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CN105229470B - 用于治疗和诊断系统性红斑狼疮的方法 - Google Patents

用于治疗和诊断系统性红斑狼疮的方法 Download PDF

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CN105229470B CN201480011322.4A CN201480011322A CN105229470B CN 105229470 B CN105229470 B CN 105229470B CN 201480011322 A CN201480011322 A CN 201480011322A CN 105229470 B CN105229470 B CN 105229470B
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Abstract

本发明公开了用于诊断、预后和治疗系统性红斑狼疮(SLE)的方法和试剂，其涉及根据红细胞C4d(EC4d)标志物、B细胞C4d(BC4d)标志物、抗核抗体(ANA)和可任选的被排除的标志物的任意一种标志物的水平来计算受试对象的SLE风险得分。

Description

用于治疗和诊断系统性红斑狼疮的方法
交叉引用
本申请要求2013年3月15日提交的美国临时专利申请系列号No.61/792284的优先权，该申请以引用方式全文并入本文。
背景技术
系统性红斑狼疮(SLE)是自身免疫疾病，其可表征为血液中产生不常见的自身抗体。这些自身抗体与它们各自的抗原结合，形成免疫复合物，该免疫复合物循环并最终沉积在组织中。这种免疫复合物沉积导致慢性炎症和组织损伤。
导致狼疮的异常自身免疫的确切原因是未知的。遗传基因、病毒、紫外光和药品可能都起到一些作用。遗传因素增加了发展自身免疫疾病的趋势，并且诸如狼疮、类风湿性关节炎和免疫性甲状腺紊乱之类的自身免疫疾病在狼疮患者的亲属中比普通人群更常见。一些科学家相信狼疮中的免疫系统仍容易受到外部因素(例如病毒或紫外光)的刺激。通常，狼疮的症状可以仅由短时暴露于日光而突发或恶化。
由于SLE患者可以具有多种症状和相关器官的不同的组合，单一的检验不能建立SLE的诊断。为了帮助医生改善SLE诊断的精确性，American Rheumatism Association建立了11个标准。这11个标准与在SLE患者中所观察到的多种症状密切相关。当个体具有这些标准中的4个或更多，则强烈建议诊断为SLE。但是，疑似SLE的一些患者可能从未发展出足够用于明确诊断的标准。其他患者仅在观察几个月或几年之后便累积足够的标准。然而，在一些环境下，在仅具有这些传统标准中的几个标准的患者中，可以诊断为SLE。在这些患者中，一定数量的患者可能后来发展出其他的标准，但是许多患者从未发展出其他标准。常用于诊断SLE的11个标准为：
1-高于脸颊的颧骨的红斑或“蝴蝶”红斑
2-盘状皮肤红斑：可以导致结疤的斑片状发红
3-光敏感：对暴露日光产生反应的皮肤红斑
4-粘膜溃疡：口腔、鼻或喉咙内膜的溃疡
5-关节炎：手和足的2处或多处肿胀的压痛关节
6-胸膜炎/心包炎：心脏或肺周围的内膜组织的炎症，通常与呼吸的胸痛有关
7-肾脏异常：异常量的尿蛋白或成堆的细胞基本组分(称为管型)
8-脑刺激：通过癫痫(惊厥)和/或精神病表明
9-血细胞计数异常：少量的白细胞或红细胞、或者血小板
10-免疫紊乱：异常免疫检验包括抗dsDNS或抗Sm(Smith)抗体、梅毒的假阳性血液检验、抗心磷脂抗体、狼疮抗凝物或阳性LE prep检验，以及
11-抗核抗体：阳性ANA抗体检验
尽管所述的标准作为这些特征(区别狼疮与其他相关的自身免疫疾病)的有用的提示，但是它们不可避免地容易出错。测定所述的标准的存在或缺乏通常需要说明。如果自由标准用于测定迹象或症状的存在或缺乏，则人们可以容易地将患者在实际上未患狼疮时就诊断为患有狼疮。相似地，SLE的临床表现范围比11个标准所描述的更多，并且在患者之间每种表现在活性和严重性水平方面彼此不同。使困难诊断进一步复杂的是，SLE的症状在疾病的过程中不断演化。在一定时间内，新症状在之前未受影响的器官中可以发展。由于传统上不具有狼疮的明确检验，所以通常被误诊。
此外，监测疾病活性在护理狼疮患者中也是成问题的。狼疮发展成一系列耀斑或急性疾病期后有所缓解。耀斑的症状(其在患者之间、甚至在相同的患者中变化相当大)包括不适、发烧、系统性关节痛和光敏性(在短暂暴露于太阳后，发展成红斑)。狼疮的其他症状包括脱发、粘膜溃疡以及导致胸痛的心脏和肺的内膜炎症。
在狼疮中，红细胞、血小板和白细胞可以被靶向，从而导致贫血症和出血问题。更严重的是，血管中免疫复合物沉积和慢性炎症可以导致肾相关的间歇性衰竭，从而需要透析或肾移植。由于在狼疮中血管是自身免疫应答的主要靶物，所以早发性中风和心脏疾病都是平常的。而且，经过一定时间后，这些耀斑可以导致不可逆的器官损伤。
发明概述
在第一方面中，本发明提供了用于治疗处于系统性红斑狼疮(SLE)风险下的方法，其包括：
(a)在由处于患有SLE风险之下的受试对象得到的生物样品中，根据以下主要标志物的每一种标志物的水平来计算受试对象的SLE风险得分：
(I)红细胞C4d(EC4d)标志物；
(II)B细胞C4d(BC4d)标志物；和
(III)抗核抗体(ANA)；
其中所述的受试对象处于患有SLE的风险之下，并且其中根据EC4d标志物、BC4d标志物、抗Smith(抗Sm)抗体和双链DNA抗体(抗dsDNA)的各个水平，所述的受试对象是SLE阴性的；以及
(b)至少部分根据SLE风险得分来治疗受试对象的SLE或另一种疾病。
在另一个方面中，本发明提供了用于诊断处于SLE风险之下的受试对象患有SLE可能性的方法，其包括：
(a)根据EC4d标志物、BC4d标志物、抗Smith(抗Sm)抗体和双链DNA抗体(抗dsDNA)的各个水平，测定处于SLE风险之下的受试对象为SLE阴性，和
(b)在由处于患有SLE风险之下的受试对象得到的生物样品中，根据以下主要标志物的每一种标志物的水平来计算SLE风险得分：
(I)红细胞C4d(EC4d)标志物；
(II)B细胞C4d(BC4d)标志物；和
(III)抗核抗体(ANA)；
其中所述的风险得分表明了受试对象患有SLE的可能性。
在所述的方法的一个实施方案中，所述的方法进一步包括在由所述的受试对象得到的生物样品中测定1、2、3或所有4种被排除(rule-out)的标志物的水平，其中所述的标志物选自SS-B(La)标志物、Scl-70标志物、Jo-1标志物和CENP标志物，并且其中所述的计算SLE风险得分包括根据主要标志物的每种标志物以及一种或多种排除的标志物的水平来计算SLE的风险得分。
在另一个实施方案中，所述的方法进一步包括在由所述的受试对象得到的生物样品中测定MCV标志物的水平，并且其中所述的计算SLE风险得分包括根据主要标志物的每种标志物、一种或动作排除标志物和MCV标志物的水平来计算SLE风险得分。
在另一个实施方案中，计算SLE风险得分包括通过一种或多种转化分析来调节一种或多种主要标志物的水平。在一个此类的实施方案中，所述的一种或多种转化分析包括逻辑回归分析，并且其中逻辑回归分析包括：
(i)调节主要标志物的每一种标志物的水平，从而产生各主要标志物的加权得分，和
(ii)将各主要标志物的加权得分结合，从而产生SLE风险得分。
在另一个实施方案中，计算SLE风险得分包括通过一种或多种转化分析来调节1、2、3或所有4种被排除的标志物的水平。在一个此类的实施方案中，所述的一种或多种转化分析包括逻辑回归分析，并且其中逻辑回归分析包括：
(i)调节主要标志物的每一种标志物的水平以及1、2、3或所有4种被排除的标志物的每一种标志物的水平，从而产生各主要标志物以及1、2、3或所有4种被排除的标志物的加权得分，和
(ii)将各主要标志物以及1、2、3或所有4种被排除的标志物的加权得分结合，从而产生SLE风险得分。
在另一个实施方案中，SLE风险得分是通过以下方法计算的：
(a)测定净平均荧光强度的自然对数，其中所述的荧光强度是通过荧光激活细胞分选术(FACS)针对EC4d和BC4d而测定的；
(b)根据预定的阈值来测定ANA是否为阴性(值为0)、中阳性(值为1)或强阳性(值为2)；
(c)测定任何被排除的标志物是否落入上述预定阈值并因此为阳性(值为1)，或者被排除的标志物是否均未落入上述预定阈值并因此均为阴性(值为0)；以及
(d)将(a)-(c)中测定的值结合，从而得到SLE风险得分。
附图简述
图1为示出本发明方法的一个实施方案的流程图，其中所述的方法用于根据细胞基补体激活产物的血液样品水平(包含2个检测层)来诊断SLE。
图2为在抗dsDNA阴性受试对象中的指数得分。RA：类风湿性关节炎；PM/DM：多肌炎/皮肌炎；Scl：硬皮病；SS：Sjogren综合征；NHV：正常的健康志愿者。
发明详述
本文所述的所有参考文献均以引用方式并入本文。除非内容中清楚地作出相反的指示，本文所公开的与本发明相同或不同方面的一个或多个其他实施方案结合。
除非内容中清楚地作出相反的要求，否则在整个说明书和权利要求书中，词语“包括”(动词形式)、“包括”(分词形式)等与专用的或穷举的含义相反，将解释为包括一切在内的含义；换言之，为“包括但不限于”的含义。此外，使用单数或复数的词语分别包括复数或单数。此外，当词语“在此”、“上文”、“下文”和相似意义的词语用于本申请中时，是指本申请作为一个整体，而非本申请的任何特定的部分。如本文所用，除非内容中清楚地作出相反的指示，单数形式“a”、“an”和“the”包括复数指示物。除非明确地作出相反的陈述，否则“和”如本文所用，可以与“或”交换使用。
本公开的实施方案的描述无意于穷举的，或者将本公开限定为所公开的精确形式。尽管为了说明本文描述了本公开的具体的实施方案和实施例，但是相关领域的那些技术人员将意识到，多种相当的修改可以在本公开的范围内。例如尽管方法的步骤或功能以给定的顺序提出，但是备选的实施方案可以以不同的顺序发挥功能，或者可以以基本同时地发挥功能。本文提供的公开的教导可以视情况而应用于其他过程或方法中。本文所述的多个实施方案可以结合，从而提供其他的实施方案。
在第一方面中，本发明提供了用于治疗处于系统性红斑狼疮(SLE)风险之下的受试对象的方法，其包括：
(a)在由处于患有SLE风险之下的受试对象得到的生物样品中，根据以下主要标志物的每一种标志物的水平来计算受试对象的SLE风险得分(也称为“指数得分”)：
(I)红细胞C4d(EC4d)标志物；
(II)B细胞C4d(BC4d)标志物；和
(III)抗核抗体(ANA)；
其中所述的受试对象处于患有SLE的风险之下，并且其中根据EC4d标志物、BC4d标志物、抗Smith(抗Sm)抗体和双链DNA抗体(抗dsDNA)的各个水平，所述的受试对象是SLE阴性的；以及
(b)至少部分根据SLE风险得分来治疗受试对象的SLE或另一种疾病。
在第二方面中，本发明提供了用于诊断处于SLE风险之下的受试对象患有SLE可能性的方法，其包括：
(a)根据EC4d标志物、BC4d标志物、抗Smith(抗Sm)抗体和双链DNA抗体(抗dsDNA)的各个水平，测定处于SLE风险之下的受试对象为SLE阴性，和
(b)在由处于患有SLE风险之下的受试对象得到的生物样品中，根据以下主要标志物的每一种标志物的水平来计算SLE风险得分：
(I)红细胞C4d(EC4d)标志物；
(II)B细胞C4d(BC4d)标志物；和
(III)抗核抗体(ANA)；
其中所述的风险得分表明了受试对象患有SLE的可能性。
与现有技术的方法相比，本发明的方法在诊断和治疗系统性红斑狼疮(SLE)方面提供了改善。在任一方面的实施方案中，所述的方法进一步包括在由受试对象得到的生物样品中，测定一种或多种(例如1、2、3或所有4种)被排除的标志物的水平，其中所述的标志物选自综合征B型抗原(SS-B(La))标志物、Scl-70标志物(拓扑异构酶I)、Jo-1标志物、和着丝粒B蛋白(CENP)标志物，其中计算SLE风险得分包括根据主要标志物的每一种标志物以及一种或多种被排除的标志物的水平来计算SLE风险得分。在这种实施方案中，SLE诊断的特异性比现有技术的方法得到大幅的改善。
所述的标志物可以为任何合适的标志物，例如生物样品中对抗一种或多种被排除的标志物的抗体。例如Jo-1标志物可以为抗Jo-1抗体，SS-B(La)标志物可以为抗SS-B(La)抗体，Scl-70标志物可以为抗Scl-70抗体，并且CENP标志物可以为抗CENP抗体。在其他的实施方案中，被排除的标志物可以进一步包括MCV(突变的瓜氨酸波形蛋白)标志物，例如抗MCV抗体。
用于测量这些标志物的每一种标志物的水平和在各种组织样品中的正常水平的探针和检测是本领域那些技术人员已知的，并且用于实施此类测量的试剂盒可得自许多的制造商，包括但不限于以下实例中提及的那些。
在任一方面的另一个实施方案中，计算SLE风险得分包括通过一种或多种转化分析来调节主要标志物的一种或多种标志物的水平。可以使用任何此类的转化分析，包括但不限于逻辑回归分析。在此类实施方案中，逻辑回归分析可以包括：
(i)调节主要标志物的每一种标志物的水平，从而产生各主要标志物的加权得分，和
(ii)将各主要标志物的加权得分结合，从而产生SLE风险得分。
在另一个实施方案中，计算SLE风险得分包括通过一种或多种转化分析来调节主要标志物的一种或多种标志物的水平和一种或多种(1、2、3或所有4种)被排除的标志物的水平。在此类实施方案中，所述的一种或多种转化分析包括逻辑回归分析，其包括：
(i)调节主要标志物的每一种标志物的水平以及一种或多种被排除的标志物的每一种标志物的水平，从而产生各主要标志物以及一种或多种被排除的标志物的加权得分，和
(ii)将各主要标志物以及一种或多种被排除的标志物的加权得分结合，从而产生SLE风险得分。
指数＝-5.2626+0.9877×ANA.成分+[0.2955×log(EC4d)+1.0260×log(BC4d)]-2.4944x特异性成分
在此类实施方案中，针对(EC4d)和(BC4d)测量平均荧光强度(例如流式细胞仪的输出)，并取对数。“ANA20”是指阳性率；高于ANA单位的阈值数/ml样品，ANA20＝1；低于单位的阈值数/ml样品，ANA20＝0。如本领域那些技术人员所理解的那样，用于测定标志物作为“阳性”或非阳性的“阈值”在制造商/检测的彼此之间是不同的，但是本领域的那些技术人员可以容易地测定。“被排除的”如下测定：如果对于任何“被排除的”标志物而言，所述的检测为阳性，则ANA20为1；以及如果对于所有“被排除的”标志物而言，所述的检测为阴性，则ANA20为0。
在一个实施方案中，SLE风险得分可以通过以下方法计算：
(a)针对EC4d和BC4d测定净平均荧光强度(通过荧光激活细胞分选术(FACS)测定)的自然对数；
(b)根据预定的阈值(例如通过试剂盒制造商或最终用户测定的阈值)来测定ANA是否为阴性(值为0)、中阳性(值为1)或强阳性(值为2)；
(c)测定任何被排除的标志物是否落入上述预定阈值并因此为阳性(值为1)，或者被排除的标志物是否均未落入上述预定阈值并因此均为阴性(值为0)；以及
(d)将(a)-(c)中测定的值结合，从而得到SLE风险得分，可任选地包括通过一种或多种转化分析来调节一种或多种标志物的水平。
在另一个实施方案中，测定BC4d标志物的水平包括测定B淋巴细胞表面上BC4d的水平，并且测定EC4d标志物的水平包括测定红细胞表面上EC4d的水平。例如测定BC4d标志物的水平可以包括测定细胞或包含B淋巴细胞的组织提取物中BC4d的水平，并且测定EC4d标志物的水平可以包括测定细胞或包含红细胞的组织提取物中EC4d的水平。在其他的实施方案中，使用C4d特异性抗体(例如本领域已知的那些)来测定BC4d标志物的水平和EC4d标志物的水平。
本发明提供了用于诊断和治疗处于患有系统性红斑狼疮(SLE)风险之下的受试对象的改善的方法，其中所述的受试对象根据初始评估(使用单个标志物的水平)而显示为阴性的。
所述的受试对象优选为人类受试对象(成人或儿童)。SLE为自身免疫疾病，其可表征为血液中产生不常见的自身抗体。这些自身抗体与它们各自的抗原结合，形成免疫复合物，该免疫复合物循环并最终沉积在组织中。处于SLE风险之下的受试对象可以具有多种症状，包括但不限于不适、发烧、慢性炎症、组织损伤；高于脸颊的颧骨的红斑或“蝴蝶”红斑；盘状皮肤红斑：可以导致结疤的斑片状发红；光敏感：对暴露日光产生反应的皮肤红斑；粘膜溃疡：口腔、鼻或喉咙内膜的溃疡；关节炎：手和足的2处或多处肿胀的压痛关节；胸膜炎/心包炎：心脏或肺周围的内膜组织的炎症，与呼吸有关的胸痛；肾脏异常：异常量的尿蛋白或成堆的细胞基本组分(称为管型)；脑刺激：通过癫痫(惊厥)和/或精神病表明；血细胞计数异常；免疫紊乱；以及梅毒的假阳性血液检验。
如本文所用，“生物样品”得自受试对象的肌体。可以使用得自受试对象的任何合适的生物样品。特别适用于本发明的方法的样品为血液样品、活组织检查样品，包括但不限于肾活组织检查样品。在一个实施方案中，血清学标志物(例如ANA,CENP,Jo-1,La/SS-B和SCl-70标志物)得自血液样品，而EC4d,PC4d,ECR1和/或BC4d标志物为沉积在循环血细胞上的那些。
优选的是使用EDTA(乙二胺四乙酸盐)处理血液样品，从而抑制补体激活。样品可以保持在室温或储存在4℃下。在一些实施方案中，全血样品可以分级成不同的成分。例如在一个实施方案中，通过差式离心将红细胞与样品中的其他类型的细胞分离。与红细胞结合的补体激活产物(例如EC4d和ECR1)的分析可以在分离的红细胞上实施。在一些实施方案中，白细胞与血液样品的其他成分分离。例如可以通过离心将白细胞(白细胞层)可以与血浆分离并且与红细胞分离。可以通过使用针对已知的细胞表面标志物的抗体来分离各种类型的白细胞(例如淋巴细胞、单核细胞等)，其中所述的标志物是该类型细胞特异性的。针对白细胞的细胞表面标志物的抗体是本领域那些技术人员已知的。例如细胞表面标志物CD3,CD4,CD8和CD19的特异性单克隆抗体是市售可得的，并且可以用于选择淋巴细胞。对在白细胞表面上发现的补体激活产物(例如BC4d)的分析可以在白细胞的分离级份中实施。血小板级份可以得自其他的血液成分，从而可以分析与血小板结合的补体激活产生，流入PC4d。可以使用本领域已知的方法来进行血小板的分离，包括差式离心和使用血小板特异性抗体的免疫沉淀(例如CD42b)。
可以使用本领域那些技术人员已知的多种方法来测量样品中特定生物标志物的水平(例如定量或数量)。此类方法包括但不限于流式细胞仪、ELISA(使用红细胞、血小板或白细胞溶解产物(例如淋巴细胞溶解产物))和放射性免疫测试。在一个实施方案中，使用流式细胞计数方法并使用各种分子特异性的多克隆或单克隆抗体通过直接或间接免疫荧光进行的测量来测定C4d的水平，这些分子的每一种分子都可以使用分离的样品(例如红细胞、白细胞或血小板特异性级份)或使用单一样品(例如全血)来测量。
如本文所用，“转化分析”可以为任何合适的操作，包括但不限于广义模型(例如逻辑回归、广义相加模型)，多变量分析(例如判别分析、主成分分析、因子分析)，以及时间-事件“生存”分析。
如本领域那些技术人员根据本文的教导所理解的那样，加权系数可以通过多种技术测定并可以广泛改变。在测定合适的加权系数的一个实例中，使用在2组患者中发现的标志物水平来进行多变量逻辑回归(MLR)，其中所述的2组患者中，一组患者患有SLE，一组未患有SLE。对于MLR可以使用的变量(标志物)选择，具有多种方法，因此，未选择的标志物由模型中删除，而测定保留在模型中的各预示性标志物的加权系数。然后，这些加权系数可以例如乘以样品中的标志物水平(以任何合适的单位表示，包括但不限于有限重量/体积、重量/重量、重量/细胞压积数等)，然后例如求和，从而计算SLE风险得分。
在一个非限定性的实施方案中，构成指数得分的一些成分(例如ANA和被排除的标志物)可以与预定的阈值/临界值有关(例如ANA成分可以具有0、1或2的值；被消除的标志物可以具有0或1的值)。在此类方案中，根据ANA或被排除的标志物在阈值决定极限下的分析误差，所述的指数可以潜在地由正值变为负值(或者反之亦然)。因此，在一些实施方案中，当使用阈值/临界值(例如ANA和/或被排除的标志物)来评估用于测定指数得分的成分时，可以定义所述指数的“模棱两可的结果”，并且在阈值的20％或更低内(因此能够潜在地影响指数的阳性率或阴性率)。在这种实施方案中，所述的得分可以注释为模棱两可的。
如本文所用，“结合”包括结合使用标志物的任何数学操作，从而得到可以与阈值相比较的单一得分(加、减、除、乘和它们的组合)。在这些模型中，可以使用合适的加权系数来调节标志物的水平。
所述的方法可以使用测量SLE风险得分与标准SLE风险得分之间的比较。可以使用用于比较的任何合适的标准，包括但不限于由正常个体或患有SLE的受试对象群体得到的SLE风险得分的预定水平或范围，或者包围所述的相反情况。如本文所用，“预定的水平”或“预定的范围”是指值或值的范围，其可以由在对照受试对象(即，健康受试对象)群体或受到自身免疫疾病(例如SLE或非SLE自身免疫紊乱)折磨的受试对象群体中测量的特定SLE分析得分的定量或数量(例如绝对值或浓度)来测定。可以通过计算可以取得最大的统计学意义的SLE风险得分的值或值范围来选择SLE风险得分的预定水平或预定范围。在一些实施方案中，预定值的水平可以基于由对照/正常受试对象群体得到的SLE风险得分的变化。例如预定水平可以为高于正常SLE风险得分范围的至少2、3、4或5标准偏差。此外，还可以通过计算SLE风险得分(对于该得分而言，SLE风险得分在该水平或范围内的超过50％,60％,70％,75％,80％,85％,90％或95％的患者患有SLE)的水平或范围来测定SLE风险得分的预定水平或预定范围。
如本文所用，“诊断(分词形式)/诊断(名词形式)”是指确认SLE的存在或本性。诊断方法在它们的敏感性和特异性方面不同。诊断检测的“敏感性”为检验阳性的患病个体的百分率(“真阳性”的百分率)。所述的检测未能检测到的患病个体为“假阴性”。未患病的并且在检测中为检验阴性的受试对象被称为“真阴性”。诊断检测的“特异性”为1减去假阳性率，其中“假阳性”率定义为检验为阳性的未患病的那些群体。尽管特定的诊断方法未能提供一种状况的决定性诊断，但是如果该方法提供了有助于诊断的明确指示，便足够了。
至少部分根据SLE风险得分来“治疗”受试对象的SLE或另一种疾病是指主治医师或其他医学专业人士根据被认为合适的方法随后治疗那些被确认为可能患有SLE(根据他们的风险得分)的受试对象。此类治疗可以包括但不限于免疫抑制剂(例如环磷酰胺、皮质甾类等)和/或缓解疾病的抗风湿性药物(DMARD，例如甲氨蝶呤、咪唑硫嘌呤、来氟米特、Belimumab和抗疟药(例如必赖克瘘锭和羟化氯喹))。缓解疾病的抗风湿性药物(DMARD)预防性地用于降低耀斑的发生率、疾病的进展以及降低对甾类化合物使用的需要；当耀斑形成时，使用皮质甾类治疗它们。
本文所述的本发明所有方面的方法可以人工实施，或者可以与自动化系统或计算机联合使用。例如可以使用自动化系统来实施所述的方法，其中分析受试对象的血液样品从而对特定的生物标志物的水平作出一个或多个测定，并且通过适用于该目的的软件自动化地实施预定水平或预定范围的比较。用于本发明的方法的计算机软件或计算机可读介质包括这样的计算机可读介质，其包括：(a)用于接收与测定沉积在红细胞或淋巴细胞(例如B细胞)表面上的补体成分C4d相应的数据的编码，和用于接收与ANA,SS-B(La)标志物,Scl-70标志物,Jo-1标志物,CENP标志物和/或抗dsDNA抗体(例如生物样品中的此类样品)的量相应的数据的编码；(b)用于检索沉积在个体此类细胞表面上的补体成分C4d的预定水平的编码，和用于检索ANA,SS-B(La)标志物,Scl-70标志物,Jo-1标志物,CENP标志物和/或抗dsDNA抗体(例如此类样品)的预定水平的编码；以及(c)用于比较(a)中的数据与(b)中的预定水平的编码，从而测定是否可以作出精确的SLE诊断或者是否需要额外测量其他的生物标志物。
在本发明的某些实施方案中，生物标志物水平的一个或多个预定的水平或预定的范围可以存储在与数字计算机有关的存储器中。在获得与补体C4d,ANA,SS-B(La)标志物,Scl-70标志物,Jo-1标志物,CENP标志物和/或抗dsDNA抗体(例如此类样品)相应的数据后(例如得自合适的分析仪器)，该数字计算机可以将测量的生物标志物数据与一个或多个合适的预定水平或预定范围比较。在进行比较之后，如果数据表明了SLE诊断，则该数字计算机可以自动化地计算。
因此，本发明的一些实施方案可以通过数字计算机执行的计算机编码体现。数字计算机可以为使用任何标准的或专用操作系统(例如基于Windows的操作系统)的微型、迷你或大帧计算机。所述的编码可以存储在任何合适的计算机可读介质上。计算机可读介质的实例包括磁盘、电子盘、光盘、磁带、记忆棒、芯片等。此外，本领域的那些普通技术人员还可以以任何合适的计算机程序语言(包括C,C++等)编写编码。
因此，本发明进一步包括非临时性的计算机可读存储介质，其包括使得用于测量样品中标志物水平的装置实施本发明的任何方面或实施方案的方法的一组指令。在另一个方面中，本发明提供了在计算机上提供用于自动化地实施本发明的方法的非临时性计算机可读存储介质，其中所述的计算机与用于测量样品(例如血液样品)中所述标志物水平的装置连接。如本文所用，术语“计算机可读介质”包括磁盘、光盘、有机物存储器、以及CPU可读的任何其他的易失性(例如随机存储存储器(“RAM”))或易失性(例如只读存储器(“ROM”))海量存储系统。计算机可读介质包括协作的或相互连接的计算机可读介质，其专门存在于处理系统上，或者分布于多重相互连接的处理系统(可以位于或远离于处理系统)中。可以使用用于测量标志物水平的任何合适的装置，包括但不限于流式细胞仪装置和用于实施ELISA的装置。
此外，本发明还提供了用于诊断SLE的检验试剂盒和组合。在一个实施方案中，本发明包括用于诊断SLE的检验组合，其包括以下检验的至少3种(即，3、4或所有5种)：用于EC4d水平的第一检验；用于BC4d水平的第二检验；用于SS-B(La)标志物、Scl-70标志物、Jo-1标志物和CENP标志物的一种或多种(1、2、3或所有4种)的水平的第三检验；ANA水平的第四检验；以及抗dsDNA抗体水平的第五检验。用于测定特定生物标志物水平的试剂盒或检验包括用于根据本文所述的方法来实施测量的多种试剂。例如在一个实施方案中，所述的试剂盒或检验包括针对各种生物标志物实施免疫荧光测试的试剂，例如对一种或多种标志物(对所述的靶物具有特异性)具有特异性的单克隆抗体与荧光部分的缀合物。此外，所述的试剂盒可以包括：在实施此类型检测时可能需要的此类其他的材料，例如缓冲剂、放射性标记的抗体、比色剂的试剂、用于将不同细胞级份与全血分离的指令、以及基于生物标志物的特定预定水平来诊断SLE的指令。
在另一个实施方案中，所述的试剂盒或检验包括针对各种生物标志物来实施其他标准检测(例如ELISA或放射免疫检测)的试剂。在此类实施方案中，所述的试剂盒或检验包括对所述的靶物具有特异性的单克隆抗体或其他标志物，其中所述的靶物与合适的标签(例如放射性碘、亲和素、生物素或酶，例如过氧化物酶)缀合。所述的试剂盒可以额外包括缓冲剂，用于抗体缀合的酶的底物，用于将不同的细胞级份与全血分离的指令、以及基于生物标志物的特定预定水平来诊断SLE的指令。
应该理解的是本文所述的实例和实施方案仅是为了说明的目的，并且根据它们的各种修改或改变对于本领域的技术人员是启示性的，并且包含在本申请的精神和范围以及所附权利要求的范围内。本文所述的所有参考文献、出版物、专利和专利申请对于所有目的而言以引用方式全文并入本文。
实施例
引言
系统性红斑狼疮(SLE)为慢性自身免疫疾病，从而导致自身抗体介导的组织损伤及潜在地威胁生命的多器官衰竭(1)。在美国，这种混杂的炎性疾病影响了161,000至322,000的成人，其中受影响的女性为男性的9倍以上(2)。此外，在非裔美国人和西班牙人中，患病率比高加索人更高，并且社会人口学背景预示为预后不良(3)。SLE的表现是多样的，包括红斑、关节炎、贫血、血小板减少、浆膜炎、肾炎、癫痫和精神病。由于这些症状是混杂的、非特异性的、发展性的，并且通常模仿了其他疾病的那些情况，所以SLE的诊断是复杂的，并且可以成为医生的挑战。诊断SLE依赖于患者的病史、当前的症状和试验室检验的组合。尽管1982年出版的修订版的American College of Rheumatology标准(4)需要存在11个标准中的4个标准，从而将患者分类为患有SLE，但是在临床实践中使用这些标准并非是始终如一的(5)。在标准的试验室检验中，常用于支持SLE诊断的标准试验室检验主要为抗核抗体(ANA)和抗双链DNA(抗dsDNA)抗体(6)。但是，ANA和抗dsDNA抗体具有局限，并且这些血清型标志物均不能提供足够平衡的敏感性和/或诊断SLE的特异性。公认的是补体激活对SLE发病机理的核心(7)，并且沉积在红细胞和B淋巴细胞上的细胞结合C4d片段可以促进SLE的诊断(8-11)。此外，多个报道已经确定CB-CAP对疾病活性的潜在贡献(12；13)，并且它们的测量可以帮助治疗医生管理SLE患者。
我们之前在大规模多中心横向研究中确定了CB-CAP对SLE诊断的贡献(14)，并且我们的数据证明过多的C4d补体沉积在红细胞、B细胞和血小板上，而且备选地，在SLE中红细胞上降低的CR1的表达通常与其他疾病具有几倍的差异(14)。然而，在SLE和其他风湿性疾病之间观察到这些标志物的表达具有明显的重叠，由此表明单独的CB-CAP均不能独立地获得足够平衡的临床敏感性和特异性(15)。在该研究中，抗dsDNA是不敏感的(29.5％)但却特异性的标志物(>95％)，而ANA是敏感的，但却是特异性差的标志物。我们依赖于抗dsDNA抗体的高特异性(低的假阳性率)来评价CB-CAPANA和抗MCV的递增值。在抗dsDNA阴性个体中，逐步加入对数归一化的EC4d和BC4d标志物会显著增加敏感性，同时保持足够的特异性。抗MCV进一步增加的特异性的增益依赖于类风湿性关节炎(RA)(不具有抗MCRRA的针对RA的特异性为87.7％，具有抗MCF的对抗RA的特异性为97.4％)并且能够选择更佳的临界值，从而增加总体SLE敏感性。将ANA、EC4d、BC4d的加权总和与抗MCV结合的指数得分(>0)对SLE是敏感的(71.6％)和特异性的(90.1％)。总之，抗DNA与指数得分结合将单独的抗DNA的临床敏感性由29.5％改善至80％。临床敏感性上的这种50.5％的改善大幅地超过了特异性由96.1％至86.5％的9.6％的损失。此外，当与结合的抗dsDNA和ANA相比时，抗dsDNA的指数使得特异性改善30.3％(59.0％与89.3％)，敏感性仅损失10.0％(89.0％与79.0％)。
然而，在我们的诊断方法的特异性是高度针对患有RA的患者的同时，针对其他疾病(包括硬皮病、皮肌炎、脉管炎和Sjogren综合征)的特异性明显低于75％，因此潜在地限制了临床实践中我们诊断方法的值。
方法
临床草案和验证计划
在2010年5月至8月(组1)和2011年6月至2013年9月(组2)招募的2组受试对象中建立多变量指数的性能特征。
研究设计和计划
2个独立的研究(组1和2)为多中心横向研究，并且需要一次对受试对象的随访。无需定期随访来评价诊断方法学的性能特征。在获得受试对象的知情同意书后，实施以下过程：
·获得受试对象与任何和所有风湿性疾病状况的诊断有关的病史，并针对与这些状况的诊断有关的纳入/排除标准和细节回顾所述的病史；
·针对SLE和其他风湿性疾病疾病的状况来记录诊断的数据，并将满足特定的SLE诊断标准的归档(修订版的ACR Criteria for the Classification of SLE)((Tan etal.,1982；Hochberg,1997)；
·将受试对象的人口特征归档(出生日期，性别，种族/种族特点)；
·就分娩可能性而言，通过试纸对所有女性实施尿妊辰试验；
·获得大约15mL患者血液用于分析CB-CAPS(EC4d和BC4d)、ANA、抗dsDNA、抗MCV和ENA抗体；在禁食或未禁食的状况下获得血液样品。所述的样品由1个7.5ml EDTA管(紫色帽)和1个SST管(红虎(red tiger)帽)，其需要在运送前离心。所有生物样品都通过过夜传递由研究位点运送至Exagen Diagnostics(使用所提供的运输试剂盒)。由于CB-CAPS应该在收集样品的48小时内分析(参见预分析变量项目ID 25945)，周日不接收样品；因此仅由周一至周六招募受试对象(周四运送的截止时间为10:00a.m.)。
·获得血液，并将其由该位点运送至Exagen Diagnostics(San Diego的基础设施)。为了使分析试验室保持盲态，公开受试对象的诊断的CRF和任何受试对象的信息都被传真至Exagen临床项目管理者，而用于分析的血液样品直接送至分析试验室，并附有完整的受试对象特定的申请表。在实施研究的过程中，研究者不可获得这些检验结果。样本仅通过受试对象编号和姓名的首字母确认，并且分析试验室对受试对象特定的诊断保持是盲态的。仅临床成员在整个研究中具有接近患者诊断的权限。
·分离、洗涤红细胞和B淋巴细胞，使用C4d特异性的单克隆和/或多克隆抗体对红细胞和B淋巴细胞进行免疫荧光标记，并使用我们临床试验室批准的检测通过流式细胞仪进行分析。使用平均荧光强度作为各种细胞表面标志物表达水平的指示物；使用FDA批准的固相免疫检测测量dsDNA、ANA、抗MCV和ENA抗体作为体内诊断。除了抗MCV，使用制造商的临界值用于所有的ELISA。
研究群体的选择
纳入标准：
·能够阅读、理解和签署知情同意书
·≥18岁
·同意并能够收集血液样品
·具有风湿性疾病状况的受试对象必须落入以下2类中的一类
·根据修订版的ACR Criteria for the Classification of SLE来诊断SLE
表1示出了SLE的分类标准
表1：SLE的ACR标准
·11个标准中4个或更多个标准的任意组合，在患者经历的过程中的任何时间都良好地归档，患者可能患有SLE。
·被诊断患有以下风湿性疾病的一种：抗磷脂综合征(APS)；纤维肌痛(仅ANA+患者)；系统性硬化病；类风湿性关节炎；多肌炎；皮肌炎；Wegeners肉芽肿；结节性多动脉炎；冷球蛋白血症性血管炎；白细胞破裂性脉管炎；其他免疫血管炎；原发性Sjogren综合征。
·此外，招募大约200名正常健康志愿者(称为排除标准)。
排除标准：
·仅对于正常健康志愿者：根据临床研究者的判断，临床明显的并发发病包括心血管的，精神病学的，神经病学的，胃肠的(例如胃或十二指肠溃疡、炎性肠病、GI出血史)，代谢性的，肺部的(例如哮喘、COPD)，肾(包括肾功能不全)，肝脏的，血液学的，免疫学的，内分泌的(例如甲状腺机能减退、糖尿病)，主动感染或慢性感染病史(B或C型肝炎或者HIV)，肿瘤病和/或减肥手术史。
·原发性免疫缺陷综合征的明显或试验室证明。
·怀孕的或泌乳的妇女。
试验过程
总计800名受试对象的数据计划用于2组受试对象中，其中所述的800名受试对象由大约300名SLE、300名非SLE风湿性疾病和200名健康对照组成，它们由美国大约15个参与中心聚集而成。参与中心被鼓励招募相等熟练的SLE受试对象和其他风湿性疾病状况的受试对象，从而保证样品平衡。由各受试对象抽取血液，用于CB-CAPS和其他血清学标志物。
提交给申办者的所有数据和血液样品都通过使用受试对象的ID编号而严格地保持匿名的。各中心均分配到2个数字场所编号，并且各中心都分配给二次ID编号。各中心负责保存研究编号列表和在他们的位点处的相关的受试对象名称。任何支持文件都除去所有受试对象的标识符，并且所有血液样品仅通过受试对象ID编码和试验确认。此外，申办者的临床试验对于所有受试对象的诊断都是盲态的。
统计分析
使用2.15.0版本的R软件来进行统计分析。统计分析使用了受试者操作特征(ROC)曲线下面积(SLE与非SLE患者，其排除了正常受试对象)并计算诊断敏感性和特异性。对于各标志物使用合适的受试者操作曲线(单变量分析)，此外还跟踪测定的指数值作为多变量逻辑回归方程式的输出。作为性能的量度，计算敏感性和特异性。使用弃一交叉验证法来计算所报告的性能统计(敏感性、特异性)ROCAUC。
临床性能
总计304名SLE患者(285名患者患有其他风湿性疾病，87.8％为女性，平均年龄为48岁)适用于分析。患有其他风湿性疾病的285名患者组包括RA(161名患者，85％为女性，平均年龄为59岁)，系统性硬化病(35名患者，80％为女性，平均年龄为53岁)，多肌炎/皮肌炎(PM/DM：27名患者，81％为女性，平均年龄为56岁)，原发性Sjogren综合征(33名患者，94％为女性，平均年龄为56岁)，以及29名患有多种其他风湿性疾病的患者(83％为女性，平均年龄为55岁)(肉芽肿性血管炎[5名患者]，纤维肌痛[13名患者]，脉管炎[10名患者]，抗磷脂综合征[1名患者])。此外，还招募总计205名的健康个体(66……为女性，平均年龄为41岁)。
表2：2组中患者的分布
304名患者的特征示于表3中。
表3：所招募的304名SLE患者的特征
在SLE诊断方法中使用标志物的单变量分析
在所有招募的受试对象(n＝794)中测定血清学标志物(ANA,抗dsDNA,抗MCV,SS-B/La,CENP,Scl-70,Smith)和CB-CAPS。ANA(≥20个单位)为敏感性标志物(91.7％，279名SLE患者检验为阳性)，而针对其他的风湿性疾病则很大程度上是非特异性的(52.3％)(表4)。
在304名SLE患者中，通过固相检测，总计101名SLE患者检验为抗dsDNA阳性(33.2％)，并且使用绿蝇短膜虫(Crithidia Luciliae)间接免疫荧光检测(INOVO诊断学)证明97个检验结果证明为阳性，因此最终的敏感性为31.9％(97/304)。总计11名非SLE受试对象(6名RA，2名硬皮病、2名脉管炎和1名正常)通过ELISA检验为抗dsDNA阳性(>301个单位)，但是其中的3名受试对象(2名RA和1名硬皮病)通过Crithidia检验证明为非阳性，因此针对其他疾病的特异性为97.2％(277/285)，针对正常健康个体为99.5％(204/205)。抗Smith具有较差的敏感性(14％)，但是为SLE的高度特异性标志物(100％)。备选地，抗MCV(临界值为70个单位)、SS-B/La(>10个单位)、SCl-70(>10个单位)和Jo-1(>10个单位)分别是类风湿性关节炎、Sjogren、硬皮病和PM/DM患者特异性的(表4)。
表4：通过单变量分析得到的标志物性能
*Scl:硬皮病
如表5中所示，SLE中EC4d和BC4d的水平比其他疾病或正常受试对象高几倍。EC4d水平高于75个单位或者BC4d水平高于200个单位是SLE高度特异性的。仅患有其他疾病的2/285受试对象(一名受试对象患有RA，一名受试对象患有脉管炎)分别呈现出EC4d或BC4d水平高于75或200个单位(特异性99.3％)。备选地，总计48名SLE患者(16％)呈现出升高的EC4d或BC4d。
此外，EC4d水平高于12MFI在区分NHV与SLE中达到97％的特异性，而BC4d水平高于48个单位是96％特异性的。
表5：EC4d和BC4d的水平
*Scl:硬皮病；结果表示为平均值±平均值的标准误差
多变量指数检测-数据的分析后降低
所用的诊断方法使用了双层法。在层1中，抗dsDNA(>301个单位；通过短膜虫证明)、抗Smith(>10个单位；制造商的临界值，SLE的标准)或高的EC4d(>75个单位)或BC4d(>200个单位)表明SLE。在层1为阴性的受试对象中进行测定的层2中，加权指数得分累积了ANA成分(ANA≥20个单位，≥60个单位)，CBCAPS成分(对数归一化的EC4d+BC4d)，和特异性成分，该特异性成分由抗MCV(>70个单位；RA标志物)、SS-/La(>10个单位；Sjogren疾病标志物)、CENP/Scl-70(>10个单位；硬皮病标志物)或Jo-1(>10个单位；多肌炎/皮肌炎)组成。指数>0表明SLE，双层结合得到整体的性能特征。图1概括了所用的双层诊断方法。
层1的性能特征
在所招募的794名受试对象中，其中总计150名受试对象检验为层1标志物的至少一种是阳性的(dsDNA>301个单位，通过短膜虫证明；或者抗Sm>10个单位；EC4d>75个单位；或者BC4d>200个单位)。在这150名受试对象中，其中的140名受试对象患有SLE(敏感性为46.1％，140/304)，而其中的9名受试对象患有其他的风湿性疾病(5RA，1名系统性硬化病，2名脉管炎，1名APS，以及1名正常)(特异性为96.8％,276/285)。区分正常健康受试对象的特异性为99.5％(204/205)(表6)。
表6：层1的阳性率
在层1中为阳性的140名SLE患者中，其中总计48名患者(34.3％)检验为EC4d(>75个单位)或BC4d(>200个单位)阳性。由此断定通过逻辑回归，在层2中分析了总计645名受试对象(165名SLE，276名其他疾病，以及在层1中检验为阴性的204名正常健康者)。
层2的性能特征
在SLE(n＝165)和其他疾病(n＝111)的患者中，逻辑回归分析利用了ANA阳性(通过ELISA，ANA成分)，以及逻辑归一化的EC4d和BC4d水平(CBCAPS成分)和抗MCV(>70个单位)、SS-B/La(>10个单位)、CENP(>10个单位)、Scl-70(>10个单位)或Jo-1(>10个单位)阳性的抗体特异性成分复合物。
多变量逻辑回归的ANA成分使用了2个阈值。其由阴性ANA(ANA<20个单位；在此情况下，ANA成分受影响的值为0)、中阳性(ANA20-60个单位；在此情况下，ANA成分受影响的值为1)和强阳性(>60个单位；在此情况下，ANA成分受影响的值为2)组成。与患有其他疾病的受试对象相比(111/276名受试对象，阳性率为40.2％)，SLE中抗体特异性成分的阳性率为9.1％(15/164阳性)。在层2中，仅3名正常受试对象是特异性成分阳性的。
表7：在层2中，在受试对象中特异性成分的阳性率
表8突出了层2中多变量逻辑回归的估值。使用SLE和非SLE受试对象(排除了正常的健康个体)来计算估值。
表8：逻辑回归估值
与逻辑回归模型的输出相应的指数方程式如下：
层1阴性患者中的方程式1指数方程式
ANA成分：如果ANA<20个单位；ANA成分受影响的值为0；如果ANA为中阳性(ANA为20-60个单位)，则ANA成分受影响的值为1.如果ANA为强阳性(≥60个单位)，则ANA成分受影响的值为2；
特异性成分(Spec.Comp)：如果特异性成分的所有标志物部分(抗MCV>70个单位；SS-B/La>10个单位；CENP>10个单位；Scl-70>10个单位；或者Jo-1>10个单位)低于它们各自的临界值，则输入结果为0；相反，如果特异性成分的任何标志物高于它们各自的临界值，则输入结果为1。Log相当于EC4d和BC4d的净MFI的自然对数。
指数计算的实例示于表9中。
表9：指数计算
在其他疾病中，指数得分为-1.74(中值)(IQ范围：-2.54.；-0.90)，在SLE中指数得分为0.47(中值)(IQ范围：-0.64；1.79)(图2)。在NHV中，指数得分为-1.46(中值)(IQ范围：-1.17；-1.86)，表10突出了在SLE和对照组(非SLE和NHV)中观察到的中值指数。敏感性为63.6％，针对其他疾病的特异性为88.8％(245/276)，针对正常健康受试对象的特异性为97.5％(199/204)。临界值设定为-2.5个单位得到SLE的敏感性为98.7％，其他风湿性疾病的特异性为24.9％(正常健康者的特异性为5.8％)。备选地，临界值设定为+2.5个单位得到SLE的敏感性为50.0％，其他风湿性疾病的特异性为96.1％(正常健康者的特异性为100％)。
表10：层2中的指数值
整体性能特征—2层结合的
层1与指数得分(只用临界值0)的组合产生了针对SLE的80.3％(244/304)的敏感性，以及在区分SLE与其他风湿性疾病中产生85.5％(236/276)的特异性。区分SLE与健康受试对象的特异性为97.1％(199/205)。双层分析结合的结果示于表11中。
表11：结合的双层方法的整体性能
向基础模型中逐步加入CACAPS和特异性成分
此外，将双层方法的性能特征与未使用CBCAPs(EC4d和BC4d)和特异性成分(“基础模型”)而获得的性能特征比较。基础模型由双层分析、以及层1中的抗dsDNA和抗Sm和层2中的ANA成分组成。CBCAPS和特异性成分的逐步加入示于表12中。如表13所示，加入CBCAPS和特异性成分会改善性能特征和基础模型，并且产生AUC为0.894，并且区分SLE与其他疾病的敏感性为80％、特异性为86％。抗体特异性成分使RA、原发性Sjogren综合征、PM/DM和系统性硬皮病的诊断方法的特异性最大。区分正常受试对象与SLE的特异性对于基础模型而言为90.2％，对于使用CBCAPS的模型而言为94.1％，对于全模型而言为97.1％。
表12：模型比较
表13：逐步加入CBCAPS和特异性成分
使用之前的方法进行组群分析和比较
2个组群之间的敏感性差异(组1＝81％与组2＝79％)不具有统计学意义(p＝0.652)(总体敏感性＝80％)。此外，区分LSE与其他疾病的特异性差异不具有统计学意义(组1＝87％与组2＝84％；p＝0.485)(总体特异性＝86％)。此外，我们还比较了当前双层方法的性能特征与由当前检测得到的性能特征(表14)。加入结缔组织疾病特异性的血清型标志物(SS-B/La，Scl-70，CENP，Jo-1)将诊断方法的特异性由64％改善至79％(组合数据库：p＝0.024)。
表14：性能特征的比较
指数的分析可重复性
此外，在由11名SLE患者得到的总计19份样品中测定指数的逐日的可重复性。对于具有多指数测定的患者而言，每隔一周收集血液。这些患者并非为临床验证研究的一部分(组1和组2)。在连续3天中连续3次测定ANA、CBCAPS和抗体特异性成分的复合指数。表15突出了日间的变化性。
表15：指数的分析变化性
中值标准偏差为0.12(范围为0.03至0.26)。
模棱两可的结果的定义
根据模棱两可的ANA和特异性成分的模棱两可的指数结果
由于构成指数得分的3种成分的2种成分(ANA和抗体特异性成分)与临界值(ANA成分的值可以为0、1或2；抗体特异性成分的值可以为0或1)有关，所以在ANA(20个单位；60个单位)或形成特异性成分的各种标志物(抗CV[70个单位]；SS-B/La[10个单位],CENP[10个单位],Jo-1[10个单位]或Scl-70[10个单位])的医学决定极限下根据分析误差所述的指数可以潜在地由阳性变为阴性(或者反之亦然)。例如表16中所示，在10个单位的决定极限下，根据2个单位的SS-B/La差异(9与11个单位)，所述的指数可以由-1.0(情况2，SS-B/La＝9个单位；特异性成分＝0)变成+1.5(情况1，SS-B/La＝11个单位；特异性成分＝1)。
表16：标志物水平对指数得分的影响
由此断定当ANA和/或形成特异性成分的标志物接近临界值时(并由此能够潜在地影响指数的阳性或阴性)，必须定义指数的模棱两可的结果。当ANA的水平范围为16至24个单位(在20个单位的临界值下，为20％CV)或者48至72个单位(在60个单位的临界值下，为20％CV)时，我们定义了模棱两可的ANA成分。备选地，当抗MCV水平范围为56至84个单位(在70个单位的临界值下，为20％CV)时或者当SSB-La,CENP,SCl-70和Jo-1的范围为8至12个单位(在10个单位的临界值下，为20％CV)时，我们定义了模棱两可的抗体特异性成分。
如表17所示，指数值由阳性变成阴性还强烈地取决于指数方程式中的CBCAPS成分。建立根据指数模棱两可的结果的决定规则。在所招募的794名受试对象中，其中总计39名受试对象(4.9％)呈现出模棱两可的结果。
表17：CBCAPS成分对模棱两可的定义的影响
方法
FACS测量
使用批准的FACS检测来测量沉积在红细胞(EC4d)和B淋巴细胞(BC4d)上的C4d。
EC4d：使用Dulbecco磷酸盐缓冲盐水洗涤全血(50μl)，离心5分钟(800g)并使用500μl1％正常山羊血清溶液将红细胞团再次悬浮(Jackson ImmunoresearchLaboratories,West Grove,PA)。随后，使用对抗人类C4d的纯化的小鼠单克隆抗体(小鼠抗人C4d，Quidel inc,San Diego)染色10μl红细胞悬液，或者备选地使用非特异性小鼠抗人IgG1κ抗体在4℃下将所述的红细胞悬液染色45分钟。然后，如上所述洗涤样品。将红细胞团在4℃下(在黑暗中)在溶液(25μl)中再次悬浮45分钟，其中所述的溶液包含与异硫氰酸荧光素(FITC,Jackson ImmunoResearch Laboratories,West Grove,PA)缀合的山羊抗小鼠抗体。染色后，使用250μL冷的1％正常山羊血清溶液洗涤和再次悬浮红细胞，经历FACS分析用于检测沉积在细胞表面上的C4d。
BC4d水平：在使用氯化铵基试剂(BD Pharm Lyse,BD Bioscience,San Jose,CA)溶解由全血(700μl)得到的红细胞并离心(在800g下5分钟)后，将细胞团再次悬浮于500μl1％正常山羊血清溶液，并使用单克隆C4d抗体染色(在2-8℃下，45分钟)，如上文所述。随后，使用上文所述的对抗人C4d的纯化的小鼠单克隆抗体或非特异性小鼠抗人IgG1κ抗体在4℃下将25μl细胞悬液染色45分钟。使用山羊抗小鼠异硫氰酸荧光素(FITC)抗体检测细胞表面C4d染色(在2-8℃下，45分钟，在黑暗中)。使用对抗人CD-19(CD-19与B细胞分化和成熟的所有阶段过程中表达的95kDa I型跨膜糖蛋白反应，其与R-藻红蛋白(R-PE)缀合)的单克隆抗体来检测B淋巴细胞特异性的C4d补体激活衍生片段。
所有的FACS分析均使用Beckman Coulter FC500血细胞计数仪和CXP软件(Beckman coulter,Brea CA)。获得同种型背景的对照和各种补体蛋白质(C4d)的平均荧光强度(MFI)，然后通过特异性MFI结果减去非特异性MFI来测定净MFI。使用由44名风湿性疾病患者得到的血液在低、中和高强度下建立日间EC4d水平变化的(连续5天)中值系数，并且对于EC4d而言，范围为3.3至9.6％。在患有风湿性疾病的34名患者中，在低、中和高强度下日间BC4D变化的系数范围为5.3至12.1％。在所有的FACS试验中，包括建立流式细胞仪的合适的校准、补偿和线性的对照。
对ANA、dsDNA和抗MCV的ELISA测量
使用酶联免疫吸附检测(ELISA)来测量ANA、抗dsDNA和抗突变的瓜氨酸波形蛋白抗体[抗MCV,抗瓜氨酸肽抗体](16)。所用的所有ELISA方法都被the US Food and DrugAdministration确认为安全且有效地用于体外诊断用途中。ANA和抗dsDNA得自INOVADiagnostics(INOVA,San Diego,CA)，而个MCV得自Orgentec Diagnostika,Germany。在我们的临床试验中建立用于所有方法的日内和日间的变化系数，并且其低于20％。对于所有的ELISA试验而言，包括合适的阳性和阴性对照。
用于CENP,Jo-1,La/SS-B,Ro/SS-A,SCl-70,Smith的氟代酶免疫检测测量
使用EliAIgG方法在Phadia 250仪器(ThermoFisher,Uppsala,Sweden)上在血清或血浆中定性测量SS-A/Ro(60kDa,52kDa),SS-B/La,着丝粒B(CENP),Scl-70(抗拓扑异构酶I),Jo-1和Smith抗核IgG抗体。对于各种分析物而言，使用制造商建议的临界值。在我们的临床试验中，对于所有分析物而言，分析再现性和可重复性低于20％。
统计分析
使用2.15.0版R软件来进行统计分析。根据需要对各种标志物使用受试者操作曲线(单变量分析)，而且还跟踪测定的指数值作为多变量逻辑回归方程式的输出。作为性能的量度，计算敏感性和特异性(1-假阳性率)。使用k折交叉验证(k＝10)来计算所报告的性能统计(敏感性、特异性、ROCAUC)，重复10次(所报告的结果为平均值)。此外，使用3种其他的验证方法来计算性能特征(数据未示出)，它们都与所报告的性能特征具有极其相似的结果。3种其他的验证方法为弃一交叉验证，分离样品验证的平均值(3分之2用于训练，3分之1用于验证)，和表观验证(也称为重新代入)。在适当的情况下，通过疾病分层来生成验证组((书)Clinical Prediction Models:A Practical Approach to Development,Validation and Updating.Ewout W.Steyerberg.2009)。
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Claims (7)

1.(a)结合红细胞C4d和B细胞C4d标志物的C4d抗体、(b)结合抗核抗体的荧光试剂、以及(c)结合选自由SS-B(La)、Scl-70、Jo-1和CENP组成的组的一种或多种被排除的标志物的抗体在制备用于在受试对象中诊断系统性红斑狼疮可能性的产品中的用途，其中所述诊断包括：
在由处于患有系统性红斑狼疮风险之下的受试对象得到的生物样品中，根据红细胞C4d标志物、B细胞C4d标志物、抗核抗体和一种或多种被排除的标志物的每一种标志物的水平来计算系统性红斑狼疮风险得分，其中，根据红细胞C4d标志物、B细胞C4d标志物、抗Smith(抗Sm)抗体，和双链DNA抗体(抗dsDNA)中的每一个的各自水平，所述受试对象为系统性红斑狼疮阴性：
其中所述的系统性红斑狼疮风险得分是通过以下方法计算的：
(i)测定净平均荧光强度的自然对数，其中所述的荧光强度是通过荧光激活细胞分选术(FACS)针对红细胞C4d和B细胞C4d而测定的；
(ii)根据预定的阈值来测定抗核抗体是否为阴性、中阳性或强阳性，其中阴性的值为0，中阳性的值为1，且强阳性的值为2；
(iii)测定任何所述的被排除的标志物是否落入上述预定阈值并因此为阳性，或者所述的被排除的标志物是否均未落入上述预定阈值并因此均为阴性，其中阳性的值为1且阴性的值为0；以及
(iv)将(i)-(iii)中测定的值结合，从而得到所述的系统性红斑狼疮风险得分；
其中风险得分>0表明了所述的受试对象患有系统性红斑狼疮的可能性。
2.权利要求1所述的用途，其中所述的诊断包括测定所述的被排除的标志物的2种或多种标志物的水平。
3.权利要求1所述的用途，其中所述的诊断包括测定所述的被排除的标志物的3种或多种标志物的水平。
4.权利要求1所述的用途，其中所述的诊断包括测定所有4种所述的被排除的标志物的水平。
5.权利要求1-4的任意一项所述的用途，所述一种或多种被排除的标志物进一步包括突变的瓜氨酸波形蛋白。
6.权利要求1-4的任意一项所述的用途，其中计算所述的系统性红斑狼疮风险得分包括通过一种或多种转化分析来调节一种或多种所述的标志物的水平。
7.权利要求6所述的用途，其中所述的一种或多种转化分析包括逻辑回归分析，并且其中所述的逻辑回归分析包括：
(i)调节所述的标志物的每一种标志物的水平，从而产生各标志物的加权得分，和
(ii)将所述的各标志物的加权得分结合，从而产生所述的系统性红斑狼疮风险得分。
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