。备选的术语包括肽活性药物成分(API)和肽活性原料。

在本发明的一个方面，活性肽成分是肽或蛋白质。

在本发明的一个方面，活性肽成分选自胰岛素肽和GLP-1肽。

在本发明的一个方面，活性肽成分是GLP-1肽。

术语“GLP-1肽”当在此使用时，意指为具有GLP-1活性的人GLP-1或者其类似物或衍生物的肽。

术语“人GLP-1”或“天然GLP-1”当在此使用时，意指其结构和特性是众所周知的人GLP-1激素。人GLP-1也表示为GLP-1(7-37)，其具有31个氨基酸并且是从胰高血糖素原分子选择性裂解的结果。

本发明的GLP-1肽具有GLP-1活性。该术语指结合GLP-1受体并启动导致促胰岛素作用或本领域已知的其它生理学作用的信号转导通路的能力。例如，可使用标准GLP-1活性测定来测试本发明的类似物和衍生物的GLP-1活性。

术语“GLP-1类似物”当在此使用时，意指改进的人GLP-1，其中人GLP-1的一个或多个氨基酸残基已被其它氨基酸残基取代和/或其中一个或多个氨基酸残基已从人GLP-1中缺失和/或其中一个或多个氨基酸残基已经添加和/或插入到人GLP-1中。

在一个方面，GLP-1类似物包含相对于人GLP-1的10个或更少的氨基酸修饰(取代，缺失，添加(包括插入)及其任何组合)，或者相对于人GLP-1的9、8、7、6、5、4、3或2个修饰或更少，甚至或者1个修饰。

GLP-1分子中的修饰表示为位置和取代天然氨基酸残基的氨基酸残基的单或三字母代码。

当使用序列表时，序列的第一个氨基酸残基指定为1号。然而，根据本领域对GLP-1肽确立的实践，在下文中，这第一个残基被称为7号，而随后的氨基酸残基被相应地编号，以37号结尾。因此，一般来说，本文对GLP-1(7-37)序列的氨基酸残基编号或位置号码的任何参照是以位置7的His起始和以位置37的Gly结束的序列。使用单字母代码表示氨基酸，术语像34E、34Q或34R表示位置34的氨基酸分别是E、Q和R。使用3字母代码表示氨基酸，相应的表达分别是34Glu、34Gln和34Arg。

所谓“des7”或“(或Des⁷)”意指缺失N-末端氨基酸组氨酸的天然GLP-1。因此，例如，des7GLP-1(7-37)为人GLP-1的类似物，其中位置7的氨基酸缺失。这种类似物也可称为GLP-1(8-37)。类似地，与GLP-1(7-37)的类似物相关的(des7+des8)、(des7，des8)、(des7-8)或(Des7，Des8)，其中可暗示涉及GLP-1(7-37)，指类似物，其中对应于天然GLP-1的两个N-末端氨基酸(组氨酸和丙氨酸)的氨基酸已经缺失。该类似物也可称为GLP-1(9-37)。

本发明的类似物的非限制性实例是[Aib⁸,Arg³⁴]GLP-1(7-37)，其示GLP-1(7-37)类似物，其中位置8的丙氨酸已用α-氨基异丁酸(Aib)取代和位置34的赖氨酸已用精氨酸取代。这种类似物也可表示为(8Aib,R34)GLP-1(7-37)。

术语“GLP-1衍生物”当在此使用时，意指化学修饰的母体GLP-1(7-37)或其类似物，其中修饰呈现为连接酰胺、碳水化合物、烷基、酰基、酯、聚乙二醇化、其组合等的形式。

在本发明的一个方面，修饰包括侧链连接GLP-1(7-37)或其类似物。在一个特定的方面，侧链能够与白蛋白形成非共价聚集体，从而促进衍生物随着血流循环，并且还具有延长衍生物作用时间的效果，这是由于GLP-1-衍生物和白蛋白的聚集体仅缓慢崩解以释放活性肽成分。因此，作为整体，取代基或侧链最好称为白蛋白结合部分。在特别的方面，侧链具有至少10个碳原子或至少12、14、16、18、20、22或至少24个碳原子。在更特别的方面，侧链可进一步包括至少5个杂原子，特别是O和N，例如至少7、9、10、12、15、17或至少20个杂原子，如至少1、2或3个N原子和/或至少3、6、9、12或15个O原子。

在另一个特别的方面，白蛋白结合部分包含对白蛋白结合特别相关并由此对延长特别相关的部分，该部分可相应的称为“延长部分”。延长部分可在或接近白蛋白结合部分的相对端(相对于其与肽的连接点)。

在更进一步的特别方面，白蛋白结合部分包含在延长部分和与肽的连接点之间的部分，该部分可称为“接头”、“接头部分”、“间隔基”等。接头可以是任选的，因此在那种情况下，白蛋白结合部分可能与延长部分相同。

在特别的方面，白蛋白结合部分和/或延长部分是亲脂性的和/或在生理学pH(7.4)下带负电荷。

白蛋白结合部分、延长部分或接头可例如通过酰化而共价连接GLP-1肽的赖氨酸残基。在一个优选的方面，白蛋白结合部分(优选地包括延长部分和接头)的活性酯在酰胺键的形成下共价地连接于赖氨酸残基的氨基，优选其ε氨基(该过程被称为酰化)。

除非另外说明，当提及赖氨酸残基的酰化时，应理解指其ε-氨基。

为了此目的，术语"白蛋白结合部分"、"延长部分"和"接头"可包括这些分子的未反应的以及反应的形式。是否是指一种或另一种形式根据使用该术语的上下文是清楚的。

对于与GLP-1肽的连接，脂肪酸的酸基或脂肪二酸的酸基之一与GLP-1肽中的赖氨酸残基的ε氨基形成酰胺键(优选地经由接头)。

术语"脂肪二酸"指如上定义的脂肪酸，但在ω位置具有额外的羧酸基团。因此，脂肪二酸是二羧酸。

本发明衍生物的两个接头的每一个可包含以下第一个接头元件：

化学式I：

，

其中k为范围1-5的整数，和n为范围1-5的整数。

在一个特定的方面，当k=1和n=1时，这个接头元件可称为OEG或8-氨基-3,6-二氧杂辛酸的二基，和/或它可由下式表示：

化学式II：

NH-(CH2)2-O-(CH2)2-O-CH2-CO-*。

在另一个特别的方面，本发明的衍生物的每个接头还可独立地包含第二个接头元件，优选Glu二基，如化学式III和/或化学式IV：

化学式III：

化学式IV：

,

其中Glu二基可被包括p次，其中p为范围1-3的整数。

化学式III也可称为γ-Glu或简称为γGlu，这是由于它是在此用来连接另一个接头元件或连接赖氨酸的ε-氨基的氨基酸谷氨酸的γ羧基。如上文所解释的，另一个接头元件可以是例如另一个Glu残基或OEG分子。Glu的氨基继而与延长部分的羧基或与例如OEG分子的羧基(如果存在)或与例如另一个Glu的γ-羧基(如果存在)形成酰胺键。

化学式IV也可称为α-Glu或简称为aGlu或更简称为Glu，这是由于它是在此用来连接另一个接头元件或连接赖氨酸的ε-氨基的氨基酸谷氨酸的α羧基。

以上化学式III和化学式IV的结构覆盖Glu的L-型以及D-型。在特别的方面，化学式III和/或化学式IV独立地是a)L-型或b)D-型。

在更进一步的特定方面，接头具有a)5-41个C原子；和/或b)4-28个杂原子。

本发明的GLP-1衍生物的血浆中浓度可使用任何合适的方法测定。例如，可使用LC-MS(液相层析质谱)或免疫测定例如RIA(放射免疫测定)、ELISA(酶联免疫吸附测定)和LOCI(发光氧通道免疫测定(LuminescenceOxygenChannelingImmunoasssy))。合适的RIA和ELISA测定的一般方案见于例如WO09/030738第116-118页。

GLP-1类似物和激活的侧链的缀合通过使用任何常规方法进行，例如描述于以下参考文献(其还描述激活聚合物分子的合适方法)的方法：R.F.Taylor，(1991)，"Proteinimmobilization.Fundamentalandapplications"，MarcelDekker，N.Y.；S.S.Wong，(1992)，"ChemistryofProteinConjugationandCrosslinking"，CRCPress，BocaRaton；G.T.Hermansonetal.，(1993)，"ImmobilizedAffinityLigandTechniques"，AcademicPress，N.Y.)。技术人员将意识到，要采用的激活方法和/或缀合化学取决于多肽的连接基团(其实例在上文另外给出)以及聚合物的官能团(例如是胺、羟基、羧基、醛、巯基、琥珀酰亚胺基、马来酰亚胺、乙烯砜或卤代乙酸酯)。

在此，肽或蛋白质的命名根据以下原理进行：命名作为相对于母体肽或蛋白质例如人GLP-1(GLP-1(7-37))的突变和修饰(如酰化)给出。对于酰基部分的命名，根据IUPAC命名法进行命名，而在其它情况下按照肽命名法。例如，酰基部分的命名：

化学式5

可以例如是“(17-羧基十七烷酰基氨基)-4(S)-羧基丁酰基氨基]乙氧基)乙氧基]乙酰基氨基)乙氧基]乙氧基)乙酰基”、“十八烷二酰基-γGlu-OEG-OEG”、“十八烷二酰基-gGlu-OEG-OEG”、“十八烷二酰基-gGlu-2xOEG”或“17-羧基十七烷酰基-Glu-OEG-OEG”，其中OEG是氨基酸残基8-氨基-3,6-二氧杂辛酸(-NH(CH₂)₂O(CH₂)₂OCH₂CO-)的简写符号，和γGlu(或gGlu)是氨基酸γL-谷氨酸部分的简写符号。

一个实例是具有以下给出的序列/结构的实施例4的酰基化GLP-1肽(也见专利申请WO2006/097537中的实施例4)，其被命名为“N{ε-26}-[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-羧基-4-(17-羧基十七烷酰基氨基)丁酰基]氨基]乙氧基]乙氧基]乙酰基]氨基]乙氧基]乙氧基]乙酰基]-[Aib8,Arg34]-GLP-1-(7-37)-肽”，以指出在GLP-1(7-37)的位置8的氨基酸丙氨酸(缩写为Ala或A)已经突变为非蛋白质构型的氨基酸α-氨基异丁酸(缩写为Aib)，在GLP-1(7-37)的位置34的氨基酸已经突变为精氨酸(缩写为Arg或R)和在GLP-1(7-37)的位置26的氨基酸赖氨酸(缩写为Lys或K)已在位置26的赖氨酸残基中的ε氮(表示为N{ε-26})上被下述残基酰化修饰：2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-羧基-4-(17-羧基十七烷酰基氨基)丁酰基]氨基]乙氧基]乙氧基]乙酰基]氨基]乙氧基]乙氧基]乙酰基(或者表示为例如“(17-羧基十七烷酰基氨基)-4(S)-羧基丁酰基氨基]乙氧基)乙氧基]乙酰基氨基)乙氧基]乙氧基)乙酰基”或“十八烷二酰基-γGlu-OEG-OEG”)。或者，该肽可例如命名为““N-ε²⁶-[2-(2-[2-(2-[2-(2-[4-(17-羧基十七烷酰基氨基)-4(S)-羧基丁酰基氨基]乙氧基)乙氧基]乙酰基氨基)乙氧基]乙氧基)乙酰基][Aib8,Arg34]GLP-1(7-37)肽””。下式中的星号表示所提及的残基当与GLP-1(7-37)比较时是不同的(即突变的)。此外，本发明的药用组合物的酰基化GLP-1肽也可根据IUPAC命名法(OpenEye，IUPAC式)命名为例如“Ne26[(S)-(22,40-二羧基-10,19,24-三氧代-3,6,12,15-四氧杂-9,18,23-三氮杂四十烷-1-酰基)][Aib8，Arg34]GLP-1-(7-37)肽”。在此，术语“氨基酸残基”为已经从羧基除去羟基和/或已从氨基除去氢原子的氨基酸。

化学式6，SEQIDNO:1

在序列表中，SEQIDNO:1的第一个氨基酸残基(组氨酸)被指定为1号。然而，根据本领域确立的实践，这个组氨酸残基在此被称为7号，和随后的氨基酸残基被相应地编号，以37号甘氨酸结尾。因此，一般来说，本文对GLP-1(7-37)序列的氨基酸残基编号或位置号码的任何参照是以位置7的His起始和以位置37的Gly结束的序列。

在本发明的一个方面，活性肽成分为胰岛素肽。

术语“胰岛素肽”当在此使用时，意指为人胰岛素或者其具有胰岛素活性的类似物或衍生物的肽。

术语“人胰岛素”当在此使用时，意指其结构和特性是众所周知的的人胰岛素激素。人胰岛素具有两条多肽链，称为A-链和B-链。A-链是21个氨基酸的肽和B-链是30个氨基酸的肽，两条链经二硫桥连接：A-链位置7的半胱氨酸和B-链位置7的半胱氨酸之间的第一个桥，和A-链位置20的半胱氨酸和B-链位置19的半胱氨酸之间的第二个桥。第三个桥存在于A-链的位置6和11的半胱氨酸之间。

在人体内，激素作为单链前体胰岛素原(前胰岛素原)合成，其由下述构型的24个氨基酸的前肽和其后的含有86个氨基酸的胰岛素原组成：前肽-B-ArgArg-C-LysArg-A，其中C是31个氨基酸的连接肽。Arg-Arg和Lys-Arg是连接肽从A和B链裂解的裂解位点。

用于本发明的胰岛素肽具有至少0.01%的如下文所定义的胰岛素受体亲和力。因此已知，甚至在非常低的(例如人胰岛素肽的)胰岛素受体亲和力时，对于相同的人胰岛素类似物，可获得体内生物学活性(如例如在Diabetes39，1033-1039(1990)，Ribeletal.中说明的)。

术语“胰岛素类似物”当在此使用时，意指改进的人胰岛素，其中胰岛素的一或多个氨基酸残基已被其它氨基酸残基取代和/或其中一个或多个氨基酸残基已经从胰岛素缺失和/或其中一个或多个氨基酸残基已经添加和/或插入到胰岛素中。

在一个方面，胰岛素类似物包含相对于人胰岛素的10个或更少的氨基酸修饰(取代、缺失、添加(包括插入)和其任何组合)，或者相对于人胰岛素的9、8、7、6、5、4、3或2个修饰或更少，甚至或者1个修饰。

胰岛素分子中的修饰表示为链(A或B)的位置和取代天然氨基酸残基的氨基酸残基的单或三字母代码。

所谓“连接肽”或“C-肽”意指单链胰岛素原分子的B-C-A多肽序列的连接部分“C”。在人胰岛素链中，C-肽连接B链的位置30和A链的位置1，并为35个氨基酸残基长度。连接肽包括两个末端二元氨基酸序列，例如，Arg-Arg和Lys-Arg，其用作从A和B链裂解连接肽的裂解位点，以形成双链胰岛素分子。

所谓“desB30”或“B(1-29)”意指缺失B30氨基酸的天然胰岛素B链或其类似物，和“A(1-21)”意指天然胰岛素A链。因此，例如，A14Glu,B25His,desB30人胰岛素是人胰岛素的类似物，其中在A链位置14的氨基酸用谷氨酸取代，在B链位置25的氨基酸用组氨酸取代，和在B链位置30的氨基酸缺失。

在此，术语像“A1”、“A2”和“A3”等分别表示在胰岛素A链(从N-末端计数)的位置1、2和3的氨基酸等。类似地，术语像B1、B2和B3等分别表示在胰岛素B链(从N-末端计数)的位置1、2和3的氨基酸等。使用单字母代码表示氨基酸，术语像A21A、A21G和A21Q表示在A21位置的氨基酸分别为A、G和Q。使用三字母代码表示氨基酸，相应的表示分别为A21Ala、A21Gly和A21Gln。

胰岛素类似物的实例是这样的实例，其中在位置A14的氨基酸是Glu，在位置B25的氨基酸是His并且其任选地还包含一或多个额外的突变。胰岛素类似物的其它实例是缺失类似物，例如，其中人胰岛素中的B30氨基酸已经缺失的类似物(des(B30)人胰岛素)。其中A-链和/或B-链具有N-末端延伸的胰岛素类似物和其中A-链和/或B-链具有C-末端延伸的胰岛素类似物，例如用两个精氨酸残基加入到B-链的C-末端，也是胰岛素类似物的实例。

术语“胰岛素衍生物”当在此使用时，意指化学修饰的母体胰岛素或其类似物，其中修饰呈现酰胺、碳水化合物、烷基、酰基、酯、聚乙二醇化等的形式。

在本发明的一个方面，修饰包括侧链与人胰岛素或其类似物的连接。在一个特定的方面，侧链能够与白蛋白形成非共价聚集体，从而促进衍生物随着血流循环，并且还具有延长衍生物作用时间的效果，因为胰岛素衍生物和白蛋白的聚集体仅缓慢崩解以释放活性肽成分。因此，作为整体，取代基或侧链优选称为白蛋白结合部分。在特别的方面，侧链具有至少10个碳原子，或至少12、14、16、18、20、22或至少24个碳原子。在更特别的方面，侧链可进一步包括至少5个杂原子，特别是O和N，例如至少7、9、10、12、15、17或至少20个杂原子，如至少1、2或3个N原子和/或至少3、6、9、12或15个O原子。

在另一个特别的方面，白蛋白结合部分包含对白蛋白结合特别相关并由此对延长特别相关的部分，该部分可相应地称为“延长部分”。延长部分可在或接近白蛋白结合部分的相对端(相对于其与肽的连接点)。

在特别的方面，白蛋白结合部分和/或延长部分是亲脂性的，和/或在生理学pH(7.4)下带负电荷。

白蛋白结合部分、延长部分或接头可例如通过酰化而共价连接人胰岛素或胰岛素类似物的赖氨酸残基。

在一个方面，白蛋白结合部分(优选地包含延长部分和接头)的活性酯在酰胺键的形成下共价连接赖氨酸残基的氨基，优选其ε氨基(该过程被称为酰化)。

除非另外说明，当提及赖氨酸残基的酰化时，要理解指其ε-氨基。

为了此目的，术语"白蛋白结合部分"、"延长部分"和"接头"可包括这些分子的未反应的以及反应的形式。是否是指一种或另一种形式根据采用该术语的上下文是清楚的。

对于与人胰岛素或胰岛素类似物的连接，脂肪酸的酸基或脂肪二酸的酸基之一与人胰岛素或胰岛素类似物中的赖氨酸残基的ε氨基形成酰胺键(优选地经由接头)。

化学式I：

，

其中k为范围1-5的整数，和n为范围1-5的整数.

在一个特定的方面，当k=1和n=1时，这个接头元件可被称为OEG或8-氨基-3,6-二氧杂辛酸的二基，和/或它可由下式表示：

化学式II：

NH-(CH2)2-O-(CH2)2-O-CH2-共聚-*。

化学式III：

化学式IV：

，

其中Glu二基可被包括p次，其中p为范围1-3的整数。

化学式III也可称为γ-Glu，或简称为γGlu，这是由于它是在此用来连接另一个接头元件或连接赖氨酸的ε-氨基的氨基酸谷氨酸的γ羧基。如上文所解释的，另一个接头元件可以是例如另一个Glu残基或OEG分子。Glu的氨基继而与延长部分的羧基或与例如OEG分子的羧基(如果存在)或与例如另一个Glu的γ-羧基(如果存在)形成酰胺键。

化学式IV也可被称为α-Glu或简称为aGlu或更简称为Glu，由于它是在此用来连接另一个接头元件或连接赖氨酸的ε-氨基的氨基酸谷氨酸的α羧基。

以上化学式III和化学式IV的结构覆盖Glu的L-型和D-型。在特别的方面，化学式III和/或化学式IV独立地是a)L-型或b)D-型。

在更进一步的特定方面，接头具有a)5-41个C原子和/或b)4-28个杂原子。

在此，胰岛素肽的命名如本申请上文对于GLP-1肽解释的那样进行：命名作为相对于母体肽(即人胰岛素)的突变和修饰(如酰化)给出。

一个实例是具有以下给出的序列/结构的实施例3的酰化胰岛素肽胰岛素1(也见专利申请WO2009/115469中的实施例9)，其被命名为“N{ε-B29}-[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-羧基-4-(17-羧基十七烷酰基氨基)丁酰基]氨基]乙氧基]乙氧基]乙酰基]氨基]乙氧基]乙氧基]乙酰基]-[GluA14,HisB25],des-ThrB30-胰岛素(人)”，以表示在人胰岛素A-链位置14的氨基酸酪氨酸已经突变为氨基酸谷氨酸(缩写为Glu或E)，在人胰岛素B-链位置25的氨基酸苯丙氨酸已经突变为组氨酸(缩写为His或H)，在人胰岛素B-链位置30的氨基酸苏氨酸已经缺失和在人胰岛素B-链位置29的氨基酸赖氨酸(缩写为Lys或K)已在赖氨酸残基的ε氮(表示为N{ε-B29})上被下述残基酰化修饰：[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-羧基-4-(17-羧基十七烷酰基氨基)丁酰基]氨基]乙氧基]乙氧基]乙酰基]氨基]乙氧基]乙氧基]乙酰基](或者表示为“十八烷二酰基-Glu-OEG-OEG”)。

化学式7，SEQIDNO:2和3

此外，本发明的药用组合物的酰基化胰岛素也可命名为“A14E,B25H,B29K(N^ε十八烷二酰基-γGlu-OEG-OEG)，desB30人胰岛素”或根据IUPAC命名法(OpenEye，IUPAC式)命名为例如“N{ε-B29}-[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-羧基-4-(17-羧基十七烷酰基氨基)丁酰基]氨基]乙氧基]乙氧基]乙酰基]氨基]乙氧基]乙氧基]乙酰基]-[GluA14,HisB25],des-ThrB30-胰岛素(人)”。

用于根据本发明的固体口服药用组合物的胰岛素类似物的衍生物的非限制性实例包括N{ε-B29}-[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-羧基-4-(17-羧基十七烷酰基氨基)丁酰基]氨基]乙氧基]乙氧基]乙酰基]氨基]乙氧基]乙氧基]乙酰基][GluA14,HisB25],des-ThrB30-胰岛素(人)。

多肽和激活的聚合物分子的缀合通过使用任何常规方法进行，例如如描述于以下参考文献((其还描述激活聚合物分子的合适方法)的方法：R.F.Taylor，(1991)，"Proteinimmobilization.Fundamentalandapplications"，MarcelDekker，N.Y.；S.S.Wong，(1992)，"ChemistryofProteinConjugationandCrosslinking"，CRCPress，BocaRaton；G.T.Hermansonetal.，(1993)，"ImmobilizedAffinityLigandTechniques"，AcademicPress，N.Y.)。技术人员将意识到，要采用的激活方法和/或缀合化学取决于多肽的连接基团(其实例在上文另外给出)以及聚合物的官能团(例如是胺、羟基、羧基、醛、巯基、琥珀酰亚胺基、马来酰亚胺、乙烯砜或卤代乙酸基)。

如本文所用的，"治疗有效量的促进剂"指允许经由口服给予来吸收治疗有效量的治疗活性肽成分的促进剂的量。已表明促进剂在改进吸收差的药物的胃肠吸收的有效性取决于给药部位，最佳递送的部位取决于药物和促进剂。

本发明的实施方案

以下是本发明的实施方案的非限制性实例：

1.固体口服药用组合物，包含

a)为胰岛素肽或GLP-1肽的活性肽成分，

b)癸酸盐，例如癸酸钠，

c)Bowman-Birk抑制剂(BBI)，和

d)BBI增溶剂，例如糖醇，例如山梨醇。

2.实施方案1的固体口服药用组合物，其中每剂型存在至少10mg癸酸盐和至少1mgBB。

3.前述实施方案的任一项的固体口服药用组合物，其包含10mg-450mg癸酸盐和1mg-200mgBBI。

4.前述实施方案的任一项的固体口服药用组合物，其包含10mg-450mg癸酸盐和10mg-200mgBBI。

5.实施方案1-3的任一项的固体口服药用组合物，其包含10mg-275mg癸酸盐和1mg-200mgBBI。

6.前述实施方案的任一项的固体口服药用组合物，其包含10mg-275mg癸酸盐和10mg-200mgBBI。

7.实施方案1-4的任一项的固体口服药用组合物，其包含10mg-450mg癸酸盐和10mg-50mgBBI。

8.前述实施方案的任一项的固体口服药用组合物，其包含10mg-275mg癸酸盐和约50mgBBI。

9.前述实施方案的任一项的固体口服药用组合物，其包含约275mg癸酸盐和10mg-50mgBBI。

10.前述实施方案的任一项的固体口服药用组合物，其包含10mg–400mgBBI增溶剂。

11.前述实施方案的任一项的固体口服药用组合物，其包含100mg-275mg山梨醇。

12.前述实施方案的任一项的固体口服药用组合物，其中固体口服药用组合物以包含在胶囊中的粉末或颗粒形式存在。

13.实施方案12的固体口服药用组合物，其中胶囊包含至多1000mg粉末，例如至多650mg粉末。

14.实施方案1-13的任一项的固体口服药用组合物，其包含：

15.实施方案1-13的任一项的固体口服药用组合物，其包含：

16.实施方案1-13的任一项的固体口服药用组合物，其包含：

17.实施方案1-13的任一项的固体口服药用组合物，其包含：

18.实施方案1-13的任一项的固体口服药用组合物，其包含：

19.实施方案1-13的任一项的固体口服药用组合物，其包含：

20.实施方案1-13的任一项的固体口服药用组合物，其包含：

21.实施方案1-13的任一项的固体口服药用组合物，其包含：

22.实施方案1-13的任一项的固体口服药用组合物，其包含：

23.实施方案1-13的任一项的固体口服药用组合物，其包含：

24.实施方案1-13的任一项的固体口服药用组合物，其包含：

25.实施方案1-13的任一项的固体口服药用组合物，其包含：

26.实施方案1-13的任一项的固体口服药用组合物，其包含：

27.实施方案1-13的任一项的固体口服药用组合物，其包含：

28.实施方案1-13的任一项的固体口服药用组合物，其包含：

29.实施方案1-13的任一项的固体口服药用组合物，其包含：

30.实施方案1-13的任一项的固体口服药用组合物，其包含：

31.实施方案1-13的任一项的固体口服药用组合物，其包含：

32.实施方案1-13的任一项的固体口服药用组合物，其包含：

33.实施方案1-13的任一项的固体口服药用组合物，其包含：

34.实施方案12或13的固体口服药用组合物，其中胶囊是硬胶囊。

35.前述实施方案的任一项的固体口服药用组合物，其还包含包衣。

36.实施方案15的固体口服药用组合物，其中包衣为肠溶衣。

37.前述实施方案的任一项的固体口服药用组合物，其中BBI从植物分离。

38.实施方案1-17的任一项的固体口服药用组合物，其中BBI从豆科植物中分离。

39.实施方案1-17的任一项的固体口服药用组合物，其中BBI从大豆中分离。

40.前述实施方案的任一项的固体口服药用组合物，其中BBI经冷冻干燥或喷雾干燥。

41.前述实施方案的任一项的固体口服药用组合物，其中BBI的纯度为至少90%纯。

42.实施方案1-16或20-21的任一项的固体口服药用组合物，其中BBI经重组生产。

43.前述实施方案的任一项的固体口服药用组合物，其中胰岛素肽或GLP-1肽被酰化。

44.前述实施方案的任一项的固体口服药用组合物，其中活性肽成分为酰化的胰岛素肽。

45.前述实施方案的任一项的固体口服药用组合物，其中胰岛素肽是N{ε-B29}-[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-羧基-4-(17-羧基十七烷酰基氨基)丁酰基]氨基]乙氧基]乙氧基]乙酰基]氨基]乙氧基]乙氧基]乙酰基]-[GluA14,HisB25],des-ThrB30-胰岛素(人)。

46.实施方案1-44的任一项的固体口服药用组合物，其中胰岛素肽选自：

N{ε-B29}-[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-羧基-4-(17-羧基十七烷酰基氨基)丁酰基]氨基]乙氧基]乙氧基]乙酰基]氨基]乙氧基]乙氧基]乙酰基]-[GluA14,HisB25],des-ThrB30-胰岛素(人)；N{A1},N{A1}-二甲基,N{B1},N{B1}-二甲基,N{ε-B29}-[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-羧基-4-(17-羧基十七烷酰基氨基)丁酰基]氨基]乙氧基]乙氧基]乙酰基]氨基]乙氧基]乙氧基]乙酰基]-[GluA14,HisB25],des-ThrB30-胰岛素(人)；N{ε-B29}-[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-羧基-4-(19-羧基十九烷酰基氨基)丁酰基]氨基]乙氧基]乙氧基]乙酰基]氨基]乙氧基]乙氧基]乙酰基]-[GluA14,HisB16,HisB25],des-ThrB30-胰岛素(人)；N{ε-B29}-[(4S)-4-羧基-4-(17-羧基十七烷酰基氨基)丁酰基]-[GluA14,HisB25],des-ThrB27,ThrB30-胰岛素(人)；N{ε-B29}-十四烷酰基-des-ThrB30-胰岛素(人)；N{ε-B29}-[(4S)-4-羧基-4-(15-羧基十五烷酰基氨基)丁酰基]-des-ThrB30-胰岛素(人)，N{ε-B29}-[(4S)-4-羧基-4-(15-羧基十五烷酰基氨基)丁酰基]-[GluA14,HisB16,HisB25],des-ThrB30-胰岛素(人)；N{ε-B29}-[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-羧基-4-(17-羧基十七烷酰基氨基)丁酰基]氨基]乙氧基]乙氧基]乙酰基]氨基]乙氧基]乙氧基]乙酰基]-[CysA10,GluA14,CysB4,HisB25],des-ThrB30-胰岛素(人)；和N{ε-B29}-[(4S)-4-羧基-4-(19-羧基十九烷酰基氨基)丁酰基]-[CysA10,GluA14,CysB3,HisB25],des-ThrB27,ThrB30-胰岛素(人)。

47.实施方案1-44的任一项的固体口服药用组合物，其中活性肽成分是酰化的GLP-1肽。

48.实施方案47的固体口服药用组合物，其中GLP-1肽选自：N{ε-26}-[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-羧基-4-(17-羧基十七烷酰基氨基)丁酰基]氨基]乙氧基]乙氧基]乙酰基]氨基]乙氧基]乙氧基]乙酰基]-[Aib8,Arg34]-GLP-1-(7-37)-肽；N{ε-18}-[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-羧基-4-[10-(4-羧基苯氧基)癸酰基氨基]丁酰基]氨基]乙氧基]乙氧基]乙酰基]氨基]乙氧基]乙氧基]乙酰基],N{ε-26}-[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-羧基-4-[10-(4-羧基苯氧基)癸酰基氨基]丁酰基]氨基]乙氧基]乙氧基]乙酰基]氨基]乙氧基]乙氧基]乙酰基]-[Aib8,Lys18,Glu22,Gln34]-GLP-1-(7-37)-肽；N{ε-26}-[(2S)-2-氨基-6-[[(2S)-2-氨基-6-[[(4S)-4-羧基-4-(15-羧基十五烷酰基氨基)丁酰基]氨基]己酰基]氨基]己酰基],N{ε-37}-[(2S)-2-氨基-6-[[(2S)-2-氨基-6-[[(4S)-4-羧基-4-(15-羧基十五烷酰基氨基)丁酰基]氨基]己酰基]氨基]己酰基]-[Aib8,Arg34,Lys37]-GLP-1-(7-37)-肽；N{ε-18}-[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-羧基-4-[10-(4-羧基苯氧基)癸酰基氨基]丁酰基]氨基]乙氧基]乙氧基]乙酰基]氨基]乙氧基]乙氧基]乙酰基],-N{ε-26}-[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-羧基-4-[10-(4-羧基苯氧基)癸酰基氨基]丁酰基]氨基]乙氧基]乙氧基]乙酰基]氨基]乙氧基]乙氧基]乙酰基]-[Aib8,Lys18,Glu22,Arg34]-GLP-1-(7-37)-肽；N{ε-18}-[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-羧基-4-(13-羧基十三烷酰基氨基)丁酰基]氨基]乙氧基]乙氧基]乙酰基]氨基]乙氧基]乙氧基]乙酰基],N{ε-26}-[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-羧基-4-(13-羧基十三烷酰基氨基)丁酰基]氨基]乙氧基]乙氧基]乙酰基]氨基]乙氧基]乙氧基]乙酰基]-[Aib8,Lys18,Glu22,Arg34]-GLP-1-(7-37)-肽；N{ε-18}-[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-羧基-4-[10-(4-羧基苯氧基)癸酰基氨基]丁酰基]氨基]乙氧基]乙氧基]乙酰基]氨基]乙氧基]乙氧基]乙酰基],N{ε-26}-[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-羧基-4-[10-(4-羧基苯氧基)癸酰基氨基]丁酰基]氨基]乙氧基]乙氧基]乙酰基]氨基]乙氧基]乙氧基]乙酰基]-[Aib8,Lys18,Gln34]-GLP-1-(7-37)-肽；N{ε-26}-[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-羧基-4-(15-羧基十五烷酰基氨基)丁酰基]氨基]乙氧基]乙氧基]乙酰基]氨基]乙氧基]乙氧基]乙酰基]-[Aib8,Arg34]-GLP-1-(7-37)-肽；N{ε-26}-[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-羧基-4-(17-羧基十七烷酰基氨基)丁酰基]氨基]乙氧基]乙氧基]乙酰基]氨基]乙氧基]乙氧基]乙酰基]-[Aib8,His31,Gln34]-GLP-1-(7-37)-肽；N{ε-26}-[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-羧基-4-[10-(4-羧基苯氧基)癸酰基氨基]丁酰基]氨基]乙氧基]乙氧基]乙酰基]氨基]乙氧基]乙氧基]乙酰基],N{ε-37}-[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-羧基-4-[10-(4-羧基苯氧基)癸酰基氨基]丁酰基]氨基]乙氧基]乙氧基]乙酰基]氨基]乙氧基]乙氧基]乙酰基]-[Aib8,Arg34,Lys37]-GLP-1-(7-37)-肽；和N{ε-26}-[2-[2-[2-[[(4S)-4-羧基-4-[[2-[2-[2-(13-羧基十三烷酰基氨基)乙氧基]乙氧基]乙酰基]氨基]丁酰基]氨基]乙氧基]乙氧基]乙酰基],N{ε-37}-[2-[2-[2-[[(4S)-4-羧基-4-[[2-[2-[2-(13-羧基十三烷酰基氨基)乙氧基]乙氧基]乙酰基]氨基]丁酰基]氨基]乙氧基]乙氧基]乙酰基]-[Aib8,Arg34,Lys37]-GLP-1-(7-37)-肽。

49.实施方案48的固体口服药用组合物，其中GLP-1肽是N{ε-26}-[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-羧基-4-(17-羧基十七烷酰基氨基)丁酰基]氨基]乙氧基]乙氧基]乙酰基]氨基]乙氧基]乙氧基]乙酰基]-[Aib8,Arg34]-GLP-1-(7-37)-肽。

50.前述实施方案的任一项的固体口服药用组合物，其中癸酸盐与BBI的比例(w/w)为45:1或更小。

51.前述实施方案的任一项的固体口服药用组合物，其中癸酸盐与BBI的比例(w/w)为30:1或更小。

52.前述实施方案的任一项的固体口服药用组合物，其中癸酸盐与BBI的比例(w/w)为9:1或更小。

53.前述实施方案的任一项的固体口服药用组合物，其中癸酸盐与BBI的比例(w/w)为5.5:1或更小。

54.前述实施方案的任一项的固体口服药用组合物，其中癸酸盐与BBI的比例(w/w)为约1:1。

55.前述实施方案的任一项的固体口服药用组合物，其中固体口服药用组合物是包含在片剂中的粉末。

56.前述实施方案的任一项的固体口服药用组合物，其中固体口服药用组合物以包含在胶囊中的粉末的形式存在。

57.前述实施方案的任一项的固体口服药用组合物，其中固体口服药用组合物以包含在胶囊中的颗粒形式存在。

实施例

通用程序

以下实施例通过举例说明，而不是以限制的方式提供。

缩写表

HCl：盐酸，

MeCN：乙腈，

OEG：[2-(2-氨基乙氧基)乙氧基]乙基羰基，

RPC：反相层析，

RT：室温，

TFA：三氟乙酸，

DMSO：二甲亚砜

GI：胃肠，

TRIS：三(羟基甲基)氨基甲烷，

CH3CN：乙腈，

BSA：牛血清白蛋白

HEPES：4-(2-羟基乙基)-1-哌嗪乙磺酸

HBSS：Hank平衡盐溶液

Tween20(吐温20)：聚乙二醇脱水山梨醇单月桂酸酯20

LOCI测定：发光氧通道免疫测定

HPLC：高效液相层析，

FPLC：快速蛋白质液相层析，

RP：反相，

UV：紫外线(光)，

LC-MS：液相层析–质谱，

MALDIMS：基质辅助激光解吸质谱

NMR：核磁共振，

TLC：薄层层析，

GLP-1：胰高血糖素样肽-1，

GIjuice：胃肠液，

HI：人胰岛素，

BBI：Bowman-Birk抑制剂

通用制备方法

胰岛素肽和GLP-1肽根据本领域技术人员已知的方法制备，例如描述于WO2009/115469、WO.2006/097537和WO2011/080103的实施例中的方法。

一般来说，胰岛素肽和GLP-1肽可通过例如在大肠杆菌(FEBSLett.1997,402,124)或酿酒酵母(S.cerevisae)(ProteinSci.2013,22,296-305)中重组表达来制备。或者，胰岛素肽和GLP-1肽可通过全化学合成(JAmChemSoc.2013,135,3173-85.)制备，使用固相或液相；或通过重组表达和化学合成的组合来制备(例如描述于WO2009/083549)。胰岛素和GLP-1肽的修饰通过标准酰化技术(例如描述于WO2010/029159和WO2013/098191)进行。

使用棕榈油作为起始原料制备癸酸。使癸酸与NaOH溶液混合。将这种溶液喷雾干燥以获得癸酸钠粉末。最后，使用辊压机将喷雾干燥的癸酸钠经干法制粒。

Bowman-Birk抑制剂从Sigma-Aldrich获得并在使用前经进一步纯化(见实施例1)。

一般来说，Bowman-Birk抑制剂可从植物原料纯化，或可使用描述于本专利说明书中的重组表达系统制备。

纯化

用于胰岛素肽或GLP-1肽的典型纯化程序：

所用的HPLC系统是由以下组成的Gilson系统：215型液体处理仪、322-H2型泵和155型UV检测器。检测通常在210nm和280nm进行。

?ktaPurifierFPLC系统(GE)由以下组成：P-900型泵、UV-900型UV探测器、pH/C-900型pH和传导率检测器、Frac-950型流分收集器。UV检测通常在214nm、254nm和276nm进行。

酸性HPLC：

柱：　　Macherey-NagelSP250/21Nucleusil300-7C4

流速：　　8ml/min

缓冲液A：　　0.1%TFA在乙腈中

缓冲液B：　　0.1%TFA在水中。

梯度：　　0.0-5.0min：10%A

5.00–30.0min：　　10%A-90%A

30.0–35.0min：　　90%A

35.0–40.0min：　　100%A

中性HPLC：

柱：　　Phenomenex,Jupiter,C45μm250x10.00mm,300?

流速：　　6ml/min

缓冲液A：　　5mMTRIS,7.5mM(NH₄)₂SO₄,pH=7.3,20%CH₃CN

缓冲液B：　　60%CH₃CN，40%水

梯度：　　0-5min：　10%B

5-65min：　　10-90%B

65-69min：　　90%B

69-80min：　　90%B

脱盐：

柱：　　HiPrep26/10

流速：　　10ml/min，6倍柱体积

缓冲剂：　　10mMNH₄HCO₃。

检测和表征胰岛素/GLP-1肽和BBI的通用方法

胰岛素和/或GLP-1肽和/或BBI的特性和纯度通常通过RP-HPLC分析、LC-MS分析和/或MALDIMS分析来测定。RP-HPLC系统由AcquityUPLC组件组成：自动取样器(ModelAcq-SM)、泵(ModelAcq-BSM)、柱式温箱(ModelAcq-SM)和检测器(ModelAcq-TUV；Waters,Milford,MA)。各种RP-HPLC柱和缓冲剂组合物可用于该系统以完成适当的分离；例如，使用在0.2M硫酸钠中的乙腈，0.04M磷酸钠,pH=7.2的线性梯度液，应用AcquityBEH1.7μMC181x50mm柱(Waters)。通常通过例如在220nm的UV吸收检测峰，并使用适当的标准品(如用于胰岛素分析的人胰岛素等)定量。

LC-MS系统由组成如下的WatersAcquityUPLC系统(Waters)组成：自动取样器(ModelAcq-SM)、泵(ModelAcq-BSM)、柱式温箱(ModelAcq-SM)、检测器(ModelAcq-TUV)和LTQOrbitrapXL(ThermoFisher)。使用乙腈在0.1%甲酸中的线性梯度，使用CSHC18柱(Waters，1x150mm)，于45℃以0.1ml/min的流速，完成RP-HPLC分离。

胰岛素肽、GLP-1肽和BBI通常描述为酸，然而，应当理解，当制备储备溶液时，根据所用的纯化程序和/或所用的缓冲液，存在这些化合物的不同盐形式。这样的盐包括但不限于钠盐、钾盐、铵盐、甲酸盐、乙酸盐、三氟乙酸盐、磷酸盐、重碳酸盐等。

实施例1:纯化BBI

从Sigma获得的BBI(所有的BBI相关种类)的纯度(使用描述于实施例2中的方法测量)范围为50至70%，这取决于批次。因此在使用前根据以下RP-HPLC程序进一步纯化BBI：

设备:Akta

柱：Gemini_NX_5μ_C18_110?柱(Phenomenex,Torrance,CA,USA，176.7ml)

平衡溶剂：5v/v%乙腈，0.1v/v%TFA

洗脱溶剂：0.1v/v%TFA在乙腈中

流速：10ml/min

梯度：0%-20%洗脱溶剂，25倍柱体积

混合含有纯的BBI的流分并用水稀释2倍，然后冻干。典型地，通过这种纯化程序除去所有与BBI不相关的杂质，留下含有几种截短形式的基本纯的BBI，如经LC-MS分析所测定的。BBI纯度(所有BBI相关的种类)在纯化后为至少90%。

实施例2：分析BBI–纯度、完整性

各流分使用装配有BEHShieldRP182,1mmx150mm-1,7μm，130?柱(Waters)的UPLC系统(Waters,Milford,MA)分析，并用乙腈在0.1%TFA中的线性梯度于60℃采用以下梯度洗脱：

在该方法中，将BBI作为单峰洗脱。通过对215nm(或者280nm)的UV-迹线求积分并使对应于BBI的峰面积除以对应于BBI和杂质的峰面积的总和并以%表示，来评价BBI的纯度。使用BBI对于特定波长的延伸系数(extensioncoefficient)或者对应于已知量的BBI的峰面积的标准曲线，可测定BBI含量(量)。

实施例3：在BBI的存在下由GI提取物所致的胰岛素肽降解

通过用0.4%BSA溶液温育最少60min，包被96孔板。向各孔中，加入210μl缓冲液(含0.005%吐温20和0.005%BSA的HBSS-HEPES缓冲液，pH6.5)、30μl底物(100μM胰岛素肽在缓冲液中)和30μlBBI(1%)。于37℃，将板预温育(加入GI液之前)60min。在加入30μlGI液后，将板在振荡器上温育60min/37℃。于0、3、6、10、30和60min采集样本(40μl)，用3vol.冷的96%EtOH(乙醇)w.1%HCOOH(甲酸)终止，并离心(于4℃，4500rcf持续10min)。将从样本得到的上清液用缓冲液稀释5倍，然后经LC-MS分析。制备标准样本(0.1、0.5、1.0、5.0、10.0μM)并处理为样本。在序列的开始和结束时分析标准曲线。每次试验的条件的两次重复都包括在内。测定每份样品的完整胰岛素肽。将所得结果对温育时间作图。胰岛素肽的半寿期通过例如使用GraphPadPrism的结果的非线性回归来测定。通过用在抑制剂的存在下获得的半寿期除以在BBI不存在下获得的半寿期，表示相对于无BBI存在的胰岛素的半寿期的半寿期。从雄性SpragueDawley大鼠(200-250g)，通过切除大约20cm块状空肠中段制备GI液，并用2.5ml0.9%氯化钠溶液淋洗内部。将氯化钠溶液收集在离心管中，合并来自所有大鼠(20)的洗液并离心(4500rpm./10min/4℃)。将上清液等分到各试管中并于-80℃贮存。

结果列于表1中。

表1：

胰岛素1：N{ε-B29}-[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-羧基-4-(17-羧基十七烷酰基氨基)丁酰基]氨基]乙氧基]乙氧基]乙酰基]氨基]乙氧基]乙氧基]乙酰基]-[GluA14,HisB25],des-ThrB30-胰岛素(人)

胰岛素2：N{A1},N{A1}-二甲基,N{B1},N{B1}-二甲基,N{ε-B29}-[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-羧基-4-(17-羧基十七烷酰基氨基)丁酰基]氨基]乙氧基]乙氧基]乙酰基]氨基]乙氧基]乙氧基]乙酰基]-[GluA14,HisB25],des-ThrB30-胰岛素(人)

胰岛素3：N{ε-B29}-[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-羧基-4-(19-羧基十九烷酰基氨基)丁酰基]氨基]乙氧基]乙氧基]乙酰基]氨基]乙氧基]乙氧基]乙酰基]-[GluA14,HisB16,HisB25],des-ThrB30-胰岛素(人)

胰岛素4：N{ε-B29}-[(4S)-4-羧基-4-(17-羧基十七烷酰基氨基)丁酰基]-[GluA14,HisB25],des-ThrB27,ThrB30-胰岛素(人)

胰岛素5：N{ε-B29}-十四烷酰基-des-ThrB30-胰岛素(人)

胰岛素6：N{ε-B29}-[(4S)-4-羧基-4-(15-羧基十五烷酰基氨基)丁酰基]-des-ThrB30-胰岛素(人)

胰岛素7：N{ε-B29}-[(4S)-4-羧基-4-(15-羧基十五烷酰基氨基)丁酰基]-[GluA14,HisB16,HisB25],des-ThrB30-胰岛素(人)

胰岛素8：N{ε-B29}-[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-羧基-4-(17-羧基十七烷酰基氨基)丁酰基]氨基]乙氧基]乙氧基]乙酰基]氨基]乙氧基]乙氧基]乙酰基]-[CysA10,GluA14,CysB4,HisB25],des-ThrB30-胰岛素(人)

胰岛素9：N{ε-B29}-[(4S)-4-羧基-4-(19-羧基十九烷酰基氨基)丁酰基]-[CysA10,GluA14,CysB3,HisB25],des-ThrB27,ThrB30-胰岛素(人)。

实施例4：在BBI的存在下由GI提取物所致的GLP-1肽降解

通过用0.4%BSA溶液温育最少60min，包被96孔板。向各孔中，加入210μl缓冲液(含0.005%吐温20和0.005%BSA的HBSS-HEPES缓冲液，pH6.5)、30μl底物(100μMGLP-1肽在缓冲液中)和30μlBBI(1%)。于37℃，将板预温育(加入GI液之前)60min。在加入30μlGI液后，将板在振荡器上温育60min/37℃。于0、3、6、10、30和60min采集样本(40μl)，用3倍体积冷的96%EtOHw.1%HCOOH终止，并离心(于4℃，4500rcf持续10min)。将从样本得到的上清液用缓冲液稀释5倍，然后经LC-MS分析。制备标准样本(0.1、0.5、1.0、5.0、10.0μM)并处理为样本。在序列的开始和结束时分析标准曲线。每次试验的条件的两次重复都包括在内。测定每份样品的完整GLP-1肽。将所得结果对温育时间作图。GLP-1肽的半寿期通过例如使用GraphPadPrism的结果的非线性回归来测定。通过用在抑制剂的存在下获得的半寿期除以在BBI不存在下获得的半寿期，表示相对于无BBI存在的GLP-1肽的半寿期的半寿期。从雄性SpragueDawley大鼠(200-250g)，通过切除大约20cm块状空肠中段制备GI液，并用2.5ml0.9%氯化钠溶液淋洗内部。将氯化钠溶液收集在离心管中，合并来自所有大鼠(20)的洗液并离心(4500rpm./10min/4℃)。将上清液等分到各试管中并于-80℃贮存。

结果列于表2。

表2：

GLP-1肽	*在0.1% BBI存在下GLP-1肽的半寿期(min)	*GLP-1肽的半寿期 (min)	*半寿期 (倍数增加)
				N-ε26-[2-(2-{2-[2-(2-{2-[(S)-4-羧基-4-(17-羧基十七烷酰基氨基)丁酰基氨基]乙氧基}乙氧基)乙酰基氨基]乙氧基}乙氧基)乙酰基][Aib8,Arg34]GLP-1-(7-37)	7.6 ± 2.7	< 0.5	> 15

*对于重复超过2次的实验，给出标准差。

实施例5：在癸酸钠和BBI的存在下，胰岛素肽跨生产粘液的E12细胞单层的转运

细胞培养

HT29-MTX(E12)细胞是来自DavidBrayden，UniversityCollegeofDublin(Dublin，Ireland)的赠礼。使细胞在补充有10%胎牛血清(FBS)、1%青霉素/链霉素、1%L-谷氨酰胺和1%非必需氨基酸的Dulbecco改良Eagle培养基中生长。对于转运测定，将E12细胞以10⁵细胞/孔的密度接种到在12-孔Transwell板(1.13cm²，0.4μm孔径)中组织培养物处理过的聚碳酸酯过滤器上。于37℃在5%CO₂气氛中培养细胞；培养基每隔一天更换。转运实验在培养14-18天后进行。

经上皮转运

测量化合物从供体室(顶面)转运到接受室(底面)的量。通过加入400μl溶液(100μM胰岛素肽+13mM癸酸钠+/-0.2%BowmanBirk抑制剂(BBI))和在转运缓冲液中的0.4μCi/μl[3H]甘露醇至供体室，并将1000μl转运缓冲液加入受体室，开始转运研究。转运缓冲液由含有10mMHEPES，0.1%的Hank平衡盐水溶液组成，在加入化合物后调节至pH7.4。测量[3H]甘露醇(一种细胞旁转运的标记物)的转运，以证实上皮的完整性。

在实验前，用转运缓冲液对上皮两侧的E12细胞平衡60min。然后除去缓冲液并启动实验。于0min和在实验结束时采集供体样本(20μl)。每15min采集受体样本(200μl)。在5%CO₂-95%O₂的气氛下于37℃在振动板(30rpm)上进行研究。

在所有含有胰岛素肽和甘露醇的样本中，分别使用LOCI测定和闪烁计数器测定浓度。

在实验之前和期间，监测细胞单层的跨上皮电阻(TEER)。在选择的实验中，在实验结束后将转运缓冲液改换成培养基，并在实验后24h测量TEER。用连接到Chopstick的EVOM?EpithelialVoltohmmeter测量TEER。

对每种胰岛素肽、癸酸钠、甘露醇溶液(含或不含0.2%BBI)测量的胰岛素肽从供体室(顶面)转运到受体室(底面)的量见表3。

表3：

胰岛素溶液	Papp (均值，cm/s)	Papp (SD，cm/s)
			胰岛素1，癸酸钠	3,49071E-07	4,17027E-08
胰岛素1，癸酸钠，BBI	5,44653E-07	5,15709E-08
			胰岛素2，癸酸钠	3,17755E-07	2,45943E-08
胰岛素2，癸酸钠，BBI	5,28329E-07	7,03655E-08
			胰岛素3，癸酸钠	4,99281E-07	1,05467E-07
胰岛素3，癸酸钠，BBI	6,74948E-07	9,11499E-08
			胰岛素4，癸酸钠	5,08956E-07	3,12406E-08
胰岛素4，癸酸钠，BBI	9,95926E-07	5,51648E-08

Papp表示表观渗透系数

胰岛素4：N{ε-B29}-[(4S)-4-羧基-4-(17-羧基十七烷酰基氨基)丁酰基]-[GluA14,HisB25],des-ThrB27,ThrB30-胰岛素(人)。

实施例6：在癸酸钠和BBI的存在下，GLP-1肽跨生产粘液的E12细胞单层的转运

细胞培养

HT29-MTX(E12)细胞是来自DavidBrayden，UniversityCollegeofDublin(Dublin，Ireland)的赠礼。使细胞在补充有10%胎牛血清(FBS)、1%青霉素/链霉素、1%L-谷氨酰胺和1%非必需氨基酸的Dulbecco改良Eagle培养基中生长。对于转运测定，将E12细胞以10⁵细胞/孔的密度接种到在12-孔Transwell板(1.13cm²，0.4μm孔径)中组织培养物处理的聚碳酸酯过滤器上。于37℃在5%CO₂气氛中培养细胞；培养基每隔一天更换。转运实验在培养14-18天后进行。

跨上皮转运

测量GLP-1肽从供体室(顶面)转运到受体室(底面)的量。通过加入400μl溶液(100μMGLP-1肽+13mM癸酸钠+/-0.2%BowmanBirk抑制剂(BBI))和在转运缓冲液中的0.4μCi/μl[3H]甘露醇至供体室，并加入1000μl转运缓冲液至受体室，开始转运研究。转运缓冲液由含有10mMHEPES，0.1%的Hank平衡盐水溶液组成，在加入化合物后调节至pH7.4。测量[3H]甘露醇(一种细胞旁转运的标记物)的转运，以证实上皮的完整性。

在实验前，用转运缓冲液对上皮两侧的E12细胞平衡60min。然后除去缓冲液并启动实验。于0min和在实验结束时采集供体样本(20μl)。每15min采集受体样本(200μl)。在5%CO₂-95%O₂的气氛下于37℃在振荡板(30rpm)上进行研究。

在所有含有GLP-1肽和甘露醇的样本中，分别使用LOCI测定(或LC-MS测定)和闪烁计数器测定GLP-1肽的浓度。

对每种GLP-1肽、癸酸钠、甘露醇溶液(含或不含0.2%BBI)测量的GLP-1肽从供体室(顶面)转运到受体室(底面)的量见表4。

表4：

GLP-1溶液	Papp (均值，cm/s)	Papp (SD，cm/s)
			GLP-1肽1，癸酸钠	1,48132E-07	1,66844E-08
GLP-1肽1，癸酸钠，0.2% BBI	3,19278E-07	5,74768E-08
			GLP-1肽2，癸酸钠	3,89E-07	2,18213E-08
GLP-1肽2，癸酸钠，0.2% BBI	4,38299E-07	5,85288E-08
			GLP-1肽3，癸酸钠	9,0672E-08	4,32679E-09
GLP-1肽3，癸酸钠，0.2% BBI	1,25404E-07	2,13832E-08
			GLP-1肽4，癸酸钠	2,03658E-07	1,66398E-08
GLP-1肽4，癸酸钠，0.2% BBI	5,28788E-07	8,62404E-08
			GLP-1肽5，癸酸钠	3,1387E-07	6,26555E-08
GLP-1肽5，癸酸钠，0.2% BBI	5,91753E-07	3,77236E-08
			GLP-1肽6，癸酸钠	1,58934E-07	1,0132E-08
GLP-1肽6，癸酸钠，0.2% BBI	2,95624E-07	2,58552E-08
			GLP-1肽7，癸酸钠	1,08637E-07	2,00018E-08
GLP-1肽7，癸酸钠，0.2% BBI	1,81771E-07	6,87461E-08
			GLP-1肽8，癸酸钠	1,83585E-07	2,11939E-08
GLP-1肽8，癸酸钠，0.2% BBI	3,62972E-07	4,2416E-08
			GLP-1肽9，癸酸钠	2,72E-07	2,28E-08
GLP-1肽9，癸酸钠，0.2% BBI	3,79E-07	8,46E-08
			GLP-1肽10，癸酸钠	2,76E-07	3,49E-08
GLP-1肽10，癸酸钠，0.2% BBI	5,10E-07	1,45E-08

Papp表示表观渗透系数

GLP-1肽1：N{ε-26}-[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-羧基-4-(17-羧基十七烷酰基氨基)丁酰基]氨基]乙氧基]乙氧基]乙酰基]氨基]乙氧基]乙氧基]乙酰基]-[Aib8,Arg34]-GLP-1-(7-37)-肽

GLP-1肽2：N{ε-18}-[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-羧基-4-[10-(4-羧基苯氧基)癸酰基氨基]丁酰基]氨基]乙氧基]乙氧基]乙酰基]氨基]乙氧基]乙氧基]乙酰基],N{ε-26}-[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-羧基-4-[10-(4-羧基苯氧基)癸酰基氨基]丁酰基]氨基]乙氧基]乙氧基]乙酰基]氨基]乙氧基]乙氧基]乙酰基]-[Aib8,Lys18,Glu22,Gln34]-GLP-1-(7-37)-肽

GLP-1肽3：N{ε-26}-[(2S)-2-氨基-6-[[(2S)-2-氨基-6-[[(4S)-4-羧基-4-(15-羧基十五烷酰基氨基)丁酰基]氨基]己酰基]氨基]己酰基],N{ε-37}-[(2S)-2-氨基-6-[[(2S)-2-氨基-6-[[(4S)-4-羧基-4-(15-羧基十五烷酰基氨基)丁酰基]氨基]己酰基]氨基]己酰基]-[Aib8,Arg34,Lys37]-GLP-1-(7-37)-肽

GLP-1肽4：N{ε-18}-[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-羧基-4-[10-(4-羧基苯氧基)癸酰基氨基]丁酰基]氨基]乙氧基]乙氧基]乙酰基]氨基]乙氧基]乙氧基]乙酰基],N{ε-26}-[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-羧基-4-[10-(4-羧基苯氧基)癸酰基氨基]丁酰基]氨基]乙氧基]乙氧基]乙酰基]氨基]乙氧基]乙氧基]乙酰基]-[Aib8,Lys18,Glu22,Arg34]-GLP-1-(7-37)-肽

GLP-1肽5：N{ε-18}-[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-羧基-4-(13-羧基十三烷酰基氨基)丁酰基]氨基]乙氧基]乙氧基]乙酰基]氨基]乙氧基]乙氧基]乙酰基],N{ε-26}-[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-羧基-4-(13-羧基十三烷酰基氨基)丁酰基]氨基]乙氧基]乙氧基]乙酰基]氨基]乙氧基]乙氧基]乙酰基]-[Aib8,Lys18,Glu22,Arg34]-GLP-1-(7-37)-肽

GLP-1肽6：N{ε-18}-[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-羧基-4-[10-(4-羧基苯氧基)癸酰基氨基]丁酰基]氨基]乙氧基]乙氧基]乙酰基]氨基]乙氧基]乙氧基]乙酰基],N{ε-26}-[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-羧基-4-[10-(4-羧基苯氧基)癸酰基氨基]丁酰基]氨基]乙氧基]乙氧基]乙酰基]氨基]乙氧基]乙氧基]乙酰基]-[Aib8,Lys18,Gln34]-GLP-1-(7-37)-肽

GLP-1肽7：N{ε-26}-[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-羧基-4-(15-羧基十五烷酰基氨基)丁酰基]氨基]乙氧基]乙氧基]乙酰基]氨基]乙氧基]乙氧基]乙酰基]-[Aib8,Arg34]-GLP-1-(7-37)-肽

GLP-1肽8：N{ε-26}-[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-羧基-4-(17-羧基十七烷酰基氨基)丁酰基]氨基]乙氧基]乙氧基]乙酰基]氨基]乙氧基]乙氧基]乙酰基]-[Aib8,His31,Gln34]-GLP-1-(7-37)-肽

GLP-1肽9：N{ε-26}-[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-羧基-4-[10-(4-羧基苯氧基)癸酰基氨基]丁酰基]氨基]乙氧基]乙氧基]乙酰基]氨基]乙氧基]乙氧基]乙酰基],N{ε-37}-[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-羧基-4-[10-(4-羧基苯氧基)癸酰基氨基]丁酰基]氨基]乙氧基]乙氧基]乙酰基]氨基]乙氧基]乙氧基]乙酰基]-[Aib8,Arg34,Lys37]-GLP-1-(7-37)-肽

GLP-1肽10：N{ε-26}-[2-[2-[2-[[(4S)-4-羧基-4-[[2-[2-[2-(13-羧基十三烷酰基氨基)乙氧基]乙氧基]乙酰基]氨基]丁酰基]氨基]乙氧基]乙氧基]乙酰基],N{ε-37}-[2-[2-[2-[[(4S)-4-羧基-4-[[2-[2-[2-(13-羧基十三烷酰基氨基)乙氧基]乙氧基]乙酰基]氨基]丁酰基]氨基]乙氧基]乙氧基]乙酰基]-[Aib8,Arg34,Lys37]-GLP-1-(7-37)-肽。

实施例7：用于固体制剂的BBI的制备

在调节的8.0的pH下，使干燥纯化的BBI溶于水至20mg/ml的浓度。溶液在装配有小直径旋风分离器和0.7mm/1.5mm喷嘴的Büchi微型-喷雾干燥器B-290上经喷雾干燥。工艺条件是：空气入口温度：120℃；溶液流速：4ml/min溶液流；氮气流速：35mm，吸气器：100%。喷雾干燥粉末用于固体制剂。

实施例8：包含胰岛素肽、癸酸钠(十烷酸钠)和BBI的硬胶囊

根据本发明的硬胶囊干燥填充物质的配制如本文概述的那样进行，该实施例涉及包含以下的本发明制剂：

胰岛素肽1.39%(w/w)

BBI8.33%(w/w)

十烷酸钠(癸酸钠)45.83%(w/w)

山梨醇43.93%(w/w)

硬脂酸镁0.52%(w/w)。

用于干燥填充18个硬壳胶囊的生产程序如下进行：

使粉碎的胰岛素肽粉末通过具有0.25mm网格尺寸的筛。过筛后，称重胰岛素肽的正确量。使山梨醇粉末通过具有0.5mm网格尺寸的筛。过筛后，称重山梨醇的正确量。将胰岛素肽和山梨醇在小容器中混合。将与胰岛素肽量相当的山梨醇量加入到所述容器中，并手动搅拌。然后加入相对于先前加入的双倍量的山梨醇并手动搅拌，直至胰岛素肽和所有的山梨醇充分混合。这之后在Turbula-mixer中经机械混合，以最终混合，获得均匀粉末。然后根据等体积原则，将癸酸钠(以碾压颗粒的形式)加入到胰岛素肽-山梨醇粉末中，并最终在Turbula-mixer中采用机械混合步骤。最后使硬脂酸镁通过具有0.25mm网格尺寸的筛。称重硬脂酸镁并加入到粉末中，在Turbula-mixer中机械混合。

然后将粉末填充到00号(Quali-V，Qualicaps)的HPMC硬胶囊中至600mg/胶囊的填充重量。

当制备含有较高浓度的BBI(如33%)的胶囊时，通过降低山梨醇总量而相应地补偿增加体积的BBI，见表5。

当制备含有较低浓度的BBI(如4,2%)的胶囊时，通过增加山梨醇总量而相应地补偿降低体积的BBI，见表5。

当制备含有较低浓度的BBI(如1,7%)的胶囊时，通过增加山梨醇总量而相应地补偿降低体积的BBI，见表5。

表5：含有各种BBI比率的胶囊填充物质的制剂

当制备含有较高浓度的癸酸钠含量(如58%)的胶囊时，通过减少山梨醇总量而相应地补偿增加体积的癸酸盐，见表6。

当制备含有较高浓度的癸酸钠含量(如75%)的胶囊时，通过减少山梨醇总量而相应地补偿增加体积的癸酸盐，见表6。

当制备含有较低浓度的癸酸钠含量(如25%)的胶囊时，通过增加加入的山梨醇的量而相应地补偿减少体积的癸酸盐，见表6。

表6：含有各种癸酸盐比率的胶囊填充物质的制剂

当制备较低浓度的BBI(如1,7%)和较高浓度的癸酸钠含量(如75%)的胶囊时，通过减少山梨醇总量而相应地补偿不同体积的合并的BBI和癸酸钠，见表7。

表7：含有各种BBI和癸酸盐比率的胶囊填充物质的制剂

如该实施例所述制备的硬壳胶囊用肠溶衣包衣。

为此目的，使用共聚物家族命名为“聚(甲基丙烯酸-共聚-丙烯酸乙酯)”(商品名EudragitL30D55?)的聚合物。将105.0g聚(甲基丙烯酸-共聚-丙烯酸乙酯)(商品名EudragitL30D55?)的水性分散液置于合适的搅拌器上的烧杯中。加入15.8gPlasAcrylT20?、4.8g柠檬酸三乙酯、1.8g吐温80和72.6g纯水形式的单硬脂酸甘油酯、增塑剂柠檬酸三乙酯和聚氧乙烯(20)脱水山梨醇单油酸酯至总干燥聚合物量的15,75%。各成分被加入到所述聚(甲基丙烯酸-共聚-丙烯酸乙酯)(商品名EudragitL30D55?)的水性乳液中。将混合物混合60分钟，然后通过0.24mm目过滤器过滤以除去块状物。

硬胶囊的包衣在锅式包衣机或流化床包衣机中进行。

在锅式包衣机中通过喷嘴泵送聚合物溶液进行包衣，其中锅尺寸为8.5’’，常规式样的空气Schlick喷嘴具有1.0mm孔口，雾化和模式气压为0.5-0.6巴，入口空气温度为35?C，空气流速为130kg/小时。在加入均匀地分布在硬胶囊上的5-7%w/w聚合物后，停止喷雾。

实施例9：包含GLP-1肽、癸酸钠(十烷酸钠)和BBI的硬胶囊

GLP-1肽　3.39%(w/w)

BBI8.33%(w/w)

十烷酸钠(癸酸钠)　45.83%(w/w)

山梨醇　41.93%(w/w)

硬脂酸镁　0.52%(w/w)

该程序如下进行：

称重喷雾干燥的GLP-1肽的正确量。使山梨醇粉末通过具有0.5mm网格尺寸的筛。过筛后，称重正确的量。将GLP-1肽和山梨醇在小容器中混合。将与GLP-1肽量相当的山梨醇的量加入到所述容器中，并手动搅拌。然后加入相对于先前加入的双倍量的山梨醇，并手动搅拌，直至胰岛素肽和所有的山梨醇充分混合。这之后在Turbula-mixer中经机械混合，以最终混合，获得均匀粉末。然后根据等体积原则，将癸酸钠(以碾压颗粒的形式)加入到GLP-1肽-山梨醇粉末中。这以两步骤进行，并最终在Turbula-mixer中采用机械混合步骤。最后使硬脂酸镁通过具有0.25mm网格尺寸的筛。称重硬脂酸镁并加入到粉末中，并机械混合。然后将粉末填充到00号(Quali-V，Qualicaps)的HPMC硬胶囊中至600mg/胶囊的填充重量。

当制备含有较高浓度的BBI(如33%)的胶囊时，通过降低山梨醇总量而相应地补偿增加体积的BBI，见表8。

当制备含有较低浓度的BBI(如1,7%)的胶囊时，通过增加山梨醇总量而相应地补偿减少体积的BBI，见表8。

表8：含有各种BBI比率的胶囊填充物质的制剂

实施例10：胰岛素肽N{ε-B29}-[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-羧基-4-(17-羧基十七烷酰基氨基)丁酰基]氨基]乙氧基]乙氧基]乙酰基]氨基]乙氧基]乙氧基]乙酰基]-[GluA14,HisB25],des-ThrB30-胰岛素(人)的犬PD/PK结果

胶囊的制备描述于实施例8。每粒胶囊含有8mg的胰岛素肽N{ε-B29}-[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-羧基-4-(17-羧基十七烷酰基氨基)丁酰基]氨基]乙氧基]乙氧基]乙酰基]氨基]乙氧基]乙氧基]乙酰基]-[GluA14,HisB25],des-ThrB30-胰岛素(人)。每项研究在得自HarlanGannat，France的8只雄性小猎兔犬(HsdRcc:DOBE)中进行，这些犬在到达时约36-48周龄和体重范围约9-11kg。对动物口服给予包衣的胶囊。在t=0min采样后立即给予胶囊。将胶囊置于犬嘴的后部，以使犬吞下胶囊而不咀嚼它。在胶囊吞下后，经注射器向口腔给予10ml水。

获得每只动物的完全的血浆浓度-时间曲线。

血液样本：

对每一时间点，弃去第一滴血。将约800μl血收集到用于血浆的1.5mlEDTAeppendorf管中，并用葡萄糖填充10ul毛细管：

时间点：

给药前(0)和15、30、45、60、75、90、105、120、135、150、165、180、210、240、270、300、360、480、600、720分钟、24、30、48和72小时。

在频繁地采样期间，在用肝素盐水保持开放的头静脉内，从Venflon导管采集血样。其它血样取自颈静脉。

将血样保持在湿冰上最多20min.，然后于4℃以1300G离心4min。

将血浆立即转移到两个微细管(micronictube)，每个管中有来自每个血样的80μl血浆，于-20C储存直至测定。

通过固定化葡萄糖氧化酶法分析葡萄糖浓度，使用浸入500μl分析缓冲液(Biosen自动分析仪和缓冲剂溶液)的10μl全血。

血浆样本的分析：

使用发光氧通道免疫测定(LOCI)分析血浆的胰岛素肽。LOCI测定采用用链霉抗生物素包被的供体珠和与结合于胰岛素肽的中段分子区的单克隆抗体缀合的受体珠。其它对N-末端表位为特异性的单克隆抗体经生物素化。在该测定中，3种反应物与胰岛素肽混合以形成两位点免疫复合物。复合物的发光从供体珠释放单态氧原子，其引导进入受体珠并触发在EnVision酶标仪中测量的化学发光。光的量与胰岛素肽的浓度成正比，且血浆中定量的低限(LLOQ)是100pM。

血浆浓度-时间曲线通过WinNonlin5.2(PharsightInc.，MountainView，CA，USA)的非房室药代动力学分析来分析。使用来自各个动物的各个浓度-时间值进行计算。为计算口服生物利用度，应用得自先前的小猎兔犬研究的iv数据。

结果概述于表9。

表9.口服给予犬含有BBI增溶剂、癸酸钠和BBI的胶囊后的胰岛素生物利用度

实施例11：GLP-1肽的犬PD/PK结果

胶囊的制备描述于实施例9中。每粒胶囊含有20mgGLP-1肽N{ε-26}-[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-羧基-4-(17-羧基十七烷酰基氨基)丁酰基]氨基]乙氧基]乙氧基]乙酰基]氨基]乙氧基]乙氧基]乙酰基]-[Aib8,Arg34]-GLP-1-(7-37)-肽。每项研究在8只雄性小猎兔犬中进行。

这些动物或者使用内窥镜在十二指肠内给予未包衣的胶囊，或者PO给予包衣的胶囊(以如在实施例8中对胰岛素胶囊描述的类似方式包衣)。对于内窥镜程序，用美托咪定(i.v.)和丙泊酚(i.v.)镇静动物。使用装配有一个定制的装置的内窥镜将胶囊给予十二指肠，该装置确保胶囊可递送至十二指肠，而不暴露于食管和胃中的液体。给予犬抵消美托咪定和iv丙泊酚的镇静作用的解毒剂(antisedan)(其被快速清除)。在给药后15-30min唤醒犬。对于PO程序，将胶囊置于犬嘴的后部，以使犬吞下胶囊而不咀嚼它。用注射器向口中提供10ml水，以有利于吞下胶囊。对于用包衣的胶囊的PO研究，给予口服片剂前诱导胃酸分泌。在给予PO剂量之前20分钟，以4μg/kg体重(120μg/mL)的剂量皮下给予五肽胃泌素。

在标准的血样采集方案中，采用20份样本(给药前至11天)以获得各动物的完全血浆浓度-时间曲线。

血液样本：

时间点：

给药前，给药后0.25、0.5、0.75、1、1.5、2、2.5、3、4、6、8、10、24、48、72、96、120、144、168、192、216、240、264和288小时。

将血样保持在湿冰上最多20min.，然后于4℃以1300G离心4min.。将血浆立即转移到两个微细管(micronictube)，每个管中有来自每个血样的80ul血浆，于-20C储存直至测定。

通过固定化葡萄糖氧化酶法分析葡萄糖浓度，使用浸入500μl分析缓冲液(Biosen自动分析仪和缓冲剂溶液)的10ul全血。

血浆样本的分析

使用发光氧通道免疫测定(LOCI)分析血浆的GLP-1肽。LOCI测定采用用链霉抗生物素包被的供体珠和与结合于GLP-1肽的中段分子区的单克隆抗体缀合的受体珠。其它对N-末端表位具特异性的单克隆抗体经生物素化。在该测定中，3种反应物与GLP-1肽混合以形成两位点免疫复合物。复合物的发光从供体珠释放单态氧原子，其引导进入受体珠并触发在EnVision酶标仪中测量的化学发光。光的量与GLP-1肽的浓度成正比，且血浆中定量的低限(LLOQ)是100pM。

血浆浓度-时间曲线通过PhoenixWinNonlin6.3(PharsightInc.，MountainView，CA，USA)的非房室药代动力学分析来分析。使用来自各个动物的各个浓度-时间值进行计算。为计算口服生物利用度，应用得自先前的小猎兔犬研究的iv数据。

结果概述于表10。

表10：内窥镜给予犬含有BBI增溶剂、癸酸钠和BBI的胶囊后的GLP-1肽的生物利用度

癸酸钠(mg)	BBI (mg)	BBI增溶剂	BBI增溶剂(mg)	生物利用度(%)
					275	0	山梨醇	325	0.10
275	10	山梨醇	315	0.38
					275	50	山梨醇	275	0.31
275	200	山梨醇	125	0.18

表11:PO给予犬含有BBI增溶剂、癸酸钠和BBI的胶囊后的GLP-1肽的生物利用度

癸酸钠(mg)	BBI (mg)	BBI增溶剂	BBI增溶剂(mg)	生物利用度(%)
					275	0	山梨醇	300	0.04
275	50	山梨醇	250	0.28
					450	0	山梨醇	125	0.27
450	50	山梨醇	75	0.57

实施例12：胰岛素片剂的制备

包含胰岛素、Bowman-Birk抑制剂和癸酸钠盐(十烷酸钠)的片剂芯材、压制片芯和包衣片剂的配制

片剂芯材的配制如本文概述的那样进行，该实施例涉及包含以下的本发明制剂：

胰岛素　　　　　　　　　1.09%(w/w)

十烷酸钠(癸酸钠盐)　　　72.37%(w/w)

山梨醇　　　　　　　　　19.49%(w/w)

Bowman-Birk抑制剂　　　6.58%(w/w)

硬脂酸　　　　　　　　　0.47%(w/w)

程序如下进行：

使用网格尺寸0.3mm的筛过筛胰岛素粉末。过筛后，称重胰岛素的正确量。使用0.5mm网格尺寸的筛过筛山梨醇粉末。过筛后，称重正确量。

将胰岛素和山梨醇在小容器中混合。将与胰岛素量相当的山梨醇的量加入到所述容器中并手动搅拌。然后加入相对于先前加入的双倍量的山梨醇并手动搅拌，直至胰岛素肽和所有的山梨醇充分混合。这之后在Turbula-mixer中经机械混合，以最终混合，获得均匀粉末。将Bowman-Birk抑制剂加入到混合物中并手动混合。

然后根据等体积原则，将癸酸钠(以碾压颗粒的形式)加入到胰岛素-山梨醇粉末中。这分两步骤进行，并最终在Turbula-mixer中采用机械混合步骤。

最后使用0.3mm网格尺寸的筛过筛硬脂酸。称重硬脂酸并加入到粉末中，并经机械混合。

然后将粉末以旋转压片机压制，形成质量760mg的片剂。

用聚合物肠溶衣对上述片芯包衣。

在锅式包衣机中通过喷嘴泵送聚合物溶液进行包衣，其中锅尺寸为8.5’’，常规式样的空气Schlick喷嘴具有1.0mm孔口，雾化和模式气压为0.55巴，入口空气温度为36℃，空气流速为100m3/小时。在加入均匀地分布在片芯上的7-8%w/w聚合物后，停止包衣。

在最终涂覆肠溶衣后，产品以低转动速度保持在包衣设备中5分钟，以允许冷却至28℃以下，以避免片剂间的粘结。

在产品从包衣设备移出后，使产品在40℃的加热柜中暴露于高温2小时，以使聚合物能够固化。

实施例13：片剂中的胰岛素肽N{ε-B29}-[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-羧基-4-(17-羧基十七烷酰基氨基)丁酰基]氨基]乙氧基]乙氧基]乙酰基]氨基]乙氧基]乙氧基]乙酰基]-[GluA14,HisB25],des-ThrB30-胰岛素(人)的犬PD/PK结果

癸酸钠(mg)	BBI (mg)	山梨醇(mg)	F (%)
				550	0	150	6.9
550	50	150	7.7

虽然本发明的某些特征已在此说明和描述，但本领域普通技术人员会想到许多修改、替代、改变和等效物。因此，要理解的是，所附权利要求书意欲覆盖所有这样的落入本发明的真正精神范围内的修改和改变。

Claims

1.固体口服药用组合物，其包含

a)为胰岛素肽或GLP-1肽的活性肽成分，

b)癸酸盐，例如癸酸钠，

c)Bowman-Birk抑制剂(BBI)，和

d)BBI增溶剂，例如糖醇，例如山梨醇。

2.权利要求1的固体口服药用组合物，其中每剂型存在至少10mg癸酸盐和至少1mgBBI。

3.前述权利要求的任一项的固体口服药用组合物，其包含10mg-450mg癸酸盐和1mg-200mgBBI。

4.前述权利要求的任一项的固体口服药用组合物，其包含10mg–400mgBBI增溶剂。

5.前述权利要求的任一项的固体口服药用组合物，其中固体口服药用组合物以包含在胶囊中的粉末或颗粒形式存在。

6.权利要求5的固体口服药用组合物，其中胶囊包含至多1000mg粉末。

7.权利要求5或6的固体口服药用组合物，其中胶囊是硬胶囊。

8.前述权利要求的任一项的固体口服药用组合物，其中BBI从植物分离。

9.前述权利要求的任一项的固体口服药用组合物，其中BBI的纯度为至少90%纯。

10.前述权利要求的任一项的固体口服药用组合物，其中胰岛素肽或GLP-1肽被酰化。

11.前述权利要求的任一项的固体口服药用组合物，其中活性肽成分为被酰化的胰岛素肽。

12.权利要求1-10的任一项的固体口服药用组合物，其中活性肽成分是被酰化的GLP-1肽。

13.前述权利要求的任一项的固体口服药用组合物，其中癸酸盐与BBI的比例(w/w)为45:1或更小。

14.前述权利要求的任一项的固体口服药用组合物，其中癸酸盐与BBI的比例(w/w)为5.5:1或更小。

15.前述权利要求的任一项的固体口服药用组合物，其中癸酸盐与BBI的比例(w/w)为约1:1。