CN105176885A - 一株枯草芽孢杆菌及其在降解有机磷农药中的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一株枯草芽孢杆菌(Bacillus？subtilis)BLCC1-0388，已于2015年08月26日保藏于中国典型培养物保藏中心，其保藏编号为CCTCC？NO:M？2015503。本发明还公开了该枯草芽孢杆菌在降解有机磷农药的应用以及以该枯草芽孢杆菌为有效成分的产品。本发明的枯草芽孢杆菌对有机磷农药具有较好的降解作用，特别是对氧化乐果降解效果显著，在可持续性农业的发展中具有广阔的应用。而且本发明的菌株可以在仅有土壤存在的条件下在土壤中定植及繁殖，并能降解氧化乐果。
Description
技术领域
本发明涉及一株枯草芽孢杆菌及其在降解有机磷农药中的应用。
背景技术
农药的长期施用已使土壤环境受到普遍污染。进入土壤中的有机农药能够被植物吸收并在植物体内迁移、代谢和积累，对人体健康和生态安全造成严重威胁，中国农药使用量达3×105t/a，除了30％～40％被作物吸收外，大部分多余的农药进入了环境及农产品中，而一些化学性质稳定，长期残留的农药，施用后又给土壤带来了污染，这些污染对人类的健康起到了危害的作用。因此有机农药在土壤中的污染状况及其环境行为已引起各国学者的广泛关注。
有机磷农药在国内外农业中作为主要的杀虫剂，得到了广泛使用。由于其大多属于中高毒性农药，且多具有内吸毒性，在环境中残留量大，难以被微生物降解，在保护农作物的同时，也造成环境的严重污染，并且已经危及到人体健康。其中，氧化乐果是一种具有广谱、内吸等特点的高效、中高毒性的有机磷农药，目前在我国农业中，尤其是果园和菜园中施用比较普遍，其销售量位于有机磷农药的前10位，对土壤生态环境具有较高的危害性。
农药在土壤中的降解作用是土壤中农药消失的主要途径，是土壤净化功能的重要表现，包括光降解、化学降解和微生物降解等作业，但其中由微生物引起的微生物降解作用尤为重要。目前，国外许多专家学者着力于研究有机磷农药的生物降解技术，国内也有许多有机磷农药降解技术以及降解微生物筛选方面的研究报道，例如在敌敌畏、敌百虫、以及甲基对硫磷等常用有机磷农药的微生物降解技术方面有较详细的报道。但在对氧化乐果降解方面未见有枯草芽孢杆菌的报道。
因此，筛选出能够高效降解农田内有机磷农药残留的枯草芽孢杆菌新菌株，对于解决农药污染问题具有较大的现实意义。
发明内容
针对上述现有技术，本发明的目的是提供一株枯草芽孢杆菌及其在降解有机磷农药中的应用。
为实现上述目的，本发明采用下述技术方案：
一株枯草芽孢杆菌，其为枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)BLCC1-0388，已于2015年08月26日保藏于位于中国武汉市武汉大学的中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，其保藏编号为CCTCCNO:M2015503。
本发明的枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)BLCC1-0388的菌学特征如下：镜检为好氧革兰氏阳性杆菌。长2.0～3.0微米、宽0.5～0.8微米，无荚膜，有芽孢；在酵母膏蛋白胨培养基上粗糙，菌落淡黄色，表面褶皱，无光泽，边缘波状。
接触酶试验为阳性，氧化酶试验为阴性，V-P测定为阳性，吲哚试验为阴性，水解明胶试验为阳性，硝酸盐还原试验为阴性，明胶液化试验为阴性；苯丙氨酸脱氨酶试验为阴性；D-葡萄糖为阳性、L-阿拉伯糖为弱阳性、D-甘露醇为阳性、木糖为弱阳性；耐盐性和需盐性：2％氯化钠为阳性、5％氯化钠为阳性、7％氯化钠为阳性、10％氯化钠为阴性；柠檬酸盐试验为阳性。
本发明还提供了该枯草芽孢杆菌BLCC1-0388在降解有机磷农药的应用，尤其是在降解氧化乐果中的应用。
本发明还保护一种产品，其活性成分为枯草芽孢杆菌BLCC1-0388或其发酵产物。
优选的，该产品为菌粉或液体菌剂。
本发明还提供该产品的制备工艺，将枯草芽孢杆菌BLCC1-0388的种子液接种于液体发酵培养基中，发酵培养，待发酵液芽孢率达到90％以上时，收集发酵液，制成液体菌剂或菌粉。
所述枯草芽孢杆菌BLCC1-0388的种子液的制备方法，步骤如下：
(i)斜面培养：将枯草芽孢杆菌BacillussubtilisBLCC1-0388的冻干粉菌种接种于固体斜面培养基上，在30℃-37℃培养20～28h；
(ii)一级种子培养：取培养好的斜面，在无菌条件下用接种环接两环于50mL～100mL种子液体培养基中，在30℃-37℃条件下，摇床培养20-24h，制得一级种子液；
(iii)扩大培养：以4-6％(v/v)的接种量，将一级种子液接于500mL～1000mL种子液体培养基中，在30℃-37℃条件下，摇床培养20-24h，制得二级种子液；
上述步骤(ii)、(iii)中所述种子液体培养基配方为：葡萄糖20g/L、蛋白胨10g/L、酵母膏5g/L，氯化钠5g/L，使用时，调节pH至6.5～7.5，121℃条件下灭菌20min；
步骤(i)中所述固体斜面培养基为上述种子液体培养基中添加质量分数为1.5～2.0％的琼脂粉。
所述液体发酵培养基的配方为：以质量百分比计，玉米面5％，豆粕3.5％，硫酸铵0.5％，磷酸氢二钠0.5％，碳酸钙0.5％，使用时，调节pH至6.5～7.5。
所述发酵培养，其培养温度为30℃-37℃。
该产品在降解有机磷农药中的应用也是本发明的保护范围。
在上述的应用中，作为一种优选的实施方式，具体的应用方法为：将产品稀释至浓度为1.0×106-5.0×106cfu/mL，均匀喷洒于被处理物表面，在自然条件(15-30℃)下于被处理物表面停留5-7天。
本发明的有益效果：
(1)本发明筛选出了一株枯草芽孢杆菌，对有机磷农药具有较好的降解作用，特别是对氧化乐果降解效果显著，经试验验证，本发明的枯草芽孢杆菌对氧化乐果的去除率最高可达93.92％，在可持续性农业的发展中具有广阔的应用。
(2)本发明的菌株可以在仅有土壤存在的条件下在土壤中定植及繁殖，并能有效降解氧化乐果。
附图说明
图1：菌株BLCC1-0388的菌体形态观察图；
图2：菌株BLCC1-0388的菌落观察图。
具体实施方式
结合实施例对本发明作进一步的说明，应该说明的是，下述说明仅是为了解释本发明，并不对其内容进行限定。
实施例1：枯草芽孢杆菌BLCC1-0388的分离筛选
1试验方法
1.1试验材料
土样：取样20份，来源良庄和房村蔬菜大棚。主要为种植圆白菜、菠菜、黄瓜、土豆和西红柿等蔬菜的土壤。
农药：纯度大于90％氧化乐果由山东农业大学植物保护学院惠赠。
无机盐培养基：NaCl0.5g、MgCl20.5g、K2SO40.5g、CaCl20.1g、FeSO40.01g、MnSO40.001g、H2O1000mL，pH7.0。
固体无机盐培养基：在无机盐培养基的基础上添加1.5％的琼脂粉。
复筛培养基：酵母膏5g、蛋白胨10g、NaCl5g、葡萄糖2g、蒸馏水1000mL、pH值7.0～7.2。
1.2菌株初筛方法
在无机盐培养基中加入氧化乐果1g/L，土样10g，转速为150r/min，37℃摇床培养。7天后以10％(体积分数)的接种量接入新鲜无机盐培养基，加氧化乐果2g/L，继续培养，7天后以10％(体积分数)的接种量接入新鲜无机盐培养基，加氧化乐果4g/L，继续培养7天，取上清液100μL在固体无机盐培养基上涂布，挑选菌斑进行划线培养，将纯培养菌落接种斜面保存。获得初筛菌株。
1.3菌株复筛方法
种子液制备：用接种环挑取菌落接入新鲜复筛培养基，37℃摇床培养24h。
将培养24h的种子液按照5％(体积分数)的接种量接到含1g/L氧化乐果的复筛培养基中，37℃摇床培养48h检测OD600值，以不接种农药的空白培养基为对照。
将培养24h的种子液按照5％(体积分数)的接种量分别接入含有2g/L、4g/L、6g/L、8g/L氧化乐果的复筛培养基中，48h后检测氧化乐果OD600值，并观察各菌株生长状况，选取生长速度最快、耐受性最好的菌株，进行斜面保存。
1.4菌株特性研究
1.4.1菌株对不同浓度氧化乐果的降解
将培养24h的种子液按照5％(体积分数)的接种量分别接入含有1g/L、1.2g/L、1.4g/L、1.6g/L、1.8g/L氧化乐果的复筛培养基中，置于温度为37℃、转速为150r/min的摇床中振荡培养，以不接种菌株的含有等量氧化乐果的复筛培养基为对照，48h后检测氧化乐果残留，计算氧化乐果去除率。
1.4.2菌株在不同培养时间下对氧化乐果的降解
将培养24h的种子液按照5％(体积分数)的接种量分别接入含有1.6g/L氧化乐果的复筛培养基中，置于温度为37℃、转速为150r/min的摇床中振荡培养，以不接种菌株的含有等量氧化乐果的复筛培养基为对照，分别在24h、48h和72h后检测氧化乐果残留，计算氧化乐果去除率。
1.4.3不同接种量菌株对氧化乐果的降解
将培养24h的种子液按照1％、3％和5％(体积分数)的接种量分别接入含有1.6g/L氧化乐果的培养基中，置于温度为37℃、转速为150r/min的摇床中振荡培养，在72h后检测氧化乐果残留，计算氧化乐果去除率。
1.4.4不同初始pH对氧化乐果的降解
将培养24h的种子液按照5％(体积分数)的接种量分别接入初始pH为5.0、6.0、7.0和8.0的氧化乐果的复筛培养基中，置于温度为37℃、转速为150r/min的摇床中振荡培养，以不接种菌株的含有等量氧化乐果的复筛培养基为对照，72h后检测氧化乐果残留，计算氧化乐果去除率。
1.5菌株鉴定
1.5.1生理生化鉴定
参照《伯杰氏细菌鉴定手册》进行。
1.5.216SrDNA鉴定
菌株基因组提取按照试剂盒提供的方法进行。
PCR引物：
P16SL:5’-GAGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’,如序列表中SEQIDNO.1所示；
P16SR:5’-GCCCCCGTCAATTCCTTTGAG-3’，如序列表中SEQIDNO.2所示；
PCR反应体系为:以提取的DNA为模板，用合成引物进行PCR扩增，反应体系(25μL):DNA模板2μL，10×PCRBuffer2.5μL，上、下游引物各0.5μL，dNTP2μL，TaqDNA聚合酶0.25μL，ddH2O17.25μL。
PCR反应条件94℃5min，95℃1min，57℃1min，72℃1min，30个循环；72℃10min，4℃保存。
扩增产物经1％琼脂糖凝胶电泳检测，回收目的片段与pMD18-T载体16℃连接过夜，转化感受态E.coliTG1，经质粒PCR和酶切鉴定后送阳性克隆子测定碱基序列。利用GenBank数据库中的Blastn程序比对分析,以Megalign软件绘制聚类图谱。
2试验结果
2.1初筛结果
分离得到疑似芽孢杆菌50株，镜检后发现有20株可以形成芽孢，其余杆状。
2.2复筛结果
复筛结果见表1.
表1部分菌株培养48h后菌液OD600值
从表1可以看出，仅有TJJ1、BLCC1-0388和TTD这三株菌在含有氧化乐果的液体培养基中能一直生长良好。所以下步筛选将以这三株菌为目的菌株进行进一步优化筛选。
2.3三株菌株对不同浓度氧化乐果的去除结果
结果见表2。
表2三株菌株对不同浓度氧化乐果的去除结果
| 菌株编号 | 2mg/mL | 4mg/mL | 6mg/mL | 8mg/mL |
| TJJ1 | 57.88％ | 26.11％ | 14.7％ | 6.83％ |
| BLCC1-0388 | 87.65％ | 45.51％ | 38.59％ | 0 |
| TTD | 23.40％ | 0 | 0 | 0 |
从表2可以看出，菌株TJJ1在氧化乐果浓度为2mg/mL时降解效果最好，其去除率为57.88％，随着氧化乐果浓度的升高，去除氧化乐果的能力逐渐下降；菌株BLCC1-0388在氧化乐果浓度为2mg/mL时降解效果最好，其去除率为87.65％，同样随着氧化乐果浓度的升高，去除氧化乐果的能力逐渐下降；菌株TTD在氧化乐果浓度为4-8mg/mL时均没有降解能力。结果表明，菌株BLCC1-0388在氧化乐果浓度为2mg/mL的降解效果最好。下步筛选将以BLCC1-0388为目的菌株进行进一步优化筛选。
2.4菌株去除氧化乐果条件优化
2.4.1菌株BLCC1-0388对不同浓度氧化乐果的降解
表3菌株对不同浓度氧化乐果的去除率
从表3中可以看出，随着氧化乐果浓度的升高，菌液OD600值和氧化乐果去除率呈逐渐下降趋势，在氧化乐果浓度为1.6mg/mL时，菌株BLCC1-0388对其去除率仍可达到84.7％。下步试验中以1.6mg/mL为终浓度进行试验。
2.4.2菌株BLCC1-0388在不同培养时间下对氧化乐果的降解
表4不同培养时间对氧化乐果的降解效果
从表4中可以看出，在氧化乐果浓度为1.6mg/mL，培养温度为37℃，初始pH为7.0，接种量5％时，培养72h对氧化乐果的去除率可以达到83.35％。
2.4.3不同接种量条件下，菌株BLCC1-0388对氧化乐果的降解
表5不同接种量条件下菌株BLCC1-0388对氧化乐果的去除效果
从表5中可以看出，在氧化乐果浓度为1.6mg/mL，初始pH7.0时，培养温度为37℃，培养72h，接种量5％，菌株BLCC1-0388对氧化乐果的去除率可以达到84.82％。
2.4.4不同初始pH条件下，菌株BLCC1-0388对氧化乐果的降解
表6不同初始pH条件下菌株BLCC1-0388对氧化乐果的去除效果
从表6中可以看出，在氧化乐果浓度为1.6mg/mL，初始pH7.0时，培养温度为37℃，培养72h，接种量5％，菌株BLCC1-0388对氧化乐果的去除率可以达到83.49％。
2.5菌株BLCC1-0388鉴定结果
2.5.1生理生化鉴定结果
镜检BLCC1-0388为好氧革兰氏阳性杆菌。细胞大小为(1.0-2.0)×(0.5-0.8)微米，无荚膜，有芽孢，如图1所示；在固体复筛培养基上粗糙，菌落淡黄色，表面褶皱，无光泽，边缘波状，如图2所示。
接触酶试验为阳性，氧化酶试验为阴性，V-P测定为阳性，吲哚试验为阴性，水解明胶试验为阳性，硝酸盐还原试验为阴性，明胶液化试验为阴性；苯丙氨酸脱氨酶试验为阴性；D-葡萄糖为阳性、L-阿拉伯糖为弱阳性、D-甘露醇为阳性、木糖为弱阳性；耐盐性和需盐性：2％氯化钠为阳性、5％氯化钠为阳性、7％氯化钠为阳性、10％氯化钠为阴性；柠檬酸盐试验为阳性。
2.5.216SrDNA检测结果
采用生理生化鉴定和16SrDNA序列分析相结合进行细菌鉴定，确定BLCC1-0388为枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)，其16SrDNA序列如序列表中SEQIDNO.3所示。
3结论
3.1以BLCC1-0388为试验菌株进行试验，在最佳发酵条件为接种量5％、培养温度为37℃、培养时间为72h、培养基初始pH为7.0时对1.6mg/mL的氧化乐果去除率可以达到83％以上。
3.2结合菌落形态和16SrDNA鉴定，菌株BLCC1-0388为枯草芽孢杆菌。
实施例2：降解有机磷农药产品的制备
(1)菌株BLCC1-0388菌粉的制备
该菌粉可采用如下制备工艺，具体步骤为：
(i)菌种：选用枯草芽孢杆菌BacillussubtilisBLCC1-0388，CCTCCNO:M2015503。
(ii)斜面培养：将枯草芽孢杆菌BacillussubtilisBLCC1-0388的冻干粉菌种接种于固体斜面培养基上，在37℃培养24h；
(iii)一级种子培养：将培养好的斜面，在无菌条件下用接种环接两环于100mL种子液体培养基中，在37℃条件下，摇床180rpm培养18h，制得一级种子液；
(iv)扩大培养：以5％(v/v)的接种量，将一级种子液接于1000mL种子液体培养基中，在37℃条件下，摇床180rpm培养20h，制得二级种子液；
(v)发酵罐培养：以5％(v/v)的接种量，将二级种子液接于液体发酵培养基中，于37℃条件下，发酵罐培养30h；
(ⅵ)收集发酵产物：待步骤(ⅴ)之发酵液芽孢率达到90％以上时，收集发酵液；
(ⅶ)发酵结束后，喷雾干燥，即得枯草芽孢杆菌BacillussubtilisBLCC1-0388的菌粉；
上述步骤(ⅲ)、(ⅳ)中所述种子液体培养基配方为：葡萄糖20g/L、蛋白胨10g/L、酵母膏5g/L，氯化钠5g/L，使用时，调节pH至6.5～7.5，121℃条件下灭菌20min；步骤(ⅱ)中所述固体斜面培养基为上述种子液体培养基中添加2.0％的琼脂粉；步骤(ⅴ)中所述液体发酵培养基配方为：玉米面5％，豆粕3.5％，硫酸铵0.5％，磷酸氢二钠0.5％，氯化钙0.5％，(质量百分数)，使用时，调节pH至6.5～7.5。
(2)菌株BLCC1-0388液体菌剂的制备
菌株BLCC1-0388液体菌剂的制备步骤中，发酵液的制备与菌株BLCC1-0388菌粉的制备步骤相同，区别在于，将制备的发酵液进行浓缩处理，即得菌株BLCC1-0388液体菌剂。
实施例3：菌株BLCC1-0388相关产品对氧化乐果的降解效果(田间试验)
大田试验在梁庄蔬菜大棚进行，田间未种植蔬菜，喷施发酵液之前采集土壤为初始氧化乐果浓度，将实施例2制备的菌粉稀释，菌液浓度为5.0×106cfu/mL，喷洒至土壤上，翻刨2cm深度。1周后采集土样，检测氧化乐果浓度，计算氧化乐果降解率，同时检测土壤中菌株数量。结果见表7。
表7菌株BLCC1-0388产品对土壤中氧化乐果的降解效果
从表7中可以看出，喷施菌株BLCC1-0388产品7d后，对土壤中氧化乐果去除率为79.06％。土壤中的活菌数可以达到8.02×108cfu/g。说明该菌株可以在仅有土壤存在的条件下在土壤中定植及繁殖，并能有效降解土壤中的氧化乐果。
Claims (10)
1.一株枯草芽孢杆菌，其特征在于，该菌株为枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)BLCC1-0388，已于2015年08月26日保藏于中国典型培养物保藏中心，其保藏编号为CCTCCNO:M2015503。
2.权利要求1所述的枯草芽孢杆菌在降解有机磷农药的应用。
3.如权利要求2所述的应用，其特征在于，所述有机磷农药为氧化乐果。
4.一种产品，其特征在于，其活性成分为枯草芽孢杆菌BLCC1-0388或其发酵产物。
5.如权利要求4所述的产品，其特征在于，所述产品为液体菌剂或菌粉。
6.权利要求4或5所述的产品的制备方法，其特征在于，将枯草芽孢杆菌BLCC1-0388的种子液接种于液体发酵培养基中，发酵培养，待发酵液芽孢率达到90％以上时，收集发酵液，制成液体菌剂或菌粉。
7.如权利要求6所述的制备方法，其特征在于，所述枯草芽孢杆菌BLCC1-0388的种子液制备步骤为：
(i)斜面培养：将枯草芽孢杆菌BLCC1-0388的冻干粉菌种接种于固体斜面培养基上，在30℃-37℃培养20～28h；
(ii)一级种子培养：取培养好的斜面，在无菌条件下接种于种子液体培养基中，在30℃-37℃条件下，摇床培养20-24h，制得一级种子液；
(iii)扩大培养：将一级种子液接种于种子液体培养基中，在30℃-37℃条件下，摇床培养20-24h，制得二级种子液。
8.如权利要求6所述的制备方法，其特征在于，所述液体发酵培养基的配方为：玉米面5％、豆粕3.5％、硫酸铵0.5％、磷酸氢二钠0.5％、碳酸钙0.5％，使用时，调节pH至6.5～7.5。
9.权利要求4或5所述的产品在降解有机磷农药中的应用。
10.如权利要求9所述的应用，其特征在于，应用方法为：将产品稀释至浓度为1.0×106-5.0×106cfu/mL，均匀喷洒于被处理物表面，在15-30℃条件下于被处理物表面停留5-7天。
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