CN105230483A - 华南紫萁离体再生体系建立的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明属于农业生物技术领域，公开了一种华南紫萁离体再生体系建立的方法，以孢子囊群为外植体，外植物体表面消毒后，接入以改良Beneck基本培养基的各类型培养基中，通过孢子囊中孢子的离体萌发获得原叶体，部分原叶体可继续进行增殖培养，另一部分原叶体可用来诱导产生幼孢子体（幼苗），幼苗经生根培养后移栽于基质，最终形成华南紫萁种苗。本发明能快速可持续地获得大量优质种苗。
Description
技术领域
本发明属于农业生物技术领域，是一种以孢子囊群为外植体的华南紫萁离体再生体系建立的方法。
背景技术
华南紫萁(OsmundavachelliiHook.)是紫萁蕨科紫萁属植物，产于亚洲亚热带湿润地区。分布于我国海南岛、两广、福建、江西、浙江、贵州、云南南部及香港，也产于越南、缅甸和印度。常野生于湿润的山地、草丛或溪边，是我国南部酸性土壤的指示植物。
华南紫萁具较高的观赏价值。植株高达1m，根状茎直立，圆柱状，叶簇生于顶部，似苏铁，株型美观，叶姿态优雅，可供庭园中栽植或室内盆栽观赏。华南紫萁的根茎及叶柄的髓部可入药，有清热解毒、止血生肌作用。主要用于外感、风热、头痛等症，也可治疗外伤出血、烫火伤、痈疖及腮腺炎。上世纪90年代末，何天士等人将其配制为药酒和药茶供人饮用，对人体保健有积极的作用，可解各种热毒症、预防癌症及其他疑难病症，性味平和，无副作用。相关的研究产品获得4项专利。
华南紫萁目前资源主要依靠野生，但自然条件下繁殖效率较低，人工繁殖一般采用分株方式进行，难以快速大规模栽培。由于华南紫萁集观赏和药用价值于一身，其潜在的市场需求非常大。利用组织培养技术建立蕨类植物再生体系，快速获得大量种苗，可以满足园林、保健市场对华南紫萁的需求，同时也间接保护了野生华南紫萁资源。
发明内容
本发明的目的在于提供一种华南紫萁离体再生体系建立的方法，即以华南紫萁的成熟孢子为外植体，经过外植体表面消毒、孢子无菌萌发、原叶体增殖、孢子体诱导与瓶苗移栽等步骤，建立了华南紫萁离体再生体系，从而快速可持续地获得大量种苗。
本发明采用下述技术方案来实现。华南紫萁离体再生体系建立的方法，包括以下步骤：
(1)外植体采集与表面消毒：剪取华南紫萁孢子叶，进行表面消毒。
(2)孢子无菌萌发：分离孢子叶上的孢子囊群，将其接种于孢子萌发培养基上进行培养。孢子萌发培养基配方为：改良Beneck基本培养基+0~15g/L蔗糖+6-苄氨基嘌呤(6-BA)0.2mg/L+2,4二氯苯氧乙酸(2,4-D)0.1mg/L+琼脂7g/L
(3)原叶体增殖培养：将步骤(2)孢子萌发形成的原叶体剪切至增殖培养基中进行原叶体增殖培养。每50d更换一次增殖培养基。增殖培养基配方为：改良Beneck基本培养基+15g/L蔗糖+6-BA0~0.6mg/L+2,4-D0.1mg/L+琼脂7g/L。
(4)孢子体的诱导：将步骤(3)形成的原叶体粉碎转接至孢子体诱导培养基诱导产生幼孢子体。孢子体诱导培养基配方为：改良Beneck基本培养基+赤霉素(GA3)0~1.2mg/L+5g/L蔗糖+琼脂7g/L+水解酪蛋白100mg/L。
(5)生根培养与炼苗：将步骤(4)诱导的幼孢子体分离出来，转接至生根培养基诱导孢子体形成不定根。生根培养基配方为：改良Beneck基本培养基+10g/L蔗糖+6-BA0.05mg/L+2,4-D0.1mg/L(或NAA0.1mg/L)+琼脂7g/L发现不定根根尖突出后，随即在培养室内松开、虚掩瓶盖10d，期间培养基因水分较快消耗而收缩，但不致干涸，孢子体结构分化更完善。
(6)移栽：取出步骤(5)的孢子体幼苗，洗去根部附着的凝胶培养基，将幼苗移栽入经高温灭菌的基质中。定期浇水，覆盖薄膜，保持相对湿度90%以上。
上述改良Beneck基本培养基配方为：NH4NO3200mg/L、KH2PO4100mg/L、MgSO4·7H2O100mg/L、CaCl2100mg/L、KI0.83mg/L、H3BO36.2mg/L、MnSO4·4H2O22.3mg/L、ZnSO4·7H2O8.6mg/L、Na2MoO4·2H2O0.25mg/L、CuSO4·5H2O0.025mg/L、CoCl2·6H2O0.025mg/L、FeSO4·7H2O6.95mg/L、Na2-EDTA·2H2O9.325mg/L。琼脂培养基pH值均调节至5.8。
上述培养条件均为：12h光照+12h黑暗，光照强度2500Lx，25±2℃。
上述步骤(1)中表面消毒条件优选如下：先用70%的酒精浸泡15s，弃酒精，加入0.1%升汞(HgCl2)消毒2min。
上述步骤(2)孢子萌发培养基配方优选为：改良Beneck基本培养基+5g/L蔗糖+6-苄氨基嘌呤(6-BA)0.2mg/L+2,4二氯苯氧乙酸(2,4-D)0.1mg/L+琼脂7g/L
上述步骤(3)中，增殖培养基配方优选为：改良Beneck基本培养基+15g/L蔗糖+6-BA0.6mg/L+2,4-D0.1mg/L+琼脂7g/L。
上述步骤(4)中，孢子体诱导培养基配方优选为：改良Beneck基本培养基+赤霉素(GA3)0.8mg/L+5g/L蔗糖+琼脂7g/L+水解酪蛋白100mg/L。接种方式优先为粉碎性接种。
上述步骤(5)中，生根培养基配方优选为：改良Beneck基本培养基+10g/L蔗糖+6-BA0.05mg/L+2,4-D0.1mg/L+琼脂7g/L。
本发明首次建立了华南紫萁离体再生体系的方法，填补了现有技术空白；使用本发明的快速繁殖的方法，可实现高度集约化和高密度工厂化生产，可在短时期内获得大量优质的华南紫萁幼苗，为园艺生产和中药栽培提供的可靠的技术保障。
附图说明
图1华南紫萁原叶体增殖效果图。
图2华南紫萁孢子体诱导效果图。
图3华南紫萁移栽效果图。
具体实施方式
准备工作：按配方制备改良Beneck基本培养基，其配方为：NH4NO3200mg/L、KH2PO4100mg/L、MgSO4·7H2O100mg/L、CaCl2100mg/L、KI0.83mg/L、H3BO36.2mg/L、MnSO4·4H2O22.3mg/L、ZnSO4·7H2O8.6mg/L、Na2MoO4·2H2O0.25mg/L、CuSO4·5H2O0.025mg/L、CoCl2·6H2O0.025mg/L、FeSO4·7H2O6.95mg/L、Na2-EDTA·2H2O9.325mg/L。琼脂培养基pH值均调节至5.8。
本发明提供的华南紫萁离体培养体系建立的方法，包括如下顺序步骤：
(1)外植体采集与表面消毒处理：在华南紫萁孢子囊群色泽黄褐，孢子叶轴尚呈黄绿新鲜状态时，剪取孢子叶自封袋中带回，及时处理新鲜材料，或贮4℃保存，2d内处理完。孢子叶表面消毒：孢子叶剪裁为3~4cm的小段，置50ml广口瓶中，饱和洗衣粉溶液浸泡，加入1滴吐温-80，盖瓶盖，浸洗20min，期间每3~5min轻轻旋摇瓶体数次；自来水缓缓冲洗孢子叶10min；在超净工作台上，弃瓶内自来水，加入70%的酒精浸泡15s，弃酒精，加入0.1%HgCl2消毒2min，再以无菌水冲洗5次，备用。
(2)孢子无菌萌发：分离孢子叶上的孢子囊群，将其接种于孢子萌发培养基上进行培养。孢子萌发培养基配方为：改良Beneck基本培养基+0~15g/L蔗糖+6-BA0.2mg/L+2,4-D0.1mg/L+琼脂7g/L。培养条件均为：12h光照+12h黑暗，光照强度2500Lx，25±2℃。
(3)原叶体增殖培养：将步骤(2)孢子萌发形成的原叶体剪切至增殖培养基中进行原叶体增殖培养。每50d更换一次增殖培养基。增殖培养基配方为：改良Beneck基本培养基+15g/L蔗糖+6-BA0~0.6mg/L+2,4-D0.1mg/L+琼脂7g/L。培养条件均为：12h光照+12h黑暗，光照强度2500Lx，25±2℃。
(4)孢子体的诱导：将步骤(3)形成的原叶体粉碎转接至孢子体诱导培养基诱导产生幼孢子体。孢子体诱导培养基配配方为：改良Beneck基本培养基+GA30~1.2mg/L+5g/L蔗糖+琼脂7g/L+水解酪蛋白100mg/L。培养条件均为：12h光照+12h黑暗，光照强度2500Lx，25±2℃。
(5)生根培养与炼苗：将步骤(4)诱导的幼孢子体分离出来，转接至生根培养基诱导孢子体形成不定根。生根培养基配方为：改良Beneck基本培养基+10g/L蔗糖+6-BA0.05mg/L+2,4-D0.1mg/L(或NAA0.1mg/L)+琼脂7g/L。10-15d陆续发现各幼孢子体不定根根尖突出后，随即在培养室内松开、虚掩瓶盖10d，期间培养基因水分较快消耗而收缩，但不致干涸，孢子体结构分化更完善。培养条件均为：12h光照+12h黑暗，光照强度2500Lx，25±2℃。
(6)移栽：取出步骤(5)的孢子体幼苗，洗去根部附着的凝胶培养基，将幼苗移栽入经高温灭菌的基质中，基质为草炭︰蛭石=3︰1。定期浇水，覆盖薄膜，保持相对湿度90%以上。
以下结合实施例对本发明作进一步详细、完整说明：
实施例1
外植体采集与表面消毒处理：在华南紫萁孢子囊群色泽黄褐，孢子叶轴尚呈黄绿新鲜状态时，剪取孢子叶自封袋中带回，及时处理新鲜材料，或贮4℃保存，2d内处理完。孢子叶表面消毒：孢子叶剪裁为3~4cm的小段，含10-12个孢子囊群，置50ml广口瓶中，饱和洗衣粉溶液浸泡，加入1滴吐温-80，盖瓶盖，浸洗20min，期间每3~5min轻轻旋摇瓶体数次；广口瓶口扎以纱布，以自来水缓缓冲洗孢子叶10min，至瓶内液体澄清；在超净工作台上，弃瓶内自来水，加入70%的酒精浸泡15s，弃酒精，加入0.1%HgCl2消毒2min，再以无菌水冲洗5次，备用。分离孢子叶上的孢子囊群，将其接种于孢子萌发培养基上进行培养，每瓶接种10个孢子囊群。培养条件均为：12h光照+12h黑暗，光照强度2500Lx，25±2℃。
孢子萌发培养基配方为：
a)改良Beneck基本培养基+0/L蔗糖+6-BA0.2mg/L+2,4-D0.1mg/L+琼脂7g/L。
b)改良Beneck基本培养基+5g/L蔗糖+6-BA0.2mg/L+2,4-D0.1mg/L+琼脂7g/L。
c)改良Beneck基本培养基+10g/L蔗糖+6-BA0.2mg/L+2,4-D0.1mg/L+琼脂7g/L。
d)改良Beneck基本培养基+15g/L蔗糖+6-BA0.2mg/L+2,4-D0.1mg/L+琼脂7g/L。
培养50d后，结果如下：
a)由85%的孢子囊群中获得原叶体，原叶体浅黄绿色，较透明。
b)由78%的孢子囊群中获得原叶体，原叶体黄绿色，稍透明。
c)由64%的孢子囊群中获得原叶体，原叶体绿色，不透明。
d)由45%的孢子囊群中获得原叶体，原叶体深绿色，不透明，少量材料后期发生褐变。
由上述培养结果可以得知：改良Beneck基本培养基的配方组成中，蔗糖对孢子萌发、原叶体的生长状态有较显著的影响。孢子萌发培养基配方优选为：改良Beneck基本培养基+5g/L蔗糖+6-苄氨基嘌呤(6-BA)0.2mg/L+2,4二氯苯氧乙酸(2,4-D)0.1mg/L+琼脂7g/L。无蔗糖培养虽然原叶体数量最多，但生长瘠薄，不利下一步的培养。
实施例2
将实施例1得到的原叶体接种原叶体剪切至增殖培养基中进行原叶体增殖培养。每50d更换一次培养基。培养条件均为：12h光照+12h黑暗，光照强度2500Lx，25±2℃。
增殖培养基配方为：
a)改良Beneck基本培养基+15g/L蔗糖+6-BA0mg/L+2,4-D0.1mg/L+琼脂7g/L。
b)改良Beneck基本培养基+15g/L蔗糖+6-BA0.2mg/L+2,4-D0.1mg/L+琼脂7g/L。
c)改良Beneck基本培养基+15g/L蔗糖+6-BA0.4mg/L+2,4-D0.1mg/L+琼脂7g/L。
d)改良Beneck基本培养基+15g/L蔗糖+6-BA0.6mg/L+2,4-D0.1mg/L+琼脂7g/L。
培养50d后，结果如下：
a)原叶体碎片可以形成新的原叶体，但数量有限，平均每瓶22个。原叶体腹面假根发达。
b)原叶体碎片可以形成新的原叶体，但数量有限，平均每瓶31个。原叶体腹面有假根。
c)原叶体碎片可以形成新的原叶体，但数量较多，排列较密集，平均每瓶55个。原叶体腹面少有假根。
d)原叶体碎片可以形成新的原叶体，但数量很多，密集排列，且层层相裹，类似生菜的形态，不易记数，如图1所示。原叶体腹面不具假根。
由上述培养结果可以得知：改良Beneck基本培养基的配方组成中，6-BA对原叶体的增殖有较显著的影响。原叶体增殖培养基配方优选为：改良Beneck基本培养基+15g/L蔗糖+6-BA0.6mg/L+2,4-D0.1mg/L+琼脂7g/L。
实施例3
将实施例2得到的原叶体粉碎接种到孢子体诱导培养基中诱导幼苗的形成。每50d更换一次培养基。培养条件均为：12h光照+12h黑暗，光照强度2500Lx，25±2℃。
孢子体诱导培养基配配方为：
a)改良Beneck基本培养基+GA30mg/L+5g/L蔗糖+琼脂7g/L+水解酪蛋白100mg/L。
b)改良Beneck基本培养基+GA30.4mg/L+5g/L蔗糖+琼脂7g/L+水解酪蛋白100mg/L。
c)改良Beneck基本培养基+GA30.8mg/L+5g/L蔗糖+琼脂7g/L+水解酪蛋白100mg/L。
d)改良Beneck基本培养基+GA31.2mg/L+5g/L蔗糖+琼脂7g/L+水解酪蛋白100mg/L。
培养50d后，结果如下：
a)有孢子体幼苗形成，平均15苗/瓶，幼孢子叶高度≤1cm。幼叶相对较厚实，有些可见叶脉。
b)有孢子体幼苗形成，平均31苗/瓶，幼孢子叶高度≤1.5cm。幼叶稍有伸长，较厚实。
c)有孢子体幼苗形成，平均42苗/瓶，幼孢子叶高度≤3cm。幼叶伸长，尚厚实，如图2所示。
d)有孢子体幼苗形成，平均48苗/瓶，幼孢子叶高度≤4.5cm。幼叶较瘦弱，细长。
由上述培养结果可以得知：改良Beneck基本培养基的配方组成中，GA3对孢子体的诱导有较明显的促进作用。孢子体诱导培养基配方优选为：改良Beneck基本培养基+GA30.8mg/L+5g/L蔗糖+琼脂7g/L+水解酪蛋白100mg/L。d)项尽管孢子体数量最多，但质量不佳，影响后续练苗移栽的成活率。
实施例4
生根培养、炼苗与移栽：将实施例3诱导的幼孢子体分离出来，转接至生根培养基诱导孢子体形成不定根。培养条件均为：12h光照+12h黑暗，光照强度2500Lx，25±2℃。
生根培养基配配方为：
a)改良Beneck基本培养基+10g/L蔗糖+6-BA0.05mg/L+2,4-D0.1mg/L+琼脂7g/L
b)改良Beneck基本培养基+10g/L蔗糖+6-BA0.05mg/L+NAA0.1mg/L+琼脂7g/L
10-15d陆续发现各幼孢子体不定根根尖突出后，随即在培养室内松开、虚掩瓶盖10d，期间培养基因水分较快消耗而收缩，但不致干涸，孢子体结构分化更完善。移栽前，对幼苗进行清洗时，观察发现：a)处理所形成的幼根相对处理粗短，移栽后再伸长，产生更多根毛，如图3所示，而b)处理形成的根色浅、多根毛，移栽时根毛易损伤，但后期也会形成新根替代原有根系。综合比较，以a)培养基短期处理效果更佳。
Claims (10)
1.华南紫萁离体再生体系建立的方法，其特征在于包括以下步骤：
(1)外植体采集与表面消毒：剪取华南紫萁孢子叶，进行表面消毒；
(2)孢子无菌萌发：分离孢子叶上的孢子囊群，将其接种于孢子萌发培养基上进行培养；
(3)原叶体增殖培养：将步骤(2)孢子萌发形成的原叶体剪切至增殖培养基中进行原叶体增殖培养；
(4)孢子体的诱导：将步骤(3)形成的原叶体粉碎转接至孢子体诱导培养基诱导产生幼孢子体；
(5)生根培养与炼苗：将步骤(4)诱导的幼孢子体分离出来，转接至生根培养基诱导孢子体形成不定根；
(6)移栽：取出步骤(5)的孢子体幼苗，洗去根部附着的凝胶培养基，将幼苗移栽入经高温灭菌的基质中。
2.根据权利要求1所述的华南紫萁离体再生体系建立的方法，其特征在于：在华南紫萁孢子囊群色泽黄褐，孢子叶轴尚呈黄绿色新鲜状态时，剪取孢子叶，及时处理新鲜材料。
3.根据权利要求1所述的华南紫萁离体再生体系建立的方法，其特征在于：孢子萌发培养基配方为：改良Beneck基本培养基+0~15g/L蔗糖+6-苄氨基嘌呤(6-BA)0.2mg/L+2,4二氯苯氧乙酸（2,4-D）0.1mg/L+琼脂7g/L。
4.根据权利要求1所述的华南紫萁离体再生体系建立的方法，其特征在于：步骤（3）中，增殖培养基配方为：改良Beneck基本培养基+15g/L蔗糖+6-BA0~0.5mg/L+2,4-D0.1mg/L+琼脂7g/L。
5.根据权利要求1所述的华南紫萁离体再生体系建立的方法，其特征在于：步骤（4）中，孢子体诱导培养基配方为：改良Beneck基本培养基+赤霉素（GA3）0~1.2mg/L+5g/L蔗糖+琼脂7g/L+水解酪蛋白100mg/L。
6.根据权利要求1所述的华南紫萁离体再生体系建立的方法，其特征在于：步骤（5）中，生根培养基配配方为：改良Beneck基本培养基+10g/L蔗糖+6-BA0.05mg/L+2,4-D0.1mg/L+琼脂7g/L；发现不定根根尖突出后，随即在培养室内松开、虚掩瓶盖10d，期间生根培养基因水分较快消耗而收缩，但不致干涸。
7.根据权利要求3、4、5或6所述的华南紫萁离体再生体系建立的方法，其特征在于：改良Beneck基本培养基配方为：NH4NO3200mg、KH2PO4100mg、MgSO4·7H2O100mg、CaCl2100mg、KI0.83mg、H3BO36.2mg、MnSO4·4H2O22.3mg、ZnSO4·7H2O8.6mg、Na2MoO4·2H2O0.25mg、CuSO4·5H2O0.025mg、CoCl2·6H2O0.025mg、FeSO4·7H2O27.8mg、Na2-EDTA·2H2O37.3mg。
8.根据权利要求1、2、3、4、5或6所述的华南紫萁离体再生体系建立的方法，其特征在于：离体培养体系建立的培养条件为12h光照+12h黑暗，光照强度2500Lx，25±2℃。
9.根据权利要求1、2、3、4、5或6所述的华南紫萁离体再生体系建立的方法，其特征在于：幼苗移栽所采用的基质为草炭︰蛭石=3︰1，经高温灭菌后使用。
10.根据权利要求1、2、3、4、5或6所述的华南紫萁离体再生体系建立的方法，其特征在于：孢子体诱导培养基配方为：改良Beneck基本培养基+GA30.8mg/L+5g/L蔗糖+琼脂7g/L+水解酪蛋白100mg/L。
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