CN105200059A - 靶向抑制小鼠UCP2基因表达的siRNA及其表达载体的构建 - Google Patents

Abstract

本发明涉及靶向抑制小鼠神经干细胞UCP2基因表达的RNA干扰重组慢病毒载体及其构建，是构建了针对小鼠神经干细胞UCP2基因的重组慢病毒载体pNL-EGFP/CMV/WPREdU3-sh？mUCP2，再以所述重组慢病毒载体联合第二代慢病毒包装质粒pCD/NL-BH*DDD和膜蛋白表达质粒pLTR-G共转染293T细胞，获得所述包装的重组慢病毒载体。以本发明获得的重组慢病毒载体转染小鼠原代神经干细胞，能高效特异性抑制小鼠神经干细胞UCP2基因表达，为有关小鼠UCP2基因的进一步功能研究奠定良好的实验基础。

Description

靶向抑制小鼠UCP2基因表达的siRNA及其表达载体的构建

技术领域

本发明属于生物工程技术领域，涉及一种针对小鼠神经干细胞UCP2基因的RNAi重组慢病毒表达载体，以及该表达载体的构建。本发明所述重组慢病毒可应用于神经管畸形发病机制的研究中。

背景技术

神经管畸形(NeuralTubeDefects，NTDs)是指以中枢神经系统为主要发病部位的先天性出生缺陷疾病，我国山西省发病率最高，统计结果高达19.9‰。NTDs的高发现象，成为全球许多国家和地区婴儿终生残疾与死亡的主要原因。

神经管的关闭过程受到基因的严格控制以及环境因素调节。根据申请者近年的研究结果以及文献检索，解偶联蛋白2(uncouplingprotein2，UCP2)与神经管畸形的关系在人群调查研究中已经得出了初步相关结论，提示UCP2基因为NTDs的候选基因。基于上述结论，申请者欲利用小鼠神经干细胞(更接近于早期胚胎神经管细胞)证明UCP2与NTDs发生之间的联系，及探索其引起神经管畸形的机制。神经干细胞是一种利用常规方法难于转染的细胞，因此急需利用一种转染效率更高的方法来满足后续实验的研究。上述技术平台的建立，将提供一个UCP2基因功能研究模型，并在后续机制研究中发挥重要作用。但目前对于小鼠神经干细胞UCP2基因的siRNA还未见研究报道。

RNA干扰(RNAi)是利用双链RNA高效、特异的阻断体内特定基因表达，促使目的基因mRNA降解而发生基因沉默的过程。RNAi在起始阶段，以各种方式(电转、病毒感染等)引入的双链RNA(dsRNA)被Dicer酶逐步切割为21～23nt的小分子干扰RNA片段(siRNA)。siRNA双链与核酶复合物结合形成RNA诱导沉默复合物(RISC)，RISC中siRNA变性，正义链脱离，反义链仍结合在复合物上并引导RISC与同源靶目标RNA结合，诱导靶mRNA降解，从而阻断基因表达。siRNA还可以作为一种特殊的引物，在RNA依赖的RNA聚合酶作用下，以靶mRNA为模板合成dsRNA分子，后者又可以进入上述循环。新生的dsRNA反复合成与降解，不断形成新的siRNA，使靶mRNA不断减少，导致目的基因沉默，呈现RNAi现象。

siRNA是RNA干扰的主要效应物。至今哺乳动物细胞RNAi技术路线可以通过两种方式进行：1)直接制备21～23nt的siRNA片段，将siRNA转入哺乳动物细胞。2)将短发夹结构RNA(shRNA)的DNA表达载体转入细胞，表达产生shRNA，经过Dicer切割后得到siRNA。前者不适于长时间的研究项目，而后者可持续较长时间，有利于后续的实验开展。

RNAi抑制基因表达作用在很大程度上受到转染方式、转染效率的限制，解决问题的关键是选择合适的载体导入细胞。目前siRNA的导入方式有三种，1)化学合成siRNAs转染干扰，2)shRNA表达载体法，3)病毒载体法。前两种方法感染效率低，尤其是针对脂质体干扰效果差的细胞，如神经干细胞。

慢病毒载体是以HIV-1为基础发展起来的基因治疗载体，其对分裂细胞和非分裂细胞均具有感染能力，目前被广泛应用于表达RNAi的研究中。与质粒载体及其他病毒载体相比，慢病毒介导的RNA干扰具有高效、稳定、特异性强的特点。

发明内容

本发明的目的是提供一种靶向抑制小鼠神经干细胞UCP2基因表达的siRNA。

本发明的另一目的是提供一种靶向抑制小鼠神经干细胞UCP2基因表达的RNA干扰重组慢病毒载体，以有效抑制小鼠原代神经干细胞中UCP2基因的表达。

本发明所述靶向抑制小鼠神经干细胞UCP2基因表达的siRNA具有SeqIDNo.1所示的核苷酸序列，记为LVT818。

本发明根据上述设计的siRNA序列，合成了两条编码shRNA的DNA模板单链，所述编码shRNA的DNA模板单链分别为具有SeqIDNo.2所示核苷酸序列的正义链和具有SeqIDNo.3所示核苷酸序列的反义链，由5’黏末端+19nt靶序列+茎环结构+靶序列互补序列+转录终止位点+3’黏末端结构构成。

LVT818-1(正义链)：

5’-CcggCCTAATGGCTGCCTACCAAcTCAAGAGATTGGTAGGCAGCCATTAGGTTTTTTg-3’。

LVT818-2(反义链)：

5’-aattcaaaaaaCCTAATGGCTGCCTACCAATCTCTTGAgTTGGTAGGCAGCCATTAGG-3’。

本发明还提供了包含所述shRNA的RNA干扰重组慢病毒载体，是在自身失活的第二代慢病毒载体pMagic4.1的多克隆位点连接所述shRNA后构建的载体pNL-EGFP/CMV/WPREdU3-shmUCP2。

具体的构建方法是将所述编码shRNA的DNA单链退火形成双链DNA片段，连接到pMagic4.1慢病毒载体(上海sbo-bio公司)的多克隆位点中，构建重组慢病毒载体pNL-EGFP/CMV/WPREdU3-shmUCP2，再以所述重组慢病毒载体联合第二代慢病毒包装质粒pCD/NL-BH*DDD和膜蛋白表达质粒pLTR-G(均购自Addgene)共转染293T细胞，获得所述包装的重组慢病毒载体。

其中，所述构建方法中，是在所述DNA片段的末端引入与AgeI和EcoRI酶切载体位点相连接的黏末端，并以AgeI和EcoRI酶切pMagic4.1载体，回收大片段与所述双链DNA片段连接后转化感受态菌，挑取重组阳性克隆。

本发明所构建的RNA干扰重组慢病毒载体可以应用于抑制小鼠神经干细胞UCP2基因表达上，以有效抑制神经干细胞中UCP2基因表达。

本发明提供了一种能够特异性沉默小鼠UCP2基因的siRNA序列，通过体外转染实验证实，该序列能够有效抑制小鼠原代神经干细胞中的UCP2基因表达。本发明进一步构建了能够稳定表达上述siRNA序列的重组慢病毒载体，并在293T细胞中生产出具有高感染率的该重组慢病毒。通过体内感染实验，该高效稳定表达UCP2基因shRNA序列的重组慢病毒能够明显抑制原代神经干细胞的UCP2基因表达。上述研究结果为进一步研究UCP2基因在神经管畸形发生过程中的作用提供了细胞模型。

本发明采用的pMagic4.1载体含有U6启动子，能够在宿主细胞中持续表达有干扰作用的小RNA。同时，该质粒能够表达由CMV启动子驱动的荧光蛋白EGFP，方便病毒包装时转染效率，以及感染宿主细胞时感染效率的检测。本发明采用的第二代慢病毒包装质粒pCD/NL-BH*DDD和膜蛋白表达质粒pLTR-G提供了病毒包装所需的酶和蛋白。将以上载体共转染293T细胞，能够高效组装自身失活的慢病毒载体。使用辅助质粒包装病毒无需感染性的腺病毒，而且只使用两个质粒就提高了转染效率和载体的产出。

与化学合成的siRNA和基于瞬时表达载体构建的shRNA相比，利用慢病毒构建的shRNA载体具有以下优点：一方面可以扩增替代瞬时表达载体使用，转入靶细胞后可以插入宿主细胞基因组中并稳定表达，不会导致插入失活；另一方面，该病毒载体可用于感染传统转染试剂难于转染的非分裂细胞系如原代神经干细胞，并且在感染后可以整合到受感染细胞的基因组，进行长时间的稳定表达，而前期其他传统形式的转染实验都无法达到预期目标。本发明将目的基因整合至靶细胞基因组长时程表达、免疫反应小，是一种比较理想的用于导入神经干细胞，用于UCP2基因在神经干细胞中沉默的干扰载体。

本发明利用失活慢病毒载体携带UCP2RNA干扰片段的DNA模板，其在体内转录成shRNA，完美的解决了RNA干扰的靶向性、安全性以及表达持续性的问题。

附图说明

图1是pMagic4.1慢病毒载体的结构示意图。

图2是病毒感染神经干细胞的荧光显微镜观测结果。

图3是病毒感染神经干细胞72h后对小鼠UCP2基因mRNA表达干扰的效果图。

图4是病毒感染神经干细胞72h后对小鼠UCP2基因的蛋白Western-blot检测结果。

图5是病毒感染神经干细胞72h后对小鼠UCP2基因的蛋白Western-blot检测结果灰度值扫描。

具体实施方式

以下结合附图和实施例对本发明作进一步的详细描述。

实施例1：设计靶向抑制小鼠UCP2基因表达的siRNA序列。

根据小鼠神经干细胞UCP2基因的mRNA序列（NM_011671），设计一组针对mUCP2基因表达的siRNA序列及对照siRNA序列，并从中筛选出一个干扰效果最佳的siRNA序列，命名为LVT818。

具体的siRNA序列如下，其中LVT818为有效干扰片段组，LVT4为阴性对照组。

LVT818：5’-CCTAATGGCTGCCTACCAA-3’；GC52.6%。

LVT4：5’-TTCTCCGAACGTGTCACGT-3’；GC52.6%。

实施例2：寡核苷酸的设计及合成。

以上述实施例1设计的siRNA序列设计合成shRNA的正义链和反义链。所述shRNA中的Loop结构选用了“cTCAAGAGA”和“TCTCTTGAg”，并分别在5’端加上AgeI和EcoRI酶切位点黏末端，由Invitrogen公司合成序列，具体的shRNA序列如下。

LVT818-1（正义链）：

5’-CcggCCTAATGGCTGCCTACCAAcTCAAGAGATTGGTAGGCAGCCATTAGGTTTTTTg-3’。

LVT818-2（反义链）：

5’-aattcaaaaaaCCTAATGGCTGCCTACCAATCTCTTGAgTTGGTAGGCAGCCATTAGG-3’。

LVT4-1（正义链）：

5’-CcggTTCTCCGAACGTGTCACGTTTCAAGAGAACGTGACACGTTCGGAGAATTTTTg-3’。

LVT4-2（反义链）：

5’-aattcaaaaaTTCTCCGAACGTGTCACGTTCTCTTGAAACGTGACACGTTCGGAGAA-3’。

将上述合成好的shRNA序列用oligoannealingbuffer溶解成20μM后，互补单链各取30μl混合，95℃水浴加热5分钟，自然冷至室温，形成双链oligo片段。取1μl所述退火产物用于后续的连接反应，其余-20℃保存。

实施例3：靶向抑制小鼠UCP2基因表达的干扰慢病毒载体的构建。

慢病毒载体pMagic4.1的结构示意图如图1。该载体含有U6启动子，能够在宿主细胞中持续启动下游基因表达，及持续表达有干扰作用的小RNA。该载体还含有CMV启动子，能够驱动荧光蛋白EGFP的表达，方便转染效率及感染效率的检测。

以AgeI和EcoRI双酶切慢病毒载体pMagic4.1使其线性化，胶纯化回收后，用T4连接酶与实施例2的退火产物16℃连接过夜，转化感受态菌，挑取重组阳性克隆，经转化筛选之后，送Invitrogen公司进行测序鉴定。

（阳性克隆测序结果）

ATAGAAAATATTTGACTGTAACACAAAGATATTAGTACAAAATACGTGACGTAGAAAGTAATAATTTCTTGGGTAGTTTGCAGTTTTAAAATTATGTTTTAAAATGGACTATCATATGCTTACCGTAACTTGAAAGTATTTCGATTTCTTGGCTTTATATATCTTGTGGAAAGGACGAAACA CCGGCCTAATGGCTGCCTACCAACTCAAGAGATTGGTAGGCAGCCATTAGGTTTTTTG AATTCGGATCCATTAGGCGGCCGCGTGGATAACCGTATTACCGCCATGCATTAGTTATTAATAGTAATCAATTACGGGGTCATTAGTTCATAGCCCATATATGGAGTTCCGCGTTACATAACTTACGGTAAATGGCCCGCCTGGCTGACCGCCCAACGACCCCCGCCCATTGACGTCAATAATGACGTATGTTCCCATAGTAACGCCAATAGGGACTTTCCATTGACGTCAATGGGTGGAGTATTTACGGTAAACTGCCCACTTGGCAGTACATCAAGTGTATCATATGCCAAGTACGCCCCCTATTGACGTCAATGACGGTAAATGGCCCGCCTGGCATTATGCCCAGTACATGACCTTATGGGACTTTCCTACTTGGCAGTACATCTACGTATTAGTCATCGCTATTACCATGGTGATGCGGTTTTGGCAGTACATCAATGGGCGTGGATAGCGGTTTGACTCACGGGGATTTCCAAGTCTCCACCCCATTGACGTCAATGGGAGTTTGTTTTGGCACCAAAATCAACGGGACTTTCCAAAATGTCGTAACAACTCCGCCCCATTGACGCAAATGGGCGGTAGGCGTGTACGGTGGGAGGTCTATATAAGCAGAGCTGGTTTAGTGAACCGTCAGATCCGCTAGCGCTACCGGACGCCACCATGGTGAGCAAAGGGCGAGGAGCTGTTCACCGGGGTGGTGCCCATCCTGGTCGAGCTGGACGGCGACGTAACGGCCACAAGTTCAGCGTGTCCGGCGAGGGCGAGGGCGATGCCACCTACGGCAAGCTGACCCTGAAGTTCATCTGCACACGGGCAAGCTGCCCGTGCCCTGACCACCCTCGTGACCACCCTGACTACGGCGGTGCAGTGCTTCAGCCGCTACCCGACACATGAGCAGCACGACTTCTCAGTCGCATGCCCGAAGCTACGTCCAGGGAGCGCACCATCTTCTTCAGGACGACGGCCAACATACAGAACCGCGCTCAAGGTGAAGCTCCAAGGTCCCAACACCTGGGTGAACCGCCACTCTAGACGCTGAAGGGGGCACTCG。

（对照克隆测序结果）

TCGGGCCGGTTAGAGAGATAATTGGAATTAATTTGACTGTAAACACAAAGATATTAGTACAAAATACGTGACGTAGAAAGTAATAATTTCTTGGGTAGTTTGCAGTTTTAAAATTATGTTTTAAAATGGACTATCATATGCTTACCGTAACTTGAAAGTATTTCGATTTCTTGGCTTTATATATCTTGTGGAAAGGACGAAACA CCGGTTCTCCGAACGTGTCACGTTTCAAGAGAACGTGACACGTTCGGAGAATTTTTG AATTCGGATCCATTAGGCGGCCGCGTGGATAACCGTATTACCGCCATGCATTAGTTATTAATAGTAATCAATTACGGGGTCATTAGTTCATAGCCCATATATGGAGTTCCGCGTTACATAACTTACGGTAAATGGCCCGCCTGGCTGACCGCCCAACGACCCCCGCCCATTGACGTCAATAATGACGTATGTTCCCATAGTAACGCCAATAGGGACTTTCCATTGACGTCAATGGGTGGAGTATTTACGGTAAACTGCCCACTTGGCAGTACATCAAGTGTATCATATGCCAAGTACGCCCCCTATTGACGTCAATGACGGTAAATGGCCCGCCTGGCATTATGCCCAGTACATGACCTTATGGGACTTTCCTACTTGGCAGTACATCTACGTATTAGTCATCGCTATTACCATGGTGATGCGGTTTTGGCAGTACATCAATGGGCGTGGATAGCGGTTTGACTCACGGGGATTTCCAAGTCTCCACCCCATTGACGTCAATGGGAGTTTGTTTTGGCACCAAAATCAACGGGACTTTCCAAAATGTCGTAACAACTCCGCCCCATTGACGCAAATGGGCGGTAGGCGTGTACGGTGGGAGGTCTATATAAGCAGAGCTGGTTTACTGAACTGTCAGATCCCGCTAGCGCTACAGACGACACCATGATGAGCCATGGCGAGGAGCTGATCACCGGGGTGTGCCCATCCTGTCTGACTGACTGCTACTAAACTGTCGACCACGTTCAGCGTGTCGGTCAGGCACAGGCGATGCCCTCCTACCGCTATGCTGACCCTGAG。

测序结果显示与设计的序列完全相同，获得的正确克隆即为构建成功的靶向抑制小鼠UCP2基因表达的干扰慢病毒载体，命名为pNL-EGFP/CMV/WPREdU3-shmUCP2。

实施例4：重组干扰慢病毒载体的包装及滴度测定。

取实施例3制备的高纯度重组慢病毒载体pNL-EGFP/CMV/WPREdU3-shmUCP2，联合第二代慢病毒包装质粒pCD/NL-BH*DDD和膜蛋白表达质粒pLTR-G(均购自Addgene)共转染293T细胞，具体操作步骤按照Invitrogen公司Lipofectamine2000使用说明进行。

预先准备2个T10cm培养皿的293T细胞，培养基为DMEM+10%FBS，1%Glutamax，1%青霉素-链霉素。将细胞分到10个10cm培养皿中，每瓶细胞密度约10⁷个。第二天镜下检查细胞，细胞融合度大致为80～90%，分布均匀。

转染前1小时，取出细胞板，去除原有细胞培养基，加入9mlOpti-MEM培养基，将细胞送回培养箱。

取两支无菌的15ml离心管，一支中加入100μgpNL-EGFP/CMV/WPREdU3-shmUCP2重组慢病毒载体，65μgpCD/NL-BH*DDD慢病毒包装质粒和35μgpLTR-G膜蛋白表达质粒，用Opti-MEM培养基补齐到5ml；另一支中加入500μlTrans-EZ溶液和4.5mlOpti-MEM培养基，用电动移液器轻轻混匀。

将Trans-EZ稀释液滴加到质粒管中，边加边轻轻晃匀，室温孵育20分钟，使DNA和Trans-EZ充分结合形成转染复合体。

取1支5ml移液管，将得到的DNA-Trans-EZ复合体均匀滴加到细胞培养板中，每板1ml。来回晃动培养板，混匀后放回到5%二氧化碳培养箱，6小时后移去细胞上清，更换为10ml的DMEM完全培养基。转染后一天观察细胞，可以看到大于95%的细胞都带有荧光。将细胞送回培养箱继续培养2天，收集所有上清，4℃、4000g离心10分钟，除去细胞碎片后，以0.45μM滤器过滤上清液，获得包装的重组慢病毒载体。

将所述包装的重组慢病毒载体浓缩纯化后，得到高滴度的慢病毒载体浓缩液，分装后-80°C长期保存，并取其中一支进行病毒生物学滴度测定。

实施例5：靶细胞侵染试验及基因表达抑制效果分析。

1、以重组干扰慢病毒载体侵染小鼠神经干细胞。

1）选取状态良好的小鼠神经干细胞，吸管柔和吹打使细胞分散，离心收集，用细胞培养液重悬后细胞计数，调节细胞浓度为3×10⁴～5×10⁴个/ml，按90μl/孔加入到24孔板里，放置培养箱里培养24小时。

2）制备MOI值为40的重组干扰慢病毒载体稀释病毒液，吸去96孔板中的培养液，每孔加入100μl稀释病毒液，同时设立无效干扰片段病毒载体稀释液和空病毒载体稀释液，分别作为阴性对照和空白对照。

3）24小时后去除含有病毒的培养液，加入新的培养液继续培养，72小时后在倒置荧光显微镜下通过观察GFP表达判断转染效率。图2是病毒感染神经干细胞荧光的显微镜下观测结果，由于pMAGic4.1载体上含有绿色荧光蛋白基因，可以看到神经干细胞90%以上的细胞均被病毒载体感染，感染效率较高。收集细胞样品，所得细胞用于Real-timePCR(实时定量PCR)及Westernblot(蛋白印迹)检测。

2、侵染后神经干细胞的RT-QPCR检测。

病毒感染神经干细胞72小时后，收集被感染细胞，常规Trizol法提取细胞RNA，逆转录获取cDNA，其中M-MLV逆转录酶和dNTP购自PROMEGA公司，OligodT购自上海生工，具体步骤根据Promega公司的M-MLV操作说明书进行。

1）将1.0μlOligodT(0.5μg/μl)和2.0μg总RNA加入到PCR小管中，补充DEPC-H₂O至9μl，混匀后离心，70℃温浴10min。之后立即插入到0℃冰水浴中，使OligodT和模板退火。

2）按下表比例，根据反应管数算出所需试剂量。将M-MLV酶等在冰上混匀，得到RT反应液。

3）在每个反应管中加入11μlRT反应液，混匀后离心。

4）RT反应在42℃进行1小时后完成，之后70℃处理10min，使RT酶失活。

5）得到的RT反应产物cDNA用于PCR。

6）Real-timePCR检测。

以β-actin基因作为内参，采用实时荧光定量PCR检测：

（1）引物序列如下：

（2）按下列比例配置反应体系：

（3）设定程序为两步法Real-time定量，95℃预变性15S，之后每一步95℃变性5S，60℃退火延伸30S，共45个循环。每次在延伸阶段读取吸光值。

结果表明，所设计的特异性干扰片段能有效抑制UCP2基因表达，被感染小鼠神经干细胞UCP2表达量仅为对照的21%，即干扰率为79%，具体结果如表1和图3所示，其中pLVT4为转染了空病毒对照的细胞组(阴性对照)，pLVT818为转染了pLVT818靶点病毒上清的细胞组。

图3是以重组干扰慢病毒载体感染小鼠神经干细胞72h后，对小鼠UCP2基因mRNA表达干扰的效果图。图中，空病毒组为转染了空病毒的对照组(空白对照)，pLVT4为转染了pLVT4病毒对照的细胞组(阴性对照)，pLVT818为转染了pLVT818靶点病毒上清的细胞组(阳性组)。可见被感染的小鼠神经干细胞UCP2基因mRNA表达量仅为空白对照的21%，即干扰率为79%。

3、Western-blot检测。

本次实验中的抗体信息。

病毒转染后72小时，提取各实验组细胞总蛋白，Westernblot检测，UCP2和β-actin的灰度比值显示，抑制率为75%，说明该质粒抑制UCP2的效率较高，如图4、5所示。

图4是病毒感染神经干细胞72h后对UCP2基因蛋白Western-blot检测结果，图中1为空病毒对照组，2、3为pLVT4病毒干扰阴性对照组，4为pLVT818病毒干扰组，可见第4组蛋白表达条带明显减少。

图5是病毒感染神经干细胞72h后对小鼠UCP2基因蛋白Western-blot检测结果的灰度值扫描。图中1为空病毒对照组，2、3为无效干扰组，4为pLVT818病毒干扰组。灰度扫描显示，第4组表达干扰达75%。

上述图3、4、5均可以说明，pLVT818病毒干扰组可以明显降低神经干细胞中UCP2的表达，pLVT818为有效干扰片段。

SEQUENCELISTING

<110>山西医科大学

<120>靶向抑制小鼠UCP2基因表达的siRNA及其表达载体的构建

<160>3

<170>Patentinversion3.2

<210>1

<211>21

<212>RNA

<213>人工序列

<223>靶向抑制小鼠神经干细胞UCP2基因表达的siRNA

<400>1

CCTAATGGCTGCCTACCAA19

<210>2

<211>58

<212>RNA

<213>人工序列

<223>靶向抑制小鼠神经干细胞UCP2基因表达的shRNA序列的正义链

<400>2

CCGGCCTAATGGCTGCCTACCAACTCAAGAGATTGGTAGGCAGCCATTAGGTTTTTTG58

<210>3

<211>58

<212>RNA

<213>人工序列

<223>靶向抑制小鼠神经干细胞UCP2基因表达的shRNA序列的反义链

<400>3

AATTCAAAAAACCTAATGGCTGCCTACCAATCTCTTGAGTTGGTAGGCAGCCATTAGG58

Claims (7)

1.一种靶向抑制小鼠神经干细胞UCP2基因表达的siRNA，所述siRNA具有SeqIDNo.1所示的核苷酸序列。

2.一种编码shRNA的DNA，所述shRNA是含有权利要求1所述siRNA的正义链或反义链的shRNA。

3.一种靶向抑制小鼠神经干细胞UCP2基因表达的RNA干扰重组慢病毒载体，是在自身失活的第二代慢病毒载体pMagic4.1的多克隆位点连接权利要求2所述shRNA后构建的载体pNL-EGFP/CMV/WPREdU3-shmUCP2。

4.权利要求3所述RNA干扰重组慢病毒载体的构建方法，是将所述编码shRNA的DNA单链退火形成双链DNA片段，连接到pMagic4.1载体的多克隆位点中，构建重组慢病毒载体pNL-EGFP/CMV/WPREdU3-shmUCP2，再以所述重组慢病毒载体联合第二代慢病毒包装质粒pCD/NL-BH*DDD和膜蛋白表达质粒pLTR-G共转染293T细胞，获得所述包装的重组慢病毒载体。

5.根据权利要求4所述的RNA干扰重组慢病毒载体的构建方法，是在所述DNA片段的末端引入与AgeI和EcoRI酶切载体位点相连接的黏末端。

6.根据权利要求4所述的RNA干扰重组慢病毒载体的构建方法，是以AgeI和EcoRI酶切pMagic4.1载体，回收大片段与所述双链DNA片段连接后转化感受态菌，挑取重组阳性克隆。

7.权利要求3所述RNA干扰重组慢病毒载体在抑制小鼠神经干细胞UCP2基因表达上的应用。