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CN105188769B - 微粒组合物 - Google Patents

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CN105188769B CN201380072860.XA CN201380072860A CN105188769B CN 105188769 B CN105188769 B CN 105188769B CN 201380072860 A CN201380072860 A CN 201380072860A CN 105188769 B CN105188769 B CN 105188769B
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Abstract

本发明提供一种适用于分子成像的微粒组合物，所述组合物包括微粒，其中，所述微粒包括具有中心区域和外壳的核心微粒结构，并且其中所述核心微粒结构包括(i)磷脂酰胆碱脂质；(ii)包括至少一个马来酰亚胺部分的磷脂酰乙醇胺脂质；和(iii)烷氧基脂肪酸。

Description

微粒组合物
技术领域
本发明涉及一种微粒组合物。更具体地但非排他地本发明涉及一种适用于对选定分子部分进行超声成像的微粒组合物。
背景技术
诊断超声波检查(超声检查)是一种以超声为基础的诊断成像技术，对于可能的病理或病灶，其用于可视化包括肌腱、肌肉、关节、血管和内部器官等组织。常见的例子是在怀孕之间日常使用的产科超声检查。然而，到目前为止，超声成像限于确定解剖结构和运动以及血液流动。
另一方面，超声分子成像，通过靶向微泡的方法，促使目标给定分子部分(moiety)/多个分子部分(moieties)的成像(表达)，而靶向微泡包括颗粒外壳上靶向配体(分子结合单元)1。这一方法通过靶向微泡的静脉(iv)给药来工作，靶向微泡随后循环和在表达目标分子的区域累积。微泡的累积可以描述在超声图像上，作为亮斑信号的区域，以定位分子。
这一技术允许在动物模型中的体内分子成像。然而，超声分子成像还没有在人体中执行，部分原因是关于它的安全性和有效性的不确定性，包括：
(1)生物素-(链霉)亲合素共轭化学的传统应用是使靶配体(分子结合单元)粘结到微泡外壳，链霉亲合素和亲和素是免疫蛋白，最好避免人类的应用；
(2)高超声功率成像技术的传统应用包括“瞬时”颗粒破坏1,2，其提升了安全考虑3。此外，该技术使分子靶(目标的分子部分)的实时床边可视化变得困难，和用于评估心脏不停跳的连续成像或使用微泡单次推注的多平面成像变得不可能；和
(3)低程度的超声分子成像，降低其作为临床诊断工具的应用。
因此，本发明的目的在于提供一种非免疫性的微粒组合物，因此，其适合用于人类受试者和动物受试者超声分子成像中。进一步，本发明的目的在于提供一种体内特异性和有效性的微粒组合物，用于在一个或多个组织/器官中对目标分子部分进行高效定量和实时的超声分子成像。这样制备的微粒在体内可以具有一个或多个有利的特征，其包括但不限于，使用单次推注微粒给药，无毒、足够稳定地用于连续和/或多平面成像，其对于目标分子部分的高效定量分析具有良好的动力学和声学响应，对目标分子部分具有足够高的靶向特异性和有效性，和在组织中缺少非特异性结合/持久性而不表达目标的分子部分(靶分子)(除了网状内皮系统(RES)的组织中，例如肝脏、脾脏，其是身体内微粒消除的常用途径)。
发明内容
本发明的一方面，提供了一种用于分子成像的微粒组合物。所述组合物包括微粒，其中，该微粒包括：具有中心区域和外壳的核心微粒结构，以及其中，该核心微粒结构包括：(i)磷脂酰胆碱脂质；(ii)包括至少一个马来酰亚胺部分(moiety)的磷脂酰乙醇胺脂质；和(iii)烷氧基脂肪酸。
该组合物提供了一种天然的微粒结构，其可以被修饰为适用于选定分子靶(目标分子部分(moiety)/多个部分(moieties))的成像。因此，该微粒进一步可以包括至少一个分子结合单元，其中，该至少一个分子结合单元共价地粘附在核心微粒结构的外壳上。
关于成像，已经发现，该特异性组合物产生足够反射声波和稳定的微粒，该微粒缺少非特异性结合，将不会在体内立即产生副反应。该微粒通过分子结合单元连接到核心微粒结构的外壳上，也有利于流动条件下高效的靶向结合。该微粒良好的动力学和声学响应允许在体内形成高效定量实时超声分子成像。
术语“分子成像”指的是分子部分的成像，例如但不限于，分子、细胞、或颗粒(包括位于人工/植入材料，例如冠脉支架、人工心瓣、或封堵器上的金属、聚合物或药物)。因此，术语“分子成像”可以用来指表型的成像(检测表型的存在、不存在、和/或程度)，其方式是通过靶向具有该微粒的分子部分的一个或组合。表型的示例包括但不限于，生理状态、病理状态、病理生理状态、疾病状态、或运行状态(例如，装置的)。例如，使用微粒靶向E-选择素(Esel)(一种内皮细胞黏附分子，其在炎症内皮细胞活化期间表达)的分子成像可以用于成像检测和评估Esel的表达程度，以及内皮激活和/或炎症。非靶向微粒，例如含有，或完全不含有非相关分子结合单元的微粒，可以用于分子成像，经常作为阴性对照，或用于评估非特异性微粒结合/粘附/保留在组织/器官/受试者/系统中的程度，或作为成像信号校准的试剂(例如，微粒超声成像信号强度-微粒浓度的校准)，或用于评估灌注或描述血液-组织的边界，等等。
术语“微粒”指的是小颗粒，表现为就它们传输和性能而言的整个单元，其典型地表现为范围在0.1-10μm(优选1-5μm)的平均颗粒尺寸直径(例如，通过显微镜、电区感应、或激光衍射技术来检测)。术语“微泡”与术语“微粒”可以是同义使用的。脂质体是一类典型的微粒，被认为是由脂质双层构成的人工制备的囊泡。类似的，胶束是一类微粒，被认为是由亲水外壳和疏水核构成的人工制备的颗粒。
本发明的所述微粒包括具有中心区域和外壳的核心微粒结构。所述核心微粒结构由主要基于脂质的组合物构成，其包括：(i)磷脂酰胆碱脂质；(ii)包括至少一个马来酰亚胺部分的磷脂酰乙醇胺脂质；和(iii)烷氧基脂肪酸。这些组分容易发生自组装以形成稳定的微粒核心结构。
根据组分(i)和(ii)，本发明所述的磷脂酰胆碱和磷脂酰乙醇胺脂质分别为典型的中性磷脂质。因此，它们是包括含磷酸基的亲水性头基和疏水性尾基的脂质。在此所使用的术语“中性”指的是在选定pH下，存在不带电或中性两性离子形式的实体。例如，合适的pH可以是7.4+/-0.5。
另外，根据组分(i)和(ii)，本发明所述的磷脂酰胆碱和磷脂酰乙醇胺脂质，分别典型地具有修饰亲水性头基的饱和或非饱和疏水性尾基。优选地，疏水疏水性尾基为饱和脂肪酸或其衍生物。术语“脂肪酸”指的是直链或支链、饱和或不饱和的包括C7-24碳链的羧酸或其衍生物。典型地，饱和脂肪酸包括C10-24的碳链，更优选地C10-20。
所述组分(i)的磷脂酰胆碱脂质优选为包括C7-24，更优选C8-22，最优选C10-20脂肪酸碳链的磷脂酰胆碱脂质。例如，所述脂质的具体示例包括，二油酰磷脂酰胆碱(DOPC)、二棕榈酰磷脂酰胆碱(DPPC)、棕榈酰油酰磷脂酰胆碱(POPC)、和二硬脂酰磷脂酰胆碱(DSPC)。可以相信，当所述脂质的脂肪酸链在C10-20的范围时，形成更稳定的微粒。更优选地，所述组分(i)的磷脂酰胆碱脂质为饱和C10-20磷脂酰胆碱脂质，例如二硬脂酰磷脂酰胆碱(DSPC；1,2-二硬脂酰-sn-甘油-3-磷酸胆碱)。
所述组分(ii)的磷脂酰乙醇胺脂质优选地包括：含有C7-24，更优选C8-22，最优选C10-20脂肪酸碳链的磷脂酰乙醇胺脂质。例如，所述脂质包括基于二油酰磷脂酰乙醇胺(DOPE)、棕榈酰油酰磷脂酰乙醇胺(POPE)、和二硬脂酰磷脂酰乙醇胺(DSPE)的结构。可以相信，当所述脂质的脂肪酸链在C10-20的范围时，形成更稳定的微粒。更优选地，所述组分(ii)的磷脂酰乙醇胺脂质为饱和C10-20磷脂酰乙醇胺脂质，例如二硬脂酰磷脂酰乙醇胺(DSPE)。
在本发明优选的方面，所述组分(ii)的磷脂酰乙醇胺脂质是聚乙二醇修饰的。术语“聚乙二醇修饰的”指的是实体，通常是基于聚合物或脂质的实体，其共价地结合到聚乙二醇(PEG)聚合物链上。PEG链具有分子式C2nH4n+2On+1和低于2000克/摩尔的分子量。在这种情况下，马来酰亚胺部分粘附至PEG聚合物链，更优选地，PEG聚合物链提供了马来酰亚胺部分和所述磷脂酰乙醇胺脂质部分间的共价连接。
因此，所述组分(ii)的磷脂酰乙醇胺脂质优选地包括分子量至少为500，例如至少1000、1500、或2000的聚乙二醇链。根据自组装，1500-2500分子量的聚乙二醇链是优选的。
所述组分(ii)的磷脂酰乙醇胺脂质包括至少一个马来酰亚胺部分，马来酰亚胺部分是具有通式H2C2(CO)2NH的化学实体，其可以用以下结构来表示。
优选地，潜在地通过PEG聚合物链，所述述组分(ii)的马来酰亚胺部分的NH基共价地结合到所述磷脂酰乙醇胺部分。
特别优选地，所述微粒组合物的磷脂酰乙醇胺脂质是1,2-二硬脂酰-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺-N-[马来酰亚胺(聚乙二醇)-2000](简称DSPE-PEG2000-Mal)。
特别地，马来酰亚胺部分作为所述分子结合单元手柄的应用不同于通常在制备该颗粒中的免疫(链霉)亲合素-生物素的配位化学。尽管可以使用其他配位化学，让人惊奇地是，马来酰亚胺键产生具有低水平免疫的微粒。而且，所述马来酰亚胺键的pH稳定性在以下方面具有优势：防止所述分子结合单元的降解，以及通过防止体内所述分子结合单元与所述微粒外壳的解离，防止制备期间所述微粒的降解。
根据本发明组分(iii)的所述烷氧基脂肪酸可以包括直链的或支链的、饱和的或不饱和的脂肪酸基。而且，所述脂肪酸链可以是C7-24链，更优选C8-22链，最优选C10-20链。如此，包括直链、饱和或不饱和的(优选饱和的)C10-20链的脂肪酸链是优选的。所述烷氧基(例如，与脂肪酸基形成酯的基团)可以是单独地结合到所述脂肪酸的氧上的直链或支链的烷基(优选C1-50烷基或C1-24烷基)，烯基(优选C1-50烯基或C1-24烯基)，或聚乙二醇基。
本文所用术语“Cx-y烷基”指的是含有x-y个碳原子的直链或支链的饱和烃基。例如，C1-50烷基指的是含有1-50个碳原子的直链或支链的饱和烃基。C1-50烷基的例子包括甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、异丁基、仲丁基、叔丁基、正戊基、异戊基、新戊基、己基、异己基、1,1-二甲基丁基、2,2-二甲基丁基、3,3-二甲基丁基、2-乙基丁基、庚基、辛基、壬基、癸基、十一烷基、十二烷基、十四烷基、十六烷基、十八烷基、二十烷基、三十烷基、四十烷基、和五十烷基。
本文所用术语“Cx-y烯基”指的是含有一个或多个碳碳双键和具有x-y个碳原子的直链或支链的烃基。C1-50烯基的例子包括乙烯基、1-丙烯基、2-丙烯基、2-甲基-1-丙烯基、1-丁烯基、2-丁烯基、3-丁烯基、3-甲基-2-丁烯基、1-戊烯基、2-戊烯基、3-戊烯基、4-戊烯基、4-甲基-3-戊烯基、1-己烯基、3-己烯基、5-己烯基、庚烯基、辛烯基、壬烯基、癸烯基、十一碳烯基、十二碳烯基、十三碳烯基、十五碳烯基和十六碳烯基。
术语“烃”指的是只有氢和碳构成的实体，所述实体可以是饱和或不饱和，支链或直链的。
在优选的方面，所述烷氧基脂肪酸是聚乙二醇脂肪酸。因此，例如，合适的烷氧基脂肪酸可以是C10-20饱和聚乙二醇脂肪酸酯。在微粒稳定性方面，特别优选的聚乙二醇脂肪酸酯是PEG40硬脂酸酯。
除非另外指出，组分(i)-(iii)或任何在本文中所述的进一步组分可以以盐的形式，以及游离形式(酸或碱)而存在。
根据本发明的所述微粒组合物可以包括至少一个结合到所述核心微粒结构外壳上的分子结合单元。在这种方法中，生成的靶向微泡对于选定分子部分是有特异性的(表达)，例如，特异性粘附在选定分子部分上。在一个优选实施例中，所述至少一个分子结合单元是通过所述至少一个马来酰亚胺部分共价粘附到所述核心微粒结构上。而且，所述微粒组合物可以包括一个或多个不同的分子结合单元以靶向一个或多个分子部分(表达)。
所述分子结合单元可以是任何能够结合到互补分子部分的无机或有机分子。所述分子结合单元的精确识别和本性依赖于待所述微粒识别和成像的目标分子部分。例如，所述分子部分可以是分子、蛋白质、受体、颗粒或细胞，其包括存在于人工或植入材料上。所述分子部分可以存在于细胞的表面。所述分子结合单元可以是任何能够结合到所述目标分子部分的合适的单元。所述分子结合单元应该特异性结合到所述目标分子部分，从而其不能结合到其他分子部分。因此，合适的分子结合单元可以包括但不限于，蛋白质、多肽、核酸、糖、脂质、无机部分、或小有机部分(例如，药物分子)。在一些实施例中，所述分子结合单元可以是金属(例如，镍、钴、镁或锌的离子，其结合到组氨酸标记)。4在一些特定的实施例中，所述分子结合单元可以是结合蛋白质、亲合体、或抗体分子。
术语“结合蛋白”指的是任何能够特异性结合到分子的蛋白质(以下称之为它的“结合配对物”)。特异性结合蛋白具有结合位点，在该结合位点上，其结合至它的结合配对物。所述结合蛋白通常在这一位点上只是高亲和性地结合至它的结合配对物和与该结合配对物具有类似结构的其他分子。与所述结合配对物不相似的分子将低亲和性地结合，即使有的话。结合蛋白为本领域相关技术人员所熟知的。结合蛋白的例子包括但不限于，T细胞受体、HLA蛋白、细胞表面受体和酶。5术语“结合蛋白”也包括上述的功能片段或任何其他能够特异性结合的分子。功能片段是上述结合蛋白仍然能够高亲和性地特异结合到它的结合配对物的一部分。
术语“亲合体”指的是基于58个氨基酸残基蛋白质结构域的小分子，其是从葡萄球菌A蛋白的IgG结合域衍生而来。它们被挑选从而对小分子具有特异性结合(例如，见专利文献WO95/19274A1)。6-8
术语“抗体”或“抗体分子”指的是任何同型的多克隆或单克隆抗体，或其抗原结合片段，例如，Fv、Fab、F(ab’)2片段和单链Fv片段。所述抗体分子可以为重组抗体分子，例如，嵌合抗体分子、CDR接枝抗体分子(作为人类抗体分子也很出名)或其片段。所述抗体及其制备方法在现有技术中是已知的。所述抗体分子由任何合适的方法来制得，例如，使用杂交或噬菌的技术。本领域技术人员知道怎样生产对小分子具有特异性结合亲和能力的抗体。8所述抗体分子可以从任何合适生物中制备，例如，绵羊、小鼠、兔子、山羊、驴、骆驼、美洲驼马或鲨鱼。优选地，所述抗体分子是人类、人源化、嵌合或啮齿动物的抗体分子。
术语“特异性地结合”指的是两分子之间的相互作用，其形成在生理条件下相对稳定的复合物。其特征在于，高亲和性明显不同于经常具有低亲和性的非特异性结合。
所述分子结合单元优选地为抗体分子。在这种情况下，所述抗体分子可以通过裸露的硫醇基(例如，-SH)共价地粘附到马来酰亚胺基，从而得到硫醚键(例如，-S-)。
合适的分子结合单元的具体例子为E-选择素(Esel)用抗体。Esel是一种内皮细胞黏附分子，其通常只在激活内皮细胞中表达(剩余内皮细胞中缺乏基本的表达)。9尤其是，可以用于内皮激活或炎症的特异性检测。10,11因此，本发明的一个实施例允许首次使用超声在心脏和肾脏中实施Esel的特异性成像。
在不同疾病的各种病理生理学过程涉及到的其他血管内分子/细胞，其可以是所述分子结合单元的靶，包括但不限于：
(i)在动脉粥样硬化、缺血再灌注损伤、急性心肌梗死和早期血管成形术、慢性局部缺血、心脏移植排斥、脑脊髓炎、克罗恩(Crohn)病和肿瘤辐射等发炎过程中，在主动脉、心脏、骨骼肌、肾脏、脑、肠和前列腺癌(后肢移植)等组织中，P-选择素(Psel)、非选择性的选择素(例如，非选择性Esel、Psel、Lsel合并)、细胞间粘附分子-1(ICAM-1)、血管细胞粘附分子-1(VCAM-1)、粘膜地址素细胞粘附分子-1(MAdCAM-1)和含β1、β3的整合素(例如，α5β1、αVβ3、αIIbβ3(糖蛋白IIb/IIIa受体(GPIIb/IIIa受体)))
(ii)血管内皮生成因子受体-2(VEGFR-2)、含β1、β3或αV的整合素(例如，α5β1、αVβ3)和内皮因子，位于以下的血管生成：(a)位于脑、胰腺、乳房脂肪垫、后肢、侧腹或腹股沟区域的肿瘤(乳腺、前列腺、卵巢、结肠、胰腺癌、黑色素瘤、血管肉瘤、纤维肉瘤和神经胶质瘤)；(b)慢性局部出血(后肢、骨骼肌)；和(c)基质胶插塞血管生成；
(iii)在中风或血栓栓塞性疾病中，位于颈动脉、左心耳、下腔静脉和腹主动脉中的血栓症(血块)的αIIbβ3(GPIIb/IIIa受体)；
(iv)淋巴结中的L-选择素(Lsel)；
(v)报道分子，诸如大多数组织相容性复合物(MHC)类I H-2Kk蛋白，例如位于，在内皮原始细胞治疗中，由内皮原始细胞衍生而来的传染骨髓上；
(vi)激活的白细胞，例如，在心脏或肾脏中的缺血再灌注损伤、急性心肌梗死和早期血管成形术、和心脏移植排斥(磷脂酰丝氨酸可以作为分子结合单元，其通过可能的机制靶向激活的白血球，该机制包括但不限于，电荷相互作用和补体结合)。
在一些实施例中，所述分子结合单元可以选自下表：
表1-体内超声分子成像
a在标准单字母命名法中，含有前缀“c”的多肽序列代表“环(cyclo-)”。b与白血球的磷脂酰丝氨酸的相互作用包括激活白血球上的电荷相互作用和互补物受体(未定义)。c真实的分子靶是未知的。
简写：DSPS(二硬脂酰磷脂酰丝氨酸)；Ab(抗体)
在实施例中，无论分子结合单元是否配位到组分(ii)的马来酰亚胺部分，在所述微粒或组分(ii)上的任何马来酰亚胺部分(换言之，那些含有活性马来酰亚胺功能的马来酰亚胺部分)，例如，可以通过水解或与过量的硫醇反应而被失活。尤其是，使用每个分子中单硫醇基的合适分子可以是优选的，例如，L-半胱氨酸(从反应物而来的微粒或组分随后需要被纯化)。
当所述分子结合单元配位到所述微粒上的时候，在该配位反应中使用的所述配位反应比优选地为至少2×106个分子结合单元(例如，抗体分子)/微粒。在一些实施例中，所述配位反应比可以优选地为至少3×106个分子结合单元/微粒。更进一步地，所述配位反应比可以优选地为至少4×106个分子结合单元/微粒。当使用这一数量级的反应比的时候，制得在流动条件及静止条件下能够足够结合的微粒。更低水平(例如，约1×106个分子结合单元/微粒)生成在静止条件下只能靶向的微粒。
以另一方式表达，假设所有组分(ii)结合到所述微粒的所述外壳上，在使所述分子结合单元配位到所述微粒上的反应中，使用的所述配位反应比使得所述至少一个分子结合单元与组分(ii)的配位反应摩尔比为≥1:1。另外，所述至少一个分子结合单元与组分(ii)的配位反应摩尔比可以为≥5:1。进一步地，所述配位反应摩尔比可以为≥8:1、≥9:1或≥10:1。在一些实施例中，所述配位反应摩尔比可以约是10:1。
在一些实施例中，所述微粒具有至少约0.3×105个分子结合单元(例如，抗体分子)/微粒。这允许所述微粒在流动条件及静止条件下能够充足地结合。在一些实施例中，所述微粒具有至少约1×105个分子结合单元(例如，抗体分子)/微粒。所述微粒可以具有至少约2×105个分子结合单元(例如，抗体分子)/微粒。进一步地，所述微粒可以具有至少约3×105个分子结合单元(例如，抗体分子)/微粒。在特定实施例中，所述微粒可以具有至少约3×105-约4×105个分子结合单元(例如，抗体分子)/微粒。
所述微粒可以具有至少约2500个配位的分子结合单元(例如，抗体分子)/μm2微粒表面积。进一步地，所述微粒可以具有至少约5000个配位的分子结合单元(例如，抗体分子)/μm2微粒表面积。在一些实施例中，所述微粒可以具有至少约7500个配位的分子结合单元(例如，抗体分子)/μm2微粒表面积。
已经发现，通过保持每一分子结合单元上的配位位点为最小值(例如，只还原1个链间二硫键以生成每抗体中的2个-SH基)和使颗粒配位后的任何未反应基团(例如，通过未反应-SH基的烷基化)失活，由于交联而明显的颗粒团聚也可以被避免。
所述分子结合单元可以在所述微粒形成之前或之后共价地粘附在所述微粒组合物的所述组分(ii)上。当结合单元在所述微粒形成之前共价地粘附在组分(ii)上，则最终的组分摩尔比为5-15。
所述微粒的结构形态学不限于任何方法，以及所述颗粒可以表现为脂质体或胶束的结构。在一些实施例中，所述核心微粒结构是胶束的结构。当所述核心微粒结构是胶束的结构时，所述组分脂质的亲水性头基创建所述核心结构的所述外壳，而疏水性尾部延伸到所述核心的中心区域。在另一些实施例中，所述核心微粒结构是脂质体的结构。
在本发明一个优选方面中，所述微粒组合物在所述核心微粒结构的中心区域含有流体介质。所述流体介质可以是任何生理学上可接受的介质，其可以含有或不含有活性成分，其通过所述分子结合单元用于传递到特异性靶向的位置。优选地，所述流体介质包括生理学上可接受的气体。合适的生理学上可接受的气体包括空气、氮气、二氧化碳、氙、氪、六氟化硫、氯三氟甲烷、二氯二氟甲烷、溴三氟甲烷、溴氯二氟甲烷、四氟甲烷、二溴二氟甲烷、二氯四氟乙烷、氯五氟乙烷、六氟乙烷、六氟丙烯、八氟丙烷、六氟丁烯、八氟-2-丁烯、八氟环丁烷、十氟丁烷、全氟环戊烷、十二氟戊烷、和十四氟己烷。从实际方面来看，以及根据病人安全方面考虑，空气、氮气、六氟化硫、氯三氟甲烷、二氯二氟甲烷、溴三氟甲烷、溴氯二氟甲烷、四氟甲烷、二溴二氟甲烷、二氯四氟乙烷、氯五氟乙烷、六氟乙烷、六氟丙烯、八氟丙烷、十氟丁烷、十二氟戊烷、和十四氟己烷是优选的。在一些实施例中，所述生理学上可接受的气体选自空气、氮气、六氟化硫、八氟丙烷、十氟丁烷、十二氟戊烷、和十四氟己烷。在另一些实施例中，所述生理学上可接受的气体可以选自六氟化硫、氯三氟甲烷、二氯二氟甲烷、溴三氟甲烷、溴氯二氟甲烷、四氟甲烷、二溴二氟甲烷、二氯四氟乙烷、氯五氟甲烷、六氟乙烷、六氟丙烯、八氟丙烷、十氟丁烷、十二氟戊烷、和十四氟己烷。进一步地，所述生理学上可接受的气体可以选自六氟化硫、八氟丙烷、十氟丁烷、十二氟戊烷、和十四氟己烷。在特定实施例中，所述生理学上可接受的气体是八氟丙烷。
所述微粒可以具有在0.1-10μm、0.2-10μm或0.5-10μm的范围内的平均直径(例如，通过显微镜、电区感应、或激光衍射技术来检测)。在一些实施例中，所述微粒可以具有在0.5-8μm、0.5-7μm或0.8-6μm的范围内的平均直径。在特定实施例中，所述微粒可以具有在1-5μm的范围内的平均直径。所述微粒可以具有主要球形形态。另外，颗粒尺寸分布可以为至少90％或至少95％的颗粒直径小于10μm(优选地，小于6μm)。在特定实施例中，所有微粒将具有小于10μm的直径。在进一步的实施例中，至少95％的所述微粒将具有小于6μm的直径。当用于例如全身给药的时候(例如，iv)，这一尺寸的微粒能够畅通地穿过微血管或微循环，包括肺毛细血管床。就电荷而言，颗粒具有近中性的电荷，＞-30mV到＜+30mV范围内的ζ电位(zeta potential)，当从未结合壳体组分之后所述微粒的纯化/未纯化的测量。所述ζ电位优选地在＞-20mV到＜+20mV范围内，更优选在＞-20mV到＜+10mV范围内。微粒的具体例子包括抗体作为所述分子结合单元，其在pH7.4、1mM KCl下具有约5mV的ζ电位。
微粒可以通过任何合适的路径来给药，例子包括但不限于，iv、动脉内、肌肉内、淋巴内或直接注射/给药到组织或组织腔/间隙。
在本发明一个特别优选的方面，所述微粒包括：(i)-(iii)的摩尔比满足以下范围的组合物：(i)70-80；(ii)5-15；和(iii)10-20。使用特定摩尔比的这一特定成分的组合物，已经有利地发现，可以制得在体内(特别是人类)是功能化和有活力的靶向微粒，用于有效、定量和实时超声分子成像。
所述微粒的组合物可以与用于生成微粒的组分混合物的组合物同义地使用(例如，中间体微粒组合物)。
所述微粒组成也可以包括一个或多个标记部分，或其药学上可接受的盐。标记部分是一种有助于通过成像技术将所述微粒可视化的实体。在所述组合物中所述标记部分的摩尔比可以为0.2-50，优选地0.5-5。
标记部分的一个示例是荧光染料，其可以用作可视化工具。荧光染料的示例包括但不限于：1,2-二油酰-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺-N-(5-二甲基氨基-1-萘磺酰)、1,2-二油酰-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺-N-(1-芘磺酰)、1,2-二油酰-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺-N-(羧基荧光素)、1-油酰-2-[6-[(7-硝基-2-1,3-苯并噁二唑-4-基)氨基]己酰]-sn-甘油-3-磷酸-L-丝氨酸，25-[N-[(7-硝基-2-氧-1,3-二唑-4-基)-甲基]氨基]-27-降胆甾醇、油酰-2-[6-[(7-硝基-2-1,3-苯并噁二唑-4-基)氨基]己酰]-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺、1,2-二油酰-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺-N-(丽丝胺罗丹明B磺酰)、罗丹明双十六烷酰磷酸乙醇胺、3,3'-双十八烷基氧杂羰花青高氯酸盐(DiO)、BODIPY FL荧光探针、荧光素-5-异硫氰酸脂(FITC)、5-羧基荧光素、和1,1'-双十八烷基-3,3,3',3'-四甲基吲哚羰花青高氯酸盐(DiI)。优选的荧光染料是1,1'-双十八烷基-3,3,3',3'-四甲基吲哚羰花青高氯酸盐(DiI)在所述组合物中，所述荧光染料的摩尔比可以是0.5-5，优选1-4，更优选1.5-3。所述微粒组合物可以包括一种以上的荧光染料。
所述标记部分通过粘附到组分(i)、(ii)或(iii)中的一个或多个、分子结合单元、或额外的组分(例如，另一脂质组分)，可以合并到所述微粒组合物中。当所述标记部分通过已知的微粒组分来添加，所述未标记组分的摩尔比(例如，组分(i)、(ii)、(iii)，或所述分子结合单元的配位比)可以保持不变或按比例降低，从而含有标记和不含有标记的特别组分的总摩尔比保持不变。例如，假如FITC通过组分(i)以摩尔比为2的FITC-DSPC引入到包括摩尔比为75/9/14的DSPC/DSPE-PEG2000-Mal/PEG40硬脂酸酯的组分组合物中，最终组分组合物要么包含摩尔比为2/75/9/14的DSPC-FITC/DSPC/DSPE-PEG2000-Mal/PEG40硬脂酸酯，要么包含摩尔比为2/73/9/14的DSPC-FITC/DSPC/DSPE-PEG2000-Mal/PEG40硬脂酸酯。在另一实施例中，其中，所述标记通过额外的组分来添加(例如，通过作为另一脂质的DSPE)。所述其他微粒组分的摩尔比仍然保持不变。例如，假如引入摩尔比为2的DiI(包含DSPE)到包含摩尔比为75/9/14的DSPC-FITC/DSPC/DSPE-PEG2000-Mal/PEG40硬脂酸酯的组分组合物中，随后，最终组分组合物可以包括摩尔比为2/75/9/14的DiI/DSPC/DSPE-PEG2000-Mal/PEG40硬脂酸酯。使用上述相同的机理，一种以上的标记部分可以用于给定的微粒。
可替换的标记部分包括本领域公知的应用于不同成像技术中的标记部分，例如，核磁共振成像(MRI)、闪烁扫描术、单光子发射计算机断层成像(SPECT)、正电子发射断层成像(PET)、计算机断层显像(CT)、X光成像/透视、荧光成像、生物发光成像、显微法、光学方法、或其多模衍生法。所述标记部分的示例可包括但不限于，顺磁性、超顺磁性或超超顺磁性颗粒(例如，钆(Gd)、氧化铁、铁、铂、镁)，放射性核素(例如，锝-99m、铊-201、碘-123、碘-131、镓-67、铟-111、氟-18、碳-11、氮-13、氧-15、铷-82)，不透射线颗粒(例如，碘、钡和金属)，荧光团或荧光染料(例如，上面所述的那些)，酶底物(例如，对于荧光素酶的)，和金纳米颗粒。标记的进一步示例可以包括但不限于，Gd-DTPA-双(硬脂酸酰胺)(Gd-BSA)；Gd-DTPA-双(肉豆蔻酰胺)(GdDTPA-BMA)；1,2-二肉豆蔻酰-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺二亚乙基-三胺五乙酸酯：Gd3+(DMPEDTPA:Gd3+)；D-35-1,2-二己酰-sn-甘油-3-磷酸胆碱；钆(III)2-[4,7-二-羧甲基-10-[(N,N-二硬脂氨基甲基-N"-氨基-甲基]-1,4,7,10-四-氮杂-环十二烷-1-基]-乙酸(Gd.DOTA.DSA)；钆(III)1,4,7,10-四氮杂环十二烷-1,4,7,10-四乙酸单(N1-胆甾醇氧基-3-羰基-1,2-二胺乙烷)酰胺(Gd.DOTA.Chol)；1,4,7,10-四氮杂环十二烷-1,4,7,10-四乙酸单(N1-双硬脂酰基磷脂酰基乙醇胺)酰胺(Gd.DOTA.DSPE)；以及钆(III)二亚乙基三胺-1,1,4,7,10-五(乙酸)-10-乙酸单(N1-胆甾醇氧基-3-羰基-1,2-二胺乙烷)酰胺(Gd.DTPA.Chol)。
这些标记部分可以通过微粒组分(i)、(ii)、或(iii)、分子结合单元、或通过额外的组分(例如，另一脂质组分)引入到所述微粒。当通过已知微粒组分加入标记部分的时候，未标记组分的摩尔比(组分(i)、(ii)、(iii)、或所述分子结合单元的配位比)可以保持不变或成比例的减小，从而含有和不含有标记的颗粒组分的总摩尔比保持不变。例如，假如通过组分(i)，Gd标记作为Gd.DOTA.DSPC以摩尔比为20而被引入到包括摩尔比为75/9/14的DSPC/DSPE-PEG2000-Mal/PEG40硬脂酸酯的组分组合物，最终组分组合物可以包括摩尔比为20/75/9/14或20/55/9/14的Gd.DOTA.DSPC/DSPC/DSPE-PEG2000-Mal/PEG40硬脂酸酯。在另一实施例中，通过额外的组分(例如，通过作为另一脂质的DPPE)，标记被加入，其他微粒组分的摩尔比可以保持不变。例如，假如通过附加脂质DSPE，Gd标记作为摩尔比为20的Gd.DOTA.DSPE被引入到包括摩尔比为75/9/14的DSPC/DSPE-PEG2000-Mal/PEG40硬脂酸酯的组分组合物，最终组分组合物随后可以包括摩尔比为20/75/9/14/2的Gd.DOTA.DSPE/DSPC/DSPE-PEG2000-Mal/PEG40硬脂酸酯。在大多数的情况下，所述标记形成小摩尔范围的总微粒剂型，但是具有与目标成像方法的检测灵敏度相一致的充足数量。例如，相对于用于PET检测的荧光素-18标记或用于荧光显微检测的DiI标记，需要更多的钆标记将用于MRI检测。通过使用以上的机理，一种以上的标记可以用于给定的微粒。
所述微粒组成也可以包括进一步的脂质组分，例如，二硬脂酰磷脂酰乙醇胺(DSPE)。当所述脂质为DSPE时，DSPE在所述组合物中的摩尔比可以是0.5-5，优选1-4，更优选1.5-3。尤其是，当没有标记(例如，像DiI的荧光染料)时，在所述微粒组合物中存在DSPE是优选的。
在本发明进一步的实施例中，所述微粒组成可以进一步包括肿瘤靶向剂。本发明包括肿瘤靶向剂的微粒通常包括配体，该配体用于肿瘤细胞中过表达受体，该过表达相对于哺乳动物非肿瘤组织细胞中所述受体的表达而言。在一些实施例中，所述分子结合单元为肿瘤靶向剂。
所述肿瘤靶向剂的一个示例为包括叶酸部分的实体。在本发明优选的方面，所述肿瘤靶向剂为磷脂-聚乙二醇-叶酸化合物。更优选地，所述磷脂-聚乙二醇-叶酸化合物是DSPE-PEG2000-叶酸[二硬脂酰磷酯酰乙醇胺-聚乙二醇(2000)-叶酸]。
在适当的时候，所述核心微粒结构的中心区域可以包括气相标记，示例包括但不限于，氩-133、氪-81m、氮-13、锝-99m DTPA)。
除了超声成像，不含有标记的微粒也可以适用于MRI、CT、X光成像或显微镜法。51,52此外，也可以进一步包括用于提高磁共振成像和核磁共振成像的脂质。
在适当的时候，基于治疗或调查目的，所述微粒组成也可以包括活性、治疗的或标签材料(示例包括但不限于，抗体、多肽、药物、含放射性核素的化合物、放射性药物、放射性气体、或基因材料，其位于(i)-所述核心微粒结构所述中心区域内，或(ii)-所述核心微粒壳体内/上，或(iii)-(i)和(ii)两者都有)53。
在特别优选的实施例中，所述微粒组合物包括微粒，其中，所述微粒包括：具有中心区域和外壳的核心微粒结构，和共价粘附到所述核心微粒结构的所述外壳上的至少一个分子结合单元，其中，所述核心微粒结构包括：(i)饱和C10-20磷酰胆碱脂质；(ii)包括分子量至少为1000的聚乙二醇链和至少一个马来酰亚胺部分的饱和C10-20磷酯酰乙醇胺脂质；和(iii)饱和C10-20聚乙二醇脂肪酸酯，其中，所述微粒具有(i)-(iii)的摩尔比满足以下范围的组合物：(i)70-80；(ii)5-15；和(iii)10-20，以及所述核心微粒结构的所述中心区域包括选自空气、氮气、六氟化硫、氯三氟甲烷、二氯二氟甲烷、溴三氟甲烷、溴氯二氟甲烷、四氟甲烷、二溴二氟甲烷、二氯四氟乙烷、氯五氟乙烷、六氟乙烷、六氟丙烯、十氟丁烷、十二氟戊烷、十四氟己烷和八氟丙烷的生理学上可接受的气体。在这一实施例中，更有利的是，如果所述马来酰胺部分通过聚乙二醇链的方式连接到所述饱和C10-20磷酯酰乙醇胺脂质，以及所述分子结合单元为抗体分子。
进一步地，在上述实施例中，所述核心微粒结构可以包括(i)DSPC，其作为饱和C10-20磷酰胆碱脂质；(ii)DSPE-PEG2000-Mal，其作为包括分子量至少为1000的聚乙二醇链和至少一个马来酰亚胺部分的饱和C10-20磷酯酰乙醇胺脂质；和(iii)PEG40硬脂酸酯，其作为饱和C10-20饱和聚乙二醇脂肪酸酯。
在以上所述实施例中，组分(i)-(iii)的摩尔比可以满足以下范围：(i)72-78；(ii)7-12；和(iii)12-18。
在本发明另一高度优选的实施例中，所述微粒组合物包括微粒，其中，所述微粒包括：具有中心区域和外壳的核心微粒结构，和共价粘附在所述核心微粒结构的所述外壳上的至少一个分子结合单元，其中，所述核心微粒结构包括：(i)DSPC；(ii)DSPE-PEG2000-Mal；和(iii)PEG40硬脂酸酯，其中，所述微粒具有(i)-(iii)的摩尔比满足以下范围的组合物：(i)72-78；(ii)7-12；和(iii)12-18，所述核心微粒结构的所述中心区域包括选自空气、氮气、六氟化硫、氯三氟甲烷、二氯二氟甲烷、溴三氟甲烷、溴氯二氟甲烷、四氟甲烷、二溴二氟甲烷、二氯四氟乙烷、氯五氟乙烷、六氟乙烷、六氟丙烯、十氟丁烷、十二氟戊烷、十四氟己烷和八氟丙烷(优选八氟丙烷)的生理学上可接受的气体，以及所述分子结合单元为抗体分子。这一实施例优选地也包括摩尔比为0.5-5，优选1-4，更优选1.5-3的进一步的磷酯酰乙醇胺脂质。该进一步的磷酯酰乙醇胺脂质优选也包括C7-24，优选C8-22，更优选C10-20，更进一步优选饱和C10-20的脂肪酸链，最优选其为二硬脂酰磷酯酰乙醇胺(DSPE)。
含有所需生理学上可接受气体的所述微粒在形成之后，立即通过例如在-80℃下冷冻，并于水溶液中存储。为了完成这一过程，所述颗粒冷冻在液氮中(例如，经过或未经过在先洗涤纯化以除去未结合的微粒组分或片段)。随后，当需要使用所述颗粒时，它们可以通过缓慢的升温来加热(例如，通过手)。这应用到粘附在所述外壳的所述表面上，且具有或没有分子结合单元的微粒上。
所形成的微粒(例如，经过或未经过在先洗涤纯化以除去未结合的微粒组分或片段)还可以作为冻干物来存储(干粉)。例如，冻干物(粉末)可以存储于封闭小瓶中，在所述小瓶的头部空间中含有期望的生理上可接受的气体。然后，当需要时去使用所述颗粒，它们可以通过滴注合适的水基溶液(例如，生理盐水、5％右旋糖、5％葡糖糖、磷酸盐缓冲盐水(PBS))之后剪切混合(例如手或机器摇动)以进行重构。
合适的水基溶液(示例包括但不限于，生理盐水、5％右旋糖、5％葡萄糖、PBS)可以包括合适的添加剂，后者的示例包括但不限于，基体试剂(糖、麦芽糖等碳水化合物、)；冷冻保护剂(例如，丙二醇、甘油)、缓冲液(一水磷酸二氢钠、五水磷酸氢二钠)，药学上可接受的载体/赋形剂，或它们的组合。
本发明也关注了适用于制备分子成像微粒组合物的中间体微粒组合物，其中，所述中间体组合物包括：(i)磷脂酰胆碱脂质；(ii)包括至少一个马来酰亚胺部分的磷脂酰乙醇胺脂质；和(iii)烷氧基脂肪酸。所述组合物显示稳定的中间体剂型，其可以用作形成或再形成微粒的基础，以及很容易储存，运输和随后再成形(根据所需要的分子结合单元，在适当的时候)。示例包括(但不限于)：
(a)所述微粒组合物的冻干物(干粉)，其事先混合和溶解在合适的有机溶剂中；
(b)(a)的冻干物(干粉)，其事先悬浮在合适的水基溶液中；
(c)所形成的微粒的冻干物(干粉)，其事先在合适的水基溶液中；和
(d)以上(a)、(b)或(c)中的冻干物的水悬浮物(溶液)，其在合适的水基溶液中。
尤其是，所述中间体微粒组合物可以具有满足以下范围的(i)-(iii)的摩尔比：(i)70-80；(ii)5-15；(iii)10-20。
所述中间体微粒组合物可以进一步包括至少一个分子结合单元。在这一情况下，所述至少一个分子结合单元可以共价地粘附在所述至少一个马来酰亚胺部分上。
在优选的实施例中，所述中间体微粒组合物为冻干物。例如，中间体组合物可以通过提供包含上述特定摩尔比的组分(i)-(iii)的混合物来制得。所述组分可以通过溶解在合适的溶剂(例如，氯仿)中以混合，以及随后通过冻干法来制备以保存。
所述中间体组合物可以具有与适用于分子成像的所述微粒组合物相关的任何上述的特征。因此，所述中间体组合物可以包括相同的脂质和额外的组分。
所述中间体组合物可以通过提供包含上述特定摩尔比的组分(i)-(iii)的混合物来制得。所述组合物可以溶解在合适的溶剂(例如，比率为1:2的环己烷:氯仿)中以混合，随后通过冻干法来制备以保存。
冻干法可以允许溶剂的交换以得到合适的水基溶液。在所需生理学上可接受的气体的存在下，通过剪切混合(例如，使用超声处理、机器或手动搅拌)，可以随后形成中间体组合物的微粒。然后，形成的所述微粒通过冻干法制备为干粉并储存，例如，其中有/没有在先的清洗纯化以除去，例如，未结合的微粒组分或片段。
所述中间体微粒组合物(有/没有在先的清洗纯化以除去，例如，未结合的微粒组分或片段)可以作为冻干物(干粉)来储存。例如，所述冻干物(粉末)能够储存在密封小瓶内，其顶部空间含有所需生理学上可接受的气体。然后，当需要使用所述颗粒的时候，滴加到合适的水基溶液，随后剪切混合(例如，机械或手动振动)，它们可以重新形成。
另外，根据本发明，提供了一种包含中间体微粒组合物的试剂盒，和包括生理学上可接受气体的流体介质源。尤其是，所述生理学上可接受气体可以选自空气、氮气、二氧化碳、氙、氪、六氟化硫、氯三氟甲烷、二氯二氟甲烷、溴三氟甲烷、溴氯二氟甲烷、四氟甲烷、二溴二氟甲烷、二氯四氟乙烷、氯五氟乙烷、六氟乙烷、六氟丙烯、八氟丙烷、六氟丁烯、八氟-2-丁烯、八氟环丁烷、十氟丁烷、全氟环戊烷、十二氟戊烷、和十四氟己烷。例如，所述试剂盒可以包括含有水性(优选胶束的)脂质分散液(例如，在合适水基溶液中的冻干物的悬浮液)的密封小瓶内，所述小瓶在所述小瓶的顶部空间具有生理学上可接受气体。
换句话说，所述试剂盒包括含有冻干物(干粉)作为中间体微粒组合物的密封小瓶，所述小瓶在所述小瓶的顶部空间具有生理学上可接受气体。当需要的时候，通过滴加到合适的水基溶液，随后剪切混合(例如，通过手或机械摇动)，所述微粒可以重新形成。
在进一步的方面，根据本发明，提供了一种微粒组合物的制备方法，所述方法包括：由组分(i)到(iii)形成具有中心区域和外壳的核心微粒结构。所述方法可以进一步包括共价地粘附至少一个分子结合单元到所述核心微粒结构的所述外壳上。
具有中心区域和外壳的所述核心微粒结构可以使用任何合适的方法形成。用于制造微粒的常用方法涉及，例如，高剪切混合，比如，含有外壳形成组分的水介质的超声处理。所述溶液(水胶束分散液，在存在脂质的情况下)可以在所述溶液中喷入气体时，使用探针型超声发生器进行超声处理。通过超声诱导剪切使气体分散到所述水相中。通过使外壳组分立即沉降在所述气液界面，使微粒气体颗粒稳定化。手动搅拌或高速混合可以取代超声处理被使用，例如，在牙科银汞合金的处理中。具有水胶束脂质分散液和气体顶部空间的封闭小瓶可以放置在汞合金调拌器中。短时间(例如，小于1min)混合(例如，在约2000-4000rpm)后，微粒备用。可选地，微粒外壳组分或微粒可以制备成干前体(冻干物)。使用/不使用合适的基体试剂(例如，碳水化合物)，微粒外壳组分或微粒可以分别共溶或悬浮在合适的溶液中，放置于小瓶中并进行冻干(冻干化)。小瓶可以随后填充所需气体并密封。含有冻干物(干粉)的小瓶在储存中非常稳定。在即将使用之前，通过合适的溶液(例如，5％右旋糖，或5％葡萄糖、或生理盐水)，随后剪切混合(例如，通过手或机械摇动)，它们可以重组以形成所述微粒。4,54,55
根据本发明，还提供了一种微粒组合物的制备方法，所述方法包括：(i)剪切混合(例如，如上所述的超声处理、或机械/手动搅拌)组分(i)-(iii)的悬浮液，从而形成具有中心区域和外壳的核心微粒结构；和(ii)共价地粘附至少一个分子结合单元到所述核心微粒结构的所述外壳上。
对于实施例，生理学上可接受的气体封闭在所述微粒的中心区域，所述生理学上可接受气体可以结合到上述方法的步骤(i)中，优选的方式是在所述气体存在下进行所述步骤。
更特别地，所述微粒可以由上述的中间体微粒组合物制得。从而，所述冻干物(粉末)可以使用合适的水基溶液再次悬浮，随后，在所需气体(例如，C3F8)的存在下，使用剪切混合的方法，通过超声处理、手动搅拌、或机械搅拌(例如，使用机器如Wig-L-Bug CrescentDental(IL,美国)或Espe Capmix(Espe,德国))在如2000-4000rpm下牙科汞合金调拌器45-60s)形成所述颗粒。所述形成的颗粒随后洗涤，然后与分子结合单元配位。在配位以后，所述颗粒可以洗涤(纯化)以除去未配位的分子结合单元/气泡片段等。通过旋转-浮选法，其使下层清液与生理上可接受水基溶液进行交换。
微粒也可以由事先形成的具有或没有粘附分子结合单元的微粒冻干物(粉末)来再生。如此，所述事先形成微粒的冻干物(粉末)可以重新悬浮在合适的水基溶液中。在所需气体(例如C3F8)的存在下，随后，所述颗粒使用剪切混合的方法来再生，通过超声处理、手动搅拌、或机械搅拌(例如，使用机器如Wig-L-Bug Crescent Dental(IL,美国)或EspeCapmix(Espe,德国))在如2000-4000rpm下如牙科汞合金调拌器如45-60s)。
在微粒没有粘附分子结合单元的情况下，在使用或储存之前，优选地纯化所述再生的微粒以除去未结合的微粒组分或片段等。所述微粒可以在与分子结合单元配位之前被纯化。在配位反应之后，储存之前，优选地纯化所述微粒以除去未结合的分子结合单元或微泡片段等。当应用时(例如，给受试者给药)，优选地首先纯化所述微粒。
在微粒具有粘附分子结合单元的情况下，由冻干物再生的微粒在使用之前可以纯化或可以不纯化。任何合适的方法可以用于微粒的纯化。例如，通过旋转-浮选法，其使下层清液与生理上可接受水基溶液进行交换。
所述微粒可以根据任意以下方法来储存：
储存方法1：所形成的(洗涤或未洗涤)微粒(有或没有粘附的分子结合单元)的冷冻。这涉及到急速冷冻，以及在容器顶部空间中使用或未使用所需气体时于-80℃储存该微粒。
储存方法2：所形成的(洗涤或未洗涤)微粒(有或没有粘附的分子结合单元)的冻干。在冻干之前，基体试剂(例如，碳水化合物)可以加入或不加入所述形成的微粒中。为了再形成该微粒，在所需气体存在下，合适的水基溶液可以加入，随后，剪切混合(超声处理或优选手动/机械摇动)。
储存方法3：对于有或没有粘附的分子结合单元的微粒，在有机溶剂中脂质混合物的冻干(从而制得初始冻干物)。该组分在有机溶剂(例如，环己烷；氯仿)中溶解和混合，然后，在冻干之前，基体试剂(例如，碳水化合物)可以加入或不加入。为了形成该微粒，冻干物溶解在合适的水基溶液中，随后，在剪切混合之前，所需气体存在下，溶液可以在混合物中脂质的链熔融温度(Tc)以上培养或不培养。
可以理解，通过进行以上任何顺序的步骤(i)和(ii)，可以制得所述微粒，即，制备方法并不限于在步骤(i)后进行步骤(ii)。步骤(i)可以首先进行，随后是步骤(ii)。可选地，步骤(ii)可以首先进行，随后是步骤(i)。因此，所述分子结合单元在颗粒形成之前可以通过组分(iii)配位到所述核心微粒结构的所述外壳上。为此，所述分子结合单元可以与组分(ii)或包括组分(ii)的脂质混合物混合。在任何一种情况下，优选地，除去非配位的分子结合单元。例如，含有所述分子结合单元的所述配位组分(ii)可以在使用之前被纯化。组分(ii)上的残留马来酰亚胺部分(例如，那些含有活性马来酰亚胺功能的马来酰亚胺部分)也可以通过如水解或通过与过量硫醇反应来失活。尤其是，使用每分子含有单个硫醇基的合适分子是优选的，例如，L-半胱氨酸(随后可以需要纯化以除去未反应的硫醇)。可以使用任何关于纯化的合适方法，例如，高效液相色谱(HPLC)。所述配位组分的检验可以通过任何合适的方法，例如，质谱、核磁共振、和氨基酸分析(依赖于所述分子结合单元和/或反应物的性质)。
已经发现，当在所述配位反应中使用的所述配位反应比至少为2×106个分子结合单元(例如，抗体分子)/微粒的时候，用于共价粘附所述分子结合单元到所述核心微粒结构的所述外壳上的配位反应是特别有效的。在一些实施例中，所述配位反应比可以是至少3×106个分子结合单元/微粒，进一步，所述配位反应比可以是至少4×106个分子结合单元/微粒。当使用这一数量级的反应比时，生产的微粒在流动条件及静止条件下能够充分地结合。更低水平(例如，约1×106个分子结合单元/微粒)制得只能够在静止条件下靶向结合的微粒。
以另一种方式表示，假设所有组分(ii)结合到所述微粒的所述外壳上，在使所述分子结合单元配位在所述微粒上的反应中，所述配位反应比使得所述至少一个分子结合单元对组分(ii)的配位反应摩尔比是≥1:1。另外，所述至少一个分子结合单元对组分(ii)的配位反应摩尔比可以是≥5:1。进一步地，所述配位反应摩尔比可以是≥8:1、≥9:1、或≥10:1。在一些实施例中，所述配位反应摩尔比可以是约10:1。
还发现，通过使每一配体上配位位点保持最小，例如，通过只还原1个链间二硫键，以制得每抗体含2个-SH基，可以避免由于交联造成显著的颗粒团聚。这还可以通过使颗粒团聚后任何未反应的-SH基失活来进一步提高(例如，通过烷基化未反应的-SH基)。
以上所述组合物的其他特征也可以应用于上述方法，从而本领域技术人员将会理解，这些特征也可以是本方法的特征。
另外，根据本发明，提供了一种包括微粒组合物、药学上可接受的载体或赋形剂的药物组合物。所述组合物可以包括，例如，(i)具有粘附在所述微粒所述表面上的单个类型的分子结合单元的微粒，(ii)具有粘附在所述微粒所述表面上的大于一种类型的分子结合单元的微粒，或(iii)微粒混合物、每一组分都具有粘附在所述微粒所述表面上的不同的分子结合单元。
药物上可接受载体(助剂或赋形剂)可以用于所述药物组合物，其包括但不限于，离子交换剂、氧化铝、硬脂酸铝、卵磷脂、血清蛋白(例如，人血清白蛋白)、缓冲物质(例如，磷酸盐)、甘氨酸、山梨酸、山梨酸钾、饱和植物脂肪酸、水、盐或电解质(例如，硫酸鱼精蛋白)的部分甘油酸酯混合物、磷酸氢二钠、磷酸氢钾、氯化钠、锌盐、硅胶、三硅酸镁、聚乙烯吡咯烷酮、基于纤维素的物质、聚乙二醇、羧甲基纤维素钠、聚丙烯酸酯、蜡、聚乙烯-聚氧丙烯嵌段共聚物、聚乙二醇和羊毛脂。
在本文中，本发明的所述微粒组合物，或其药物组合物，适用在诸如超声成像、MRI、闪烁扫描术、SPECT、PET、CT、X光成像/透视、荧光成像、生物发光成像、显微法、光学方法、或其多模衍生法等分子成像中作为造影剂来使用。在这种情况下，该特异性微粒组合物有利于：(i)在远程非RES组织中最低的非特异性保留，而不表达全身或iv给药后目标分子(靶分子)部分；(ii)有效实时的超声分子成像，和(iii)所述目标分子部分的声学定量到高定量程度。进一步地，本发明可以使用目前所应用的临床超声系统，其中，低超声功率非线性(微粒特异性的)成像模式(在已有临床超声系统提供的)。在考虑生物安全性和获得更好的成像信息方面，所述成像技术的低功率和实时性质尤其有利的。使用单次微粒推注给药的连续、多平面、或三维成像应用该技术也是可行的。
所述微粒，在任何形式，或所述中间体组合物形式，通过使用现有技术中合适的方法，可以进行杀菌，例如，通过紫外或γ辐射。
还提供了一种成像方法，包括：使本发明所述的微粒组合物、或其药物组合物给药到受试者；以及使用成像技术使所述受试者成像；正如以上所述的，所述成像技术可以是本领域中广泛熟知的，例如，超声成像、MRI、闪烁扫描术、SPECT、PET、CT、X光成像/透视、荧光成像、生物发光成像、显微法、光学方法、或其多模衍生法。
这一方法允许所述微粒的成像，该微粒粘附在目标分子部分上，其是所述分子结合单元结合到所述分子部分的结果。例如，当所述微粒的所述分子结合单元是Esel抗体的时候，给药后，所述微粒将会结合到所述受试者的Esel(炎症期间，在激活内皮上表达的内皮粘附分子)，从而在所述受试者中，所述成像方法允许Esel表达的存在/不存在和定位的成像检测，以及Esel表达(和内皮激活或炎症)程度的成像定量。
本方法也允许作为分子成像中阴性对照或校正的微粒的成像。例如，当所述分子结合单元不存在或为阴性对照或不相关抗体的时候，给药后，所述微粒不会结合到受试者的目标分子部分，从而所述成像方法允许受试者中非特异性微粒保留的存在/不存在、定位和程度的成像，或作为成像判断的阴性对照或作为成像信号(例如，信号强度-给药微粒的已知数量或浓度)的校准剂。
所述受试者可以是任何类型的受试者。优选地，所述受试者为哺乳动物受试者，例如人。
在本发明的另一方面，提供了一种适用于分子成像的微粒组合物。所述组合物包括微粒，其中，所述微粒包括：具有中心区域和外壳的核心微粒结构，和其中所述核心微粒结构包括：(i)磷脂酰胆碱脂质；(ii)包括磷脂酰乙醇胺脂质；和(iii)烷氧基脂肪酸。
可以理解，本发明的这一方面可以具有在考虑本发明第一方面下如上所述的任何特征。因此，所述微粒组合物的组分(ii)可以包括至少一个马来酰亚胺部分，所述组合物可以进一步包括分子结合单元，以及所述组合物的所述成分可以进一步定义为如上所述的。每一成分的相关比例同样适用于涉及的本发明这一方面。
附图说明
本发明将仅通过实施例和根据下图的实施例进行更详细地描述。
图1.小鼠心脏冷冻切片的免疫组织化学，典型例为脂多糖(LPS)预处理6h后的小鼠，放大倍数200×，低功率放大倍数(低倍率)40×。
图2.E-选择素(Esel)靶向微粒和体外验证，(a)Esel靶向颗粒的示意图；(b)Esel靶向颗粒的形态学；(c)Esel靶向颗粒的尺寸分布，每一条方块表示在不同场合制得颗粒的平均±SEM，n＝5集合；(d)Esel靶向微粒的体外验证，每一条方块表示粘附颗粒密度相对于Esel靶向颗粒在皿(dish)E的平均±SEM。
图3.该Esel靶向微粒的体内验证，小鼠提睾肌中Esel靶向颗粒的活体镜检查法(IVM)，(a)在野生型(WT)和Esel敲除(KO)小鼠中，相对于时间的循环颗粒消除。数据点代表平均±SD；(b)在5只WT和5只Esel KO的小鼠中，相对于时间的粘附颗粒的累积；(c)在WT(i)和Esel KO(ii)的小鼠中，粘附颗粒的硅增强靶(SIT)摄像图像(荧光显微法、放大倍数200×)；(d)在提睾肌微静脉壁上粘附颗粒的定量化。每一点表示一只动物，每条方块表示组平均±SEM；(e)在小鼠提睾肌微静脉中的Esel靶向颗粒的共焦显微分析，Esel为绿色(i、ii)，颗粒为红色(iii、iv)，内皮(PECAM-1)为灰色(v、vi)。混合的所有3组分(vii、viii)。
图4.在小鼠心脏中，Esel表达的实时超声(US)分子成像，(a)分别用LPS预处理的(1)WT和(2)Esel KO小鼠，在舒张末期胸骨旁短轴(PSA)视图中，心脏的时序14MHz对比脉冲序列(CPS)图像。不同动物的LV腔的TIC(目标(ROI)C的区域)和心肌(ROI M中的)如下所示；每一数据点表示扣除背景的平均信号强度(I)±SD；时间信号强度曲线(TIC)给定推注(B)、分布(D)和消除期(E)也被表示，(b)颗粒给药＞20min后(当自由循环颗粒已经从血池(左心室(LV)腔)中消除)，在14和7MHz CPS下，该心脏的PSA、胸骨旁长轴(PSA)和心尖四腔(A4C)视图。动物、增益和MI在频率上相同，箭头表示房室前间壁中部。在颗粒给药之前的基线图像如图6所示。
图5a.在小鼠腹部，Esel表达的实时US分子成像。在颗粒给药之前(i、ii、v、vi)和≈30min后(iii、iv、vii、viii)，合并的14MHz“只有CPS造影”和“B模式图像”，肾脏为K，肝脏为L，脾脏为S。
图5b.在小鼠下腹部，Esel表达的实时US分子成像。在颗粒给药之前(ix、x、xiii、xiv)和≈30min后(xi、xii、xv、vxi)，各自的14MHz“只有CPS造影”和“B模式图像”，肾脏为K，脾脏为S。
图6.关于图4b的基线图像(在颗粒给药之前)。
图7.在小鼠心脏中，Esel的临时表达。(a)Esel mRNA。每一数据点表示一只动物。最佳拟合指数曲线±95％的置信区间(CI)如图所示。(b)Esel细胞表面蛋白。每一数据点分别表示5、5、4、5只小鼠在LPSTime为3、5、8、24小时的平均±95％CI。最佳拟合指数曲线±95％CI如图所示。(c)Esel mRNA-Esel细胞表面蛋白。
图8.在小鼠心脏中，Esel表达的声学定量，皮尔逊(Pearsons)r：(a)WT＝-0.87，KO＝-0.08；(b)WT＝0.84，KO＝不适用；(c)WT＝-0.78，KO＝-0.05；(d)WT＝0.81，KO＝不适用，实心圆＝WT，空心正方形＝Esel KO，误差的方块表示SD。
具体实施方式
实施例
实验细节
抗体
由名为D布朗博士提供(英国UCB Celltech公司)的MES-1单克隆抗体(mAb)、抗小鼠Esel的大鼠IgG2a,k10、及其F(ab’)2片段(MES-1F(ab’)2)。AF488-MES-1(用7支Alexa488荧光染料标记的MES-1)和还原MES-1F(ab’)2(通过三(2-羧乙基)膦盐酸盐(TCEP)还原制备，每个FF(ab’)2含2个硫醇基(SH))以如下所述方式来制备。MEC13.3mAb、抗小鼠PECAM-1(BD Biosciences)的大鼠IgG2a,k，抗小鼠PECAM-1的别藻蓝蛋白标记的mAb(BDBiosciences)，大鼠IgG2a,k的同型阴性对照mAb(BD Biosciences)，抗大鼠IgG2a的生物素化兔mAb(二级抗体)(Vector Laboratories)。
(a)用于微粒配位的MES-1F(ab’)2的还原
MES-1F(ab’)2使用4摩尔过量的TCEP(Sigma-Aldrich)来还原：在交换缓冲液(50mM 2-(N-吗啉基)乙烷磺酸(Sigma-Aldrich)，2mM乙二胺四乙酸(Sigma-Aldrich)，pH为6)中，MES-1F(ab’)2(83.3μM，8.3mg/ml)和TCEP(333.3μM，0.096mg/ml)在37℃下持续搅拌培养1h。反应体积范围为1-1.6ml。通过放置在冰上以停止反应，并在4℃下，立即根据制造商的使用说明，使用5ml-泽巴脱盐(Zeba Desalt)自转柱(尺寸排斥极限1000Da)根据自转柱凝胶过滤法纯化还原的F(ab’)2。该自转柱事先在冷的交换缓冲液中平衡。F(ab’)2的还原程度(每一F(ab’)2中SH的数量)，通过根据制造商的使用说明使用含Ellman试剂的Ellman试验(Perbio Science)来分光光度检测，Ellman试验进行下列修改：Ellman反应由2.5μlEllman试剂(10μM，4mg/ml)、7.5μl交换缓冲液和90μl纯化还原性F(ab’)2在交换缓冲液中，在室温(rt)下覆盖铝片培养，以使曝光最小化；在Ellman反应开始的24min处，测量在412nm(A412)处的吸光度，通过参考含SH化合物L-半胱氨酸盐酸盐(Perbio Scienc)在交换缓冲液(pH6)中已知浓度的Ellman反应的标准曲线来确定还原的F(ab’)2中SH的浓度；重复Ellman空白反应，其中，该缓冲液取代还原的F(ab’)2加入用于测试样品中A412的基线扣除。该还原的F(ab’)2的浓度由Ellman试剂的存在下的A280确定，F(ab’)2还原的程度如下计算：该还原的F(ab’)2中每个F(ab’)2分子含有2个SH基团。保持纯化的还原的F(ab’)2在交换缓冲液的浓度为≈8mg/ml(80μM)，以用于后续的微粒配位。
(b)共聚焦显微分析用MES-1mAb与Alexa488(AF488)荧光染料的标记
如下使用Alexa488羧酸、2,3,5,6-四氟苯酯、5-异构体(MolecularProbes)标记MES-1。100μl标记反应混合物由50μl mAb(在磷酸盐缓冲盐水(PBS)pH7.5下，25.7μl，浓度194μM或29.1mg/ml)、750μM AF488(水中6.6μl，浓度11.3μM或10mg/ml)、2.6μl(加入MES-1mAb体积的1/10)1M NaHCO3(pH8.5)和65.1μl蒸馏水构成，其在室温培养1h，在30min时温和手动的搅拌。对照组不包括染料或MES-1mAb。根据制造商的使用说明，用以下具体条件，使用具有6kDa尺寸排阻极限的凝胶过滤色谱法自转柱(使用SSC填充缓冲液的Bio-Spin P-6柱，BioRad)，AF488标记MES-1随后从反应混合物中纯化并悬浮在PBS(pH7.5)中：该Bio-Spin柱首先用PBS使用3次清洗循环来进行缓冲交换；在20℃下都进行离心分离。使用分光光度计来确定AF488标记MES-1的标记浓度和程度。样品用PBS稀释到100μl的体积，一式两份，并测定在280nm(A280)和495nm(A495)处的吸光度，该标记mAb的浓度如下计算：其中，0.11为AF488在A280分布的校正因子。通过使用将mg/ml的mAb浓度转化为μM，其中，150000是mAb以Da计的分子量，106是从M转化为μM的乘法因数。AF488的浓度如下计算：AF其中，71000是AF488染料(cm-1M-1)在494nm下(cm-1M-1)的近似摩尔消光系数，106是从M转化为μM的乘法因子。最终，标记的程度如下计算：铝箔在所有阶段都使用，以使曝光最小化。在这一方案中，未反应的AF488保留在色谱柱中，通过无MES-1mAb的对照反应来证实。15:1(AF488：MES-1)的标记反应摩尔比在生成正在每一分子中具有标记7个AF488的MES-1，标记效率＝46％，产率≈89％。纯化的AF488标记MES-1(6.748mg/ml，44.984μM)等分，用铝箔包裹并储存在-20℃备用。AF488标记MES-1对Esel的灵敏性和特异性的保存通过使用脂多糖(LPS)预处理的野生型(WT)和Esel敲除(KO)小鼠冷冻心脏切片上的免疫组织化学来确认。
微粒制备
天然(未配位)马来酰亚胺-功能化脂质-外壳化八氟丙烷(C3F8)微粒由含摩尔比为75:9:14:2的1,2-二硬脂酰-sn-甘油-3-磷酯酰胆碱(DSPC；Avanti Polar Lipids，AL)、1,2-二硬脂酰-sn-甘油-3-磷酯酰乙醇胺-N-(马来酰亚胺(聚乙二醇)-2000))(DSPE-PEG2000-Mal；Avanti Polar Lipids)、单硬脂酸酯聚乙二醇(PEG40硬脂酸酯；Sigma-Aldrich)和荧光染料1,1'-双十八烷基-3,3,3',3'-四甲基吲哚羰花青高氯酸盐(DiI；Molecular Probes)的水性悬液，在C3F8存在下，超声处理制备得到。为了制备Esel靶向颗粒，每F(ab’)2含有2个SH基团的TCEP-还原MES-1F(ab’)2通过马来酰亚胺-硫醇配位接枝到上述天然颗粒的壳体外表面上。该配位反应比为4.338×106个F(ab’)2分子/颗粒(7.2nmol F(ab’)2/109颗粒)(其中，在水性悬液中的DSPE-PEG2000-Mal分子的总数量/从水性悬液制得的未洗涤颗粒总数量＝4.338×106)。假如水性悬液中≤10％的组分结合到颗粒的外壳上，外壳上该组份的摩尔比仍然接近初始水性悬液的摩尔比56，随后，颗粒的总体平均尺寸将含有≤4.338×105个马来酰亚胺分子，估算的F(ab’)2:马来酰亚胺配位反应摩尔比为≥10:1)。该配位反应在4℃，近中性pH，C3H8气氛下持续温和搅拌30分钟(min)；通过加入过量的N-乙基马来酰亚胺(NEM)淬灭未反应的SH来终止反应。在颗粒配位前后，C3H8气氛和4℃下，使用多循环离心浮选法，用冷的除气生理盐水洗涤颗粒，以除去未结合组分和颗粒片段。新鲜制备的颗粒马上分成多个20-50μl的小份，用保鲜膜(American National Can)封盖和密封，随后，急速冷冻在液氮中，并储存在-80℃下备用。随后，在不同时间制备的5个批次中，解冻Esel靶向颗粒的浓度范围为1-3×109个颗粒/ml。
具体实验条件如下：通过在50ml圆底烧瓶中，将摩尔比为75:9:14:2的DSPC、DSPE-PEG2000-Mal、PEG40硬脂酸酯和DiI分散至少量环己烷:氯仿(1:2)溶剂中而制备得到天然(未配位)微粒。使用气态氮蒸汽除去过量的溶剂。然后，脂质转移到冻干机，在还原性气氛(例如，1.3×104Pa)，-78.5℃(使用干冰套)下冻干为完全干燥的。干粉(冻干物)随后分散在合适的水基溶液中(例如，生理盐水或含有0.01％丙二醇的生理盐水(PGNS：丙二醇103.5mg/ml、甘油126.2mg/ml、NaCl 6.8mg/ml、pH≈7.4))，以成为4mg/ml的浓度，通过65℃下超声浴中超声处理均匀直到透明。一旦全部溶解，则温和地通入C3H8气体到溶液(F2Chemicals)。随后，使用剪切混合方法，通过使用超声发生器(Misonix 3000，Qsonica，CT)进行C3H8的声波分散，形成微粒。探针尖端位于溶液里约2mm，初始温度约为60℃，声功率为约120W的时候，用高强度超声喇叭(20-21Hz)进行超声处理30-60s。更多的C3H8气体加入到该微泡分散体中，容器盖口，并立即加入到冰冷水(3min)，以消除超声处理过程中产生的热量。使用Beckman Coulter Allegra X-15R离心机(Beckman Coulter)，在1000g、4℃的条件下进行离心浮选15-25min，从而洗涤(纯化)所制备的微粒：离心分离后，颗粒浮在样品小瓶的上部，下层清液被除去并用等体积的冷脱气生理盐水(pH 7.4)代替。洗涤步骤重复7次以除去未结合外壳组分和颗粒片段。为了生成Esel靶向微粒，这些洗涤后的天然微粒加入到还原性MES-1F(ab’)2同时混合(每一还原的F(ab’)2，其含有2个SH基团，制备方式如上所述)。用于生成成功的Esel靶向颗粒的配位反应比是4.338×106F(ab’)2分子/颗粒。颗粒和F(ab’)2在配位反应混合物中的浓度范围分别为5-8×109/ml和35-60uM(3.5-6mg/ml)。反应混合物含有约2/3体积的源自还原的F(ab’)2的交换缓冲液(pH6)和1/3体积源自洗涤颗粒的生理盐水(pH7.4)。该配位反应在4℃下培养30min，持续地温和地混合在垂直倾斜旋转轮上。通过加入过量于F(ab’)220摩尔的溶解在无水二甲亚砜(DMSO，Sigma-Aldrich)的80mM NEM(Sigma-Aldrich)来终止颗粒的配位反应，4℃下，反应混合物在旋转器上培养30-60min。典型地，反应混合物中的NEM和DMSO的浓度分别为≈1mM和≤1.7％v/v。随后，在160g 4℃下通过进行上述的离心浮选法5min，用冷的生理盐水洗涤颗粒4次。这除去未结合的F(ab’)2、未反应的NEM、DMSO和颗粒片段。为了最小化颗粒的损失，所有洗涤和培养在高颗粒浓度(≥1×109颗粒/ml)，C3H8气氛(以降低从颗粒中扩散出C3H8气体的浓度梯度)和4℃(降低气体扩散速率)下进行。为了保存颗粒DiI荧光染料，DiI化合物、冻干物或颗粒避光以保护。
微粒形态学、浓度、尺寸分布和电荷分析
检测颗粒完整性(球形形态、没有团聚)，条件是把颗粒放置在血球计(ReichertBright-Line Metallized Hemocytometer，Hausserscientific，PA)中，在显微镜下，在诸如1:200冷生理盐水的稀释液中。根据制造商的使用说明，颗粒浓度和尺寸分布通过在装备有30μm直径小孔计数管的库尔特多重计数器IIe(Coulter Multisizer IIe)(CoulterElectronics)的电区感应来检测。该装置允许尺寸检测的范围为0.72-18μm，分辨率为0.09μm。对于颗粒电荷分析，颗粒分散在1ml的1mM KCl(pH7.4)中获得≈107颗粒/ml。根据制造商的使用说明，其静电荷通过在泽塔萨热纳米ZS(Zetasizer Nano ZS)(MalvernInstruments)中的光散射下被检测以作为ζ电位。
体外靶向微粒结合评价
100μl的Esel靶向或非靶向(天然)颗粒以2.5×109颗粒/ml放置在倒置的聚苯乙烯培养皿上，其喷涂有200μl的7nM的重组同二聚体小鼠Esel蛋白(R&D Systems)(皿E)，或放置在Esel喷涂皿上，其事先用500μl的67nM的过量MES-1F(ab’)2阻断(皿B)，或放置在未喷涂皿上，在其上使用磷酸盐缓冲盐水pH7.5(PBS)而不是使用Esel进行皿喷涂(皿P)。1min后温和地洗去未粘附的颗粒。随后，所述皿用冷的脱气PBS进行再填充，以用于在装配有浸没物镜的立式光学显微镜进行即时检测。从10个随机光场(OF)上对粘附在每一皿上颗粒的数量进行计数和平均，以测定粘附颗粒的密度。
具体方法如下：聚苯乙烯培养皿(35mm Not TC-Treated CultureDish，Coring Life Sciences)涂覆200μl 1.25μl/ml(7nM，室温下，在缓冲盐水pH7.5(PBS)中稀释)重组同二聚体小鼠Esel蛋白(R&D Systems)，涂覆持续1h(皿E)。用PBS代替Esel作为“空白”阴性对照(皿P)。随后，非特异性结合位点用PBS中的4ml 2.5％w/v牛血清蛋白(BSA，Sigma-Aldrich)在室温下阻断2h。BSA随后被丢弃且用PBS清洗皿。为了制备用过量的MES-1F(ab’)2处理的Esel喷涂皿(皿B)，500μl的6.67μm/ml(67nM)的MES-1F(ab’)2在室温下被放置于皿E中30min，随后，用PBS清洗。因为颗粒的浮力，皿被倒置用于室温下培养颗粒1min：100μl的Esel靶向或非靶向(天然)的颗粒以2.5×107颗粒/ml被使用(在冷的脱气的PBS中稀释)。随后，温和地洗去未粘附颗粒，且用冷的脱气的PBS将皿再填充，以用于即时检测，检测方法是使用配备有浸没物镜且连接有摄像机和监视器的立式光学显微镜。从10个随机光场(OF)上对粘附在每一皿上的颗粒的数量进行计数和平均，并显示在监视显示器上，后者的表面积通过使用分级测微计进行确定。从而确定所述粘附颗粒密度。
动物
野生型(WT)小鼠：成年雄性C57B16/Jax(Charles River，UK)。Esel敲除(KO)小鼠：成年雄性在C57B16背景基础上对Esel纯合子进行KO57，由K Norman博士和P Hellewell教授(英国谢菲尔德大学)赠予的小鼠通过本地繁殖得到。所有动物工作是在由动物(科学程序)法(Animal(Scientific Procedure)Act)1986下的内政部(Home Office)授权的项目许可和个人许可(Project Licences and Personal Licences)下进行；从当地伦理审查委员会(Ethical Review Panel)获得了伦理批准。
脂多糖(LPS)小鼠模型(实验性内毒素血症)
WT和Esel KO小鼠用50μg来自大肠杆菌0111：B4(Sigma-Aldrich)的LPS预处理，其用生理盐水放大成200μl的体积，通过腹腔(ip)注射来诱导全身炎症。通过ip注射的LPS全身给药，在包括心脏和肾脏的多器官内产生包括Esel表达诱导的全身炎症。58,59这一动物模型与用在颗粒靶向中的动物模型(例如，缺血再灌注损伤、心脏移植排斥、血栓形成、慢性出血/肿瘤血管生成动物模型)的不同在于：(i)它不需要可以导致混淆变量的手术过程，例如手术创伤或血凝块；(ii)该颗粒的靶分子存在于多器官中(不仅仅是一个)，独特地允许靶向颗粒在多器官中特异性的同时评估，以及在存在其他组织的“颗粒挪用”时，评估成像技术在检测目标组织内靶分子的能力；和(iii)心肌上的靶分子表达本质上是全身的和均匀的，这独特地允许靶向颗粒信号衰减的研究。此外，在LPS预处理小鼠的心肌上，Esel独自在活化内皮细胞上的表达和它本质上全身均匀表达的结合，使得LPS小鼠模型-Esel结合成为用于检测分子表达的声学定量的理想体内模型。
组织免疫化学
免疫组织化学是在新鲜获取的WT(用或未用LPS预处理)和Esel KO(用LPS预处理)小鼠的心脏的丙酮固定冷冻切片上进行。在室温下(rt)，用100μl的1:1000兔血清(Sigma-Aldrich)阻断非特异性结合位点1h后，切片在室温下用100μl的0.01mg/ml的一级抗体：MES-1(对于Esel)、MEC13.3(对于PECAM-1，内皮标志物)或同型阴性对照培育1h。随后，每一切片在室温下用100μl的0.005mg/ml的生物素化二级抗体培养60min，在室温下用0.3％的H2O2甲醇阻断内源性过氧化物酶20-30min后，以辣根过氧化物酶为基础的检测系统，维克他斯坦(Vectastain)ABC试剂盒(Vector Laboratories)，与作为色原底物的3,3’-二氨基联苯胺溶液(SIGMAFATSTM DAB片剂，Sigma-Aldrich)一起使用。使用哈里斯(Harris)改性苏木素溶液(Sigma-Aldrich)和1％的NaHCO3对切片复染，随后，用70-100％的乙醇脱水，使用名为Histomount(VWR)的设备进行干燥和封固，并在光学显微镜下检测。LPS预处理与为了立即采取组织而处死动物之间的持续时间被称为LPSTime。
反转录酶-实时定量聚合酶链反应(RT-qPCR)
WT小鼠如上所述使用LPS预处理。LPS预处理与为了立即采取组织而处死动物之间的持续时间被称为LPSTime。新鲜获取的组织保持在溶液(Ambion)以在原位保存核糖核酸(RNA)。随后，根据制造商的使用说明，使用名为TRIzol抽提试剂(Invitrogen)，分离总RNA。随后，根据制造商的使用说明，使用Qiagen溶液反转录试剂盒(Qiagen)，执行第一链互补脱氧核糖核酸(cDNA)合成。接着是对Esel和次黄嘌呤转磷酸核糖基转移酶-I(HPRT-I)进行使用Green检测方法的实时qPCR，根据制造商的使用说明，其在iCyclerTM(iCycler iQ实时PCR检测系统，Bio-Rad)中96-孔板上进行。所有PCR反应在同样的板的孔中上进行一式三份。该引物序列为：Esel正向引物5'-CTCATTGCTCTACTTGTTGATG-3'；Esel反向引物5'-GCATTTGTGTTCCTGATTG-3'；HPRT-I正向引物5'-ATTAGCGATGATGAACCAG-3'；HPRT-I反向引物5'-AGTCTTTCAGTCCTGTCCAT-3'。对于数据分析，使用iCycler iQ光学系统软件版本3.0a(Bio-Rad),从扩增曲线中检测出阈值循环(Ct)。由于Esel和HPRT-I引物对的PCR效率相差≤5％(分别是93±4％和92±3％(平均±SD)；每组n＝4)。比较Ct法用于评估Esel信使(mRNA)相对于HPRT-I的数量。其使用公式：Esel mRNA(％HPRT-I)＝2-ΔCt，其中，ΔCt＝CtEsel–CtHPRT-I，下标指的是目标基因。使用重复的平均值并对每一动物的LPSTime作图。
本方法的进一步细节如下所示，来自于小鼠心脏的总RNA的产量通常是≈1μg纯RNA每1mg组织，保持浓度在分子等级(无RNA酶)H2O(Sigma-Aldrich)中超过≈1mg/ml。对于第一链cDNA合成，RT反应混合物由1μg总RNA，2μl 10×缓冲RT，2μl脱氧核糖核苷三磷酸(dNTP)混合(5mM的每组2'-脱氧腺苷5'-三磷酸(dATP)、2'-脱氧胞苷5'-三磷酸(dCTP)、2'-脱氧鸟苷5'-三磷酸(dGTP)、2'-脱氧胸苷5'-三磷酸(dTTP))，1μ(4单元)名为Omniscript的反转录酶，2μl(1μg)寡聚(dT)12-18引物(Invitrogen)和分子等级的H2O形成20μl的总反应体积，在37℃培养1h。在涂覆有光学性能密封胶带(Optical Quality Sealing Tape)(Bio-Rad)的96-孔0.2ml薄壁PCR板(Bio-Rad)的每一孔的25μl反应体积内进行qPCR。qPCR反应混合物由5μl cDNA模板(最终RT反应的1:50水稀释液)、0.5μl(10μM)每组各自基因的正向和反向引物(引物序列见文本；该序列从Invitrogen定制订购)、6.5μl分子等级H2O和12.5μliQTM Green Supermix(Bio-Rad)构成。该qPCR循环条件是：95℃下初始3min的变性步骤(前90s为Well Factor分析)；然后在95℃保持15s，56℃保持1min进行40个循环；在0.5℃下的溶解曲线分析步骤(95℃ 1min变性，56℃ 1min重置，然后进行80个在60℃保持10s的循环，每循环增加0.5℃)；在4℃进行最终冷却步骤。对于每一种动物，Esel和HPRT-I在同样板上扩增；对于两者的引物对，使用分子等级的H2O代替cDNA模板的无模板阴性对照在所有板中培养。对于数据分析，异常扩增曲线或溶解曲线的孔被排除在外。
活体镜检法(IVM)的建立
提睾肌肌肉的炎症由WT和Esel KO小鼠术前2h阴囊内注射50ng重组IL-1β(R&DSystems)而产生。尾巴静脉用24G 0.7×19mm静脉(iv)导管进行插管(死腔≈50μl)(BDMedical)。长持续时间麻醉通过使用200-300μl含有1mg/ml甲苯噻嗪(Rompum，Bayer)和10mg/ml氯胺酮盐酸盐(Ketalar，Parke-Davis)混合物的生理盐水腹腔内(ip)注射来完成。动物放置在定制温控(37℃)IVM工作台上。在解剖显微镜下，右或左睾丸温和地从阴囊切口取出。沿着提睾肌肌肉来制取纵向切口，随后，展开并钉在横过透明的显微镜工作台上。取出的肌肉通过热控迪洛德(Tyrode)盐缓冲溶液(9.6g迪洛德盐(Sigma-Aldrich)+1g碳酸氢钠，用灭菌蒸馏水制备成1L的体积)的连续过熔来维持。使用所装备用于明亮视野的竖式显微镜(Axioskop，Carl Zeiss)和荧光显微镜进行观察和记录，该显微镜带有20×和40×的浸没物镜(Water Achroplan，Carl Zeiss)，电荷耦合装置(CCD)照相机(带控制器的ColorChilled 3CCD照相机，Hamamatsu Phototonics)，硅增强靶(SIT)照相机(C-2400-08，Hamamatsu Phototonics)，监视器(Triton，Sony)，S-VHS记录仪(Model AG6730SVHS 625，Panasonic)和个人计算机。为了比较WT和Esel KO动物之间的相对颗粒粘附的剪切速率，在颗粒注射之前，光学多普勒流速仪(微循环研究所,德克萨斯A&M大学,德克萨斯)用于测量WT和KO小鼠20-40μm直径微静脉的微血管中线红血球速度(Vrbc)。每个动物测得5个随机血管段。
小鼠提睾肌中Esel靶向微粒的IVM
对于麻醉(甲苯噻嗪/氯胺酮混合物ip)WT和Esel KO小鼠提睾肌的活体显微镜评 估，含1.5×109个Esel靶向颗粒的100μl生理盐水被施用通过尾巴静脉导尿管进行快速iv 推注给药，紧接着用100μl生理盐水冲洗。在肌肉外置2h之前，所有动物使用50ng重组IL-1β (R&D Systems)阴囊内给药，以引导提睾肌炎症。使用所装备用于明亮视野的竖式显微镜和 荧光显微镜进行观察和记录，该显微镜带有20×和40×的浸没物镜，CCD和SIT照相机。为了 检测相对颗粒粘附的剪切速率，在颗粒注射之前，使用光学多普勒流速仪，从每个动物5个 随机血管段中，测试20-40μm直径微静脉内的Vrbc。所有记录使用S-VHS记录仪和个人计算机 来完成。所有动物在实验末期被处死。该设置的具体细节见上。通过几个明视野下包括一定 数量的不同血管的OF和荧光显微镜，对血流和颗粒进行评估。在颗粒注射后5、7、10± 15min，荧光显微镜下，监视器上OF内的自由循环颗粒的数量每10s计数一次。在OF场粘附颗 粒的累积(规定为不移动超过3s)评估为微粒注射后15min以内。粘附在20-40μm直径微静脉 上的颗粒数量在颗粒注射后≈15min时从1-5个400μm长度段/微静脉，2-6个微血管/动物中 来计数(当自由循环颗粒不存在/最小的时候)。在一些动物中，使用间歇性合并的明视野显 微镜和荧光显微镜，追踪90min以内的在同样OF中的粘附颗粒，寻找是否存在向组织小间隙 或细胞内化的转移。对于分析而言，粘附颗粒的密度以每微血管表面积(VSA)的颗粒数量来 表示，其中VSA(mm2)＝πD(mm)×L(mm)，D和L分别为血管段的直径和长度。对于每一微静脉， 该粘附颗粒密度作为它的段的平均值来表示，且对于每一动物，用微静脉的平均值来表示。 剪切速率从Vrbc估算所得：其中，Vb是平均整体速度，α是将Vrbc转化为Vb的因子，其在相对静脉 中的泊肃叶流动为1.6。60每一动物的剪切速率采用取样的5只随机微静脉段的平均值。
小鼠提睾肌中Esel靶向微粒的共聚焦显微分析
将1.5×107个Esel靶向颗粒施用于事先用50ng IL-1β阴囊内给药预处理2.5h后的WT和Esel KO小鼠，使用上述用于IVM的方法。15min后，施用快速iv丸剂，即150μl的混合物，其为含有50μl AF488-MES-1(用于Esel)和25μl抗小鼠PECAM-1(内皮标志物)的别藻蓝蛋白标记mAb的生理盐水iv，随后，用100μl生理盐水冲洗。在再经过15-20min后，动物使用甲苯噻嗪/氯胺酮的混合物的丸剂iv来进行最终麻醉，然后灌注PBS以移除在循环中的粘附颗粒和mAb。然后立即采集提睾肌并固定在4％多聚甲醛PBS中以用于共聚焦显微分析(z-堆积)。在移动到z轴的下一深度之前，使用含有40×的浸没物镜的竖式共焦点激光扫描显微镜(LSM 5PASCAL，Carl Zeiss)，3种不同的荧光剂、DiI(颗粒)、Alexa488(Esel)和别藻蓝蛋白(PECAM-1)连续地在每一深度处扫描。图像使用Zeiss LSM 5图像浏览软件来处理。
该方法的进一步的细节如下。在Esel靶向颗粒和含有AF488-MES-1和抗小鼠PECAM-1的别藻蓝蛋白标记mAb的抗体混合物iv给药后，循环中的未粘结颗粒和mAb通过灌注PBS来移除。这通过解剖使心脏和上腹暴露而实现。随后，急速切口开在右心房，接着使用连接20ml注射器的针头注射PBS到LV腔。这允许PBS灌注到身体内，它和血液通过右心房上的切口离开循环。当肝脏由于血液被PBS取代变得暗淡的时候，足量的PBS灌注是合适的。随后立即采集提睾肌肌肉，展开并室温下固定在4％多聚甲醛PBS溶液30min，然后，放置在4℃下冷的PBS中5min。铝箔用于使组织曝光最小化。新鲜组织立即在共聚焦显微镜下检测(z-堆积)，其使用含有40×的浸没物镜(Water Achroplan，Carl Zeiss)的竖式共焦点激光扫描显微镜(LSM 5PASCAL，Carl Zeiss)。在移动到z轴的下一深度之前，3种不同的荧光剂、颗粒用DiI(在543nm处激发，在560-615nm处检测)、Esel用Alexa488(在488nm处激发，在505-530nm处检测)和PECAM-1用别藻蓝蛋白(在633nm处激发，在650nm处检测)连续地在每一深度处扫描。图像使用自带Zeiss LSM 5图像浏览软件来处理。
超声(US)成像
WT和Esel KO小鼠都用LPS预处理，如上所述，尾静脉进行插管并用甲苯噻嗪/氯胺酮混合物麻醉。胸部、腹部和骨盆随后被剃毛，并且将动物仰卧放置。ECG电极垫(Blue Sensor P，Ambu)施加于爪子上，并连接到装备有小动物ECG滤波器(Small AnimalECG Filter)的US仪(Acuson512US系统,Siemens,CA)。一层温暖的凝胶(超声和电子传动装置用凝胶，Henleys Medical)联接在皮肤和US换能器(15L8-s线阵式换能器，针脚26mm，Siemens)之间。所使用的US设置如下：14MHz(P14MHz，空间分辨率≈0.02mm)的对比脉冲序列(CPS)模式、产生由扫描器估计的0.22-0.26低机械指数(MI)的传输功率9dB、动态范围55dB、时间增益％、CPS增益8、基本2D增益15dB、色图M:3(在加热受试者比例(只用CPS造影图像)下的气泡信号)、灰度级组织信号(“B-模式”图像)、没有使用TEQ。在颗粒注射之前，在乳头肌水平处基线胸骨旁短轴(PSA)的视图，带有/没带有区域放大选项(RES，通过提高分辨率放大图像)的心脏胸骨旁长轴(PLA)和心尖四腔(A4C)的视图被记录为3s-数字剪辑。此后，通过使用独立式夹子，固定传感器的位置，维持在PSA视图上成像。随后启动秒表，1×108Esel靶向颗粒(与生理盐水构成100μl体积)在10s的时候通过尾静脉导管被注射，而作为快速iv推注则超过1-2s，随后在20s的时候，用100μl体积的生理盐水冲洗超过1-2s。应用连续US超声处理，在秒表上的0到1min23s之间没有中止，随后中止，随后每次只用3s用于数字图像的采集。具有多次连续心动周期的心脏的3s-数字剪辑(RES激活)在10s和13s时被记录，随后，从20s到1min20s每隔10s间隔，随后，从2min20s到10min20s每隔1min间隔，随后，从12min20s到30min20s每隔2min间隔，随后，直到秒表上60min20s每隔5min间隔(如果颗粒造影加强在左心室(LV)腔不再可见，提前停止图像采集)进行记录。PSA视图内包括心脏的胸部及周围组织的非放大(非RES)图像每隔≈5min间隔记录一次。心脏的其他视图(PLA和A4C视图)在最后采集。在一些动物中，7MHz(P7MHz，空间分辨率≈0.04mm)CPS在MI为0.22的成像(增益和其他设置保持和14MHz成像一样)也在基线处和14MHz成像研究的最后进行采集。当从14MHz转化为7MHzCPS成像时，传输功率在减小US频率之前首先从-9dB减小到-19dB，以避免导致不经意颗粒破坏的MI(高达≈0.7)的增加。在一些动物中，在胸腔、腹部和骨盆中的其他组织的成像，在心脏成像研究的基线处和结束处在前-后投影中进行，以寻找额外的心脏组织中的颗粒保留。为了实现它，探针被横向定位且在3s-成像获取期间缓慢地在尾部从脖子的正下方移动到骨盆；获得在14和7MHz CPS的非-RES成像。所有动物只接受一剂量的颗粒，从而避免前一颗粒剂量的后续效应(例如，Esel结合位点的阻断)。在成像的最后，如上所述，动物被处死，并且组织立即采集用于冷冻切片免疫组织化学和qRT-PCR。
时间-信号强度曲线(TIC)的生成
使用软件(LLC Charlottesville，Virginia)，用视频密度测量法离线测量粒子的信号强度。在PSA视图(“只用CPS造影”的图像)中，选择心脏舒张末期的图像帧并进行对齐，排除那些不能对齐的(例如，由于较大运动的产物)。如图4a所示，目标区域(ROI)位于LV腔(C)的心肌(M)前壁的中部和邻近区域。在所有动物中，这些区域之所以被选择是由于它们始终最小或最低限度地受到US衰减的影响。该视频信号强度(VI)经过对数解压缩是“线性”的，其使用了公式：线性其中，dB为动态范围(本研究中为55dB)。线性VI(I)以任意声学单位来表示(AU)。在3s-记录周期内，将多个舒张末期的图像帧中的I在每个时间点上进行平均，随后在对应动物中通过减去基线图像(颗粒给药之前的图像)的平均值I进行背景噪声校正。心肌(组织)和LV腔(中心血池)的TIC分别通过心肌和LV腔内扣除背景的I-气泡给药后的时间进行绘图来构建。
体内Esel表达和颗粒半衰期的声学定量
在微粒给药后的20min10s(R20)，心肌中基线扣除的气泡信号强度，根据上述TIC获得，并用于分析。基于TIC的定量分析(TIC基方法)可代替的新方法也用于定量Esel表达的水平。同时，TIC基方法也允许检测其他变量，其包括保留和循环微粒的体内半衰期。用于US分子成像的LPSTime采用LPS预处理与靶向颗粒给药之间的持续时间。对于每一动物，平均心率(HR)由记录在心脏成像期间不同时间点上所有的HR计算而来。
统计
皮尔逊相关、线性或非线性回归分析正如所示那样执行。学生的t-检测或带有土耳其(Turkey)事后分析的ANOVA被用于显著性检验，其中，p<0.05被认为是显著的。
结果
Esel表达
冷冻切片免疫组织化学表明Esel在LPS预处理的所有WT小鼠心脏中被表达(n＝35，LPSTime＝4-9h)。空间分布在整个心肌上基本均匀，但是限定在毛细血管后微静脉和毛细血管。未用LPS处理WT小鼠(n＝5)的阴性对照和使用LPS预处理Esel KO小鼠(n＝10，LPSTime＝4-7h)，未检测到Esel，见图1。
通过qRT-PCR定量Esel表达
RT-qPCR表明在LPS预处理≈3h后的时间内，心脏中Esel mRNA的浓度以指数形式减小，到≈9h时，达到很低的水平(n＝42，LPSTime＝3.2-15.7h)，见图7a。这一趋势类似于细胞表面Esel蛋白浓度的趋势(以％注射剂量的放射性/g组织(％ID/g组织)来表达)，Eppihimer等58通过使用相同的小鼠品种、性别和年龄，以及同样的LPS给药剂量和途径，使用iv放射性标记mAb确定了该趋势(n＝19)，见图7b。
从Esel mRNA浓度对LPSTime的最佳拟合曲线(R2＝0.75)和Esel细胞表面蛋白浓度对LPSTime的最佳拟合曲线(R2＝0.88)中，使用LPSTime作为公分母，经验公式描述Esel mRNA的浓度和细胞表面蛋白的关系，能够导出：见图7c。因此，在本LPS小鼠模型中，Esel细胞表面蛋白浓度可以从心脏中mRNA的浓度预测得到。在本研究中(见后者)，在用于Esel表达的US定量的mRNA或蛋白浓度范围内(分别为55-238％的HPRT-I或0.63-0.80％的ID/g组织)，mRNA浓度和细胞表面蛋白的关系近似是线性的，以允许直接应用mRNA浓度作为细胞表面蛋白浓度的代理量词(后者是靶向微粒的实际靶)。
Esel靶向微粒
Esel靶向颗粒的图示如图2a所示。该颗粒表现为球形形态；颗粒-颗粒聚集或交联是最小的，见图2b。颗粒尺寸分布在不同场合制备的5批中是可再现的；颗粒直径＝2.2(平均)±0.2(SEM)μm，98.6％或100％的颗粒分别在6或10μm直径以下，见图2c。颗粒(洗涤后)具有近中性的电荷，ζ电位在pH7.4处约为5mV。
该颗粒在体内足够产生回声、稳定、缺少非特异性结合，且不会产生即时副反应。使用其他组合物的颗粒不会表现出所有这些期望的性能。合适的天然颗粒也含有充足的马来酰亚胺基团，以在流动条件下，为了有效地靶结合，使足够多的靶向单元配位到颗粒表面。用于制成成功的Esel靶向颗粒的配位反应比为4.338×106个F(ab’)2分子每颗粒。更低的F(ab’)2:颗粒反应比1×106:1产生的颗粒，只能够在静止条件下粘附靶。也发现，通过保持每一结合单元上配位位点为最小(例如，在每F(ab’)2中只还原1个链间二硫键以生成2个SH)，和颗粒配位之后使任何未反应颗粒失活(例如，未反应SH的烷基化)，由交联导致的明显的颗粒聚集能够被避免。用同样的方法，靶向其他分子的颗粒经合适靶向配体的取代来完成。使用F(ab’)2代替整个mAb，在这种情况下，消除了任何Fc-给药的非特异性相互作用或免疫组织副作用。
本文所述的靶向配体与颗粒的定向位点马来酰亚胺-硫醇结合，偏离了传统用于制备靶向颗粒的产生免疫的(链霉)亲和素-生物素配位化学。尽管可以使用其他配位化学，但是定向位点马来酰亚胺-硫醇配位法由于在近中性pH下具有低的免疫原性、强的和快速的硫醚键形成(键强度在纳米牛顿的数量上；二级速率常数为0.8-1×106M-1s-1)的优点而具有优势。近中性pH在避免制造期间对该结合单元和颗粒的负面影响中是有利的，并且防止该结合单元从体内颗粒外壳上解离。基于类似配位化学的靶向颗粒，包括颗粒组织之前的靶向配体与磷脂类的非共价配位，是存在的，但只有很少发展到体内超声分子成像，44-47,61-64，它们均没有显示我们的微粒区别于它们的所有以下期望的属性：(i)高的靶结合特异性，其证明为远程非RES组织最小的非特异性保留，而不在iv给药后表达该靶分子；(ii)实时US分子成像的有效性；和(iii)高定量程度的分子靶声学定量的有效性。
体外Esel靶向微粒的校正
位于喷涂皿上(皿E)，并粘附在Esel上的Esel靶向颗粒：2060(平均)±1070(SEM)颗粒/mm2，n＝5，见图2d。相对Esel的靶向颗粒的特异性通过最低粘附到先前用过量抗Esel抗体阻断的Esel上来说明(皿B)：在皿E上8(平均)±4(SEM)％靶向颗粒，n＝5。额外地，在皿上使用靶向或非靶向(天然)颗粒没有喷涂Esel的阴性对照(皿P)，或显示类似低水平的颗粒粘附的皿E和B上的非靶向颗粒：皿P上的靶向颗粒(9±3％，n＝5)，皿E上的非靶向颗粒(10±9％，n＝2)，B上的(7±7％，n＝2)，P上的(7±7％，n＝2)。含土耳其事后分析的ANOVA表明，粘附颗粒在皿E上靶向颗粒和阴性对照之间的相对密度是显著性差异(p＜0.0001)；在阴性对照之间没有观察到显著性差异。
体内Esel靶向微粒的校正
对5只WT(身体重量：25(平均)±2(SD)g，范围是23-27g)和5只Esel KO(24±2g，范围是22-27g)的小鼠，分别在IL-1β预处理后的3:06-4:03h和3:17-4:30h之间用Esel靶向颗粒给药。可以看见该颗粒通过尾部血管，在iv推注给药后≈7-17s，循环并达到提睾肌肌肉。自由循环颗粒的数量随着时间减小，它们从WT中血池中的消除变得比KO中的更快，见图3a。颗粒给药后超过10min所有动物血池中自由循环颗粒的数量最小或不被检测到。在WT动物(370(平均)±46(SEM)颗粒/mm2VSA，n＝5只动物)的提睾肌微静脉壁上粘附和累积颗粒；在KO中这是最小的(11±3，n＝5)，p＜0.0001(学生t-检测)，见图3c-d。在颗粒推注给药后，提睾肌微静脉壁上的颗粒聚集很快达到平衡，见图3b。聚集颗粒一直持续到超过自由循环颗粒从血池消除之后。很小一部分颗粒中可以观察到反转；很少看见粘附颗粒的完全解离。没有观察到由颗粒导致的血管内阻塞。当间歇性观察至90min，没有检测到所述粘附颗粒转移到组织内小间隙或细胞内化。共焦点显微镜表明粘附颗粒用表达在WT(n＝3只动物，体重：21.8-24g)提睾肌微静脉内皮细胞表面上Esel共定位；Esel表达不能在KO中检测到(n＝2，25.7-28.4g)，见图3e。
直径为20-40μm微静脉中的剪切速率，其由3只WT(身体重量：26(平均)±2(SD)g，范围是25-28g)和3只KO(27±1g，范围是26-29g)小鼠中检测而来，在WT(329(平均)±46(SD)s-1，n＝3)组中高于KO组(211±37s-1，n＝3)，这可能是由于在前者样品中更小的血管直径(WT 30(平均)±3(SEM)μm，n＝3；KO 34±1μm，n＝3)。然而，分别对于剪切速率和血管直径组进行对比，这些区别没有统计学上的显著性，p＝0.30和0.12(学生t-检测)。
超声分子成像
(1)动物
15只WT(年龄为5.7(平均)±0.2(SD)周，其范围为5.1-6.1周；体重为19.5(平均)±1.5(SD)g，其范围为17-22g)和8只Esel KO(年龄为7.9±3.2周，其范围为5-13.6周；体重为22.3±3.7g，其范围为17-28g)小鼠被成像。靶向分子在LPS注射和给药之间持续的时间(LPSTime)，对于WT组范围为3:26-5:59h，而对于KO组范围为4:27-5:39h。
(2)心脏成像
存在于颗粒给药前后的非线性CPS产物(橙色)能够在WT和Esel KO动物中观察到；这些产物很小并位于心肌的外面，见图4a(帧0:10)，图4a2(帧20:20)。iv气泡推注给药之后，首先，颗粒信号在右心室4次心跳之内(≈1s)被检测，信号强度快速升高。接着是颗粒信号在左心室的出现，颗粒从肺循环返回。颗粒给药后，LV腔和心肌中的气泡信号强度分别在6-7个心跳(≈1.5-2s)或9-12个心跳(≈2-3s)内达到峰值。一段时间后，气泡信号强度然后在心室和心肌中减小，见图4a。由于高颗粒浓度，显著的US衰减发生在随后的气泡推注给药早期，具有位于US路径远端心脏区域内信号的主要损失(例如，在PSA视图中，在心肌和邻近LV腔5-10点钟的位置，见图4a)。随着血池(LV腔)内的循环气泡浓度随着时间减小，该衰减减小(比较帧0:30与帧6:20，见图4a)，但不会消失(帧20:20，见图4a1)，很可能是因为衰减是由于骨、肺气±保留的颗粒被覆盖所致。重要的是，心肌内的Esel表达是实时可见的，其通过WT心肌中的颗粒信号的持续来指示，同时，在血池(LV腔)中的自由循环颗粒在一段时间后减小及消失。在KO心肌中，其中没有Esel，颗粒信号的持续残留低/最小化，这与心肌中非特异性颗粒保留的低/最小化相一致，见图4a-b。US衰减，由近US路径的骨、肺气±保留的颗粒被覆盖所致，影响心肌的一些部分，这取决于成像扫描平面，这会导致WT动物中Esel目标颗粒信号的假损失(例如，在14MHz CPS成像的PSA视图中，保留颗粒信号在LV后壁、下壁、后间隔壁、前间隔壁(分别从5-10点钟位置逆时针方向)的中间具有假性损失)。然而，通过改变扫描平面(例如，从PSA到PLA或A4C视图)以改变覆盖物体的相对位置，或通过减小US频率以增加其穿透深度(例如，从14到7MHz)，这些衰减效果可以通过保留颗粒信号的良好恢复而被克服，见图4b。因此，在WT心肌中，Esel的全表达在US成像中得到证实，与免疫组织化学的数据保持一致。
在以上情况下，分子靶的US检测被晚期远端衰减所限定，而该衰减是由于近US路径的骨/气和保留颗粒的覆盖。然而，已经发现，通过使用更低频率US(更大的穿透深度)或不同的成像角度，该衰减可以被克服。从人类成像角度来看，其中使用更低频率US(例如，3-7MHz)和多平面成像是标准的，以及相对于本体的尺寸，换能器的足迹更小(使其更容易达到最佳探针位置/角度并避免覆盖骨/气)，这些衰减组织很可能不重要。然而，在机器衰减校正算法上的改进可以进一步使衰减现象最小化。
(3)其他组织的成像
参考基线图像，对比WT和Esel KO动物之间的胸部、腹部和骨盆的扫描(在颗粒给药之前)，显示出在非RES组织中靶向颗粒的非特异性保留是低的/最小化的。Esel表达在WT的肾皮质而不是KO动物中被检测出来(图5a和5b)。免疫组织化学和共焦点显微分析证实了Esel主要在肾小球内皮细胞上表达，后者在肾脏中集中。正如所预期的，靶向颗粒在WT和KO动物中从脾脏和肝脏开始(图5a和5b)，多数RES组织涉及到颗粒消除。
(4)副作用
归因于Esel靶向颗粒的死亡或明显的副作用未被检测到。在心肌中，没有观察到明显的颗粒阻断血管内阻塞，而该阻塞导致局部心肌灌注损失，其表现为局部壁动异常。
心肌(组织)和LV腔(中心血池)的超声TIC
进行靶向颗粒的iv推注给药之后，来自于TIC的具有不同特征的三相是可识别的，如图4a所示：
(1)推注相(B)：持续几秒钟，特征在于在推注的数秒内，初始时，颗粒信号强度快速上升以到达峰顶或饱和和/或衰减水平(随着增加的颗粒浓度)
(2)分布相(D)：持续达1-2min(花费了几个循环来完成)，特征在于颗粒信号强度很快迅速地减小，随着颗粒通过混合分布在组织中来稀释。高颗粒浓度导致信号饱和/衰减，使得再循环峰变得模糊。随着颗粒浓度在一段时间内进一步的减小，随着衰减的减小，该颗粒信号强度经常似是而非地被观察到增加，在颗粒给药的0.5-1min内升到第二低峰(如图4a插图的箭头)。
(3)消除相(E)：持续几分钟，特征在于在颗粒信号强度长时间缓慢地减小。在LV腔(表示自由循环颗粒在中心血池的浓度)中，颗粒信号强度在WT动物中比Esel KO动物更快地变得无法检测；在两组中，它们在颗粒给药后20min基本上不可检测。在心肌中，WT动物的颗粒信号强度比KO的减少的较慢，并持续到LV腔内颗粒信号的消失。在KO动物中，在心肌内的颗粒信号在LV腔内的颗粒信号消失之前变得不可检测(正如相关心肌血管容积(rMBV≤24％)，除了在非特异性气泡保留检测程度存在的时候。
Esel表达的声学定量
(1)动物
使用12只WT(年龄为5.7(平均)±0.3(SD)周，其范围为5.1-6.1周；体重为19.5(平均)±1.4(SD)g，其范围为18-22g)和8只Esel KO(年龄为7.9±3.2周，其范围为5-13.6周；体重为22.3±3.7g，其范围为17-28g)小鼠。LPSTime范围，对于WT组为3:53-5:59h，对于KO组为4:27-5:39h。在此有3只WT动物排除在定量分析之外，由于：(i)颗粒剂量错误(1只动物)；(ii)关于Esel表达水平的不确定因素(2只动物)；和(iii)这3只动物中的1只具有没有充分定量的TIC，可能是由于严重衰减的产物。
(2)基于单个晚期时间点分析的方法
在WT和Esel KO两组中，108个颗粒的iv推注给药后≈20min，血池(LV腔)中自由循环颗粒的信号是不存在/最小的。因此，在气泡给药后20min10s(R20)处，心肌中背景扣除的I用于表示仅有的保留颗粒，而到这个时间，任何残留的自由循环颗粒的信号分布被认为是可忽略的，由于它们在中心血池的低浓度(在LV腔的信号强度)。例如，LV腔中0.1AU将只贡献心肌之中的0.005-0.024AU，假设相对心肌血体积(心肌的％，指的是血)≤5-24％。65-67在WT动物(0.46±0.16(SEM)，范围0.01-l.61，n＝12)中的R20明显高于KO动物(0.06±0.03，-0.01-0.24，n＝8)中的，p＜0.05。在WT(r＝-0.78，p<0.05，n＝12)而不是KO(r＝-0.05，p<0.9，n＝8)小鼠中，R20与LPSTime的相关很强，如图8c。它与Esel mRNA的浓度也具有很强的相关性(r＝0.81，p<0.005，n＝12)，如图8d。
(3)基于TIC的方法
心肌中的最大的保留颗粒信号强度，Ar在WT(2.3±0.4(SEM)，范围为0.8-4.2，n＝12)中明显高于Esel KO(0.4±0.1，0-1，n＝8)动物中，p＜0.005。KO中的低Ar值表示非特异性颗粒保留的小程度。在WT(r＝0.87，p<0.0005，n＝12)而不是KO(r＝-0.08，p<0.86，n＝8)小鼠中，Ar与LPSTime的相关性很强，见图8a。通过使用图7a的曲线，LPSTime转化为Esel mRNA的浓度，图8b表明Ar与Esel mRNA的浓度也具有很强的相关性(r＝0.84，p<0.001，n＝12)，在范围内的后者相对于细胞表面Esel蛋白的浓度为近似线性相关，见图7c。
体内颗粒半衰期的声学定量(使用基于TIC的方法)
对于WT(n＝12)和KO(n＝8)的动物，体内自由循环颗粒的半衰期为≈2(平均)±1(SD)min，范围为1-5min。其可与大多数商业用非靶向微泡(范围为≈1-3min)对比，表明生产的微粒具有商业品质或更好的。该保留颗粒在心肌中的消除随着心肌中保留颗粒最大浓度的增加而降低。关系是非线性的，且可以经验拟合为指数或S曲线(sigmoidal)函数。这导致保留颗粒的半衰期更短，最大保留颗粒的浓度更低。声学上有效的保留颗粒在这些组的动物心肌的体内半衰期为WT(n＝12)中的≈7(平均)±5(SD)min，范围为3-18min，相对于KO(n＝8)动物中的4±4min，范围为1-14min。
靶向微粒在靶表面的药物动力学和聚集动力学
在微粒推注给药后，粘附在靶表面的微粒聚集基本上很快的完成。使用新型的基于TIC的方法，发现体内保留和自由循环靶向微粒的消除遵循一级动力学。
这些结果说明靶向微粒在体内用于一个或多个器官的高效定量实时超声分子成像是特异和有效的。微粒在体内具有有利的特征，其包括但不限于，无毒，对于使用单次推注微粒给药的连续和多平面成像足够稳定，对于目标分子部分的高效定量分析具有有利的动力学和声学响应。它们对于体内目标分子部分，具有足够的高靶向特异性和有效性，并在组织中没有非特异性结合/保留而不表达目标分子部分(除了肝脏和脾脏，它们是体内微粒消除的主要途径)。总之，这些靶向微粒不同于并优于现有技术。
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Claims (93)

1.一种适用于分子成像的微粒组合物，所述微粒组合物包括微粒，其中，所述微粒包括：具有中心区域和外壳的核心微粒结构，并且其中所述核心微粒结构包括：
(i)磷脂酰胆碱脂质，其中所述磷脂酰胆碱脂质为1,2-二硬脂酰-sn-甘油-3-磷酸胆碱；
(ii)包括至少一个马来酰亚胺部分的磷脂酰乙醇胺脂质，其中所述包括至少一个马来酰亚胺部分的磷脂酰乙醇胺脂质为1,2-二硬脂酰-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺-N-[马来酰亚胺(聚乙二醇)-2000]；和
(iii)烷氧基脂肪酸，其中所述烷氧基脂肪酸为PEG40硬脂酸酯；
其中，组分(i)-(iii)的摩尔比满足以下范围：
(i)70-80；
(ii)5-15；和
(iii)10-20；
所述微粒组合物进一步包括至少一个分子结合单元，其中，所述至少一个分子结合单元通过所述至少一个马来酰亚胺部分共价地粘附在所述核心微粒结构的所述外壳上。
2.根据权利要求1所述微粒组合物，其中，所述核心微粒结构进一步包括标记部分。
3.根据权利要求2所述微粒组合物，其中，所述组合物中所述标记部分的摩尔比为0.2-50。
4.根据权利要求3所述微粒组合物，其中，所述组合物中所述标记部分的摩尔比为0.5-5。
5.根据权利要求2-4中任一项所述微粒组合物，其中，所述标记部分为荧光染料。
6.根据权利要求5所述微粒组合物，其中，所述标记部分为1,1'-双十八烷基-3,3,3',3'-四甲基吲哚羰花青高氯酸盐(DiI)。
7.根据权利要求1所述微粒组合物，其中，所述核心微粒结构进一步包括磷脂酰乙醇胺脂质。
8.根据权利要求7所述微粒组合物，其中，所述磷脂酰乙醇胺脂质为C10-20的饱和磷脂酰乙醇胺脂质。
9.根据权利要求8所述微粒组合物，其中，所述磷脂酰乙醇胺脂质为二硬脂酰磷脂酰乙醇胺(DSPE)。
10.根据权利要求7-9中任一项所述微粒组合物，其中，所述磷脂酰乙醇胺脂质在所述组合物中的摩尔比为0.5-5。
11.根据权利要求1-4、6-9中任一项所述微粒组合物，其中，所述核心微粒结构的所述中心区域包含流体介质。
12.根据权利要求5所述微粒组合物，其中，所述核心微粒结构的所述中心区域包含流体介质。
13.根据权利要求10所述微粒组合物，其中，所述核心微粒结构的所述中心区域包含流体介质。
14.根据权利要求11所述微粒组合物，其中，所述流体介质包括生理学上可接受的气体。
15.根据权利要求12所述微粒组合物，其中，所述流体介质包括生理学上可接受的气体。
16.根据权利要求13所述微粒组合物，其中，所述流体介质包括生理学上可接受的气体。
17.根据权利要求14所述微粒组合物，其中，所述生理学上可接受的气体选自空气、氮气、二氧化碳、氙、氪、六氟化硫、氯三氟甲烷、二氯二氟甲烷、溴三氟甲烷、溴氯二氟甲烷、四氟甲烷、二溴二氟甲烷、二氯四氟乙烷、氯五氟乙烷、六氟乙烷、六氟丙烯、八氟丙烷、六氟丁烯、八氟-2-丁烯、八氟环丁烷、十氟丁烷、全氟环戊烷、十二氟戊烷、和十四氟己烷。
18.根据权利要求15所述微粒组合物，其中，所述生理学上可接受的气体选自空气、氮气、二氧化碳、氙、氪、六氟化硫、氯三氟甲烷、二氯二氟甲烷、溴三氟甲烷、溴氯二氟甲烷、四氟甲烷、二溴二氟甲烷、二氯四氟乙烷、氯五氟乙烷、六氟乙烷、六氟丙烯、八氟丙烷、六氟丁烯、八氟-2-丁烯、八氟环丁烷、十氟丁烷、全氟环戊烷、十二氟戊烷、和十四氟己烷。
19.根据权利要求16所述微粒组合物，其中，所述生理学上可接受的气体选自空气、氮气、二氧化碳、氙、氪、六氟化硫、氯三氟甲烷、二氯二氟甲烷、溴三氟甲烷、溴氯二氟甲烷、四氟甲烷、二溴二氟甲烷、二氯四氟乙烷、氯五氟乙烷、六氟乙烷、六氟丙烯、八氟丙烷、六氟丁烯、八氟-2-丁烯、八氟环丁烷、十氟丁烷、全氟环戊烷、十二氟戊烷、和十四氟己烷。
20.根据权利要求14所述微粒组合物，其中，所述生理学上可接受的气体包括八氟丙烷。
21.根据权利要求15所述微粒组合物，其中，所述生理学上可接受的气体包括八氟丙烷。
22.根据权利要求16所述微粒组合物，其中，所述生理学上可接受的气体包括八氟丙烷。
23.根据权利要求1-4、6-9、12-22中任一项所述微粒组合物，其中，所述至少一个分子结合单元包括蛋白质、多肽、或小分子有机部分。
24.根据权利要求5所述微粒组合物，其中，所述至少一个分子结合单元包括蛋白质、多肽、或小分子有机部分。
25.根据权利要求10所述微粒组合物，其中，所述至少一个分子结合单元包括蛋白质、多肽、或小分子有机部分。
26.根据权利要求11所述微粒组合物，其中，所述至少一个分子结合单元包括蛋白质、多肽、或小分子有机部分。
27.根据权利要求23所述微粒组合物，其中，所述至少一个分子结合单元为抗体。
28.根据权利要求24所述微粒组合物，其中，所述至少一个分子结合单元为抗体。
29.根据权利要求25所述微粒组合物，其中，所述至少一个分子结合单元为抗体。
30.根据权利要求26所述微粒组合物，其中，所述至少一个分子结合单元为抗体。
31.根据权利要求1-4、6-9、12-22、24-30中任一项所述微粒组合物，其中，所述至少一个分子结合单元与组分(ii)的配位反应摩尔比为≥1:1。
32.根据权利要求5所述微粒组合物，其中，所述至少一个分子结合单元与组分(ii)的配位反应摩尔比为≥1:1。
33.根据权利要求10所述微粒组合物，其中，所述至少一个分子结合单元与组分(ii)的配位反应摩尔比为≥1:1。
34.根据权利要求11所述微粒组合物，其中，所述至少一个分子结合单元与组分(ii)的配位反应摩尔比为≥1:1。
35.根据权利要求23所述微粒组合物，其中，所述至少一个分子结合单元与组分(ii)的配位反应摩尔比为≥1:1。
36.根据权利要求31所述微粒组合物，其中，所述至少一个分子结合单元与组分(ii)的配位反应摩尔比为≥5:1。
37.根据权利要求32所述微粒组合物，其中，所述至少一个分子结合单元与组分(ii)的配位反应摩尔比为≥5:1。
38.根据权利要求33所述微粒组合物，其中，所述至少一个分子结合单元与组分(ii)的配位反应摩尔比为≥5:1。
39.根据权利要求34所述微粒组合物，其中，所述至少一个分子结合单元与组分(ii)的配位反应摩尔比为≥5:1。
40.根据权利要求35所述微粒组合物，其中，所述至少一个分子结合单元与组分(ii)的配位反应摩尔比为≥5:1。
41.根据权利要求1-4、6-9、12-22、24-30、32-40中任一所述微粒组合物，其中，所述微粒具有至少约1×105个分子结合单元/微粒。
42.根据权利要求5所述微粒组合物，其中，所述微粒具有至少约1×105个分子结合单元/微粒。
43.根据权利要求10所述微粒组合物，其中，所述微粒具有至少约1×105个分子结合单元/微粒。
44.根据权利要求11所述微粒组合物，其中，所述微粒具有至少约1×105个分子结合单元/微粒。
45.根据权利要求23所述微粒组合物，其中，所述微粒具有至少约1×105个分子结合单元/微粒。
46.根据权利要求31所述微粒组合物，其中，所述微粒具有至少约1×105个分子结合单元/微粒。
47.根据权利要求1-4、6-9、12-22、24-30、32-40、42-46中任一所述微粒组合物，其中，所述微粒的平均直径在0.5-5μm的范围内。
48.根据权利要求5所述微粒组合物，其中，所述微粒的平均直径在0.5-5μm的范围内。
49.根据权利要求10所述微粒组合物，其中，所述微粒的平均直径在0.5-5μm的范围内。
50.根据权利要求11所述微粒组合物，其中，所述微粒的平均直径在0.5-5μm的范围内。
51.根据权利要求23所述微粒组合物，其中，所述微粒的平均直径在0.5-5μm的范围内。
52.根据权利要求31所述微粒组合物，其中，所述微粒的平均直径在0.5-5μm的范围内。
53.根据权利要求41所述微粒组合物，其中，所述微粒的平均直径在0.5-5μm的范围内。
54.一种适用于生成分子成像微粒组合物的中间体微粒组合物，其中，所述中间体微粒组合物包括：
(i)磷脂酰胆碱脂质，其中所述磷脂酰胆碱脂质为1,2-二硬脂酰-sn-甘油-3-磷酸胆碱；
(ii)包括至少一个马来酰亚胺部分的磷脂酰乙醇胺脂质，其中所述包括至少一个马来酰亚胺部分的磷脂酰乙醇胺脂质为1,2-二硬脂酰-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺-N-[马来酰亚胺(聚乙二醇)-2000]；和
(iii)烷氧基脂肪酸，其中所述烷氧基脂肪酸为PEG40硬脂酸酯；
其中，(i)-(iii)的摩尔比满足以下范围：
(i)70-80；
(ii)5-15；和
(iii)10-20；
所述中间体微粒组合物进一步包括至少一个分子结合单元；其中，所述至少一个分子结合单元共价地粘附在所述至少一个马来酰亚胺部分上。
55.根据权利要求54所述中间体微粒组合物，进一步包括标记部分。
56.根据权利要求55所述中间体微粒组合物，其中，所述标记部分在所述组合物中的摩尔比为0.2-50。
57.根据权利要求56所述中间体微粒组合物，其中，所述标记部分在所述组合物中的摩尔比为0.5-5。
58.根据权利要求55-57中任一项所述中间体微粒组合物，其中，所述标记部分为荧光染料。
59.根据权利要求58所述中间体微粒组合物，其中，所述标记部分为1,1'-双十八烷基-3,3,3',3'-四甲基吲哚羰花青高氯酸盐(DiI)。
60.根据权利要求54所述中间体微粒组合物，进一步包括磷脂酰乙醇胺脂质。
61.根据权利要求60所述中间体微粒组合物，其中，所述磷脂酰乙醇胺脂质是C10-20的饱和磷脂酰乙醇胺脂质。
62.根据权利要求61所述中间体微粒组合物，其中，所述磷脂酰乙醇胺脂质是二硬脂酰磷脂酰乙醇胺(DSPE)。
63.根据权利要求60-62中任一项所述中间体微粒组合物，其中，所述磷脂酰乙醇胺脂质在所述组合物中的摩尔比是0.5-5。
64.根据权利要求54-57、59-62中任一项所述中间体微粒组合物，其中，所述至少一个分子结合单元包括蛋白质、多肽、或小分子有机部分。
65.根据权利要求58所述中间体微粒组合物，其中，所述至少一个分子结合单元包括蛋白质、多肽、或小分子有机部分。
66.根据权利要求63所述中间体微粒组合物，其中，所述至少一个分子结合单元包括蛋白质、多肽、或小分子有机部分。
67.根据权利要求54所述中间体微粒组合物，其中，所述至少一个分子结合单元为抗体。
68.根据权利要求54-57、59-62、65-67中任一项所述中间体微粒组合物，其中，所述至少一个分子结合单元与组分(ii)的配位反应摩尔比为≥1:1。
69.根据权利要求58所述中间体微粒组合物，其中，所述至少一个分子结合单元与组分(ii)的配位反应摩尔比为≥1:1。
70.根据权利要求63所述中间体微粒组合物，其中，所述至少一个分子结合单元与组分(ii)的配位反应摩尔比为≥1:1。
71.根据权利要求64所述中间体微粒组合物，其中，所述至少一个分子结合单元与组分(ii)的配位反应摩尔比为≥1:1。
72.根据权利要求68所述中间体微粒组合物，其中，所述至少一个分子结合单元与组分(ii)的配位反应摩尔比为≥5:1。
73.根据权利要求69所述中间体微粒组合物，其中，所述至少一个分子结合单元与组分(ii)的配位反应摩尔比为≥5:1。
74.根据权利要求70所述中间体微粒组合物，其中，所述至少一个分子结合单元与组分(ii)的配位反应摩尔比为≥5:1。
75.根据权利要求71所述中间体微粒组合物，其中，所述至少一个分子结合单元与组分(ii)的配位反应摩尔比为≥5:1。
76.根据权利要求54-57、59-62、65-67、69-75中任一项所述中间体微粒组合物，其中，所述组合物是冻干物或水性分散体。
77.根据权利要求58所述中间体微粒组合物，其中，所述组合物是冻干物或水性分散体。
78.根据权利要求63所述中间体微粒组合物，其中，所述组合物是冻干物或水性分散体。
79.根据权利要求64所述中间体微粒组合物，其中，所述组合物是冻干物或水性分散体。
80.根据权利要求68所述中间体微粒组合物，其中，所述组合物是冻干物或水性分散体。
81.一种试剂盒，包括根据权利要求54-80中任一项所述中间体微粒组合物，和包含生理学上可接受气体的流体介质源。
82.根据权利要求81所述试剂盒，其中，所述生理学上可接受气体选自空气、氮气、二氧化碳、氙、氪、六氟化硫、氯三氟甲烷、二氯二氟甲烷、溴三氟甲烷、溴氯二氟甲烷、四氟甲烷、二溴二氟甲烷、二氯四氟乙烷、氯五氟乙烷、六氟乙烷、六氟丙烯、八氟丙烷、六氟丁烯、八氟-2-丁烯、八氟环丁烷、十氟丁烷、全氟环戊烷、十二氟戊烷、和十四氟己烷。
83.根据权利要求81所述试剂盒，其中，所述生理学上可接受气体包括八氟丙烷。
84.一种制备权利要求1-53任一所述微粒组合物的方法，所述方法包括：
(i)形成包括组分(i)-(iii)的具有中心区域和外壳的核心微粒结构。
85.根据权利要求84的制备微粒组合物的方法，所述方法进一步包括：
(ii)共价地粘附至少一个分子结合单元到所述核心微粒结构的所述外壳上。
86.根据权利要求84或85所述制备微粒组合物的方法，其中，步骤(i)在生理学上可接受气体存在下进行。
87.根据权利要求84或85所述制备微粒组合物的方法，其中，所述至少一个分子结合单元与组分(ii)在步骤(i)中的配位反应摩尔比为≥1:1。
88.根据权利要求86所述制备微粒组合物的方法，其中，所述至少一个分子结合单元与组分(ii)在步骤(i)中的配位反应摩尔比为≥1:1。
89.根据权利要求87所述制备微粒组合物的方法，其中，所述至少一个分子结合单元与组分(ii)在步骤(i)中的配位反应摩尔比为≥5:1。
90.根据权利要求88所述制备微粒组合物的方法，其中，所述至少一个分子结合单元与组分(ii)在步骤(i)中的配位反应摩尔比为≥5:1。
91.一种药物组合物，包括根据权利要求1-53中任一项所述微粒组合物，和药学上可接受的载体或赋形剂。
92.根据权利要求91所述药物组合物，在分子成像中用作造影剂。
93.根据权利要求1至53中任一项所述微粒组合物，在分子成像中用作造影剂。
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