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CN105189786A - 用作治疗癌症的疗法的靶标的falz - Google Patents

用作治疗癌症的疗法的靶标的falz Download PDF

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CN105189786A CN201480026088.2A CN201480026088A CN105189786A CN 105189786 A CN105189786 A CN 105189786A CN 201480026088 A CN201480026088 A CN 201480026088A CN 105189786 A CN105189786 A CN 105189786A
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Abstract

本公开提供了基于BPTF的表达水平预测和/或确定受试者是否患有癌症的方法。本公开还提供了基于在两个时间点之间BPTF的表达水平的变化确定受试者的癌症是正在进展还是正在消退的方法。本公开进一步提供了治疗患有癌症的受试者的方法，所述方法是通过施用包括抑制性BPTF核酸的多核苷酸和/或抑制BPTF的表达或活性的药剂来实现的。

Description

用作治疗癌症的疗法的靶标的FALZ
相关申请的交叉引用
本申请按照美国法典第35篇第119条要求2013年3月15日提交的临时申请序列号61/790,153的优先权，该临时申请的公开内容以引用的方式并入本文。
政府许可权
本发明是在政府支持下根据美国国家卫生研究院(NationalInstitutesofHealth)和美国国家癌症研究所(NationalCancerInstitute)授予的基金号CA114337和CA122947作出的。政府对本发明具有一定的权利。
技术领域
本公开提供了基于测量FALZ的表达水平的癌症诊断、受试者存活率、和/或癌症进展的方法。本公开进一步提供了一种通过抑制FALZ活性和/或表达来治疗患有癌症的受试者的方法。
背景技术
包括组蛋白的翻译后修饰、DNA甲基化、组蛋白变体的掺入、以及核小体重塑在内的表观遗传学机制已经发展到调节染色质的结构以及涉及DNA。
发明内容
BPTF(布罗莫结构域(bromodomain)PHD指转录因子；也被称为FALZ(胎儿阿尔茨海默氏病抗原(fetalAlzheimerantigen)))是在致瘤性转化中的确切作用尚不明确的基因。本公开证实了FALZ表达是原发性黑色素瘤的一种独立的预后标志物，并且可以代表一种对在黑色素瘤中的靶向疗法的响应的预测性生物标志物。此外，shRNA介导的对FALZ的抑制在体外和/或体内使得黑色素瘤细胞、成胶质细胞瘤细胞、以及乳腺癌细胞的生长显著减少，这表明了在黑色素瘤以及其它实体肿瘤的疗法中靶向FALZ的潜在治疗效用。
本公开提供了一种癌症预后的方法，所述方法包括：(i)从受试者获得生物样品；(ii)测量所述受试者的样品中BPTF的水平；(iii)将所述受试者的样品中BPTF的水平与来自一种或多种对照生物样品的BPTF的平均水平相比较；(iv)基于与所述对照中BPTF的平均水平相比，具有更低(或更高)的BPTF水平，提供所述受试者可能患有癌症的预后。在一个实施方案中，所述癌症选自由黑色素瘤、乳腺癌以及脑癌组成的组。在另一个实施方案中，所述受试者的生物样品来自于组织活检。在又另一个实施方案中，所述一种或多种对照生物样品来自于良性痣的组织活检。在另一个实施方案中，所述对照生物样品包括来自所述受试者的样品。在再另一个实施方案中，所述对照生物样品包括并非来自所述受试者的样品。在一个实施方案中，本公开使用分别与BPTF多肽或BPTF多核苷酸特异性结合的标记的抗体或核酸片段。
本公开提供了一种确定受试者是否患有癌症的方法，所述方法包括：(i)从受试者获得生物样品；(ii)测量所述受试者的样品中BPTF的水平；(iii)将所述受试者的样品中BPTF的水平与来自一种或多种对照生物样品的BPTF的平均水平相比较；以及(iv)基于与所述对照中BPTF的平均水平相比，具有显著更低(或更高)的BPTF水平，确定所述受试者是否患有癌症。在一个实施方案中，所述癌症选自由黑色素瘤、乳腺癌以及脑癌组成的组。在另一个实施方案中，所述受试者的生物样品来自于组织活检。在又另一个实施方案中，所述一种或多种对照生物样品来自于良性痣的组织活检。在另一个实施方案中，所述对照生物样品包括来自所述受试者的样品。在又另一个实施方案中，所述对照生物样品包括并非来自所述受试者的样品。在一个实施方案中，本公开使用分别与BPTF多肽或BPTF多核苷酸特异性结合的标记的抗体或核酸片段。
本公开提供了一种确定受试者的癌症是正在进展还是处在缓解期的方法，所述方法包括：(i)在第一时间点从受试者获得生物样品；(ii)测量来自所述第一时间点的所述受试者的样品中BPTF的水平；(iii)在第二时间点从受试者获得生物样品；(iv)测量来自所述第二时间点的所述受试者的样品中BPTF的水平；(v)将来自所述第一时间点的BPTF水平与来自所述第二时间点的水平相比较；以及(vi)基于来自这两个时间点的BPTF水平的变化，确定癌症是正在进展还是处在恢复期，其中在所述第一时间点与所述第二时间点之间BPTF水平升高则表明所述癌症处在缓解期，并且其中在所述第一时间点与所述第二时间点之间BPTF水平升高则表明所述癌症正在进展。在一个实施方案中，所述癌症选自由黑色素瘤、乳腺癌以及脑癌组成的组。在另一个实施方案中，所述生物样品来自于组织活检。在又另一个实施方案中，所述方法包括在获得所述第一样品之后向所述受试者施用抗癌治疗剂。在又另一个实施方案中，所述方法包括如果所述BPTF水平升高，那么向所述受试者施用BPTF抑制剂。在一个实施方案中，本公开使用分别与BPTF多肽或BPTF多核苷酸特异性结合的标记的抗体或核酸片段。
本公开提供了一种提供患有癌症的受试者的存活率预后的方法，所述方法包括：(i)在第一时间点从受试者获得生物样品；(ii)测量来自所述第一时间点的所述受试者的样品中BPTF的水平；(iii)在第二时间点从受试者获得生物样品；(iv)测量来自所述第二时间点的所述受试者的样品中BPTF的水平；(v)将来自所述第一时间点的BPTF水平与来自所述第二时间点的水平相比较；以及(vi)基于来自这两个时间点的BPTF水平的变化，提供所述受试者的存活率的预后，其中在所述第一时间点与所述第二时间点之间BPTF的水平升高则表明所述受试者的存活率不良，并且其中在所述第一时间点与所述第二时间点之间BPTF的水平降低则表明所述受试者的存活率较好。在一个实施方案中，所述癌症选自由黑色素瘤、乳腺癌以及脑癌组成的组。在另一个实施方案中，所述生物样品来自于组织活检。在一个实施方案中，本公开使用分别与BPTF多肽或BPTF多核苷酸特异性结合的标记的抗体或核酸片段。
本公开还提供了一种治疗受试者的癌症的方法，所述方法包括：通过施用有效量的抑制性BPTF核酸和/或有效量的抑制BPTF表达的药剂来抑制BPTF的表达。在一个实施方案中，所述癌症选自由黑色素瘤、多形性成胶质细胞瘤以及乳腺癌组成的组。在另一个实施方案中，抑制BPTF的表达使得对癌细胞的增殖或迁移进行抑制或阻止。在又另一个实施方案中，所述方法与一种或多种另外的抗癌治疗剂组合使用。在另一个实施方案中，所述一种或多种另外的治疗剂选自由以下各项组成的组：铂类似物、烷化剂、烷基磺酸盐、雄激素、抗肾上腺剂、抗雄激素剂、抗生素、抗雌激素剂、芳香酶抑制性4(5)-咪唑、抗代谢物、叶酸类似物、乙烯亚胺以及甲基三聚氰胺(methylamelamines)、叶酸补充剂、氮芥(nitrogenmustard)、亚硝基脲、嘌呤类似物、嘧啶类似物、拓扑异构酶抑制剂、胸苷酸合酶抑制剂、抗癌抗体、化学治疗剂、脱甲基化剂、以及靶向治疗剂。在又另一个实施方案中，所述方法包括向所述受试者施用包含抑制性BPTF核酸的载体。在又另一个实施方案中，所述载体包括表达载体。在再另一个实施方案中，所述载体包括复制型逆转录病毒载体。
本公开还提供了一种组合物，所述组合物包含BPTF抑制剂和第一线抗癌治疗剂。
本公开提供了在附图和以下说明中所阐述的一个或多个实施方案。根据所述说明和附图以及权利要求书，本发明的其它特征、目的以及优势将是显而易见的。
附图说明
图1A-F示出了shRNA介导的对Bptf表达的抑制对鼠类黑色素瘤的作用。A)在B16-F10鼠类黑色素瘤细胞中由两种不同的shRNA在mRNA水平上使Bptf表达下调。B)在Bptf基因敲低之后对细胞增殖的抑制。C-D)Bptf基因敲低显著地抑制了体内肿瘤细胞生长和转移性肺肿瘤负荷。E-F)在Bptf基因敲低之后在mRNA水平和蛋白质水平上对CCND2表达和BCL-XL表达的抑制。
图2A-G示出了抑制BPTF表达对人类黑色素瘤的作用。A)在1205-Lu细胞中在mRNA水平上对BPTF表达的抑制。B)BPTF抑制诱导了G0/G1停滞并且减少了细胞周期的S期。C-D)在BPTF基因敲低之后对细胞增殖的显著抑制，如分别通过细胞存活测定和集落形成测定所确定。E)BPTF基因敲低在黑色素瘤细胞中诱导了细胞凋亡。F-G)BPTF基因敲低显著地抑制了体内肿瘤细胞生长和转移性肿瘤负荷。
图3A-D示出了BPTF表达对于对DNA酶-1处理的敏感性以及ERK1/2通路的影响。A-B)在1205-Lu细胞和C8161.9细胞中，抑制BPTF表达提高了DNA酶-I对BCL-XL和BCL-2的启动子序列的超敏感性。C-D)在1205-Lu细胞和C8161.9细胞中抑制BPTF之后，在这两种黑色素瘤细胞系中CCND2、BCL-XL以及BCL-2在mRNA水平上的表达。C-F)示出了在1205-Lu细胞和C8161.9细胞中抑制BPTF之后各种蛋白质表达的蛋白质印迹分析。
图4A-D示出了原发性皮肤黑色素瘤中BPTF的水平。A-B)在具有最高的BPTF表达水平的黑色素瘤患者(曲线1)中，相比于所有其它患者(曲线2)，对DMFS和DSS进行的卡普兰-迈耶分析(Kaplan-Meieranalysis)。C-D)示出了组织样品中低的和高的BPTF拷贝数的FISH分析的代表性显微照片。
图5A-H示出了调节BPTF表达对于对选择性BRAF抑制剂的敏感性的作用。A-B)BPTF基因敲低使1205-Lu黑色素瘤细胞对威罗菲尼(vemurafenib)和达拉菲尼(dabrafenib)敏感。C-D)在1205-Lu黑色素瘤细胞中BPTF的过表达赋予对BRAF抑制剂的抗性。E)在对威罗菲尼具有获得性抗性之后转移性黑色素瘤样品的HE染色。F)对(E)中样品的BPTF表达的免疫组织化学分析示出了异质的BPTF染色模式。G)(E)中样品的泛黑色素瘤染色。H)对抗性样品中BPTF拷贝的荧光原位杂交(FISH)分析。
图6A-I示出了抑制BPTF表达对人类成胶质细胞瘤细胞的作用。A)在U251细胞中由shRNA介导的在mRNA水平上对BPTF的抑制。B-C)在BPTF基因敲低之后对细胞增殖的显著抑制，如分别通过细胞存活测定和集落形成测定所确定。D)BPTF抑制诱导了G0/G1停滞并且减少了细胞周期的S期。E)BPTF基因敲低在U251细胞中诱导了细胞凋亡。F)在抑制BPTF之后不同基因的mRNA表达。G)示出了各种蛋白质表达的蛋白质印迹分析。H)在抑制BPTF之后U251细胞在裸小鼠中的体内生长。I)在间充质型和原神经型GBM亚型中BPTF的表达。
图7A-C示出了抑制BPTF抑制了B16-F10鼠类黑色素瘤(A)、1205-Lu人类黑色素瘤(B)、以及U251人类GBM(C)细胞的侵袭潜能。
图8A-F示出了抑制BPTF对C8161.9人类黑色素瘤细胞的作用。A)在C8161.9黑色素瘤细胞中在mRNA水平上对BPTF的抑制。B-C)在BPTF基因敲低之后对细胞增殖的显著抑制，其分别通过细胞存活测定和集落形成测定所确定。D)BPTF基因敲低在C8161.9黑色素瘤细胞中诱导了细胞凋亡。E)BPTF基因敲低抑制了C8161.9黑色素瘤细胞的侵袭性。F)通过BPTF基因敲低显著地抑制了C8161.9细胞的体内肿瘤生长。
图9示出了BCL-XL或ERK的过表达解除了抑制BPTF对1205-Lu黑色素瘤细胞存活的作用。
图10A-C：A)在1205-Lu黑色素瘤细胞系中BPTF过表达增强了细胞增殖。B)在BPTF过表达之后各种基因的表达水平。C)示出了在BPTF过表达之后各种蛋白质表达的蛋白质印迹。
图11A-B示出了在组织微阵列中对BPTF表达的免疫组织化学分析，所述免疫组织化学分析示出了BPTF表达的说明性显微照片。A)表达低水平的BPTF的原发性黑色素瘤；B)表达高水平的BPTF的原发性黑色素瘤。
图12A-B：A)BPTF基因敲低使LOX黑色素瘤细胞系对威罗菲尼处理敏感。B)在LOX黑色素瘤细胞系中BPTF的过表达赋予了对威罗菲尼处理的抗性。
图13A-D：A)在对达拉菲尼具有抗性之后转移性肿瘤样品的HE染色。B)示出了异质BPTF染色模式的肿瘤样品的免疫组织化学染色。C)转移性黑色素瘤的泛黑色素瘤染色。D)对转移性黑色素瘤中的BPTF拷贝数的荧光原位杂交(FISH)分析。
图14A-F：A)在LN18人类成胶质细胞瘤细胞中由shRNA介导的对BPTFmRNA的抑制。B-C)在BPTF基因敲低之后对细胞增殖的抑制，其分别通过细胞存活测定和集落形成测定所确定。D)BPTF基因敲低抑制了LN18细胞的侵袭性。E-F)在抑制BPTF之后各种基因的表达水平。F)示出了在抑制BPTF之后各种蛋白质表达的蛋白质印迹分析。
图15示出了shRNA介导的对FALZ的抑制在MDA-231乳腺癌细胞系中抑制了肿瘤细胞的增殖(左图)和侵袭性(右图)。
图16示出了shRNA介导的对FALZ的抑制在MDA-231乳腺癌细胞系中抑制了集落形成能力(左图)并且诱导了细胞凋亡(右图)。
图17示出了在MDA-231乳腺癌细胞系中FALZ基因敲低抑制了裸小鼠体内的肿瘤生长(左图)。右图示出了对人类乳腺癌组织样品的FISH分析，该FISH分析表明了FALZ拷贝数增加。
具体实施方式
除非上下文另外明确规定，否则如本文和所附权利要求书中所用的单数形式“a/an(一)”和“所述”包括复数指代对象。因此，举例来说，提到“apolynucleotide(一种/个多核苷酸)”时，包括多种/个这样的多核苷酸，并且提到“所述细胞”时，包括提到一个或多个细胞，诸如此类。
除非另外定义，否则本文所用的所有技术术语和科学术语所具有的含义与本公开所属领域的普通技术人员通常所了解的含义相同。虽然在实施所公开的方法和组合物时可以使用与本文所述的方法和材料相似或等同的方法和材料，但在本文中描述了示例性方法、装置以及材料。
而且，除非另外说明，否则使用“或”意指“和/或”。类似地，“包含(comprise)”、“包含(comprises)”、“包含(comprising)”、“包括(include)”、“包括(includes)”以及“包括(including)”是可互换的并且不意图具限制性。
应当进一步了解的是，在对各种实施方案的说明使用术语“包含”的情况下，本领域技术人员应了解，在一些具体情况下，可以替代性地使用语言“基本上由……组成”或“由……组成”来描述一个实施方案。
提供上文以及贯穿全文所论述的公布仅仅是因为其在本申请的申请日之前公开。本文的任何信息并不被理解为承认本申请的发明人无权因在先的公开而先于所述公开。此外，对于在一篇或多篇出版物中存在的与在本公开中已经明确定义的术语相似或相同的任何术语，在所有方面将以如在本公开中所明确提供的术语的定义为准。
核小体重塑和组蛋白变体的掺入基本上是经由ATP依赖性染色质重塑复合体的作用来实现的，所述复合体代表了控制基因表达的机制的关键组分。ATP依赖性染色质重塑因子基于相关ATP酶的序列同源性被分为四个主要的亚家族(ISWI、SWI/SNF、CHD以及INO80)。
鉴于最新证实了在各种人类癌症中染色质调节因子中的突变，已经认识到染色质重塑因子在肿瘤发生中发挥了越来越重要的作用。此外，鉴于17q24基因座在许多肿瘤中的扩增，它一直以来已经被假定含有致癌基因。布罗莫结构域PHD指转录因子(BPTF；还被称为FALZ)(它的基因存在于17q24上)是NURF复合体的最大组分，已经牵涉到胚胎发育、胸腺细胞成熟、以及染色质重塑。哺乳动物中的NURF复合体是被充分表征的ATP依赖性染色质重塑复合体。然而，对BPTF在肿瘤发生中所发挥的功能作用知之甚少。
在黑腹果蝇(Drosophilamelanogaster)中被鉴定出的核小体重塑因子(NURF)是ATP依赖性染色质重塑因子的ISWI家族的关键成员。在哺乳动物中，BPTF(布罗莫结构域PHD指转录因子)代表了果蝇NURF301————即NURF染色质重塑复合体的最大亚基——的直系同源物。在所有的真核生物物种间存在NURF301同源物并且所述同源物似乎在进化上是保守的。NURF301参与对engrailed1和engrailed2表达的调节，大概是通过改变核小体的周期性对齐。
NURF复合体经由与序列特异性转录因子相互作用来介导它的细胞功能中的一些。在果蝇中，热休克因子(HSF)、GAGA、以及人工结构域VP16已经被证实与NURF301上的多个表面相互作用并且与ISWI发生弱的相互作用。NURF301具有结合特异性组蛋白翻译后修饰的两个被充分表征的结构域。与布罗莫结构域并列的PHD指与H3K4me2/3相互作用，并且相邻的布罗莫结构域结合H4K16ac。此外，NURF可能以序列特异性方式直接与DNA相互作用。BPTF(还被称为FALZ)已经被报道为在胚胎发育中是必要的并且涉及ATP依赖性染色质重塑。
本公开通过cDNA微阵列分析和FISH证实了BPTF(在本文有时被称为FALZ)在转移性黑色素瘤和乳腺癌中显著过表达。人类BPTF基因(SEQIDNO:1)位于染色体17q24上，所述染色体17q24是许多肿瘤中染色体变化的热点。已经在乳腺癌中证实了17q24的扩增，并且已经在其它实体肿瘤中观测到17q24拷贝数增加。在肺胚胎细胞中证实了在涵盖了BPTF基因的17q24.3基因座处出现的易位。FAC1(胎儿Alz-50-反应性克隆1)是BPTF的一种截短形式，在神经变性疾病中上调，表现出序列特异性DNA结合活性，并且可能在转录调节中起作用。虽然充分了解诸如NURF之类的重塑复合体的重要性，但是迄今为止，BPTF在肿瘤发生中的功能作用仍被不完全地表征。
本公开提供了BPTF在黑色素瘤、多形性成胶质细胞瘤(GBM)以及乳腺癌中的功能和生物学作用。尽管具体分析了这些癌症类型，但涵盖了BPTF在其它肿瘤和癌症中的作用。本公开证实了靶向抑制BPTF抑制了黑色素瘤、GBM以及乳腺癌细胞增殖；在很大比例的黑色素瘤和乳腺癌中BPTF拷贝数升高，以及BPTF过表达是人类黑色素瘤患者的存活率降低的标志物。此外，在BRAF突变型黑色素瘤细胞中，BPTF调节ERK通路并且赋予对选择性BRAF抑制剂的获得性抗性。
本公开证实了BPTF在肿瘤进展中的功能上的和生物学上的意义，具体集中在黑色素瘤、成胶质细胞瘤、以及乳腺癌。在鼠类黑色素瘤细胞和乳腺癌细胞中抑制BPTF表达引起对肿瘤细胞的增殖和侵袭性的显著抑制。体内研究确认了BPTF在黑色素瘤进展中所发挥的强大作用，这是因为通过使用不同的靶向BPTF的shRNA观测到肿瘤细胞生长和转移性肿瘤计数的显著减少。在两种人类黑色素瘤和GBM细胞系以及乳腺癌细胞中确认了BPTF对细胞周期进展以及体外和体内肿瘤细胞生长的影响。
为了获得对BPTF在黑色素瘤细胞中的功能在机制上的了解，综合分析鉴定出在抑制BPTF表达之后，BCL2、BCL-XL以及CCND2的下调，它们是肿瘤细胞增殖、细胞周期进展、以及细胞凋亡的关键介质。这些基因的下调是通过在黑色素瘤和GBM细胞系中进行qRT-PCR和蛋白质印迹分析来确认的。由于在哺乳动物中NURF复合体已经被在体外证实影响核小体定位和核酸酶超敏感性位点，因此本公开证实了抑制BPTF表达提高了BCL2基因和BCL-XL基因对DNA酶I处理的敏感性。
除对BPTF在黑色素瘤、乳腺癌以及GBM中的作用的机制分析以外，还对BPTF作为黑色素瘤的生物标志物的作用进行了详细分析。对原发性黑色素瘤的FISH分析揭示了在36％的病例中BPTF拷贝数升高，和良性痣形成对比，在所述良性痣中，不存在BPTF拷贝数增加。这表明了BPTF作为潜在的诊断标志物来辨别黑色素瘤与痣的潜在效用。此外，所观测到的BPTF拷贝数增加可能提供了在黑色素瘤中BPTF激活的机制，这鉴定出在基因表达谱分析中所观测到的BPTF过表达的遗传学基础。此外，对BPTF免疫染色的数字成像分析将BPTF过表达鉴定为人类黑色素瘤患者的无远处转移和疾病特异性存活率的独立预测因素。因此，这些研究证实了BPTF是远处转移(黑色素瘤进展中的致命事件)的预测因子和促进因子这两者。综上所述，这些发现将BPTF确定为黑色素瘤肿瘤发生和肿瘤进展的新型靶标、分子标志物以及介质。此外，对GBM组织和乳腺癌细胞中的BPTF表达的分析表明在原神经型GBM亚型和乳腺癌细胞中富含BPTF表达，该原神经型GBM亚型对化学治疗剂响应不佳。
BRAF是一种在黑色素瘤中在40％至50％的病例中借助于点突变的主要致癌驱动因子。在黑色素瘤细胞中，突变型BRAF除了促进肿瘤细胞侵袭和血管生成之外还组成性地激活MAP激酶通路，并且转导促增殖和促存活信号。重要的是，抑制BPTF表达在带有突变型(1205-Lu)或野生型(C8161.9)BRAF的黑色素瘤细胞中产生了显著的抗肿瘤作用，并且使得磷酸化的ERK1/2(Thr204/Tyr204)和它直接的靶标p90RSK(Ser380)的水平显著降低，所述磷酸化的ERK1/2(Thr204/Tyr204)和它直接的靶标p90RSK(Ser380)代表了MAPK通路的下游效应子。有趣的是，在BPTF基因敲低后被抑制的基因中的三种(BCL2、BCL-XL以及CCND2)由ERK调节。这些发现提供证据表明BPTF激活MAPK通路并且从而增强肿瘤细胞的增殖、侵袭性以及存活，而抑制肿瘤细胞的细胞凋亡。
使用选择性BRAF抑制剂治疗带有BRAF突变的转移性黑色素瘤患者已经被证实赋予了整体存活率优势。然而，完全响应是罕见的并且在大部分所治疗的病例中对这些药剂产生了获得性抗性。已经描述了获得性抗性的若干种机制，主要包括MAPK通路的重新激活[经由N-RAS突变或COT/MAP3K8激酶过表达]、血小板衍生生长因子受体β的激活或经由PI3K通路的激活(经由IGF1R的过表达)。本公开证实了调节BPTF的表达(通过过表达或由shRNA介导的下调)显著地调节了突变型BRAF黑色素瘤细胞对选择性BRAF抑制剂的敏感性并且进一步提供了新的证据表明染色质重塑因子涉及在癌症中促进对靶向疗法的获得性抗性。除了对黑色素瘤细胞系中对BRAF抑制剂的敏感性进行机制分析之外，在进展之前和之后使用选择性BRAF抑制剂对样品进行的分析表明在一个子集的病例中具有治疗抗性之后BPTF拷贝数增加。这表明了鉴于BPTF激活可以促进黑色素瘤细胞增殖和存活，在黑色素瘤中对靶向疗法的抗性期间BPTF激活可以被选择。
惊人的是，在对治疗前的病变和正在进展的病变中BPTF的表达进行的免疫组织化学分析中存在显著性差异。虽然在治疗前的转移性肿瘤中BPTF的表达是均一的，但是在一些肿瘤中对正在进展的病变进行的分析鉴定出具有不同的形态和BPTF表达的细胞的不同克隆。肿瘤细胞的一种克隆(缺乏BPTF染色)代表了似乎已经响应于疗法的凋亡细胞，而其它克隆鉴定出可能代表了抗性克隆的存活细胞(具有显著的BPTF染色)。这产生了有趣的推测，即对靶向疗法具有抗性的转移性肿瘤并非具有均一的抗性，而是由仍积极地响应于治疗的细胞亚群构成。这些观测结果与最近有关肾细胞癌的肿瘤内分子不均一性的论证是一致的，并且由最新的研究所支持，所述研究证实了在进行靶向疗法时在进展后转移性黑色素瘤中异质的免疫组织化学标志物表达。综上所述，这些结果明确支持了在研究联合疗法的潜在效用方面的尝试，这些尝试被计划或正在进行中以靶向上述抗性机制中的一些。此外，它们表明了BPTF靶向是克服对BRAF抑制剂的抗性的一种可能的方法，或是一种用于具有突变型BRAF的转移性黑色素瘤的可能的联合治疗。
在最新的研究中，通过全基因组测序，BPTF是肝癌中突变的一组染色质重塑因子之一。对COSMIC数据库进行的分析揭示了在包括黑色素瘤在内的少数皮肤癌中BPTF的突变。本公开证实了BPTF在黑色素瘤、乳腺癌以及成胶质细胞瘤中的致癌作用，所述致癌作用在一个子集的病例中部分地是通过拷贝数增加来驱动的。本文所呈现的结果指定了BPTF在肿瘤进展中的新型功能作用，所述功能作用是借助于BPTF对肿瘤细胞增殖和存活的影响、经由BCL2、BCL-XL、CCND2以及ERK的激活来实现的。BPTF过表达是与黑色素瘤相关的存活率的独立预测因素。此外，BPTF的水平升高促进了对靶向突变型BRAF的疗法的抗性并且可以在具有对这些药剂的获得性抗性期间被选择。
鉴于本文和以下实施例中所提供的数据，本公开提供了可用于以下各项的方法和组合物：(a)治疗具有异常的BPTF表达的癌症；(b)通过抑制由BPTF表达所引起的诱导性药物抗性来增强使用现有的第一线化学治疗剂和抗体的靶向疗法；以及(c)可用于鉴定癌症的进展和疗法的诊断。本文所述的治疗方法可以使用抑制剂核酸疗法(例如shRNA、siRNA、反义分子等)来下调BPTF表达。或者，本公开可以通过将BPTF抑制剂(例如布罗莫结构域抑制剂)与第一线治疗剂组合来改进疗法。示例性布罗莫结构域抑制剂描述于例如美国专利公开号2014/0066410中，该美国专利公开的公开内容以引用的方式并入本文。在这后一个实施方案中，治疗性方法和组合物将是布罗莫结构域抑制剂和用于癌症的第一线治疗剂的组合。布罗莫结构域抑制剂可以在施用第一线治疗剂/化学治疗剂之前、与所述施用组合、或在所述施用之后被施用。
如本文所用的术语“反义寡核苷酸”指的是具有与BPTF多核苷酸序列互补的核苷酸序列的未修饰的或修饰的核酸，所述BPTF多核苷酸序列包括与BPTF的转录或翻译相关的多核苷酸序列(例如BPTF多核苷酸的启动子)，其中所述反义多核苷酸能够与BPTF多核苷酸序列杂交。特别要关注的是能够在体外或体内抑制编码BPTF多肽的多核苷酸的转录和/或翻译的反义多核苷酸。这样的反义寡核苷酸可以经由基因疗法(例如重组病毒载体)、与电荷中和部分(例如TAT或其它蛋白质转导结构域，参见例如美国专利公开号2009/0093425、2009/0093026、以及2006/0222657，这些美国专利公开的公开内容以引用的方式并入本文)可操作地连接、或直接核酸递送技术向靶细胞递送。
如本文所用的术语“siRNA寡核苷酸”、“RNAi寡核苷酸”、“短干扰RNA”或“siRNA”可互换使用并且指的是经由转录后基因沉默(也被称为RNA干扰(RNAi))起作用的寡核苷酸。所述术语指的是能够进行RNA干扰“RNAi”的双链核酸分子(参见Kreutzer等,WO00/44895；Zernicka-Goetz等,WO01/36646；Fire,WO99/32619；Mello和Fire,WO01/29058)。SiRNA分子一般是RNA分子，但进一步涵盖了化学修饰的核苷酸和非核苷酸。已经通过向细胞中的瞬时siRNA转移(这是通过诸如脂质体介导的转染、电穿孔、或显微注射等传统方法来实现的)进行了siRNA基因靶向实验。siRNA的分子是具有21个至23个核苷酸的RNA，所述RNA具有与通常引发RNAi的长双链RNA(dsRNA)的RNA酶III加工产物相似的特征性的具有2个至3个核苷酸的3'突出端。
对介导基因沉默的siRNA通路的有效利用部分地取决于细胞内递送siRNA的有效方法。siRNA分子在细胞中倾向于具有短的寿命，不容易递送到难以被转染的细胞类型中并且对于经由化学合成产生来说是相对昂贵的(Jacks等,(2005)Biotechniques39:215-224；Bernards等,(2006)NatureMethods3:701-706)。
一种用于有效细胞内递送siRNA的方法是使用短发夹RNA或“shRNA”。shRNA是单链RNA分子，所述分子包括由非互补区连接的两个互补序列。在体内，互补序列退火以形成在一端具有未配对环的双链螺旋。所得的棒棒糖状的结构被称作茎环并且可以通过RNAi机器来识别并且在细胞内被加工成具有siRNA样特性的短双链体RNA。
shRNA可以在细胞中通过由已经被插入适当载体中的DNA模板进行转录来合成。有用的shRNA通常具有50个至70个核苷酸的长度，具有由具有5个至10个核苷酸的环隔开的具有19个至29个核苷酸的两个互补序列。shRNA的构造一般是通过二聚体方法中的一种来实现的：使互补寡核苷酸退火；基于启动子的聚合酶链反应(PCR)；或引物延伸。许多载体系统利用RNAPolIII启动子；PolIII介导的转录是有利的，这是因为它开始于明确限定的起始位点，产生含有非多聚腺苷酸的转录物，并且PolIII启动子在所有细胞类型中具有活性。(Brummelkamp等,(2002)Science296:550-553；McIntyre,G.和Fanning,G.(2006)BMCBiotechnology6:1-8)。
编码shRNA的载体系统提供了基因沉默试剂的可再生的细胞内来源，所述基因沉默试剂可以在载体稳定整合到宿主基因组中之后介导持久的基因沉默。此外，shRNA盒可以容易地插入逆转录病毒载体、慢病毒载体或腺病毒载体中以便将shRNA递送到广泛的细胞类型中，包括非分裂的原代培养物。shRNA载体的可调节型式对于遗传筛选是特别有用的。
或者，iRNA分子可以经由电荷中和方法和组合物来递送。举例来说，美国专利公开号2009/0093425、2009/0093026、以及WO/2014/031575，这些专利以引用的方式并入本文。
在一个实施方案中，本公开提供了用于治疗其中癌细胞包含BPTF的过表达的癌症的方法和组合物，所述方法包括施用包含BPTF的核酸抑制剂的组合物。这样的核酸抑制剂可以包括例如siRNA、shRNA以及其前体。举例来说，本公开证实了shRNA可以用于对BPTF的表达进行基因敲低并且提供有益的结果。这样的shRNA包括但不限于BPTFshRNA1：TGGCTGTGATCGGTGTCAGAATTGGTACC(SEQIDNO:3；其中T可以是U)；BPTFshRNA2：GGTGATGAAGCATAATGCTGTAATAGAAC(SEQIDNO:4；其中T可以是U)；以及BPTFshRNA3(SEQIDNO:5；其中T可以是U)：ATTTAGATTCATCATAAGGCG、以及包含修饰的碱基、电荷中和部分等的上述物质中的任一种。以治疗有效量施用抑制性核酸。
如本文所用的术语“治疗有效量”意图指的是药物的如下量，在向个体施用治疗有效量的所述药物时，所述量产生药物作用，所述药物作用被观测为所述个体的一个或多个临床终点、癌细胞的生长和/或存活、癌细胞的转移的减少或逆转、或癌细胞对第一线抗癌剂的化学治疗剂的抗性降低。治疗有效量通常是通过将它们所具有的作用与在向情形类似的个体施用不包括活性成分的组合物时所观测到的作用相比较来确定的。用于受试者的精确有效量将取决于受试者的体格和健康情况、病况的性质和程度、以及被选用于施用的治疗剂或治疗剂的组合。然而，用于给定情形的有效量是通过常规的实验来确定的并且在临床医师的判断范围内。
如本文所用的术语“与……组合”或“联同……”指的是施用本公开的BPTF调节剂以及其它治疗方案。
如本文所用的术语“敏感的”指的是所用的BPTF疗法是可接受的治疗方法的患者，例如有可能积极响应的患者。对BPTF疗法敏感的癌症患者相对于对BPTF疗法不敏感的那些患者表达高水平的BPTF。不是BPTF疗法的良好候选者的癌症患者包括具有如下肿瘤样品的癌症患者，所述肿瘤样品在它们的癌细胞中或癌细胞上缺乏BPTF或具有较低水平的BPTF。
如本文所用的术语“检测”意指确立、发现、或确定活性(例如基因表达)或生物分子(例如多肽)的迹象。
如本文所用的短语“同源核苷酸序列”或“同源氨基酸序列”或其变化形式指的是特征在于在核苷酸水平或氨基酸水平上至少指定百分比的同源性的序列并且可与“序列同一性”互换使用。同源核苷酸序列包括编码蛋白质的同工型的那些序列。这些同工型可以由于例如RNA的选择性剪接而表达于相同生物体的不同组织中。或者，同工型可以由不同的基因编码。同源核苷酸序列包括编码除人类以外的物种的蛋白质的核苷酸序列，所述物种包括但不限于哺乳动物。同源核苷酸序列还包括但不限于本文所示的核苷酸序列的天然存在的等位基因变异和突变。同源氨基酸序列包括含有保守性氨基酸取代并且多肽具有相同的结合和/或活性的那些氨基酸序列。
同源性百分比或同一性百分比可以通过例如使用Smith和Waterman(Adv.Appl.Math.,1981,2,482-489)的算法的Gap程序(威斯康星州麦迪逊的大学研究园遗传学计算机小组(GeneticsComputerGroup,UniversityResearchPark,MadisonWis.)的威斯康星序列分析包(WisconsinSequenceAnalysisPackage)，用于UNIX的第8版)，使用默认设置来确定。在一些实施方案中，探针与靶标之间的同源性是约50％至约60％。在一些实施方案中，核酸具有与SEQIDNO:1或其部分约60％、约70％、约80％、约85％、约90％、约92％、约94％、约95％、约97％、约98％、约99％以及约100％同源的核苷酸。本公开进一步提供了SEQIDNO:1或它的同源物的完全互补序列的一部分。
同源性还可以在多肽水平上。在一些实施方案中，多肽与SEQIDNO:2或其部分约60％、约70％、约80％、约85％、约90％、约92％、约94％、约95％、约97％、约98％、约99％以及约100％同源。
如本文所用的术语“探针”指的是具有可变长度的核酸序列。在一些实施方案中，探针包含至少约10个并且最多约6,000个核苷酸。在一些实施方案中，探针包含至少12个、至少14个、至少16个、至少18个、至少20个、至少25个、至少50个或至少75个连续核苷酸。探针用于检测相同的、相似的、或互补的核酸序列。具有更长长度的探针通常是从天然来源或重组来源获得的，对靶序列具有高度特异性，并且与靶标的杂交要比低聚物慢得多。探针可以是单链或双链的，并且在PCR、基于膜的杂交、原位杂交(ISH)、荧光原位杂交(FISH)、或ELISA样技术中被设计成具有特异性。
如本文所用的术语“混合”指的是将一种或多种化合物、细胞、分子等在同一个区域中组合在一起的过程。这可以例如在试管、皮氏培养皿(petridish)、或允许一种或多种化合物、细胞或分子被混合的任何容器中进行。
如本文所用的术语“分离的”指的是多核苷酸、多肽、抗体、或宿主细胞处在与其中天然存在所述多核苷酸、所述多肽、或所述抗体的环境不同的环境中。分离细胞的方法是本领域技术人员公知的。分离的多核苷酸、多肽或抗体一般是被基本上纯化的。
如本文所用的术语“被基本上纯化的”指的是化合物(例如多核苷酸或多肽或抗体)从它的天然环境中被取出并且至少60％不含、至少75％不含、以及至少90％不含与它天然缔合的其它组分。
如本文所用的术语“结合”意指两个或更多个生物分子或化合物之间的物理相互作用或化学相互作用。结合包括离子相互作用、非离子相互作用、氢键相互作用、范德华(VanderWaals)相互作用、疏水性相互作用等。结合可以是直接的或间接的；间接的结合是经由或由于另一种生物分子或化合物的作用。直接结合指的是不经由或由于另一种分子或化合物的作用，而是在没有其它实质性化学中间体的情况下而发生的相互作用。
如本文所用的术语“接触”意指直接地或间接地使一种分子与第二种分子在物理上接近而集合在一起。所述分子可以处在多种缓冲液、盐、溶液等中。“接触”包括例如将多核苷酸放到容纳核酸分子的烧杯、微量滴定板、细胞培养瓶、或微阵列等中。接触还包括例如将抗体放到容纳多肽的烧杯、微量滴定板、细胞培养瓶、或微阵列等中。接触可以在体内、离体或体外进行。
如本文所用的短语“严格杂交条件”或“严格条件”指的是探针、引物、或寡核苷酸将与它的靶序列杂交，但是与最少数目的其它序列杂交时的条件。严格条件是具有序列依赖性的并且在不同的情况下将是不同的。更长的序列将在更高的温度下与它们的合适互补序列特异性杂交。一般来说，严格条件被选择为在限定的离子强度和pH值下比特定序列的热解链温度(Tm)低约5℃。Tm是在平衡状态下50％的与靶序列互补的探针与所述靶序列杂交时的温度(在限定的离子强度、pH值以及核酸浓度下)。由于靶序列一般以过量存在，因此，在Tm下，50％的探针在平衡状态下与它们的互补序列杂交。通常，严格条件将是如下的条件，其中在pH7.0至8.3，盐浓度低于约1.0M钠离子，通常约0.01M至1.0M钠离子(或其它盐)，并且温度对于短探针、引物或寡核苷酸(例如10个至50个核苷酸)来说是至少约30℃，并且对于更长的探针、引物或寡核苷酸来说是至少约60℃。严格条件还可以通过添加去稳定剂(如甲酰胺)来实现。
如本文所用的术语“中等严格条件”指的是探针、引物、或寡核苷酸将与它的靶序列杂交，但是与有限数目的其它序列杂交时的条件。中等条件是具有序列依赖性的，并且在不同的情况下将是不同的。中等条件是本领域技术人员公知的并且尤其描述于Maniatis等(MolecularCloning:ALaboratoryManual(《分子克隆：实验室手册》),冷泉港实验室出版社(ColdSpringHarborLaboratory)；第2版(1989年12月))中。
本文所述的核酸组合物可以例如用于产生多肽、用作探针来检测生物样品(例如人类细胞提取物)中的mRNA或由这些样品产生的cDNA、用于产生多核苷酸的额外拷贝、用于产生核糖酶或寡核苷酸(单链的和双链的)、以及用作单链DNA探针或用作形成三链的寡核苷酸。本文所述的探针可以用于例如确定样品中存在或不存在本文所提供的多核苷酸。所述多肽可以用于产生对与癌症相关的多肽具有特异性的抗体，所述抗体进而可用于诊断方法、预后方法等中，如本文所更详细地论述。多肽还可用作治疗干预的靶标，如本文所更详细地论述。本公开的抗体还可以例如用于纯化、检测、以及靶向本发明的多肽，包括体外和体内的诊断方法和治疗方法这两者。举例来说，所述抗体可用于免疫测定中以定性地和定量地测量生物样品中本发明的多肽的水平。参见例如Harlow等,Antibodies:ALaboratoryManual(《抗体：实验室手册》),(冷泉港实验室出版社(ColdSpringHarborLaboratoryPress),第2版,1988)。这些用途和其它用途更详细地描述于下文中。针对BPTF的抗体是已知的(例如来自美国德克萨斯州蒙哥马利郡的BethylLaboratories公司(BethylLaboratories,Inc.,Montgomery,TX,USA))。
如本文所用的术语“成像剂”指的是与本公开的抗体、小分子或探针连接的可以使用本领域技术人员已知的技术检测的组合物。如本文所用的术语“基因表达的迹象”指的是基因被表达的任何可测量的标记。
术语“药学上可接受的载体”指的是用于施用治疗剂如抗体或多肽、基因、以及其它治疗剂的载体。所述术语指的是本身不会诱导对接受组合物的个体有害的抗体产生，并且可以被施用而没有不当毒性的任何药物载体。合适的载体可以是大的缓慢代谢的大分子，如蛋白质、多糖、聚乳酸、聚乙醇酸、聚合氨基酸、氨基酸共聚物、脂质聚集体以及无活性病毒粒子。这样的载体是本领域的普通技术人员公知的。治疗性组合物中的药学上可接受的载体可以包括液体，如水、盐水、甘油以及乙醇。在这样的媒介物中还可以存在辅剂物质，如湿润剂或乳化剂、pH缓冲物质等。
可以由本公开的方法和组合物治疗的癌症的具体实例包括但不限于BPTF相关癌症。如本文所用的“BPTF相关癌症”指的是特征在于相对于非癌细胞差异性地表达BPTF的细胞的癌症。本公开还适用于任何以下肿瘤细胞类型，其中BPTF在癌细胞生长、肿瘤形成、癌细胞增殖、癌细胞转移、细胞迁移、对治疗剂的抗性、以及血管生成中起作用。在一些实施方案中，所述癌症是乳腺癌、皮肤癌、食道癌、肝癌、胰腺癌、前列腺癌、子宫癌、宫颈癌、肺癌、膀胱癌、卵巢癌、多发性骨髓瘤以及黑色素瘤。
本公开提供了如下的方法和组合物，所述方法和组合物提供了对与BPTF过表达相关的疾病和病症的治疗、抑制和管理以及对这些疾病和病症的症状的治疗、抑制和管理。本发明的一些实施方案涉及如下的方法和组合物，所述方法和组合物包括治疗、抑制或管理癌症的组合物，所述癌症包括但不限于癌症转移、癌细胞增殖、癌细胞生长以及癌细胞侵袭。
本公开进一步提供了包括其它活性成分与本公开的BPTF调节剂和抑制剂的组合的方法。在一些实施方案中，所述方法进一步包括向患者施用一种或多种常规的癌症治疗剂。在一些实施方案中，本公开的方法进一步包括使用化学疗法、放射疗法或手术中的一种或多种与BPTF调节剂或抑制剂的组合治疗所述患者。与任何其它疗法组合的BPTF疗法的施用可以在施用非BPTF疗法之前、同时或之后进行。
本公开还提供了使用本公开的BPTF调节剂，特别是BPTF抑制性抗体和小抑制性RNA分子(例如siRNA、shRNA等)诊断癌症和/或预测癌症进展的诊断和/或成像方法。在一些实施方案中，本公开的方法提供了对肿瘤和/或转移进行成像和定位的方法以及癌症的诊断和预后方法。在一些实施方案中，本公开的方法提供了评价BPTF相关疗法的适当性的方法。
本公开提供了BPTF调节剂和BPTF抑制剂，特别是用于对癌症进行治疗、诊断、检测或成像的BPTF调节剂和BPTF抑制剂。BPTF调节剂或BPTF抑制剂还可用于制备用于治疗癌症的药物。
在一些实施方案中，BPTF调节剂或BPTF抑制剂是寡核苷酸、小分子、模拟物、或抗体。在一些实施方案中，与对照相比，BPTF调节剂将BPTF生物活性抑制了25％、50％、60％、70％、75％、80％、90％、95％、97％、98％、99％或100％。在一些实施方案中，与对照相比，BPTF调节剂将BPTF表达抑制了至少25％、50％、60％、70％、75％、80％、90％、95％、97％、98％、99％或100％。
如本文所用的BPTF调节剂包括调节BPTF的表达或活性的任何药剂。“调节剂”可以是拮抗性的或激动性的。对于治疗癌症，BPTF调节剂是抑制性分子或拮抗性分子。示例性BPTF抑制剂包括抑制性抗体、小分子抑制剂(例如布罗莫结构域抑制剂)、以及抑制剂核酸分子。BPTF抑制性抗体包括抑制或降低BPTF多肽(例如包含序列SEQIDNO:2的多肽、其突变体或变体)的生物活性的抗体。
在一些实施方案中，BPTF调节剂是单克隆抗体、多克隆抗体、嵌合抗体、人类抗体、人源化抗体、单链抗体、或Fab片段。所述抗体可以被标记有例如酶、放射性同位素或荧光团。在一些实施方案中，BPTF调节剂是与BPTF结合的单克隆抗体，所述BPTF由如SEQIDNO:2中所示的序列组成。在诊断应用中，所述抗体可以被标记有可检测的标记。
在一些实施方案中，所述抗体是人源化抗体。可以通过多种方法实现人源化抗体，所述方法包括例如：(1)将非人类互补决定区(CDR)移植到人类框架和恒定区上(这一过程在本领域中被称为“人源化”)，或者作为另外一种选择，(2)移植整个非人类可变域，但通过置换表面残基将它们用人类样表面“遮盖”(这一过程在本领域中被称为“镶饰”)。在本发明中，人源化抗体将包括“人源化”抗体和“镶饰”(veneered)抗体这两者。类似地，人类抗体可以通过将人类免疫球蛋白基因座引入到其中内源性免疫球蛋白基因已经部分或完全失活的转基因动物例如小鼠中而产生。在激发后，观测到人类抗体的产生，这在所有方面非常类似于在人类中所看到的，包括基因重排、组装、以及抗体谱系。这种方法描述于例如美国专利号5,545,807；5,545,806；5,569,825；5,625,126；5,633,425；5,661,016；以及以下科学出版物中：Marks等,Bio/Technology10；779-783(1992)；Lonberg等,Nature368856-859(1994)；Morrison,Nature368,812-13(1994)；Fishwild等,NatureBiotechnology14,845-51(1996)；Neuberger,NatureBiotechnology14,826(1996)；Lonberg和Huszar,Intern.Rev.Immunol.1365-93(1995)；Jones等,Nature321:522-525(1986)；Morrison等,Proc.Natl.Acad.Sci；U.S.A.,81:6851-6855(1984)；Morrison和Oi,Adv.Immunol.,44:65-92(1988)；Verhoeyer等；Science239:1534-1536(1988)；Padlan,Molec.Immun.28:489-498(1991)；Padlan,Molec.Immunol.31(3):169-217(1994)；以及Kettleborough,C.A.等,ProteinEng.4(7):773-83(1991)，这些文献中的每一篇以引用的方式并入本文。
针对BPTF的抗体可以被单独使用或与其它组合物组合使用。所述抗体可以进一步在N末端或C末端处与异源多肽以重组方式融合或与多肽或其它组合物以化学方式缀合(包括共价缀合和非共价缀合)。举例来说，本公开的抗体可以与可用作检测测定中的标记的分子以及效应分子(如异源多肽、药物、放射性核素、或毒素)以重组方式融合或缀合。参见例如PCT公开WO92/08495；WO91/14438；WO89/12624；美国专利号5,314,995；以及EP396,387。
除了嵌合抗体和人源化抗体之外，完全人类抗体可以源自于具有人类免疫球蛋白基因的转基因小鼠(参见例如美国专利号6,075,181、6,091,001、以及6,114,598，所有这些专利以引用的方式并入本文)、或源自于人类免疫球蛋白基因的噬菌体展示文库(参见例如McCafferty等,Nature,348:552-554(1990)；Clackson等,Nature,352:624-628(1991)；以及Marks等,J.Mol.Biol.,222:581-597(1991))。
单克隆抗体可以使用Kohler等,(1975)Nature256:495-496的方法或其改动方案来制备。通常，使用含有抗原的溶液对小鼠进行免疫接种。免疫接种可以通过将含有抗原的溶液在盐水中，优选地在诸如弗氏完全佐剂(Freund'scompleteadjuvant)的佐剂中混合或乳化，并且肠胃外注射所述混合物或乳液来进行。可以使用本领域已知的任何免疫接种方法来获得本发明的单克隆抗体。在对动物进行免疫接种之后，将脾(以及任选的若干大淋巴结)取出并且解离成单细胞。可以通过将细胞孔悬浮液施加到涂有目的抗原的板或孔中来筛选脾细胞。表达对所述抗原具有特异性的膜结合免疫球蛋白的B细胞与板结合并且没有被冲洗掉。然后诱导所得的B细胞或所有解离的脾细胞与骨髓瘤细胞融合以形成杂交瘤，并且在选择培养基中培养。将所得的细胞通过连续稀释或有限稀释来平板接种并且测定特异性结合目的抗原(并且不与无关抗原结合)的抗体的产生。然后在体外(例如在组织培养瓶或中空纤维反应器中)或在体内(以小鼠体内的腹水形式)培养所选择的分泌单克隆抗体(mAb)的杂交瘤。
作为使用杂交瘤进行表达的替代方案，可以在诸如CHO或骨髓瘤细胞系的细胞系中产生抗体，如美国专利号5,545,403；5,545,405；以及5,998,144中所公开；所述每一件专利以引用的方式并入本文。简单地说，将所述细胞系用分别能够表达轻链和重链的载体转染。通过转染分开的载体上的两种蛋白质，可以产生嵌合抗体。Immunol.147:8；Banchereau等(1991)Clin.Immunol.Spectrum3:8；以及Banchereau等(1991)Science251:70；所有这些文献以引用的方式并入本文。
短语“互补决定区”指的是共同限定原生免疫球蛋白结合位点的天然FY区的结合亲和力和特异性的氨基酸序列。参见例如Chothia等,J.Mol.Biol.196:901-917(1987)；Kabat等,美国卫生和公共服务部NaI出版物号(U.S.Dept.ofHealthandHumanServicesNaIPublicationNo.)91-3242(1991)。短语“恒定区”指的是抗体分子中赋予效应功能的部分。在本发明中，小鼠恒定区被人类恒定区取代。主题人源化抗体的恒定区源自于人类免疫球蛋白。重链恒定区可以选自以下五种同种型中的任一种：α、δ、ε、γ或μ。一种将抗体人源化的方法包括将非人类重链序列和轻链序列与人类重链序列和轻链序列比对，基于这种比对选择非人类框架并且将所述非人类框架用人类框架置换，进行分子建模以预测人源化序列的构象并且与亲本抗体的构象相比较。在这一过程之后是CDR区中干扰CDR结构的残基的反复回复突变直到人源化序列模型的所预测的构象非常接近亲本非人类抗体的非人类CDR的构象为止。可以将这样的人源化抗体进一步衍生化以促进摄取和清除，例如经由Ashwell受体。参见例如美国专利号5,530,101和5,585,089，这些专利以引用的方式并入本文。
人源化抗体还可以使用被工程化而含有人类免疫球蛋白基因座的转基因动物而产生。举例来说，WO98/24893公开了具有人类Ig基因座的转基因动物，其中所述动物由于内源性重链基因座和轻链基因座失活而不产生功能性内源性免疫球蛋白。WO91/10741也公开了能够对免疫原产生免疫应答的转基因非灵长类哺乳动物宿主，其中所述抗体具有灵长类动物恒定区和/或可变区，并且其中编码内源性免疫球蛋白的基因座被取代或失活。WO96/30498公开了使用Cre/Lox系统来修饰哺乳动物的免疫球蛋白基因座以置换恒定区或可变区的全部或一部分而形成修饰的抗体分子。WO94/02602公开了具有失活的内源性Ig基因座和功能性人类Ig基因座的非人类哺乳动物宿主。美国专利号5,939,598公开了产生转基因小鼠的方法，其中所述小鼠缺乏内源性重链，并且表达包含一个或多个异种恒定区的外源性免疫球蛋白基因座。本发明的抗体还可以使用如美国专利号5,766,886中所论述的人类工程技术来产生，该美国专利以引用的方式并入本文。
本公开的抗体可以经由体内治疗性抗体基因转移来向受试者施用，如由Fang等(2005),Nat.Biotechnol.23,584-590所论述。举例来说，可以产生重组载体以递送多顺反子表达盒，所述多顺反子表达盒包含介导被放置在MAb重链编码序列与轻链编码序列之间的多肽的非酶依赖性共翻译自切割的肽。表达产生化学计量的这两种MAb链。介导非酶依赖性共翻译自切割的肽的优选实例是口蹄疫(foot-and-mouth-disease)衍生2A肽。
抗体的片段适用于本发明的方法中，只要它们保持全长抗体的所需亲和力即可。因此，抗BPTF抗体的片段将保持结合BPTF的能力。这样的片段的特征在于类似于相应的全长抗BPTF抗体的特性，即，片段将特异性结合人类细胞表面上表达的人类BPTF抗原。
在一些实施方案中，所述抗体与BPTF的结构域中的一个或多个表位结合。在一些实施方案中，所述抗体调节一种或多种BPTF相关生物活性。在一些实施方案中，所述抗体抑制癌细胞生长、肿瘤形成、以及癌细胞增殖中的一种或多种。
在以下情况下，抗体被定义为“特异性结合”：1)它们表现出阈值水平的结合活性；和/或2)它们不与已知的相关多肽分子发生显著的交叉反应。抗体的结合亲和力可以容易地由本领域的普通技术人员，例如通过Scatchard分析(Scatchard,Ann.NYAcad.Sci.51:660-672,1949)来确定。
本公开提供了用于治疗和/或预防受试者的癌症或癌症症状的方法，所述方法包括向所述受试者施用治疗有效量的一种或多种本公开的BPTF抑制剂。在一些实施方案中，所述癌症是与BPTF过表达相关的癌症。在一些实施方案中，所述癌症是乳腺癌、皮肤癌、食道癌、肝癌、胰腺癌、前列腺癌、子宫癌、宫颈癌、肺癌、膀胱癌、卵巢癌、多发性骨髓瘤或黑色素瘤。在一些实施方案中，所述癌症处于非激素调节的组织中。
抑制剂化合物的治疗有效量可以根据药剂师公知的程序凭经验来确定，并且将尤其取决于患者的年龄、病况的严重程度、以及所需的最终药物制剂。可以例如通过吸入、或栓剂；或向粘膜组织，如通过向阴道组织、直肠组织、尿道组织、颊面组织以及舌下组织灌洗；口服、局部、鼻内、腹膜内、肠胃外、静脉内、淋巴内、瘤内、肌内、间质内、动脉内、皮下、眼内、滑膜内、经上皮以及经皮施用本发明的调节剂。在一些实施方案中，通过灌洗、口服或动脉内施用所述抑制剂。其它合适的引入方法还可以包括可再充电的或可生物降解的装置以及缓慢释放或持续释放聚合物装置。如上文所述，本公开的治疗性组合物还可以作为联合疗法的一部分与其它已知的抗癌剂或其它已知的抗骨骼疾病治疗方案一起被施用。
本公开进一步提供了调节患者的BPTF相关生物活性的方法。所述方法包括向所述患者施用有效抑制一种或多种BPTF生物活性的量的BPTF抑制剂。用于测量BPTF生物活性的合适的测定阐述于上文和下文中。
本公开还提供了抑制有需要的患者的癌细胞生长的方法，所述方法包括向所述患者施用治疗有效量的一种或多种BPTF抑制剂。用于测量BPTF相关的细胞生长的合适的测定是本领域技术人员已知的并且阐述于上文和下文中。
本公开进一步提供了抑制有需要的患者的癌症的方法。所述方法包括确定所述患者是否是如本文所述的BPTF疗法的候选者(例如其中BPTF过表达)以及如果所述患者是BPTF疗法的候选者，那么向所述患者施用治疗有效量的一种或多种BPTF抑制剂。如果所述患者不是BPTF疗法的候选者，那么用常规的癌症治疗对所述患者进行治疗。
本公开进一步提供了抑制被诊断患有癌症或疑似患有癌症的患者的癌症的方法。所述方法包括向所述患者施用治疗有效量的一种或多种BPTF抑制剂。
本公开还提供了调节患者的癌症的一种或多种症状的方法，所述方法包括向所述患者施用治疗有效量的本文所述的BPTF抑制性组合物。
本公开还提供了用于抑制有需要的患者的癌细胞迁移的方法，所述方法包括向所述患者施用治疗有效量的BPTF抑制剂。用于测量BPTF相关的细胞迁移的合适测定是本领域技术人员已知的。
本公开还提供了用于预防性治疗易患癌症、癌症转移或已经有转移并且因此容易再发或复发的患者的方法。所述方法对高风险个体是特别有用的，所述高风险个体例如有癌症或转移性肿瘤的家族史，或显示出对癌症转移的遗传易感性。在一些实施方案中，所述肿瘤是BPTF相关肿瘤。“BPTF相关”肿瘤或癌症是与相同的非肿瘤或非癌细胞类型相比，显示出增加的BPTF表达的肿瘤或癌症。此外，所述方法可用于防止患者出现BPTF相关肿瘤的复发，所述患者的BPTF相关肿瘤已经通过手术切除术而被去除或使用常规的癌症治疗来治疗。
本公开还提供了抑制癌症进展和/或引起癌症消退的方法，所述方法包括向患者施用治疗有效量的BPTF抑制剂。
在一些实施方案中，将需要抗癌治疗的患者用本公开的BPTF抑制剂联同化学疗法和/或放射疗法来治疗。举例来说，在施用BPTF抑制剂之后，还可以将患者用治疗有效量的抗癌辐射来治疗。在一些实施方案中，提供了化学治疗性处理与BPTF抑制剂的组合。在一些实施方案中，将BPTF抑制剂与化学疗法和放射疗法组合施用。
治疗方法包括向患者施用单次剂量或多次剂量的一种或多种BPTF抑制剂。在一些实施方案中，BPTF抑制剂以可注射药物组合物的形式被施用，所述组合物是无菌的、无热原的并且包含BPTF调节剂与药学上可接受的载体或稀释剂的组合。
在一些实施方案中，将本公开的治疗方案与用于癌症的常规治疗方案一起使用，所述常规治疗方案包括但不限于手术、放射疗法、激素消融和/或化学疗法。本公开的BPTF抑制剂的施用可以在常规的癌症治疗之前、同时或之后进行。在一些实施方案中，向所述患者施用两种或更多种不同的BPTF抑制剂。
在一些实施方案中，向所述患者施用的BPTF抑制剂的量有效抑制以下各项中的一种或多种：癌细胞生长、肿瘤形成、癌细胞增殖、癌细胞转移、癌细胞迁移、血管生成等。在一些实施方案中，向所述患者施用的BPTF抑制剂的量有效增加经由细胞凋亡的癌细胞死亡。
在一些实施方案中，本公开提供了包含两种或更多种BPTF抑制剂的组合物以提供更高的对抗癌症的功效。在一些实施方案中，所述BPTF抑制剂是抑制性核酸分子(例如shRNA、siRNA以及反义分子)或抑制性抗体。并行施用两种或更多种治疗剂不需要同时或通过相同的途径施用所述药剂，只要所述药剂发挥它们的治疗作用的时间段上存在重叠即可。涵盖了同时施用或相继施用，也涵盖了在不同天或不同周施用。
在一些实施方案中，本公开的方法涵盖了施用不同的BPTF抑制剂的组合或“混合物”。
可以与本公开的BPTF抑制剂组合使用的癌症化学治疗剂包括但不限于烷化剂，如卡铂(carboplatin)和顺铂(cisplatin)；氮芥烷化剂；亚硝基脲烷化剂，如卡莫司汀(carmustine)(BCNU)；抗代谢物，如甲氨蝶呤(methotrexate)；亚叶酸；嘌呤类似物抗代谢物、巯基嘌呤；嘧啶类似物抗代谢物，如氟尿嘧啶(fluorouracil)(5-FU)和吉西他滨(gemcitabine)激素类抗肿瘤药，如戈舍瑞林(goserelin)、亮丙瑞林(leuprolide)、以及他莫昔芬(tamoxifen)；天然抗肿瘤药，如阿地白介素(aldesleukin)、白细胞介素-2、多烯紫杉醇(docetaxel)、依托泊苷(etoposide)(VP-16)、干扰素α、紫杉醇(paclitaxel)以及维甲酸(tretinoin)(ATRA)；抗生素天然抗肿瘤药，如博来霉素(bleomycin)、更生霉素(dactinomycin)、柔红霉素(daunorubicin)、多柔比星(doxorubicin)、道诺霉素(daunomycin)以及丝裂霉素(mitomycin)，包括丝裂霉素C；以及长春花生物碱天然抗肿瘤药，如长春碱(vinblastine)、长春新碱(vincristine)、长春地辛(vindesine)；羟基脲；醋葡醛内酯(aceglatone)、阿霉素(adriamycin)、异环磷酰胺(ifosfamide)、依诺他滨(enocitabine)、环硫雄醇(epitiostanol)、阿柔比星(aclarubicin)、安西他滨(ancitabine)、盐酸甲基苄肼(procarbazinehydrochloride)、卡波醌(carboquone)、卡铂、卡莫氟(carmofur)、色霉素A3(chromomycinA3)、抗肿瘤多糖、抗肿瘤血小板因子、环磷酰胺(cyclophosphamide)裂裥菌素(Schizophyllan)、阿糖胞苷(cytarabine/cytosinearabinoside)、达卡巴嗪(dacarbazine)、硫肌苷(thioinosine)、噻替哌(thiotepa)、替加氟(tegafur)、海兔毒素(dolastatin)、海兔毒素类似物(如阿里他汀(auristatin))、CPT-11(伊立替康(irinotecan))、米托蒽醌(mitozantrone)、长春瑞滨(vinorelbine)、替尼泊苷(teniposide)、氨基蝶呤(aminopterin)、洋红霉素(caminomycin)、埃斯培拉霉素(esperamicin)(参见例如美国专利号4,675,187)、新制癌菌素(neocarzinostatin)、OK-432、博来霉素、氟铁龙(furtulon)、溴尿苷(broxuridine)、白消安(busulfan)、二磷酸已烯雌酚四钠(honvan)、培洛霉素(peplomycin)、贝他汀(bestatin)干扰素-β、美雄烷(mepitiostane)、二溴甘露醇(mitobronitol)、美法仑(melphalan)、层粘连蛋白肽、香菇多糖(lentinan)、云芝(Coriolusversicolor)提取物、替加氟/尿嘧啶、雌莫司汀(estramustine)(雌激素/二氯甲基二乙胺(mechlorethamine))。
可以被用作用于癌症患者的疗法的另外的药剂包括EPO、G-CSF、更昔洛韦(ganciclovir)；抗生素、亮丙瑞林；哌替啶(meperidine)；齐多夫定(zidovudine)(AZT)；白细胞介素1至18，包括突变体和类似物；干扰素或细胞因子，如干扰素α、干扰素β以及干扰素γ；激素，如促黄体激素释放激素(LHRH)和类似物以及促性腺激素释放激素(GnRH)；生长因子，如转化生长因子-β(TGF-β)、成纤维细胞生长因子(FGF)、神经生长因子(NGF)、生长激素释放因子(GHRF)、表皮生长因子(EGF)、成纤维细胞生长因子同源因子(FGFHF)、肝细胞生长因子(HGF)、以及胰岛素生长因子(IGF)；肿瘤坏死因子-α和β(TNF-α和β)；侵袭抑制因子-2(IIF-2)；骨形态发生蛋白1-7(BMP1-7)；生长抑素；胸腺素-α-1；γ-球蛋白；超氧化物歧化酶(SOD)；补体因子；抗血管生成因子；抗原物质；以及前药。此外，BPTF抑制剂可以与靶向剂组合，所述靶向剂包括但不限于靶向BRAF(威罗菲尼或达拉菲尼)、MEK(曲美替尼(trametinib))、HER2(例如赫赛汀(herceptin))、以及EGFR(例如吉非替尼(gefitinib))的那些靶向剂。其它靶向组合包括BPTF抑制剂和以下各项中的一种或多种：爱必妥(Erbitux)(西妥昔单抗(cetuximab))、益伏(Yervoy)(易普利单抗(ipilimumab))以及帕妥珠单抗(pertuzumab)。这些疗法的实例还包括但绝不限于小分子激酶抑制剂，如伊马替尼(Imatinib)(格列卫(Gleevec))、舒尼替尼(Sunitinib)(索坦(Sutent))、索拉非尼(Sorafenib)(多吉美(Nexavar))、埃罗替尼(Erlotinib)(特罗凯(Tarceva))、达沙替尼(Dasatinib)(施达赛(Sprycel))、尼罗替尼(Nilotinib)(泰息安(Tasigna))、拉帕替尼(Lapatinib)(泰嘉锭(Tykerb))、克唑替尼(Crizotinib)(赛可瑞(Xalkori))、卢佐替尼(Ruxolitinib)(加卡菲(Jakafi))、凡德他尼(Vandetanib)(开谱萨(Caprelsa))、帕唑帕尼(Pazopanib)(福退癌(Votrient))、阿法替尼(afatinib)、阿立塞替(alisertib)、阿瓦替尼(amuvatinib)、阿西替尼(axitinib)、波舒替尼(bosutinib)、布立尼布(brivanib)、卡奈替尼(canertinib)、卡博替尼(cabozantinib)、西地尼布(cediranib)、克拉尼布(crenolanib)、达克替尼(dacomitinib)、达鲁舍替(danusertib)、多韦替尼(dovitinib)、福瑞替尼(foretinib)、简特斯匹(ganetespib)、依鲁替尼(ibrutinib)、印尼帕尼(iniparib)、兰伐替尼(lenvatinib)、利尼伐尼(linifanib)、林斯替尼(linsitinib)、马赛替尼(masitinib)、莫米洛替尼(momelotinib)、莫特塞尼(motesanib)、来那替尼(neratinib)、尼拉帕尼(niraparib)、奥普佐咪(oprozomib)、奥拉帕尼(olaparib)、皮克里尼(pictilisib)、泊那替尼(ponatinib)、奎扎替尼(quizartinib)、瑞戈非尼(regorafenib)、瑞格舍替(rigosertib)、鲁卡帕尼(rucaparib)、塞卡替尼(saracatinib)、塞瑞德(saridegib)、坦度替尼(tandutinib)、他索替尼(tasocitinib)、替拉替尼(telatinib)、替瓦替尼(tivantinib)、替沃尼布(tivozanib)、托法替尼(tofacitinib)、瓦他拉尼(vatalanib)、维力帕尼(veliparib)、维莫德(vismodegib)、沃拉舍替(volasertib)、BMS-540215、BMS777607、JNJ38877605、TKI258、GDC-0941(Folkes等,J.Med.Chem.2008,51,5522)、BZE235、以及其它药剂。
前药指的是药物活性物质的前体或衍生形式，所述前体或衍生形式与母体药物相比对肿瘤细胞具有更低的细胞毒性或无细胞毒性并且能够被酶促活化或转化成具有活性的或更具活性的母体形式。参见例如Wilman,“ProdrugsinCancerChemotherapy(癌症化学疗法中的前药)”,BiochemicalSocietyTransactions,14,第375-382页,第615次会议(615thMeeting),贝尔法斯特(Belfast)(1986)；以及Stella等,“Prodrugs:AChemicalApproachtoTargetedDrugDelivery(前药：靶向药物递送的一种化学方法)”,DirectedDrugDelivery(《定向药物递送》),Borchardt等,(编著),第247-267页,HumanaPress(1985)。前药包括但不限于含有磷酸盐的前药、含有硫代磷酸盐的前药、含有硫酸盐的前药、含有肽的前药、D-氨基酸修饰的前药、糖基化前药、含有b-内酰胺的前药、含有任选取代的苯氧基乙酰胺的前药或含有任选取代的苯乙酰胺的前药、5-氟胞嘧啶以及其它5-氟尿苷前药，它们可以被转化成更具活性的细胞毒性游离药物。可以被衍生成本文中供使用的前药形式的细胞毒性药物的实例包括但不限于上文所述的那些化学治疗剂。
在一些实施方案中，本公开的方法和组合物特别可用于乳腺癌、脑癌(多形性成胶质细胞瘤)、皮肤癌、食道癌、肝癌、胰腺癌、前列腺癌、子宫癌、宫颈癌、肺癌、膀胱癌、卵巢癌、多发性骨髓瘤以及黑色素瘤。
本公开还提供了药物组合物，所述药物组合物包含本文所述的BPTF抑制剂中的一种或多种和药学上可接受的载体。在一些实施方案中，所述药物组合物被制备成呈液体溶液或悬浮液形式的注射剂；还可以制备适合于在注射之前溶解或悬浮在液体媒介物中的固体形式。脂质体被包括在药学上可接受的载体的定义内。在药物组合物中还可以存在药学上可接受的盐，例如无机酸盐，如盐酸盐、氢溴酸盐、磷酸盐、硫酸盐等；以及有机酸盐，如乙酸盐、丙酸盐、丙二酸盐、苯甲酸盐等。关于药学上可接受的赋形剂的深入论述可在Remington:TheScienceandPracticeofPharmacy(《雷明顿：药学科学和实践》)(1995)AlfonsoGennaro,Lippincott,Williams,&Wilkins中获得。
本公开还提供了用于检测BPTF的方法。在一些实施方案中，可以在患者体内或在体外在患者样品中检测BPTF。在一些实施方案中，所述方法包括向患者施用包含与BPTF多肽或核酸结合的一种或多种BPTF抑制剂的组合物以及检测被标记有可检测的标记的BPTF药剂在所述患者中的定位。在一些实施方案中，所述患者样品包含癌细胞。在一些实施方案中，所述BPTF抑制剂与成像剂连接或被可检测地标记。在一些实施方案中，BPTF抑制剂或结合剂是与成像剂缀合的BPTF抗体并且被施用于患者以检测一种或多种肿瘤或确定所述患者对BPTF疗法的敏感性。标记的抗体将与细胞中或细胞上的BPTF多肽结合并且从而积聚在肿瘤部位。使用标准成像技术，可以检测肿瘤的部位。
本公开还提供了对表达或过表达BPTF的细胞或肿瘤进行成像/检测的方法，所述方法包括使包含与BPTF结合的药剂(例如核酸或抗体)的组合物与样品接触以及检测所述样品中BPTF的存在。在一些实施方案中，所述样品是患者样品。在一些实施方案中，所述患者样品包含癌细胞。
检测方法是本领域技术人员公知的。举例来说，检测多核苷酸的方法包括但不限于PCR、RNA印迹、DNA印迹、RNA保护、以及DNA杂交(包括原位杂交)。检测多肽的方法包括但不限于蛋白质印迹、ELISA、酶活性测定、狭缝印迹、肽质量指纹图谱分析、电泳、免疫化学以及免疫组织化学。检测方法的其它实例包括但不限于放射免疫测定(RIA)、化学发光免疫测定、荧光免疫测定、时间分辨荧光免疫测定(TR-FIA)、双色荧光显微镜法、或免疫色谱测定(ICA)，全部均是本领域技术人员公知的。在一些实施方案中，使用PCR方法检测多核苷酸表达并且使用ELISA技术检测多肽产生。
用于给定核酸的RNA印迹杂交的合适探针可以由BPTF的核酸序列(例如SEQIDNO:1)产生。用于制备标记的DNA探针和RNA探针的方法以及用于使其与靶核苷酸序列杂交的条件描述于MolecularCloning:ALaboratoryManual(《分子克隆：实验室手册》),J.Sambrook等编著,第2版,冷泉港实验室出版社,1989,第10章和第11章中。
在一个实施例中，核酸探针可以被标记有例如放射性核苷酸，如3H、32P、33P、14C或35S；重金属；或能够充当标记的配体的特异性结合对成员的配体(例如生物素、亲和素或抗体)；荧光分子；化学发光分子；或酶。可以通过切口平移、随机引物法、或本领域技术人员已知的其它方法将探针标记成高比活度。举例来说，通过根据切口平移方法将先前存在的核苷酸置换成高放射性核苷酸，已知制备具有远超过108cpm/微克的比活度的32P标记的核酸探针。
然后可以通过将杂交的过滤器曝露于照相底片来对杂交进行放射自显影检测。对由杂交的过滤器所曝光的照相底片进行光密度扫描提供了对miRNA转录物水平的准确测量。在另一个实施方案中，可以通过计算机化成像系统，如可从新泽西州皮斯卡塔韦的阿默舍姆生物科技公司(AmershamBiosciences,Piscataway,N.J.)获得的分子动力学400-B2D磷光体成像器对基因转录物水平进行定量。
在另一个实施方案中，可以使用随机引物法将类似物，例如dTTP类似物5-(N-(N-生物素基-ε-氨基己酰基)-3-氨基烯丙基)脱氧尿苷三磷酸掺入到探针分子中。生物素化的探针寡核苷酸可以通过与和产生显色反应的荧光染料或酶连接的生物素结合蛋白，如亲和素、链霉亲和素、以及抗体(例如抗生物素抗体)反应来检测。
在另一个实施方案中，可以使用原位杂交技术来对表达水平进行测定。这种技术与RNA印迹技术相比需要更少的细胞，并且包括将全细胞沉积到显微镜盖玻片上以及使用含有放射性的或以其它方式标记的核酸(例如cDNA或RNA)探针的溶液探测细胞的核酸含量。这种技术对于分析来自受试者的组织活检样品来说是特别适当的。原位杂交技术的实施更详细地描述于美国专利号5,427,916中，该美国专利的公开内容以引用的方式并入本文。
细胞中基因转录物的相对数目还可以通过以下方式来确定：使基因转录物进行逆转录，继而通过聚合酶链反应(RT-PCR)使逆转录的转录物扩增。可以将基因转录物的水平与内标相比较来定量，所述内标例如同一样品中存在的“看家”基因的mRNA水平。用作内标的合适的“看家”基因包括例如肌球蛋白或甘油醛-3-磷酸脱氢酶(G3PDH)。用于定量RT-PCR的方法和其变化方案在本领域的技术范围内。在另一个实施方案中，使用高通量茎环实时定量聚合酶链反应(RT-qPCR)来检测miRNA表达。参见Mestdagh等,NucleicAcidResearch36(21)(2008))。
具体样品的“表达谱”或“杂交谱”基本上是样品状态的指纹图谱；虽然两种状态可以具有类似地表达的任何特定的基因，但同时评价多种基因允许产生细胞状态所特有的基因表达谱。即，可以辨别正常组织与癌症组织，并且在癌症组织内，可以确定不同的预后状态(例如良好的或不良的长期存活前景)。通过比较处于不同状态的癌症组织的表达谱，获得有关在这些状态中的每一种中哪些基因重要(包括基因的上调和下调这两者)的信息。对差异性地表达于癌症组织或正常组织中的序列以及引起不同的预后结果的差异表达的鉴定允许以多种方式使用这一信息。举例来说，可以评价具体的治疗方案(例如以确定化学治疗药物是否起作用以改善具体患者的长期预后)。类似地，可以通过将患者样品与已知的表达谱相比较来进行或确认诊断。此外，这些基因表达谱(或单个基因)允许筛选抑制癌症表达谱或使不良的预后谱转变成较好的预后谱的药物候选者。
根据本文所述的表达谱分析方法，对来自疑似患有癌症(例如黑色素瘤、乳腺癌、GBM)的受试者的样品的总RNA进行定量逆转录以提供与所述样品中的RNA互补的一组标记的靶寡脱氧核苷酸。然后使所述靶寡脱氧核苷酸与包含RNA特异性探针寡核苷酸的微阵列杂交以提供所述样品的杂交谱。结果是代表了所述样品中基因的表达模式的所述样品的杂交谱。所述杂交谱包含由来自所述样品的靶寡脱氧核苷酸与所述微阵列中的BPTF特异性探针寡核苷酸结合所产生的信号。所述谱可以被记录成存在或不存在结合(有信号或零信号)。通常，所记录的谱包括来自每一次杂交的信号强度。将所述谱与由对照样品产生的杂交谱相比较。信号的改变指示所述受试者的化学疗法响应。
用于测量基因表达的其它技术也在本领域的技术范围内，并且包括用于测量RNA转录和降解的速率的各种技术，包括RNA酶保护测定、核连缀、狭缝印迹等。
在另一个实施方案中，本公开提供了一种用于在受试者中预测癌症的存在的方法。所述方法包括以下步骤：确定相对于来自一种或多种对照样品的BPTF的表达，在来自所述受试者的生物样品中BPTF是否过表达或低表达。在一个具体的实施方案中，与对照生物样品相比来自受试者的生物样品的BPTF的过表达水平表明所述受试者的样品是否是恶性的。所述癌症可以是例如GBM、黑色素瘤或乳腺癌。
在又另一个实施方案中，本公开提供了一种确定受试者的癌症进展的方法。所述方法包括以下步骤：测量来自在各个时间点从患有癌症的患者获取的生物样品的BPTF的表达水平，因此来自不同时间点的样品之间BPTF的表达水平的变化表明所述受试者的癌症正进展或恢复。在一个具体的实施方案中，如果在更早时间点与更晚时间点之间BPTF的表达水平升高，那么这表明所述受试者的癌症正在向癌症的更晚期阶段进展。在一个替代性实施方案中，如果在更早时间点与更晚时间点之间BPTF的表达水平降低，那么这表明所述受试者的癌症在缓解过程中。在另一个实施方案中，所述癌症是黑色素瘤、乳腺癌或GBM。
在又另一个实施方案中，本公开提供了一种确定患有癌症的受试者的存活率的方法。所述方法包括以下步骤：测量来自在各个时间点从患有癌症的患者获取的生物样品的BPTF的水平，因此来自不同时间点的样品之间BPTF的水平的变化表明所述受试者的存活率降低或增加。在一个具体的实施方案中，如果在更早时间点与更晚时间点之间BPTF的表达或过表达的水平升高，那么这将表明所述受试者的存活率降低。在一个替代性实施方案中，如果在更早时间点与更晚时间点之间BPTF的水平降低，那么这将表明所述受试者的存活率提高。在另一个实施方案中，所述癌症是黑色素瘤、乳腺癌或GBM。BPTF的水平可以经由蛋白质检测、DNA检测技术以及测量RNA表达来测定。
在另一个实施方案中，本公开提供了一种治疗癌症的方法，所述方法包括施用有效量的抑制BPTF的表达或活性的药剂。
如本文所用的术语“治疗(treat)”、“治疗(treating)”以及“治疗(treatment)”指的是使与疾病或病况例如黑色素瘤的相关的症状缓解，包括预防或延缓疾病症状发作和/或减少所述疾病或病况的症状的严重程度或频率。术语“受试者”和“个体”在本文被定义为包括动物，如哺乳动物，包括但不限于灵长类动物、母牛、绵羊、山羊、马、狗、猫、兔、豚鼠、大鼠、小鼠或其它牛科动物、绵羊科动物、马科动物、犬科动物、猫科动物、啮齿类动物或鼠类物种。在一个优选的实施方案中，所述哺乳动物是人类。
如本文所用的BPTF抑制剂的“有效量”是足以抑制患有癌症的受试者的癌细胞的增殖或侵袭性的量。本领域技术人员可以容易地通过考虑以下因素来确定欲向给定受试者施用的BPTF抑制剂的有效量：诸如受试者的体格大小和体重；疾病侵入的程度；受试者的年龄、健康情况以及性别；施用途径；以及施用是局部的还是全身性的。
可以由包含含有抑制性BPTF剂的多核苷酸和/或减少BPTF表达的药剂的组合物治疗的癌症包括没有血管化或尚未基本上血管化的肿瘤以及血管化的肿瘤。所述癌症可以包括非实体肿瘤(如白血病和淋巴瘤)或可以是实体肿瘤。
在一个具体的实施方案中，本公开提供了一种治疗受试者的癌症，如黑色素瘤、乳腺癌或GBM的方法，所述方法包括施用有效量的抑制BPTF的表达或活性的药剂。在另一个实施方案中，所述药剂是shRNA。在另一个实施方案中，所述药剂是双链miRNA模拟物。miRNA模拟技术是本领域公知的。参见例如Wang,Z.,2009,miRNAmimictechnology(miRNA模拟技术),MicroRNAInterferenceTechnologies(《微小RNA干扰技术》),第93-100页,Springer-LinkPublications。在另一个实施方案中，所述药剂是基于寡核苷酸的BPTF药物。
可以向受试者的细胞递送编码针对BPTF的shRNA或miRNA分子的表达载体以治疗或预防癌症。所述核酸分子以其中它们可以被摄取的形式向受试者的细胞递送并且被有利地表达以使得可以实现治疗有效水平。能够表达BPTFshRNA的表达载体可商购自各种供应商。
用于向细胞递送包含减少BPTF表达的抑制性核酸剂的多核苷酸的方法包括使用递送系统，如脂质体、聚合物、微球体、基因治疗载体、修饰的核酸(例如电荷中和的核酸)以及裸DNA载体。
可以使用转导病毒(例如逆转录病毒、腺病毒、慢病毒以及腺相关病毒)载体进行体细胞基因疗法，这特别是因为它们的高感染效率以及稳定的整合和表达(参见例如Cayouette等,HumanGeneTherapy8:423-430(1997)；Kido等,CurrentEyeResearch15:833-844(1996)；Bloomer等,JournalofVirology71:6641-6649(1997)；Naldini等,Science272:263-267(1996)；以及Miyoshi等,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.94:10319(1997))。举例来说，可以将编码针对BPTF的抑制性核酸的多核苷酸克隆到逆转录病毒载体中并且它的表达可以由内源性启动子、逆转录病毒长末端重复序列、或对目的靶细胞类型具有特异性的启动子所驱动。可以使用的其它病毒载体包括例如牛痘病毒、牛乳头状瘤病毒、或疱疹病毒，如埃-巴二氏病毒(Epstein-BarrVirus)(还参见例如以下参考文献的载体：Miller,HumanGeneTherapy15-14,(1990)；Friedman,Science244:1275-1281(1989)；Eglitis等,BioTechniques6:608-614(1988)；Tolstoshev等,CurrentOpinioninBiotechnology1:55-61(1990)；Sharp,TheLancet337:1277-1278(1991)；Cornetta等,NucleicAcidResearchandMolecularBiology36(31):1-322(1987)；Anderson,Science226:401-409(1984)；Moen,BloodCells17:407-416(1991)；Miller等,Biotechnology7:980-990(1989)；LeGalLaSalle等,Science259:988-990(1993)；以及Johnson,Chest107:77S-83S(1995))。逆转录病毒载体是特别健全的并且已经被用于临床环境中(Rosenberg等,N.Engl.J.Med323:370(1990)；Anderson等,美国专利号5,399,346；Gruber等,美国专利公开号2011/0287020A1)。还可以利用非病毒方法将基于针对BPTF的抑制性核酸的治疗剂引入到被诊断为有瘤形成的患者的细胞中。举例来说，包含针对BPTF的抑制性核酸的多核苷酸可以通过以下方式被引入到细胞中：在阳离子脂质存在下施用核酸(Feigner等,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.84:7413(1987)；Ono等,NeuroscienceLetters17:259(1990)；Brigham等,Am.J.Med.Sci.298:278(1989)；以及Staubinger等,MethodsinEnzymology101:512(1983))；脱唾液酸血清类粘蛋白-聚赖氨酸缀合(Wu等,JournalofBiologicalChemistry263:14621(1988)；Wu等,JournalofBiologicalChemistry264:16985(1989))；或通过在手术条件下进行微量注射(Wolff等,Science247:1465(1990))。包含针对BPTF的抑制性核酸的多核苷酸和/或抑制BPTF表达的药剂可以与脂质体和鱼精蛋白组合施用。
在另一个实施方案中，本公开提供了治疗性组合物，所述治疗性组合物包含含有抑制BPTF表达的针对BPTF的抑制性核酸的多核苷酸，以治疗癌症，如黑色素瘤。在另一个实施方案中，本公开提供了一种药物组合物，所述药物组合物包含抑制BPTF表达的药剂。
包含针对BPTF的抑制性核酸的多核苷酸和/或抑制BPTF表达的药剂可以作为药物组合物的一部分被施用。所述药物组合物优选地是无菌的并且在适合于向受试者施用的重量或体积单位中含有治疗有效量的包含抑制性BPTF核酸的多核苷酸分子和/或抑制BPTF表达的药剂。
包含抑制性BPTF核酸的治疗性多核苷酸分子和/或抑制BPTF表达的药剂可以与药学上可接受的载体一起在单位剂型中被施用。可以利用常规的药学实践来提供合适的制剂或组合物以向患有癌症的患者施用化合物。
如本文所用的载体包括在所利用的剂量和浓度下对所暴露的细胞或哺乳动物无毒的药学上可接受的载体、赋形剂或稳定剂。常常，生理学上可接受的载体是水性pH缓冲溶液。生理学上可接受的载体的实例包括缓冲剂，如磷酸盐、柠檬酸盐以及其它有机酸；抗氧化剂，包括抗坏血酸；低分子量(少于约10个残基)多肽；蛋白质，如血清白蛋白、明胶、或免疫球蛋白；亲水性聚合物，如聚乙烯吡咯烷酮；氨基酸，如甘氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、精氨酸或赖氨酸；单糖、二糖、以及其它碳水化合物，包括葡萄糖、甘露糖或糊精；螯合剂，如EDTA；糖醇，如甘露醇或山梨糖醇；成盐平衡离子，如钠；和/或非离子型表面活性剂，如TWEENTM、聚乙二醇(PEG)以及PLURONICSTM。
包含抑制性BPTF核酸的多核苷酸和/或抑制BPTF表达的药剂还可以被包封在例如通过界面聚合制备的微胶囊中，例如分别在胶态药物递送系统(例如脂质体、白蛋白微球体、微乳液、纳米粒子以及纳米胶囊)中或粗乳液中的羟甲基纤维素或明胶微胶囊和聚(甲基丙烯酸甲酯)微胶囊。待用于体内施用的制剂必须是无菌的。这可容易地通过经由无菌滤膜过滤来实现。可以制备持续释放制剂。持续释放制剂的合适实例包括固体疏水性聚合物的半透性基质，所述基质包含含有抑制性BPTF核酸的多核苷酸和/或抑制BPTF表达的药剂，所述基质呈成型制品(例如膜或微胶囊)的形式。持续释放基质的实例包括聚酯、水凝胶(例如聚(2-羟乙基-甲基丙烯酸酯)或聚(乙烯醇))、聚丙交酯(美国专利号3,773,919)、L-谷氨酸和γ-乙基-L-谷氨酸酯的共聚物、不可降解的乙烯-乙酸乙烯酯、可降解的乳酸-乙醇酸共聚物，如LUPRONDEPOTTM(由乳酸-乙醇酸共聚物和醋酸亮丙瑞林构成的可注射微球体)；以及聚-D-(-)-3-羟丁酸。虽然诸如乙烯-乙酸乙烯酯和乳酸-乙醇酸等聚合物使得分子能够释放超过100天，但是某些水凝胶使分子释放较短的时间段。
在另一个实施方案中，包含含有抑制性BPTF核酸的多核苷酸和/或抑制BPTF表达的药剂的药物组合物联同其它治疗剂一起被施用。关于施用其它治疗剂的“联同”指的是可以在包含含有抑制性BPTF核酸的多核苷酸和/或抑制BPTF表达的药剂的药物组合物之前、同时或之后施用的药剂。
在另一个实施方案中，本公开提供了一种用于确定受试者患有癌症和/或癌症进展的可能性的试剂盒，所述试剂盒包含：a)与BPTF互补的寡核苷酸；以及b)任选的用于在所述寡核苷酸与BPTF之间形成杂交的试剂。在另一个实施方案中，所述试剂盒任选地包括用于监测源自于受试者的生物样品中标志物的核酸分子水平的说明书。在另一个实施方案中，所述试剂盒包含无菌容器，所述无菌容器容纳引物、探针或其它检测试剂；这些容器可以是盒、安瓿、瓶子、小瓶、管、袋、小袋、泡罩包装或本领域已知的其它合适的容器形式。这些容器可以由塑料、玻璃、层压纸、金属箔或适合于容纳核酸的其它材料制成。说明书一般将包括有关本文所述的引物或探针的使用以及它们在诊断癌症中的用途的信息。优选地，所述试剂盒进一步包含本文所述的诊断测定中所述的试剂中的任何一种或多种。在其它实施方案中，所述说明书包括以下各项中的至少一种：引物或探针的说明；用于使用所附的材料来诊断癌症的方法；注意事项；警告；适应症；临床或调查研究；和/或参考文献。所述说明书可以被直接印刷在容器(在存在时)上，或被印刷成施加到所述容器的标签、或在所述容器中或连同所述容器一起供给的单独的薄片、小册子、卡片、或文件夹。
在另一个实施方案中，本公开提供了一种用于测定BPTF的表达水平的设备，所述设备包括固体载体，其中所述固体载体的表面与和BPTF互补的寡核苷酸连接。在一个实施方案中，所述设备是微阵列。固体载体的实例包括但不限于用于结合核酸的玻璃或硝化纤维素载片。
以下实施例意图说明，而不是限制本公开。虽然它们是可能使用的那些程序的典型，但是可以替代性地使用本领域技术人员已知的其它程序。
实施例
细胞培养和转染：如所述(Bagheri等,2006；Dar等,2011)获得C8161.9和1205-Lu人类黑色素瘤以及B16-F10鼠类黑色素瘤细胞。U251和LN18成胶质细胞瘤细胞系购自ATCC(弗吉尼亚州的马纳萨斯(Manassas,VA))。在含有5％胎牛血清(FBS)的DMEM/F12(加利福尼亚州卡尔斯巴德的英杰生命科技公司(InvitrogenLifeTechnologies,Carlsbad,CA))中培养C8161.9细胞；在TU2％培养基中培养1205-Lu细胞；并且在含5％FBS的RPMI-1640中培养B16-F10细胞。在含5％FBS的DMEM中培养U251和LN18。将所有细胞在37℃培养在含有5％CO2的气氛中。通过脂染胺-2000(Lipofectamine-2000)(加利福尼亚州卡尔斯巴德的英杰生命科技公司)，根据制造商的方案来进行瞬时转染。
质粒：质粒pcMV6-BPTF、pcMV6-Entry以及BPTF靶向shRNA载体组(4个克隆)pGFP-V-RS购自傲锐东源公司(Origene)(马里兰州罗克维尔的傲锐东源科技公司(OrigeneTechnologiesRockvilleMD))。来自这组的BPTFshRNA1和BPTFshRNA2用于鼠类细胞系。靶向BPTF的基于慢病毒的shRNA载体组(5个克隆)(RHS4533_NM_0059，以引用的方式并入本文)购自Openbiosystems公司(科罗拉多州的拉斐特(Lafayette,CO))。
RNA提取和cDNA合成：使用本领域常见的技术进行RNA提取和cDNA合成。
定量实时PCR(qRT-PCR)：使用TaqMan基因表达测定，根据制造商的说明书(应用生物系统公司(AppliedBiosystems))测定mRNA。用于BPTF、HPRT1、CCND2、BCL-XL、TWIST1、RAB14、CEBPB、CHI3L1、DLL3、OLIG2、PDGFRA以及BCL2的TaqMan探针购自应用生物系统公司(加利福尼亚州的福斯特城(FosterCity,CA))。
细胞活力、集落形成、细胞周期分析、以及BRAF抑制剂处理：如所述，使用本领域常见的技术，进行细胞活力和集落形成并且进行细胞周期分析。将细胞用不同浓度的威罗菲尼处理72小时或用达拉菲尼(印第安纳州印第安纳波利斯的Chemitek公司(Chemitek,Indianapolis,IN))处理48小时或处理指示的时间。使用DMSO作为媒介物。
蛋白质印迹分析：进行蛋白质印迹分析。通过使用以下特异性抗体来检测靶蛋白：针对BPTF的抗体(德克萨斯州蒙哥马利郡的BethylLaboratories公司)、针对BCL2和GAPDH的抗体(加利福尼亚州圣克鲁斯的圣克鲁斯生物技术公司(SantaCruzBiotechnology,SantaCruz,CA))、以及针对ERK1/2、pERK1/2、CCND2、BCL-XL、p90RSK的抗体(马萨诸塞州丹弗斯的细胞信号转导技术公司(CellSignalingTechnology,Danvers,MA))。
慢病毒转导和稳定细胞产生：将被克隆到pLKO1载体中的所选择的shRNA连同含有GAG/POL、REV以及VSVG基因的表达载体一起共转染到293T细胞中。在转染后48小时之时收集慢病毒。将亚汇合的人类黑色素瘤或成胶质细胞瘤细胞在8μg/ml的聚凝胺存在下用每一种所收集的慢病毒感染，并且在感染后48小时之时在它们对应的培养基中在1μg/ml的嘌呤霉素中选择。将B16-F10细胞用BPTFshRNA1、BPTFshRNA2或NegshRNA载体转染并且使用2μg/ml的嘌呤霉素选择稳定的转化体。
侵袭测定：使用常规的技术进行肿瘤侵袭的基质胶测定。对于B16-F10、1205-Lu以及C8161.9细胞，将插入腔室涂覆以15μl的6mg/ml蛋白质的的基质胶，对于C8161.9细胞，将插入腔室涂覆以17μl的7mg/ml蛋白质的基质胶，并且对于1205-Lu和U251细胞系，将插入腔室涂覆以15μl的5mg/ml蛋白质的基质胶。
DNA酶I敏感性的定量：将细胞收集并且重悬在冰冷的裂解缓冲液(100mMKCL、50mMTris-CL[pH7.9]、50％[体积/体积]甘油、200mMβ-巯基乙醇、以及5mMMgCl2)中并且孵育10分钟。通过在4℃将悬浮液以13,000g离心15分钟并且将细胞重悬在缓冲液A(50mMTris-Cl[pH7.9]、3mMMgCl2、0.2mM苯甲基磺酰氟、100mMNaCl、以及1mM二硫苏糖醇)中来将核从裂解的细胞中回收。在室温下在缓冲液A中将核用DNA酶I消化3分钟。然后用蛋白酶K处理样品并且使用QIAGENPCR纯化试剂盒(加利福尼亚州瓦伦西亚的快而精公司(Qiagen,Valencia,CA))回收DNA。使用BCL2和BCL-XL的特异性引物对DNA酶处理过的DNA进行qPCR。
组织阵列和免疫染色：所利用的组织微阵列是先前使用从石蜡块获取的1.0mm的核心直径而形成的。由福尔马林固定的组织微阵列制备载片并且将所述载片用1:100稀释的抗人类BPTF抗体(德克萨斯州蒙哥马利郡的BethylLaboratories公司)染色。在10mM柠檬酸盐缓冲液(pH6.0)中进行微波抗原修复。使用3％H2O2封闭内源性过氧化酶，并且使用正常兔血清进行另外的封闭。将一抗在含1.0％BSA的PBS中稀释并且在4℃施用过夜。通过使用生物素标记的抗山羊IgG和亲和素-生物素(加利福尼亚州伯林格姆的VectorLaboratories公司(VectorLaboratories,Burlingame,CA))，继而使用二氨基联苯胺来观测抗体染色。使用苏木精将切片复染色。
对免疫组织化学染色进行的数字评价：使用MiraxMIDI高分辨率扫描系统(德国耶拿的卡尔蔡司显微成像公司(CarlZeissMicroImaging,Jena,Germany))拍摄组织微阵列切片的整个载片图像。经由软件，使用具有ZeissPlan-Apopchromat20×/.8NA物镜(德国奥伯科亨的卡尔蔡司光电子有限公司(CarlZeissOptronicsGmBh,Oberkochen,Germany))的MarlinCCD照相机(德国的AlliedVisionTechnologies有限公司)来控制数字化过程而以0.32微米/像素的分辨率生成图像。将具有可鉴定的黑色素细胞病变的区域选用于评价，并且通过使用识别核(苏木精染色)和细胞质(棕色免疫染色)的两种不同的相位测量遮罩来施加分割特征以计算免疫组织化学染色。通过计算机辅助的颜色分割进行图像分析以确定表现阳性颜色的像素的百分比。对于每一个阳性像素，计算强度(被定义为红色值、绿色值以及蓝色值的平均值)以用于后续的分析。用于评估各种预后因素对黑色素瘤结果的意义的统计方法先前有所描述(Bagheri等,2006)。
基因表达谱分析：使用RNeasy试剂盒(加利福尼亚州瓦伦西亚的快而精公司(Qiagen,Valencia,CA))从细胞提取总RNA。通过使用与Cy3或Cy5的N-羟基琥珀酰亚胺基酯(宾夕法尼亚州匹兹堡的AmershamPharmacia公司(AmershamPharmacia,Pittsburgh,PA))连接的SuperScriptII逆转录酶(英杰公司)进行寡脱氧胸苷酸(oligo(dT))引发的聚合来将十微克的总RNA连同通用小鼠参考RNA(加利福尼亚州圣克拉拉的Stratagene公司(Stratagene,SantaClara,CA))一起转化成氨基烯丙基修饰的cDNA，然后如所述(Haqq等,2005)与微阵列载片杂交。在线性归一化、log(底数2)变换、以及受监督的层次聚类之后，将所得的聚类数据表输入到微阵列软件包的显著性分析中。选择δ来限制输出基因列表，以使得将包括5％的预测假阳性。
FISH和显微镜法：使用BAC克隆RP11-304I14、RP11-1134M2、RP11-29C18以及CTD-2314M10来检测17q24.3上的BPTF基因座(2009年2月UCSC基因组浏览器冻结，http://genome.ucsc.edu)。所有克隆均是从奥克兰研究所的儿童医院(Children'sHospitalofOaklandResearchInstitute，CHORI)获得的。使用大构建体试剂盒(Large-Constructkit)(加利福尼亚州瓦伦西亚的快而精公司)制备BACDNA并且如(Wiegant和Raap,2001)所述，将所述BACDNA通过切口平移而用AlexaFluor488dUTP(纽约州绿岛的分子探针公司(MolecularProbes,GreenIsland,NY))标记。在组织分析之前，通过与正常的中期伸展物与可商购获得的用于染色体17的着丝粒探针(科罗拉多州拉斐特的Openbiosystems公司)的组合杂交来验证所有探针的质量和定位。如先前所述(Wiegant和Raap,2001)进行组织切片上的杂交。使用由Axiovision软件控制的ZeissAxio成像器Z2(德国耶拿的蔡司公司(Zeiss,Jena,Germany))拍摄图像。
对FISH结果的分析：对FISH信号进行评估并且由具有多个Z栈层的图像手动计数。评价来自每一个病例的最少30个核并且根据先前所述的准则(Munne等,1998)解读信号并且将所述信号记录为2、3、4或更大。
动物研究：所有动物护理依照由加利福尼亚大学旧金山动物研究委员会(UniversityofCaliforniaSanFranciscoCommitteeonAnimalResearch)和加利福尼亚州太平洋医疗中心研究所(CaliforniaPacificMedicalCenterResearchInstitute)批准的机构准则和方案。通过尾静脉注射向各组45天大的雌性C57Bl/6(查尔斯河公司(CharlesRiver))接种30,000个B16-F10BPTF稳定细胞。通过尾静脉向裸小鼠注射1×106个1205-Lu细胞。对于皮下注射，分别注射1×106个1205-Lu细胞、B16-F10细胞或C8161.9细胞以及2×106个U251细胞。
统计分析：所有定量数据代表了至少一式三份样品或规定数目样品的平均值。误差棒代表了平均值的标准差。通过斯图登氏t检验(Student'st-test)或曼-惠特尼检验(Mann-Whitneytest)确定统计显著性，并且双侧p值<0.05被认为具有显著性。
BPTF基因敲低抑制了鼠类黑色素瘤的增殖、体内生长、以及转移潜能。最初在B16-F10鼠类黑色素瘤模型中使用shRNA介导的靶向来评估BPTF在黑色素瘤中的功能作用。如通过定量实时PCR(qRT-PCR)所确定，两种不同的抗BPTFshRNA(1和2)显著地抑制了BPTF表达(图1A)。在与对照shRNA相比时，shRNA介导的对BPTF表达的抑制基本上抑制了B16-F10细胞的增殖能力(图1B)。在与表达对照shRNA的细胞相比时，表达BPTFshRNA的细胞还表现出显著降低的向中的侵袭(图7A)。皮下注射表达BPTFshRNA的细胞显示出对肿瘤细胞生长的显著抑制(图1C)。向C57Bl/6小鼠静脉内接种BPTFshRNA显示出肺中转移性肿瘤计数的非常显著的减少(图1D)。这些结果证实了BPTF在黑色素瘤的增殖和转移潜能中的显著作用。
由于BPTF在癌症中未被表征的作用，进行cDNA微阵列分析以鉴定在抑制BPTF表达之后基因表达的整体模式。对稳定表达BPTFshRNA2和对照载体的B16-F10克隆进行cDNA微阵列分析。微阵列分析鉴定出27种基因的表达下调以及1008种基因过表达。下调的基因包括Bcl-xl和Ccnd2，这两者是肿瘤细胞增殖和细胞凋亡的关键介质。通过qRT-PCR以及蛋白质印迹分析确认了在B16-F10黑色素瘤中这些基因(以及Bcl-2)的差异表达(图1E-F)。
BPTF基因敲低抑制了人类黑色素瘤的增殖、体内生长、以及转移潜能。已经证实了BPTF在鼠类黑色素瘤细胞中的功能作用，对在人类黑色素瘤进展中的作用进行分析。使用与用于鼠类研究的shRNA不同的shRNA(BPTFshRNA3)靶向BPTF使得带有突变型BRAF的1205-Lu人类黑色素瘤细胞中BPTF的表达被显著抑制(图2A)。在与对照shRNA载体相比时，对BPTF的抑制引起G1/G0细胞周期停滞以及S期的显著减少(图2B)。BPTF基因敲低对黑色素瘤细胞的增殖能力具有显著的作用，如通过对细胞存活(图2C)和集落形成能力(图2D，p<0.02)的抑制所证实，并且伴有1205-Lu细胞的细胞凋亡指数显著增加(图2E，p<0.02)。使用靶向人类BPTF的两种其它shRNA观测到类似的对黑色素瘤细胞增殖和存活的作用。抑制BPTF还使得1205-Lu向中的侵袭性显著降低(图7B)。在与表达对照shRNA的细胞相比时，在表达BPTFshRNA的细胞中，裸小鼠的皮下肿瘤细胞生长受到相当大的抑制(图2F)。最终，抑制BPTF表达使得在静脉内接种1205-Lu细胞之后裸小鼠的肺中转移性肿瘤负荷减少了66％(图2G)。在带有野生型BRAF的高侵袭性C8161.9黑色素瘤细胞系中由shRNA介导的对BPTF的抑制之后确认了这些抗肿瘤作用(图8A-E)。综上所述，这些研究证实了BPTF在促进BRAF野生型和突变型黑色素瘤细胞系这两者的增殖和转移潜能中起重要作用。
BPTF调节BCL2、BCL-XL、CCND2以及ERK1/2通路的表达。FAC1是BPTF的截短形式，表现出序列特异性DNA结合活性。对BCL2和BCL-XL的启动子区域的分析表明了BPTF的可能的共有序列的存在。在稳定表达对照shRNA或BPTFshRNA的两种人类黑色素瘤细胞系中评估在这些基因的启动子区域中对DNA酶I处理的敏感性。DNA酶I超敏感性可能是由于转录因子结合或核小体定位或包装的变化(Gross和Garrard,1988)。使用qPCR分析，对BCL2和BCL-XL内含有假定的BPTF结合位点的DNA区域进行定量，并且发现所述DNA区域以大幅降低的水平存在于表达BPTFshRNA的1205-Lu和C8161.9人类黑色素瘤细胞这两者中(图3A-B)。因此，在具有减少的BPTF表达的人类黑色素瘤细胞中，BCL2和BCL-XL的启动子区域对DNA酶I处理表现出提高的敏感性。然后确认了在人类黑色素瘤细胞中，在BPTFshRNA表达后这些基因在mRNA水平上下调(图3C-D)。由于这些基因介导促存活通路，因此研究由BPTF表达调节的增殖信号转导通路，并且观测到在表达BPTFshRNA的黑色素瘤细胞中pERK1/2(Thr202/Tyr204)的水平被大幅抑制(图3E-F)。BPTF基因敲低还抑制了p90RSK(Ser380)，即pERK的下游靶标。在1205-Lu和C8161.9人类黑色素瘤细胞中，除了CCND2之外，BPTF基因敲低还调节了代表ERK通路的另外的效应子的BCL2和BCL-XL(Boucher等,2000)(图3E-F)。在稳定表达BPTFshRNA的黑色素瘤细胞中ERK1/2或BCL-XLcDNA的过表达逆转了在BPTF基因敲低后对细胞存活的抑制，这表明BPTF的促增殖功能至少部分地由ERK1/2和BCL-XL介导(图9)。
相反，在1205-Lu细胞中BPTF的过表达使得增殖能力显著提高(图10A)，并且伴有CCND2、BCL-XL以及BCL2的表达在mRNA和蛋白质水平上的上调(图10B-C)。
对黑色素细胞瘤中BPTF水平的定量。已经确定了BPTF在促进鼠类和人类黑色素瘤增殖和转移中的功能作用，对311名人类黑色素瘤患者的组织微阵列群组进行BPTF表达的免疫组织化学分析(Rangel等,2006)，并且使用数字成像分析(Kashani-Sabet等,2009)定量BPTF水平(图11)。通过卡普兰-迈耶分析，高水平的BPTF表达显著地预测了降低的无远处转移存活率(DMFS，p＝0.03，图4A)和疾病特异性存活率(DSS，p＝0.008，图4B)。通过多变量Cox回归分析，BPTF表达增加是DMFS(表1)和DSS(表2)的独立的预测因素。因此，BPTF过表达与人类黑色素瘤中远处转移的产生和存活率降低直接相关，并且是存活率的独立预测因素。
表1：对各种预后因素对黑色素瘤群组的无远处转移存活率的影响的多变量Cox回归分析。
表2：对各种预后因素对黑色素瘤群组的疾病特异性存活率的影响的多变量Cox回归分析。
为了确定黑色素瘤中的BPTF拷贝数，对81个良性痣样品和77个原发性黑色素瘤进行间期荧光原位杂交(FISH)。所有痣均具有2个拷贝的BPTF基因，而64％的黑色素瘤具有2个以上拷贝(2至2.9个拷贝)，22％具有3个以上拷贝(3至3.9个拷贝)并且14％具有4个以上拷贝(表3)。图4C-D示出了说明了低BPTF拷贝数和高BPTF拷贝数的代表性FISH显微照片。这些发现表明在显著比例的原发性黑色素瘤中BPTF拷贝数升高，这进一步支持了它的致癌作用。
表3：黑色素瘤和痣样品的BPTF拷贝数。
BPTF调节对选择性BRAF抑制剂的敏感性。ERK1/2是MAP激酶通路内BRAF的下游靶标，并且在使用选择性BRAF抑制剂处理后被显著抑制(Greger等,2012；Joseph等,2010)。鉴于在人类黑色素瘤细胞中shRNA介导的对BPTF的抑制之后激活的ERK1/2的下调，评估BPTF表达的水平以确定对选择性BRAF抑制剂的敏感性。在与表达对照shRNA的细胞相比时，表达BPTFshRNA的1205-Lu细胞对威罗菲尼处理的敏感性是3.2倍(图5A)，并且对达拉菲尼处理的敏感性是2.8倍(图5B)。相反，在1205-Lu细胞中BPTF的过表达显著降低了它们对威罗菲尼或达拉菲尼处理的敏感性(分别是2.5倍至3.4倍)(图5C-D)。在表达BRAF突变体的LOX细胞系中确认了在调节BPTF表达后调节了人类黑色素瘤细胞对选择性BRAF抑制的敏感性(图12)。
此外，对在选择性BRAF抑制剂威罗菲尼或达拉菲尼开始之前以及进展后从八名转移性黑色素瘤患者采集的样品进行基因分型、免疫组织化学染色以及FISH分析。将五名患者用威罗菲尼治疗并且将三名用达拉菲尼治疗。在对靶向疗法具有获得性抗性后，五名患者具有野生型NRAS并且三名具有杂合NRAS突变(密码子-61)。在接受威罗菲尼治疗的患者中，BPTF表达的免疫组织化学分析表明虽然在BRAF抑制剂治疗之前在转移样品中BPTF表达是均一的，但是在正在进展的样品中，BPTF表达是异质的，细胞的一种克隆不存在BPTF表达(表明响应于治疗的细胞)并且细胞的另一种克隆具有高水平的BPTF表达(表明对治疗具有抗性的细胞)(图5E-F)。使用靶向黑色素细胞抗原MART1、HMB45以及酪氨酸酶的抗体进行的免疫组织化学分析揭示了这两个区域中的阳性染色(图5G)，这确认了这些细胞的黑色素细胞谱系。TUNEL染色鉴定出由于已经进行细胞凋亡而表达很少或不表达BPTF表达的许多细胞。FISH分析揭示了在正在进展的样品中BPTF拷贝数的不均一性(图5H)。此外，在比较治疗前样品与正在进展的样品时，平均BPTF拷贝数增加(从2.6±1.9增加到3.5±2.5)。在来自接受威罗菲尼治疗的患者的样品中显示出类似的发现(图13)。总体而言，八名患者中有六名(75％)的治疗后肿瘤的特征在于BPTF表达的不均一性。综上所述，这些结果表明BPTF水平升高可以介导黑色素瘤患者对选择性BRAF抑制剂的获得性抗性，并且可以在产生对这些药剂的获得性抗性期间被选择。
BPTF促进成胶质细胞瘤进展。对BPTF是否涉及其它实体肿瘤的进展进行研究。由于黑色素细胞源自于胚胎神经嵴并且由于BPTF表达在人类胎儿脑中是丰富的(Bowser等,1995)，因此进行实验，目的在于确定BPTF在GBM的进展中的功能作用，所述GBM也是神经外胚层来源的。在U251人类GBM细胞中由BPTFshRNA3对BPTF表达的稳定抑制(图6A)使得增殖显著减少，如由细胞存活(图6B)和集落形成(图6C)的测定所确定。对BPTF表达的抑制引起显著的G1/G0细胞周期停滞，伴有对S期的抑制(图6D，p<0.01)以及对细胞凋亡的诱导(图6E，p<0.02)。抑制BPTF还显著地降低了U251细胞的侵袭性(图7C)。BPTF基因敲低引起了对GBM细胞中BCL2、BCL-XL以及CCND2表达的抑制(图6F-G)，伴有对磷酸化ERK1/2和p90RSK的显著抑制(图6G)。体内研究证实在皮下接种后在抑制BPTF后，U251肿瘤细胞生长非常显著地减少(图6H)。在LN18细胞中抑制BPTF细胞后观测到类似的作用(图14)。因此，这些结果证实了BPTF通过激活与在黑色素瘤细胞中所鉴定出的那些相类似的基因和通路来促进成胶质细胞瘤进展的功能作用。
最终，鉴定出富含BPTF表达的GBM的分子亚型。对TCGA数据集的分析揭示在GBM的原神经型子集中最常出现BPTF过表达(Verhaak等,2010)。为了确认这一观测结果，在14种GBM的独立样品中对BPTF表达水平进行观测，这些GBM借助于多种确定的分类标志物(间充质标志物CEBPB、CHI3L1、TWIST1、以及原神经型标志物DLL3、OLIG2和PDGFRA)的表达而被分类为原神经型或间充质型。在GBM的原神经型子集中，相比于间充质型子集，BPTF表达(如通过qRT-PCR分析所确定)显著更高(图6I)。
在本文已经对多个实施方案作了描述。然而，应了解的是，可以作出各种改动而不脱离本公开的精神和范围。因此，其它实施方案也落入以下权利要求书的范围内。

Claims (29)

1.一种癌症预后方法，所述方法包括：
(i)从受试者获得生物样品；
(ii)测量所述受试者的样品中BPTF的水平；
(iii)将所述受试者的样品中所述BPTF水平与来自一种或多种对照生物样品的BPTF的平均水平相比较；
(iv)基于与所述对照中所述BPTF平均水平相比，具有更低(或更高)的BPTF水平，提供所述受试者可能患有癌症的预后。
2.如权利要求1所述的方法，其中癌症选自由黑色素瘤、乳腺癌以及脑癌组成的组。
3.如权利要求1所述的方法，其中所述受试者的生物样品来自于组织活检。
4.如权利要求2所述的方法，其中所述一种或多种对照生物样品来自于良性痣的组织活检。
5.如权利要求4所述的方法，其中所述对照生物样品包括来自所述受试者的样品。
6.如权利要求4所述的方法，其中所述对照生物样品包括并非来自所述受试者的样品。
7.一种确定受试者是否患有癌症的方法，所述方法包括：
(i)从受试者获得生物样品；
(ii)测量所述受试者的样品中BPTF的水平；
(iii)将所述受试者的样品中所述BPTF水平与来自一种或多种对照生物样品的BPTF的平均水平相比较；以及
(iv)基于与所述对照中所述BPTF平均水平相比，具有显著更低(或更高)的BPTF水平，确定所述受试者是否患有癌症。
8.如权利要求7所述的方法，其中所述癌症选自由黑色素瘤、乳腺癌以及脑癌组成的组。
9.如权利要求7所述的方法，其中所述受试者的生物样品来自于组织活检。
10.如权利要求7所述的方法，其中所述一种或多种对照生物样品来自于良性痣的组织活检。
11.如权利要求10所述的方法，其中所述对照生物样品包括来自所述受试者的样品。
12.如权利要求10所述的方法，其中所述对照生物样品包括并非来自所述受试者的样品。
13.一种确定受试者的癌症是正在进展还是处在缓解期的方法，所述方法包括：
(i)在第一时间点从受试者获得生物样品；
(ii)测量来自所述第一时间点的所述受试者的样品中BPTF的水平；
(iii)在第二时间点从受试者获得生物样品；
(iv)测量来自所述第二时间点的所述受试者的样品中BPTF的水平；
(v)将来自所述第一时间点的所述BPTF水平与来自所述第二时间点的所述水平相比较；以及
(vi)基于来自所述两个时间点的BPTF水平的变化，确定癌症是正在进展还是处在恢复期，其中在所述第一时间点与所述第二时间点之间BPTF水平升高则表明所述癌症处在缓解期，并且其中在所述第一时间点与所述第二时间点之间BPTF水平升高则表明所述癌症正在进展。
14.如权利要求13所述的方法，其中所述癌症选自由黑色素瘤、乳腺癌以及脑癌组成的组。
15.如权利要求13所述的方法，其中所述生物样品来自于组织活检。
16.如权利要求13所述的方法，所述方法进一步包括在获得第一样品之后向所述受试者施用抗癌治疗剂。
17.如权利要求13所述的方法，所述方法进一步包括如果所述BPTF水平升高，那么向所述受试者施用BPTF抑制剂。
18.一种提供患有癌症的受试者的存活率的预后的方法，所述方法包括：
(i)在第一时间点从受试者获得生物样品；
(ii)测量来自所述第一时间点的所述受试者的样品中BPTF的水平；
(iii)在第二时间点从受试者获得生物样品；
(iv)测量来自所述第二时间点的所述受试者的样品中BPTF的水平；
(v)将来自所述第一时间点的所述BPTF水平与来自所述第二时间点的所述水平相比较；以及
(vi)基于来自所述两个时间点的BPTF水平的变化，提供所述受试者的存活率的预后，其中在所述第一时间点与所述第二时间点之间BPTF的水平升高则表明所述受试者的存活率不良，并且其中在所述第一时间点与所述第二时间点之间BPTF的水平降低则表明所述受试者的存活率较好。
19.如权利要求18所述的方法，其中所述癌症选自由黑色素瘤、乳腺癌以及脑癌组成的组。
20.如权利要求18所述的方法，其中所述生物样品来自于组织活检。
21.一种治疗受试者的癌症的方法，所述方法包括：
通过施用有效量的抑制性BPTF核酸和/或有效量的抑制BPTF表达的药剂来抑制BPTF表达。
22.如权利要求21所述的方法，其中癌症选自由黑色素瘤、多形性成胶质细胞瘤以及乳腺癌组成的组。
23.如权利要求21所述的方法，其中所述抑制BPTF表达使得对癌细胞的增殖或迁移进行抑制或阻止。
24.如权利要求21所述的方法，其中将所述方法与一种或多种另外的抗癌治疗剂组合使用。
25.如权利要求24所述的方法，其中所述一种或多种另外的治疗剂选自由以下各项组成的组：铂类似物、烷化剂、烷基磺酸盐、雄激素、抗肾上腺剂、抗雄激素剂、抗生素、抗雌激素剂、芳香酶抑制性4(5)-咪唑、抗代谢物、叶酸类似物、乙烯亚胺以及甲基三聚氰胺、叶酸补充剂、氮芥、亚硝基脲、嘌呤类似物、嘧啶类似物、拓扑异构酶抑制剂、胸苷酸合酶抑制剂、抗癌抗体、化学治疗剂、脱甲基化剂、以及靶向治疗剂。
26.如权利要求21所述的方法，其中所述方法包括向所述受试者施用包含抑制性BPTF核酸的载体。
27.如权利要求26所述的方法，其中所述载体包括表达载体。
28.如权利要求26所述的方法，其中所述载体包括复制型逆转录病毒载体。
29.一种组合物，所述组合物包含BPTF抑制剂和第一线抗癌治疗剂。
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