CN105188872A

CN105188872A - 用于纯化抗体的方法

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Publication number: CN105188872A
Application number: CN201480016016.XA
Authority: CN
Inventors: K.E.戈克伦; E.J.苏达; A.R.尤比拉
Original assignee: GlaxoSmithKline Intellectual Property No 2 Ltd
Current assignee: GlaxoSmithKline Intellectual Property No 2 Ltd
Priority date: 2013-03-15
Filing date: 2014-03-13
Publication date: 2015-12-23
Anticipated expiration: 2034-03-13
Also published as: EP2969098A1; JP2016519052A; WO2014141150A1; ES2765206T3; TWI625335B; KR102114021B1; US10676503B2; CN105188872B; IL240753B; EP3680000B1; BR112015022321A2; TW201522365A; ES2978309T3; CA2902287A1; RU2651483C2; EP3680000A1; AU2014229280B2; EP2969098B1; US20160024146A1; RU2015136860A

Abstract

通过超抗原层析从含有至少一种污染物的溶液纯化蛋白的方法，所述蛋白包含抗体、抗体片段或免疫球蛋白单个可变结构域，所述方法包括：a)将所述蛋白吸附至固定化在固体支持物上的超抗原；b)通过使含有吸附蛋白的固定化超抗原接触包含脂族羧酸盐的第一种洗涤缓冲液，除去至少一种污染物；和c)从固定化在固体支持物上的超抗原洗脱所述蛋白。

Description

用于纯化抗体的方法

发明领域

本发明涉及使用固定化至固体支持物的超抗原（诸如蛋白A、蛋白G或蛋白L）的蛋白纯化领域。具体地，本发明涉及洗涤缓冲液组分和在洗涤步骤中使用所述洗涤缓冲液除去宿主细胞污染物从而使期望的蛋白产物的损失最小化的方法。

发明背景

在过去的十年中，蛋白A亲和层析作为从哺乳动物细胞培养进料流捕获单克隆抗体(mAb)的主要候选方法已经变得充分建立。由于蛋白A配体和抗体的Fc-区域之间的特异性结合，该高特异性的亲和步骤能够在单个步骤中除去98%的杂质。在蛋白A层析的通常操作条件下，将经澄清的细胞培养进料流应用于柱，直到实现抗体的某个加样质量。然后通常将柱用高离子强度缓冲液洗涤以除去通过非特异性相互作用与树脂结合的宿主细胞污染物。然后通常将抗体通过pH转换从柱洗脱，并收集用于进一步处理。因此，该工作的主要目的是研究与盐组合的去污剂用于破坏离子和疏水相互作用并增强宿主细胞污染物的除去由此减小下游单元操作的纯化负担的用途。

对于大规模纯化，将许多努力放置在优化洗涤和洗脱缓冲液的组分以使产物收率最大化。但是，在同时纯化许多不同蛋白产物的生产情形中，为每种单独蛋白产物开发单独的洗涤缓冲液需要大量时间和资源来筛选多种缓冲液组分以确定对于每种特别的蛋白产物而言适当的洗涤缓冲液。可以与不同类型的蛋白一起有效地使用的“一般”中间洗涤缓冲液将是有用的和合乎需要的。本发明提供了使用这样的洗涤缓冲液组分的蛋白纯化方法。

发明概述

在一个方面，本发明涉及通过超抗原层析从含有至少一种污染物的溶液纯化蛋白的方法，所述蛋白包含抗体、抗体片段或免疫球蛋白单个可变结构域（immunoglobulinsinglevariabledomain），所述方法包括：a)将所述蛋白吸附至固定化在固体支持物上的超抗原；b)通过使含有吸附蛋白的固定化超抗原接触包含脂族羧酸盐的第一种洗涤缓冲液，除去至少一种污染物；和c)从固定化在固体支持物上的超抗原洗脱所述蛋白。

在一个方面，本发明涉及一种通过蛋白A层析从污染的蛋白溶液纯化蛋白的方法，所述方法包括：

(a)用蛋白A平衡缓冲液平衡固定化在固相上的蛋白A；

(b)将来自污染的溶液的蛋白吸附至固定化在固相上的蛋白A；

(c)通过用第一种蛋白A洗涤缓冲液洗涤所述固相，除去至少一种污染物，所述第一种蛋白A洗涤缓冲液包含约50mM至约55mMtris碱、约45mM至约50mM乙酸、至少一种脂族羧酸盐，具有约pH7.5，其中所述脂族羧酸盐选自约100mM辛酸钠、约20mM癸酸钠和约20mM十二酸钠；和

(d)用蛋白A洗脱缓冲液从所述固相回收蛋白。在本发明的一个方面，在没有加入NaCl的情况下制备所有缓冲液。

在一个实施方案中，所述蛋白A洗涤缓冲液进一步包含约1mM至约500mM醋酸钠。在一个实施方案中，所述蛋白A洗涤缓冲液包含约300mM醋酸钠。

在一个方面，本发明涉及通过蛋白L层析从污染的蛋白溶液纯化蛋白的方法，所述方法包括：

(a)用蛋白L平衡缓冲液平衡固定化在固相上的蛋白L；

(b)将来自污染的溶液的蛋白吸附至固定化在固相上的蛋白L；

(c)通过用第一种蛋白L洗涤缓冲液洗涤所述固相，除去至少一种污染物，所述第一种蛋白L洗涤缓冲液包含约50mM至约55mMtris碱、约45mM至约50mM乙酸、至少一种脂族羧酸盐，具有约pH7.5，其中所述脂族羧酸盐选自约100mM辛酸钠、约20mM癸酸钠和约20mM十二酸钠；和

(d)用蛋白L洗脱缓冲液从所述固相回收蛋白。在本发明的一个方面，在没有加入NaCl的情况下制备所有缓冲液。

在一个实施方案中，所述蛋白L洗涤缓冲液进一步包含约1mM至约500mM醋酸钠。在一个实施方案中，所述蛋白L洗涤缓冲液包含约300mM醋酸钠。

附图简述

图1.辛酸盐浓度研究结果-抗-OSM。

图2.辛酸盐浓度研究结果-抗-IL13。

图3.羧酸对比研究结果。

发明详述

应该理解，本发明不限于特别的方法、试剂、化合物、组合物或生物系统，其当然可以变化。还应该理解，本文中使用的术语仅用于描述特别的实施方案的目的，且无意进行限制。在本说明书和所附权利要求中使用的单数形式“一个”、“一种”和“所述”包括复数指示物，除非上下文另外清楚地指示。因此，例如，对“多肽”的提及包括两种或更多种多肽的组合等。

当提及可测量的值诸如量、时间持续等时，本文中使用的“约”意在包括从指定的值变化±20%或±10%(包括±5%、±1%和±0.1%)，因为这样的变化适于执行所公开的方法。

除非另外定义，否则在本文中使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属领域的普通技术人员通常所理解的相同的含义。尽管与本文描述的那些相似或相当的任何方法和材料可以用于实践本发明的测试，但是本文描述了优选的材料和方法。在描述和要求保护本发明时，将使用以下术语。

“多肽”、“肽”和“蛋白”在本文中互换地用于表示氨基酸残基的聚合物。多肽可以具有天然的(组织来源的)起源，从原核或真核细胞制备物重组或天然表达，或经由合成方法化学产生。该术语适用于这样的氨基酸聚合物：其中一个或多个氨基酸残基是对应的天然存在的氨基酸的人工化学模拟物，以及适用于天然存在的氨基酸聚合物和非天然存在的氨基酸聚合物。氨基酸模拟物表示这样的化学化合物：其结构不同于氨基酸的一般化学结构，但是其作用方式类似于天然存在的氨基酸。在科学和专利文献中充分描述了非天然残基；在下面描述了可用作天然氨基酸残基的模拟物的几种示例性非天然组合物和指南。芳族氨基酸的模拟物可以通过用例如以下氨基酸替换而产生：D-或L-萘基(naphyl)丙氨酸；D-或L-苯基甘氨酸；D-或L-2噻吩基丙氨酸；D-或L-1、-2、3-或4-芘基丙氨酸；D-或L-3噻吩基丙氨酸；D-或L-(2-吡啶基)-丙氨酸；D-或L-(3-吡啶基)-丙氨酸；D-或L-(2-吡嗪基)-丙氨酸；D-或L-(4-异丙基)-苯基甘氨酸:D-(三氟甲基)-苯基甘氨酸；D-(三氟甲基)-苯丙氨酸:D-对氟-苯丙氨酸；D-或L-对联苯基苯丙氨酸；K-或L-对甲氧基-联苯基苯丙氨酸:D-或L-2-吲哚(烷基)丙氨酸；和D-或L-烷基丙氨酸(ainine)，其中烷基可以是被取代的或未被取代的甲基、乙基、丙基、己基、丁基、戊基、异丙基、异丁基、sec-isotyl、异戊基或非酸性的氨基酸。非天然氨基酸的芳族环包括，例如，噻唑基、苯硫基、吡唑基、苯并咪唑基、萘基、呋喃基、吡咯基和吡啶基芳族环。

本文中使用的“肽”包括为本文具体举例说明的那些肽的保守变异的肽。本文中使用的“保守变异”表示使用另一种生物学上相似的残基替代氨基酸残基。保守变异的例子包括、但不限于，一个疏水残基诸如异亮氨酸、缬氨酸、亮氨酸、丙氨酸、半胱氨酸、甘氨酸、苯丙氨酸、脯氨酸、色氨酸、酪氨酸、正亮氨酸或甲硫氨酸置换另一个疏水残基，或一个极性残基置换另一个极性残基，诸如精氨酸置换赖氨酸、谷氨酸置换天冬氨酸、或谷氨酰胺置换天冬酰胺等。可互相置换的中性亲水氨基酸包括天冬酰胺、谷氨酰胺、丝氨酸和苏氨酸。“保守变异”还包括使用取代的氨基酸替代未取代的母体氨基酸，前提条件是，针对取代的多肽的抗体也与未取代的多肽发生免疫反应。这样的保守置换是在本发明的肽的种类的定义之内。本文中使用的“阳离子的”表示在pH7.4具有净正电荷的任何肽。通过本领域技术人员已知的和本文描述的标准方法，可以确定肽的生物活性。

当关于蛋白使用“重组”时，表示该蛋白已经通过引入异源核酸或蛋白或者改变天然核酸或蛋白进行了修饰。

本文中使用的“治疗性蛋白”表示这样的任何蛋白和/或多肽：其可以施用给哺乳动物以引起组织、系统、动物或人的生物学或医学应答，所述应答是例如研究人员或临床医师所寻求的。治疗性蛋白可以引起超过一种生物学或医学应答。此外，术语“治疗有效量”是指这样的任何量：与未接受该量的相应受试者相比，该量导致、但不限于疾病、病症或副作用的痊愈、预防或改善，或者疾病或障碍的进展速率的下降。该术语在其范围内还包括有效地增强正常生理功能的量、以及在患者中有效地造成增强或有助于第二种药学试剂的治疗效果的生理功能的量。

本文中鉴定的所有“氨基酸”残基呈天然的L-构型。与标准多肽命名法一致，氨基酸残基的缩写如在下表中所示。

表1.氨基酸缩写。

1个字母	3个字母	氨基酸
			Y	Tyr	L-酪氨酸
G	Gly	L-甘氨酸
			F	Phe	L-苯丙氨酸
M	Met	L-甲硫氨酸
			A	Ala	L-丙氨酸
S	Ser	L-丝氨酸
			I	Ile	L-异亮氨酸
L	Leu	亮氨酸
			T	Thr	L-苏氨酸
V	Val	L-缬氨酸
			P	Pro	L-脯氨酸
K	Lys	L-赖氨酸
			H	His	L-组氨酸
Q	Gin	L-谷氨酰胺
			E	Glu	L-谷氨酸
W	Trp	L-色氨酸
			R	Arg	L-精氨酸
D	Asp	L-天冬氨酸
			N	Asn	L-天冬酰胺
C	Cys	L-半胱氨酸

应当指出，所有的氨基酸残基序列在本文用式表示，所述式从左至右的方向为从氨基端至羧基端的常规方向。

在另一个实施方案中，所述多肽是抗原结合多肽。在一个实施方案中，所述抗原结合多肽选自可溶性的受体、抗体、抗体片段、免疫球蛋白单个可变结构域、Fab、F(ab')2、Fv、二硫键连接的Fv、scFv、闭合构象多特异性抗体、二硫键连接的scFv或双抗体。

本文中使用的术语“抗原结合多肽”表示能够结合抗原的抗体、抗体片段和其它蛋白构建体。

术语Fv、Fc、Fd、Fab或F(ab)2使用它们的标准含义(参见，例如，Harlow等人,AntibodiesALaboratoryManual,ColdSpringHarborLaboratory,(1988))。

“嵌合抗体”表示一类经工程改造的抗体，其含有来源于供体抗体的天然存在的可变区(轻链和重链)以及来源于受体抗体的轻链和重链恒定区。

“人源化抗体”表示一类经工程改造的抗体，其具有来源于非人供体免疫球蛋白的它的CDR，该分子的剩余的免疫球蛋白衍生的部分来源于一种(或多种)人免疫球蛋白。此外，可以改变框架支持残基以保持结合亲和力(参见，例如，Queen等人,Proc.Natl.AcadSciUSA,86:10029-10032(1989),Hodgson等人,Bio/Technology,9:421(1991))。合适的人受体抗体可以是这样的抗体：其通过与供体抗体的核苷酸和氨基酸序列的同源性而选自常规数据库，例如，KABAT.RTM.数据库、LosAlamos数据库和SwissProtein数据库。特征在于与供体抗体的框架区的同源性(在氨基酸基础上)的人抗体可能适于为供体CDR的插入提供重链恒定区和/或重链可变框架区。可以以类似的方式选择能够提供轻链恒定或可变框架区的合适受体抗体。应当指出，不要求受体抗体重链和轻链源自相同受体抗体。现有技术描述了几种生产这样的人源化抗体的方法--参见例如EP-A-0239400和EP-A-054951。

术语“供体抗体”表示这样的抗体(单克隆的和/或重组的)：其将它的可变区、CDR或它们的其它功能片段或类似物的氨基酸序列贡献给第一免疫球蛋白配偶体，从而提供改变的免疫球蛋白编码区并产生表达的改变的抗体，该抗体具有所述供体抗体表征的抗原特异性和中和活性。

术语“受体抗体”表示与供体抗体异源的抗体(单克隆的和/或重组的)，其将编码它的重链和/或轻链框架区和/或它的重链和/或轻链恒定区的全部(或任何部分，但在一些实施方案中全部)氨基酸序列贡献给第一免疫球蛋白配偶体。在某些实施方案中，人抗体是受体抗体。

“CDR”被定义为抗体的互补性决定区氨基酸序列，其为免疫球蛋白重链和轻链的高变区。参见，例如，Kabat等人,SequencesofProteinsofImmunologicalInterest,第4版,U.S.DepartmentofHealthandHumanServices,NationalInstitutesofHealth(1987)。在免疫球蛋白的可变部分中存在三个重链和三个轻链CDR(或CDR区)。因此，本文中使用的“CDR”表示所有三个重链CDR或所有三个轻链CDR(或如果合适，所有的重链CDR和所有的轻链CDR)。抗体的结构和蛋白折叠可能意味着其它残基被视作抗原结合区的组成部分，且被技术人员理解为这样。参见例如Chothia等人,(1989)Conformationsofimmunoglobulinhypervariableregions;Nature342,第877-883页。

本文中使用的术语“结构域”表示一种折叠的蛋白结构，其具有独立于该蛋白的其它部分的三级结构。通常，结构域会引起蛋白的不同功能特性，且在许多情况下，可以将结构域添加、除去或转移至其它蛋白，而不损失所述蛋白的剩余部分和/或所述结构域的功能。“抗体单个可变结构域”是一种折叠的多肽结构域，其包含表征抗体可变结构域的序列。因此，它包括完全的抗体可变结构域和修饰的可变结构域，例如，其中一个或多个环已经被这样的序列替换：所述序列不是表征抗体可变结构域的序列，或已被截短的抗体可变结构域，或者包含N-端或C-端延伸，以及至少保留全长结构域的结合活性和特异性的可变结构域的折叠的片段。

短语“免疫球蛋白单个可变结构域”表示独立于不同的V区域或结构域而特异性地结合抗原或表位的抗体可变结构域(V_H、V_HH、V_L)。免疫球蛋白单个可变结构域可以与其它不同的可变区或可变结构域一起以某种形式(例如同型多聚体或异型多聚体)存在，其中其它区域或结构域不是该单个免疫球蛋白可变结构域结合抗原所必需的(即，其中该免疫球蛋白单个可变结构域独立于另外的可变结构域而结合抗原)。本文中使用的术语“结构域抗体”或“dAb”与能够结合抗原的“免疫球蛋白单个可变结构域”相同。免疫球蛋白单个可变结构域可以是人抗体可变结构域，但是也包括来自其它物种诸如啮齿动物(例如，如在WO00/29004中公开的)、铰口鲨和骆驼科V_HHdAb(纳米抗体（nanobodies）)的单个抗体可变结构域。骆驼科V_HH是来源于包括骆驼、骆马、羊驼、单峰骆驼和原驼在内的物种的免疫球蛋白单个可变结构域多肽，其产生天然缺乏轻链的重链抗体。这样的V_HH结构域可以根据本领域可用的标准技术人源化，且这样的结构域仍被认为是根据本发明的“结构域抗体”。本文中使用的“V_H”包括骆驼科V_HH结构域。NARV是在软骨鱼（包括铰口鲨）中鉴定出的另一类免疫球蛋白单个可变结构域。这些结构域也被称作新型的抗原受体可变区(通常简写成V(NAR)或NARV)。关于其它细节，参见Mol.Immunol.44,656-665(2006)和US20050043519A。

术语“表位结合结构域”表示独立于不同的V区域或结构域特异性地结合抗原或表位的结构域，这可以是结构域抗体(dAb)，例如人、骆驼科或鲨鱼免疫球蛋白单个可变结构域。

本文中使用的术语“抗原结合位点”表示蛋白上的能够特异性地结合抗原的位点，这可以是单结构域，例如表位结合结构域，或者它可以是如在标准抗体上可发现的成对的V_H/V_L结构域。在本发明的某些方面，单链Fv(ScFv)结构域可以提供抗原结合位点。

术语“mAbdAb”和“dAbmAb”在本文中用于表示本发明的抗原结合蛋白。所述两个术语可以互换使用，并意图具有与本文中使用的相同的含义。

在一个方面，本发明涉及通过超抗原层析从含有至少一种污染物的溶液纯化蛋白的方法，所述蛋白包含抗体、抗体片段或免疫球蛋白单个可变结构域，所述方法包括：a)将所述蛋白吸附至固定化在固体支持物上的超抗原；b)通过使含有吸附蛋白的固定化超抗原接触包含脂族羧酸盐的第一种洗涤缓冲液，除去至少一种污染物；和c)从固定化在固体支持物上的超抗原洗脱所述蛋白。

在一个实施方案中，使用超抗原进行所述亲和层析。“超抗原”表示这样的通用配体：其与免疫球蛋白超家族的成员在不同于这些蛋白的靶配体结合部位的位点处相互作用。葡萄球菌肠毒素是与T-细胞受体相互作用的超抗原的例子。结合抗体的超抗原包括、但不限于蛋白G，其结合IgG恒定区(Bjorck和Kronvall,J.Immunol.,133:969(1984))；蛋白A，其结合IgG恒定区和V_H结构域(Forsgren和Sjoquist,J.Immunol.,97:822(1966))；和蛋白L，其结合V_L结构域(Bjorck,J.Immunol.,140:1194(1988)。在一个实施方案中，所述超抗原选自蛋白A、蛋白G和蛋白L。

本文中使用的术语“蛋白A”包括从其天然来源回收的蛋白A、合成地(例如通过肽合成或通过重组技术)生产的蛋白A、及其保留结合具有C_H2/C_H3区域的蛋白的能力的变体。蛋白A可以商业上购自Repligen、Pharmacia和Fermatech。

本文中使用的“亲和层析”是这样的层析方法：其利用生物分子之间的特异性的可逆相互作用（而不是生物分子的一般性质诸如等电点、疏水性或大小）实现层析分离。“蛋白A亲和层析”或“蛋白A层析”表示利用蛋白A的IgG结合结构域对免疫球蛋白分子的Fc部分的亲和力的特异性亲和层析方法。该Fc部分包含人或动物免疫球蛋白恒定结构域C_H2和C_H3或与这些基本上类似的免疫球蛋白结构域。蛋白A包括得自金黄色葡萄球菌（Staphylococcusaureas）的细胞壁的天然蛋白、通过重组或合成方法生产的蛋白A和保留结合Fc区的能力的变体。在实践中，蛋白A层析涉及使用固定化至固体支持物的蛋白A。参见Gagnon,ProteinAAffinityChromotography,PurificationToolsforMonoclonalAntibodies,第155-198页,ValidatedBiosystems,1996。蛋白G和蛋白L也可以用于亲和层析。固体支持物是蛋白A附着于其上面的非水性基质(例如，柱、树脂、基质、珠子、凝胶等)。这样的支持物包括琼脂糖、琼脂糖凝胶、玻璃、二氧化硅、聚苯乙烯、火棉胶、木炭、砂、聚甲基丙烯酸酯、交联的聚(苯乙烯-二乙烯基苯)和具有葡聚糖表面补充剂（extender）的琼脂糖和任意其它合适材料。这样的材料是本领域众所周知的。可以使用任意合适的方法将超抗原附着于固体支持物。将蛋白附着于合适的固体支持物的方法是本领域众所周知的。参见例如Ostrove,在GuidetoProteinPurification中,MethodsinEnzymology,182:357-371,1990。这样的固体支持物（具有和没有固定化的蛋白A或蛋白L）可容易地得自许多商业来源，包括诸如VectorLaboratory(Burlingame,Calif.)、SantaCruzBiotechnology(SantaCruz,Calif.)、BioRad(Hercules,Calif.)、AmershamBiosciences(GEHealthcare的一部分,Uppsala,Sweden)和Millipore(Billerica,Mass.)。

所述脂族羧酸盐可以是直链的或支链的。在某些实施方案中，所述脂族羧酸盐是脂族羧酸或其盐，或所述脂族羧酸盐的来源是脂族羧酸或其盐。在某些实施方案中，所述脂族羧酸盐是直链的，且选自甲酸（蚁酸）、乙酸（醋酸）、丙酸、丁酸（酪酸）、戊酸（缬草酸）、己酸、庚酸、辛酸、壬酸（天竺葵酸）、癸酸（羊蜡酸）、十一烷酸、十二烷酸（月桂酸）、十三烷酸、十四烷酸（肉豆蔻酸）、十五烷酸、十六烷酸（棕榈酸）、十七烷酸、十八烷酸（硬脂酸）和二十烷酸（arachididicacid）或其任意盐。

因此，所述脂族羧酸盐可以包含1-20个碳长度的碳主链。在一个实施方案中，所述脂族羧酸盐包含6-12个碳主链。在一个实施方案中，所述脂族羧酸盐选自己酸盐、庚酸盐、辛酸盐、癸酸盐和十二酸盐。在一个实施方案中，所述脂族羧酸盐的来源选自脂族羧酸、脂族羧酸的钠盐和脂族羧酸的钾盐。在一个实施方案中，所述洗涤缓冲液包含辛酸钠、癸酸钠或十二酸钠。在一个实施方案中，所述洗涤缓冲液包含约10mM至约125mM辛酸钠、约1mM至约30mM癸酸钠、或约1mM至约30mM十二酸钠。在一个实施方案中，所述洗涤缓冲液包含约100mM辛酸钠、约20mM癸酸钠或约20mM十二酸钠。在一个实施方案中，所述洗涤缓冲液包含约1mM至约500mM醋酸钠。在一个实施方案中，所述洗涤缓冲液包含约300mM醋酸钠。

在一个实施方案中，所述至少一种污染物是宿主细胞蛋白或宿主细胞DNA。在某些实施方案中，所述宿主细胞选自CHO细胞、NS0细胞、Sp2/0细胞、COS细胞、K562细胞、BHK细胞、PER.C6细胞和HEK细胞。所述宿主细胞可以是选自以下的细菌细胞：大肠杆菌（E.Coli）（例如，W3110、BL21）、枯草芽孢杆菌（B.subtilis）和/或其它合适的细菌；真核细胞，诸如真菌或酵母细胞（例如，巴斯德毕赤酵母（Pichiapastoris）、曲霉菌属（Aspergillussp.）、酿酒酵母（Saccharomycescerevisiae）、粟酒裂殖酵母（Schizosaccharomycespombe）、粗糙链孢霉（Neurosporacrassa））。

“缓冲液”是通过它的酸-碱共轭物组分的作用而抵抗pH的变化的缓冲溶液。

“平衡缓冲液”在本文中是用于准备层析固相的缓冲液。

“加样缓冲液”是用于将蛋白和污染物的混合物加样到层析基质上的缓冲液。平衡缓冲液和加样缓冲液可以相同。

“洗脱缓冲液”用于从层析基质洗脱蛋白。

“盐”是通过酸和碱的相互作用而形成的化合物。

在一个实施方案中，所述洗涤缓冲液包含有机酸、有机酸的共轭碱的碱金属或铵盐、和有机碱。在一个实施方案中，在没有加入NaCl的情况下制备所述洗涤缓冲液。

在一个实施方案中，所述有机酸包括、但不限于甲酸、乙酸、乳酸、柠檬酸、苹果酸、马来酸、甘氨酸、磷酸、甘氨酰甘氨酸、琥珀酸、TES(2-{[三(羟基甲基)甲基]氨基}乙磺酸)、MOPS(3-(N-吗啉代)丙磺酸)、PIPES(哌嗪-N,N′-双(2-乙磺酸))和MES(2-(N-吗啉代)乙磺酸)。

在一个实施方案中，所述有机碱包括、但不限于tris碱、精氨酸、Bis-tris、Bis-tris-丙烷、N,N-双(2-羟基乙基)甘氨酸(N,N-双(2-羟基乙基)甘氨酸)、HEPES(4-2-羟基乙基-1-哌嗪乙磺酸)、TAPS(3-{[三(羟基甲基)甲基]氨基}丙磺酸)和三(羟甲基)甲基甘氨酸(N-三(羟基甲基)甲基甘氨酸)。

在一个实施方案中，所述有机酸的共轭碱是有机酸的共轭碱的钠、钾或铵盐。在一个实施方案中，所述有机酸是乙酸，且所述乙酸的共轭碱是钠盐。

在一个实施方案中，所述蛋白是抗原结合蛋白。在一个实施方案中，所述抗原结合蛋白是抗体。在一个实施方案中，所述抗体属于IgG类。在一个实施方案中，所述抗原结合蛋白是免疫球蛋白单个可变结构域。

在一个方面，本发明涉及通过蛋白A层析从污染的蛋白溶液纯化蛋白的方法，所述方法包括：

(a)用蛋白A平衡缓冲液平衡固定化在固相上的蛋白A；

(b)将来自污染的溶液的蛋白吸附至固定化在固相上的蛋白A；

(d)用蛋白A洗脱缓冲液从所述固相回收蛋白。在一个实施方案中，在没有加入NaCl的情况下制备所有缓冲液。在一个实施方案中，所述蛋白A洗涤缓冲液进一步包含约1mM至约500mM醋酸钠。在一个实施方案中，所述蛋白A洗涤缓冲液包含约300mM醋酸钠。

在一个实施方案中，所述平衡缓冲液包含约50mM至约55mMtris碱、约45mM至约50mM乙酸，具有约pH7.2；且所述洗脱缓冲液包含1.8mM醋酸钠和约28.2mM至约300mM乙酸，具有约pH2.4至约pH3.6。

在一个实施方案中，所述方法进一步包括在步骤(c)之后和步骤(d)之前的以下步骤：通过用第二种蛋白A洗涤缓冲液洗涤所述固相，除去污染物，所述第二种蛋白A洗涤缓冲液包含55mMtris碱、45mM乙酸，具有约pH7.2。在一个实施方案中，在没有加入NaCl的情况下，制备所述第二种蛋白A洗涤缓冲液。

在一个实施方案中，所述方法进一步包括在步骤(d)之后的以下步骤：(e)用30mM乙酸、100mMHCl将含有回收的蛋白的溶液滴定至约pH3.0；(f)使步骤(e)的溶液在约pH3.0保持约30至约60分钟；和(g)用1Mtris将步骤(f)的溶液的pH调至约pH7.5。

在一个实施方案中，所述方法进一步包括过滤通过步骤(g)产生的溶液。

(a)用蛋白L平衡缓冲液平衡固定化在固相上的蛋白L；

(b)将来自污染的溶液的蛋白吸附至固定化在固相上的蛋白L；

(d)用蛋白L洗脱缓冲液从所述固相回收蛋白。在一个实施方案中，在没有加入NaCl的情况下制备所有缓冲液。在一个实施方案中，所述蛋白L洗涤缓冲液进一步包含约1mM至约500mM醋酸钠。在一个实施方案中，所述蛋白L洗涤缓冲液包含约300mM醋酸钠。

在一个实施方案中，所述方法进一步包括在步骤(c)之后和步骤(d)之前的以下步骤：通过用第二种蛋白L洗涤缓冲液洗涤所述固相，除去污染物，所述第二种蛋白L洗涤缓冲液包含55mMtris碱、45mM乙酸，具有约pH7.2。在一个实施方案中，在没有加入NaCl的情况下制备所述第二种蛋白L洗涤缓冲液。

所述“溶液”可以是细胞培养基，例如细胞培养进料流。可以将进料流过滤。所述溶液可以是澄清的未加工的液体培养基(CUB)(或澄清的发酵液/上清液)。所述CUB也被称作通过澄清除去了任何细胞和/或细胞碎片的细胞培养物上清液。可选地，使用本领域已知的方法收获至少一种周质提取物。所述溶液可以是表达蛋白的细胞的裂解制备物(例如，溶液是裂解物)。

“污染物”表示在超抗原层析之前存在于加样样品中或在超抗原层析之后存在于洗脱液中的任何外来的或不希望的分子。可能有“工艺杂质”存在。这些是作为在其中生产目标蛋白的工艺的结果而存在的杂质。例如，这些包括宿主细胞蛋白(HCP)、RNA和DNA(例如病毒)。“HCP”表示在细胞培养或发酵过程中由宿主细胞产生的、与目标蛋白无关的蛋白，包括细胞内蛋白和/或分泌蛋白。宿主细胞蛋白的一个例子是蛋白酶，如果在纯化过程中和以后仍然存在，其可以造成对目标蛋白的损伤。例如，如果蛋白酶保留在包含目标蛋白的样品中，它可以产生最初不存在的产物相关的物质或杂质。蛋白酶的存在可以造成在纯化过程中和/或在最终制剂中目标蛋白随时间的衰变。HCP的除去或降低的HCP水平在定义上等同于蛋白酶的除去或减少。

工艺杂质也包括用于培养细胞或确保目标蛋白的表达的组分，例如，溶剂(例如用于培养酵母细胞的甲醇)、抗生素、甲氨蝶呤(MTX)、培养基组分、絮凝剂等。也包括这样的分子：其为在步骤之前渗入样品中的超抗原固相的组成部分，例如，蛋白A、蛋白G或蛋白L。

污染物也包括：“产物相关的物质”，其包括保留它们的活性、但是在它们的结构上存在不同的蛋白；和“产物相关的杂质”，其包括因为它们的结构差异而已经丧失它们的活性的蛋白。这些产物相关的变体包括，例如，高分子量物质(HMW)、低分子量物质(LMW)、聚集的蛋白、前体、降解的蛋白、错误折叠的蛋白、二硫键错配连接的（underdisulfide-bonded）蛋白、片段和去酰胺化的物质。

可以测量这些杂质中的任一种在洗脱液中的存在，以确定洗涤步骤是否已经成功。例如，我们已经证实了通过ngHCP/mg蛋白测量的检测到的HCP水平的下降(参见实施例)。

因此，得自超抗原固体支持物的洗脱液可以含有样品中的蛋白，其中HCP或DNA以约5000百万份数(ppm)或更低、4000百万份数(ppm)或更低、3000百万份数(ppm)或更低、2,500百万份数(ppm)或更低、2000百万份数(ppm)或更低、1500百万份数(ppm)或更低、1000百万份数(ppm)或更低、约900百万份数(ppm)或更低、约800百万份数(ppm)或更低、约700百万份数(ppm)或更低、约600百万份数(ppm)或更低、约500百万份数(ppm)或更低、约400百万份数(ppm)或更低、约300百万份数(ppm)或更低、约200百万份数(ppm)或更低、约100百万份数(ppm)或更低、约90ppm或更低、约80ppm或更低、约70ppm或更低、约60ppm或更低或约50ppm或更低存在。“Ppm”等同于ng/mg，且“ppb”(“十亿份数”)等同于pg/mg。

当与没有脂族羧酸盐的对照洗涤步骤进行对比时，可以证实减少。可选地，当与没有脂族羧酸盐和醋酸钠的对照洗涤步骤进行对比时，可以证实减少。

如所述的方法，其中在本发明的洗涤步骤以后，目标蛋白从洗脱液的回收率是100%、99%、98%、97%、96%、95%、90%、85%、80%、70%、60%、50%或更低，包括在100%至50%的范围内或在由该范围内的不连续值的任何对限定的任何子范围内的任何不连续值。通过根据下式将洗脱液中的目标蛋白的量确定为应用于柱的目标蛋白的量的百分比，计算在洗脱液中的回收率百分比(%)：

回收率百分比=洗脱液中的产物的量/加样的产物的量X100

通过ELISA、OCTET或其它方法，可以确定存在于洗脱液中的污染物的量，以确定一种或多种上述污染物的水平。在本文描述的实施例中，使用ELISA方法确定样品中的HCP的水平。

实施例1--材料和方法

使用得自GEHealthcare(Uppsala,瑞典)的AKTAExplorer100系统，进行所有层析方法。通过使用ThermoScientificNanoDrop1000(RN)测量在280nm的吸光度，确定纯蛋白样品的浓度。在得自HewlettPackard(PaloAlto,CA)的Agilent1100HPLC上使用得自AppliedBiosystems(FosterCity,CA)的POROSProteinA柱(2.1x30mm)确定得自粗制样品的蛋白浓度。MabSelectSuReProteinA介质得自GEHealthcare(Uppsala,瑞典)。Vantage柱得自MilliporeCorporation(Bedford,MA)。使用得自HACHCompany(Loveland,CO,USA)的2100PTubidimeter（具有玻璃样品池目录号24347-06）进行浊度测量。所有化学品得自JTBaker(Phillipsburg,NJ)或SigmaAldrich(StLouis,MO)，且属于美国药典级（USPgrade）。

除非另外指出，否则在AKTAExplorer100层析系统上用1.1x25cmMabSelectSuRe柱进行所有层析实验。细胞培养物滤液的抗体浓度通过分析型蛋白A确定，或者由位于GSK,UpperMerion的BioanalyticalSciencesgroup通过Biacore蛋白浓度测定进行。

实施例2--洗涤缓冲液添加剂的初期筛选

通过使用乙酸或tris碱滴定至特定pH，制备缓冲液。作为对照，将筛选条件与得自与标准高盐蛋白A洗涤缓冲液、50mMtris、乙酸、1MNaCl、pH7.2类似的洗涤缓冲液的结果进行对比。关于测试的5种实验条件的完整列表，参考图1，且关于对应的结果，参考表3和4。在GSK资产抗-OSM(GSK315234)和抗-IL13(GSK679586)细胞培养物滤液的蛋白A层析中测试了洗涤缓冲液。这2种分别的情况产生了类似的HCP和DNA减少趋势。由于改变的和不通常的洗脱概况和过量的产物损失，没有进一步评价就TritonX100和TritonX114洗涤缓冲液而言蛋白A产物中的杂质水平。与标准的1MNaCl洗涤缓冲液相比，含有PS80（一种非离子的基于环氧乙烷聚合物的表面活性剂）的缓冲液表现出边缘清除。HCP和DNA的最大减少来自含有100mM辛酸钠（羧酸辛酸的钠盐）的洗涤缓冲液。与抗-OSM和抗-IL13的对照品相比，100mM辛酸盐缓冲液导致HCP的大约5倍减少。此外，与抗-IL13和抗-OSM的对照品相比，它分别导致DNA的100倍和60倍减少。对于洗涤筛选条件下抗-OSM和抗-IL13的完整收率、HCP、DNA和SEC数据，参见表3和表4。

表2洗涤条件的实验概述

表3抗-IL13洗涤开发的实验结果

表4抗-OSM洗涤开发的实验结果

实施例3--辛酸盐浓度对杂质清除的影响

为了检查辛酸钠浓度对杂质的除去的影响，测试了一系列辛酸钠浓度。关于就抗-OSM和抗-IL13而言用于检查辛酸盐浓度对杂质的除去的影响的缓冲液和流速的列表，参考表5。就抗-OSM和抗-IL13而言，得自辛酸盐浓度研究的数据概述在图1和图2中。对于抗-IL13和抗-OSM层析，辛酸盐浓度的变化显然影响CHOHCP和DNA的减少。就抗-OSM和抗-IL13而言，辛酸盐浓度越高，观察到HCP和DNA的减少越大。但是，对于辛酸钠和0.3M醋酸钠的组合，观察到HCP和DNA的最大减少。与单独的去污剂或盐相比，去污剂和盐的组合效应增加了缓冲液的清除能力。

由于根据经验确定的在pH7.2时大约125mM辛酸钠的溶解度，在该研究中测试的最大辛酸钠浓度是100mM辛酸钠。由于预见到溶解度在较高pH增加，如果需要较大的宿主细胞污染物除去，通过调节缓冲液系统和组分可以测试较高的辛酸盐浓度。但是，基于该工作，我们确定与0.3M醋酸钠组合的100mM辛酸钠会实现充分的宿主细胞杂质除去。

表5辛酸盐浓度实验设计的影响

实施例4--羧酸筛选

辛酸钠是辛酸的钠盐，所述辛酸由属于羧酸类别的8碳长脂族链组成。由于它们的饱和碳尾部和带电荷的羧基头部基团，这些两亲的饱和无分支盐作为去污剂起作用。为了确定碳尾巴长度对污染物除去的影响，测试了几种其它的钠盐。测试的这些其它盐包括己酸钠、庚酸钠、辛酸钠、癸酸钠和十二酸钠。实验设计总结在表6中。该实验的结果总结在图3中。由于在初步实验中观察到的低收率和改变的洗脱行为，从分析中排除了十二酸钠。尽管除了十二酸盐以外所有不同的盐产生了类似的产物收率，每种盐产生了非常不同的杂质概况（profiles）。随着链中的碳数增加，杂质水平下降。具有小于辛酸钠(C8)的碳链的钠盐产生了高得多的杂质水平。洗涤缓冲液添加剂的最佳的两种候选物是辛酸钠和癸酸钠。

表6实验设计-羧酸对比

实施例5--优化的洗涤对浊度的影响

还探究了优化的辛酸盐洗液对下游单元操作的影响；特别关注它对最小化蛋白A后沉淀和增强过滤性的影响。使用2个不同的洗液方案，在2.6x27cmMabSelectSuRe柱上处理得自1.16g/L的抗-IL13细胞培养物滤液的抗-IL13细胞培养物滤液。使用经优化的包含辛酸钠的洗液方案，通过蛋白A层析处理该物质的一半。用平衡缓冲液替代辛酸盐洗液，处理该物质的另一半。使用浊度作为过滤性的指标（determinate），记录洗脱液库的浊度测量结果。然后用30mM乙酸、100mM盐酸将洗脱液滴定至pH3.5。再次测量和记录浊度测量结果。在pH3.5温育洗脱液样品1小时以后，然后将它们滴定至pH6.0，准备用于下一个单元操作。测量并记录pH调节库的浊度测量结果。将得到的数据总结在表中，并将杂质概况（profile）呈现在表中。考虑浊度作为过滤性的指标，由于阴离子交换加样材料的浊度的50%下降，辛酸盐洗液将减少一些过滤负担。

表7抗-IL13浊度测量结果

	含有辛酸盐	不含辛酸盐
			浊度	NTU	NTU
MabSure库	36	79
			低pH库	10	10
pH 6.0调节库	64	134

表8辛酸盐洗液对蛋白A后抗-IL13杂质概况的纯度的影响

实施例6—在tris-乙酸盐缓冲液中使用蛋白A辛酸盐缓冲液的结构域抗体纯化。

使用填充在0.5x20cm柱中的蛋白A（得自GEHealthcare的MabSelectXtra）纯化DOM0100，即在大肠杆菌中表达的25kDa(V_k-V_HalbudAb+TNFR1dAb)dAb分子。对于所有步骤，流速是300cm/小时。用55mMtris-碱、45mM乙酸、pH7.5平衡以后，以13.5mg/mL树脂将细胞培养物滤液加样到柱上。加样滴度是1.88mg/mL。然后使用5柱体积的55mMtris-碱、45mM乙酸、300mM醋酸钠、100mM辛酸钠、pH7.5洗涤柱。然后将蛋白洗脱，此后将柱清洁、消毒和储存。分析洗脱峰，得到1,440ppmHCP(宿主细胞蛋白)（通过ELISA）和74.9%收率。在相同条件下将相同实验重复2次，但是使用高盐洗液替代辛酸盐洗液，分别得到2,398ppm和2,456ppmHCP（通过ELISA）以及77.2%和76.0%的收率。在150个循环之前，在匹配停留时间的0.5cmx10cm柱中评价的层析顺序的影响对动态结合能力没有影响。使用相同的层析顺序，关于MabSelect和碱稳定的MabSelectSuRe同样研究了树脂选择性，并得到可比较的HCP产物质量。

实施例7--使用蛋白L、辛酸盐洗液和tris-乙酸盐缓冲液对DAT06dAb的纯化

使用填充在0.5cmx20cm柱中的蛋白L(得自GEHealthcare的CaptoL)纯化DAT06，即在大肠杆菌中表达的11.5kDa(V_k)dAb分子。对于所有步骤，流速是300cm/小时。用52mMtris-碱、48mM乙酸、pH7平衡以后，以13mg/mL树脂加样细胞培养物滤液。然后使用5CV52mMtris-碱、48mM乙酸、100mM辛酸钠、pH7洗涤柱，然后重新平衡、洗脱、清洁、消毒和储存。分析洗脱峰，得到5,815ppmHCP（通过ELISA）和96.4%的回收率。与此相比，使用52mMtris、48mM乙酸、2MNaCl、pH7.0高盐洗涤步骤的相同层析顺序得到7,476ppmHCP（通过ELISA）和85.1%的回收率。使用平衡缓冲液、52mMtris、48mM乙酸、pH7.0的洗涤步骤得到12,523ppmHCP（通过ELISA）和94.1%的回收率。

Claims

1.通过超抗原层析从含有至少一种污染物的溶液中纯化蛋白的方法，所述方法包括：a)将所述蛋白吸附至固定化在固体支持物上的超抗原；b)通过使含有吸附蛋白的固定化超抗原接触包含脂族羧酸盐的第一种洗涤缓冲液，除去至少一种污染物，其中所述脂族羧酸盐包含6-12个碳的主链；和c)从固定化在固体支持物上的超抗原洗脱所述蛋白。

2.根据权利要求1所述的方法，其中所述超抗原选自蛋白A、蛋白G和蛋白L。

3.根据任一前述权利要求所述的方法，其中所述脂族羧酸盐选自己酸盐、庚酸盐、辛酸盐、癸酸盐和十二酸盐。

4.根据任一前述权利要求所述的方法，其中所述脂族羧酸盐的来源选自脂族羧酸、脂族羧酸的钠盐和脂族羧酸的钾盐。

5.根据任一前述权利要求所述的方法，其中所述洗涤缓冲液包含辛酸钠、癸酸钠或十二酸钠。

6.根据任一前述权利要求所述的方法，其中所述洗涤缓冲液包含约10mM至约125mM辛酸钠、约1mM至约30mM癸酸钠或约1mM至约30mM十二酸钠。

7.根据任一前述权利要求所述的方法，其中所述洗涤缓冲液包含约100mM辛酸钠、约20mM癸酸钠或约20mM十二酸钠。

8.根据任一前述权利要求所述的方法，其中所述洗涤缓冲液进一步包含约100mM至约400mM醋酸钠。

9.根据任一前述权利要求所述的方法，其中所述洗涤缓冲液包含约300mM醋酸钠。

10.根据任一前述权利要求所述的方法，其中所述至少一种污染物是宿主细胞蛋白或宿主细胞DNA。

11.根据权利要求10所述的方法，其中所述宿主细胞是选自以下的哺乳动物细胞：CHO细胞、NS0细胞、Sp2/0细胞、COS细胞、K562细胞、BHK细胞、PER.C6细胞和HEK细胞。

12.根据权利要求10所述的方法，其中所述宿主细胞选自大肠杆菌、真菌细胞或酵母细胞。

13.根据任一前述权利要求所述的方法，其中所述固体支持物选自琼脂糖、聚甲基丙烯酸酯、交联的聚(苯乙烯-二乙烯基苯)和具有葡聚糖表面补充剂的琼脂糖。

14.根据任一前述权利要求所述的方法，其中所述蛋白选自：可溶性的受体、抗体、抗体片段、免疫球蛋白单个可变结构域、Fab、F(ab')2、Fv、二硫键连接的Fv、scFv、闭合构象多特异性抗体、二硫键连接的scFv或双抗体。

15.根据任一前述权利要求所述的方法，其中所述溶液是细胞培养物滤液。

16.根据任一前述权利要求所述的方法，其中在步骤c)之后宿主细胞蛋白的相对减少倍数是约2至约10倍。

17.根据权利要求16所述的方法，其中在步骤c)之后宿主细胞蛋白的相对减少倍数是约5倍。

18.根据任一前述权利要求所述的方法，其中在步骤c)之后DNA的相对减少倍数是约2至约150倍。

19.根据权利要求18所述的方法，其中在步骤c)之后DNA的相对减少倍数是约100倍。

20.任一前述权利要求所述的方法，其中在步骤c)之后宿主细胞蛋白或DNA的量小于约5000ppm、4000ppm、3000ppm、2,500ppm、2000ppm、1500ppm、1000ppm、约900ppm、约800ppm、约700ppm、约600ppm、约500ppm、约400ppm、约300ppm、约200ppm、约100ppm、约90ppm、约80ppm、约70ppm、约60ppm,或约50ppm。

21.任一前述权利要求所述的方法，其中在步骤c)之后没有对蛋白进行任何进一步的亲和层析。

22.任一前述权利要求所述的方法，其中所述洗涤缓冲液进一步包含有机酸、有机酸的共轭碱的碱金属或铵盐，和有机碱，且其中在没有加入NaCl的情况下制备所述洗涤缓冲液。

23.权利要求22所述的方法，其中所述有机酸选自甲酸、乙酸、乳酸、柠檬酸、苹果酸、马来酸、甘氨酸、甘氨酰甘氨酸、琥珀酸、TES(2-{[三(羟基甲基)甲基]氨基}乙磺酸)、MOPS(3-(N-吗啉代)丙磺酸)、PIPES(哌嗪-N,N′-双(2-乙磺酸))和MES(2-(N-吗啉代)乙磺酸)。

24.权利要求22所述的方法，其中所述有机碱选自tris碱、Bis-tris、Bis-tris-丙烷、N,N-双(2-羟基乙基)甘氨酸(N,N-双(2-羟基乙基)甘氨酸)、HEPES(4-2-羟基乙基-1-哌嗪乙磺酸)、TAPS(3-{[三(羟基甲基)甲基]氨基}丙磺酸)和三(羟甲基)甲基甘氨酸(N-三(羟基甲基)甲基甘氨酸)。

25.权利要求22-24中的任一项所述的方法，其中所述有机酸的共轭碱是所述有机酸的共轭碱的钠、钾或铵盐。

26.权利要求22-25中的任一项所述的方法，其中所述有机酸是乙酸。

27.权利要求22-26中的任一项所述的方法，其中所述有机碱是tris碱。

28.权利要求22-27中的任一项所述的方法，其中所述有机酸是乙酸，且所述乙酸的共轭碱是钠盐。

29.通过蛋白A层析从污染的蛋白溶液纯化蛋白的方法，所述方法包括：

(a)用蛋白A平衡缓冲液平衡固定化在固相上的蛋白A；

(b)将来自污染的溶液的蛋白吸附至固定化在固相上的蛋白A；

(c)通过用第一种蛋白A洗涤缓冲液洗涤所述固相，除去至少一种污染物，所述第一种蛋白A洗涤缓冲液包含约50mM至约55mMtris碱、约45mM至约55mM乙酸、至少一种脂族羧酸盐，具有约pH7.2至约8.0，其中所述脂族羧酸盐选自约100mM辛酸钠、约20mM癸酸钠和约20mM十二酸钠；和

(d)用蛋白A洗脱缓冲液从所述固相回收蛋白，其中在没有加入NaCl的情况下制备所有缓冲液。

30.权利要求29所述的方法，其中所述平衡缓冲液包含约50mM至约55mMtris碱、约45mM至约50mM乙酸，具有约pH7.2；且所述洗脱缓冲液包含1.8mM醋酸钠和约28.2mM至约300mM乙酸，具有约pH2.4至约pH3.6。

31.权利要求29或30所述的方法，所述方法进一步包括在步骤(c)之后和步骤(d)之前的以下步骤：通过用第二种蛋白A洗涤缓冲液洗涤所述固相，除去污染物，所述第二种蛋白A洗涤缓冲液包含约50-55mMtris碱、约45-50mM乙酸，具有约pH7.2，其中在没有加入NaCl的情况下制备所述第二种蛋白A洗涤缓冲液。

32.权利要求29-31中的任一项所述的方法，所述方法进一步包括在步骤(d)之后的以下步骤：(e)用30mM乙酸、100mMHCl将含有回收的蛋白的溶液滴定至约pH3.0；(f)使步骤(e)的溶液在约pH3.0保持约30至约60分钟；和(g)用1Mtris将步骤(f)的溶液的pH调至约pH7.5。

33.权利要求32所述的方法，所述方法进一步包括过滤通过步骤(g)产生的溶液。

34.通过蛋白L层析从污染的蛋白溶液纯化蛋白的方法，所述方法包括：

(a)用蛋白L平衡缓冲液平衡固定化在固相上的蛋白L；

(b)将来自污染的溶液的蛋白吸附至固定化在固相上的蛋白L；

(c)通过用第一种蛋白L洗涤缓冲液洗涤所述固相，除去至少一种污染物，所述第一种蛋白L洗涤缓冲液包含约50mM至约55mMtris碱、约45mM至约50mM乙酸、至少一种脂族羧酸盐，具有约pH7.)，其中所述脂族羧酸盐选自约100mM辛酸钠、约20mM癸酸钠和约20mM十二酸钠；和

(d)用蛋白L洗脱缓冲液从所述固相回收蛋白，其中在没有加入NaCl的情况下制备所有缓冲液。

35.权利要求34所述的方法，其中所述平衡缓冲液包含约50mM至约55mMtris碱、约45mM至约50mM乙酸，具有约pH7.2；且所述洗脱缓冲液包含约1.8mM醋酸钠和约28.2mM至约300mM乙酸，具有约pH2.4至约pH3.6。

36.权利要求34或35所述的方法，所述方法进一步包括在步骤(c)之后和步骤(d)之前的以下步骤：通过用第二种蛋白L洗涤缓冲液洗涤所述固相，除去污染物，所述第二种蛋白L洗涤缓冲液包含55mMtris碱、45mM乙酸，具有约pH7.2，其中在没有加入NaCl的情况下制备所述第二种蛋白L洗涤缓冲液。

37.权利要求34-36中的任一项所述的方法，所述方法进一步包括在步骤(d)之后的以下步骤：(e)用30mM乙酸、100mMHCl将含有回收的蛋白的溶液滴定至约pH3.0；(f)使步骤(e)的溶液在约pH3.0保持约30至约60分钟；和(g)用1Mtris将步骤(f)的溶液的pH调至约pH7.5。

38.权利要求37所述的方法，所述方法进一步包括过滤通过步骤(g)产生的溶液。

39.权利要求29或34所述的方法，其中所述蛋白A或蛋白L洗涤缓冲液进一步包含约1mM至约500mM醋酸钠。

40.权利要求39所述的方法，其中所述蛋白A或蛋白L洗涤缓冲液包含约300mM醋酸钠。