CN105154463B

CN105154463B - 一种过表达海栖热袍菌乙酰乳酸合酶催化亚基的菌株的构建及其用途

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Publication number: CN105154463B
Application number: CN201510641578.XA
Authority: CN
Inventors: 高文运; 李恒; 赵继奎; 刘楠; 岳俏
Original assignee: NORTHWEST UNIVERSITY
Current assignee: NORTHWEST UNIVERSITY
Priority date: 2015-09-30
Filing date: 2015-09-30
Publication date: 2018-10-02
Anticipated expiration: 2035-09-30
Also published as: CN105154463A

Abstract

本发明公开了一种过表达海栖热袍菌乙酰乳酸合酶催化亚基的菌株的构建方法及其用途。重组菌株的构建方法包括以下步骤：根据TmAHAS‑CSU的基因序列设计上下游引物，设计的上游引物带有NdeI酶切位点，下游引物带有BamHⅠ酶切位点，然后以海栖热袍菌基因组DNA为模板，通过PCR扩增技术得到目的基因片断；将目的片断连接到表达载体pET28a上，得到重组质粒pET28a‑TmAHAS‑CSU，并通过热击法将该重组质粒转化入感受态细胞中以构建过表达Tm‑AHAS‑CSU蛋白的重组菌株。在此基础上验证了该重组菌株的功能及它在立体选择性地催化合成R‑PAC及其类似物方面的用途。

Description

一种过表达海栖热袍菌乙酰乳酸合酶催化亚基的菌株的构建及其用途

技术领域

本发明属于遗传工程领域，具体涉及到一种用于催化合成(R)-苯基乙酰甲醇(R-PAC)及其类似物的菌株的构建方法。

背景技术

(R)-苯基乙酰甲醇(R-PAC)是医药工业中合成α/β-肾上腺素的前体物质，也被用来合成L-麻黄碱(L-ephedrine)、伪麻黄碱(Pseudoephedrine)以及苯丙醇胺(Norephedrin)等药物，同时它也是有机合成过程中常用的一种手性中间体，可用于手性药物的合成。R-PAC目前利用生物转化法制备，主要是以酵母细胞来催化丙酮酸与苯甲醛之间的缩合反应，但由于反应速率小及底物转化为目标化合物的转化率低使得该方法并不是一个非常有效的R-PAC合成途径。因为该反应中起到催化作用的酶为丙酮酸脱羧酶(PDC)，故纯化后的PDC也已被用来制备R-PAC，主要有运动发酵单胞菌(Zymomonas mobilis)PDC(ZmPDC)及酿酒酵母菌(Saccharomyces cerevisiae)PDC(ScPDC)。ScPDC催化活性较高，但稳定性不好；ZmPDC显示较好的稳定性，但催化效率较低。用PDC作为催化剂制备R-PAC还有一个比较致命的问题，那就是PDC可以催化丙酮酸脱羧形成乙醛，而乙醛的积累则会对PDC酶产生不可逆的抑制，从而极大地影响R-PAC的生成。

乙酰乳酸合酶(AHAS)是微生物及高等植物中支链氨基酸，如缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸等生物合成途径中的关键酶，AHAS通常由两个大亚基(也称催化亚基)及两个小亚基(也称调节亚基)构成，其大亚基通常起催化作用，而小亚基则主要起到稳定大亚基及调节大亚基活性的作用。高等植物中AHAS酶表达量低且纯化后稳定性较差；微生物中AHAS广泛存在。常见微生物大肠杆菌(E.coli)中存在三种AHAS同工酶，分别称为AHAS I、II及III，其中以AHAS I在所有微生物源的AHAS中催化活性最好。AHAS是一种典型的焦磷酸硫胺素(ThPP)依赖酶，在ThPP存在下，AHAS可催化一分子丙酮酸与另一份子丙酮酸缩合形成乙酰羟酸，也称2-乙酰乳酸，该物质是支链氨基酸缬氨酸、亮氨酸的生物合成前体；同时该酶还能催化一分子丙酮酸与一分子丁酮酸反应生成2-乙酰-2-羟丁酸，该化合物则是支链氨基异亮氨酸的生物合成前体；此外，AHAS还能催化丙酮酸与苯甲醛之间的反应，立体选择性地生成R-PAC。正因为如此，大肠杆菌AHAS I及II分别被用来催化合成R-PAC(S.Engel etal.,Biotechnol.Bioeng.,2003,83:833-840；2004,88:825-831)。研究表明，AHAS I及II不仅可以有效地催化R-PAC的合成，副反应少，底物转化率高，而且受体底物谱宽，可利用多种取代的芳香族醛为底物合成R-PAC的类似物。但该反应也存在缺点：①如前所述，AHAS通常由两个大亚基及两个小亚基构成，在制备该酶时要同时制备这两个亚基然后进行体外重构才能获得，这就使得酶制备过程显得繁复；②E.coli AHAS通常稳定性较差，其大亚基单独存在时虽然也显示较弱的催化活性，但稳定性更差。这两个不足之处很大程度上限制了E.coli AHAS在催化合成R-PAC及其类似物方面的应用。

发明内容

本发明提供了一种可用于催化合成(R)-苯基乙酰甲醇(R-PAC)及其类似物的菌株的构建方法，进而可以实现以该重组菌株为催化剂立体选择性地制备R-PAC及其类似物。

本发明的技术方案如下：

一种过表达海栖热袍菌乙酰乳酸合酶催化亚基的菌株的构建方法，包括以下步骤：

1)根据海栖热袍菌乙酰乳酸合酶催化亚基(TmAHAS-CSU)的基因序列设计上下游引物，其中上游引物带有NdeI酶切位点，下游引物带有BamHⅠ酶切位点，具体如下：

上游引物：GGAATTCCATATGATGCTTCTGGACGAGATC

下游引物：CGCGGATCCTCATACTTTCCCCTCCCTAC

以上引物中，下划线部分为限制性内切酶的识别序列；

2)以海栖热袍菌基因组DNA为模板，通过PCR扩增技术得到目的基因；

3)将目的基因连接到pET28a原核表达载体上，得到重组质粒pET28a-TmAHAS-CSU；

4)通过热击法将重组质粒pET28a-TmAHAS-CSU转化入E.coli感受态细胞中，构建过表达Tm-AHAS-CSU蛋白的重组菌株Ecoli-Tm-AHAS-CSU。

其中步骤4)中，重组质粒pET28a-TmAHAS-CSU的转化具体可按照以下方法进行：

4.1)所用E.coli感受态细胞为E.coli Rosetta(DE3)或E.coli BL21(DE3)；

4.2)取感受态细胞100-300μL(OD600＝0.1-0.4)，置于冰上缓慢融化；

4.3)取重组质粒pET28a-TmAHAS-CSU 20-50ng，加入到已融化的感受态细胞中，缓慢吹吸混匀，冰上静置20-40min；

4.4)之后将其放入40-45℃水浴中热击80-100s后，再放置冰上冰浴2-5min；

4.5)向转化后的感受态细胞中加入600-1000μL的LB培养基，放置于恒温摇床上，100-120rpm、34-40℃培养1-2h；

4.6)将所得菌液收集并于2800-3300rpm离心2-5min，弃去上清即得过表达Tm-AHAS-CSU的重组菌株Ecoli-Tm-AHAS-CSU。

经证实，上述过表达海栖热袍菌乙酰乳酸合酶催化亚基的菌株，具有以下重要用途：该菌株可直接用于立体选择性地催化合成R-苯基乙酰基甲醇(R-PAC)或其类似物；所述类似物为以下三类中任意一种化合物：

第一类：R为卤素、硝基、羟基、烷氧基或者烃基，取代位置为邻位、间位或对位；

第二类：R为H、卤素、硝基、羟基、烷氧基或者烃基，取代位置为甲酰基的邻位、间位或对位；

第三类：R为H、卤素、硝基、羟基、甲氧基或者烃基，取代位置为甲酰基的邻位或间位。

相应的催化合成R-苯基乙酰基甲醇(R-PAC)或其类似物的方法也分为以下三类：

第一类催化合成反应为

该反应中，供体底物为丙酮酸，受体底物为苯甲醛(R＝H)，则产物为R-苯基乙酰基甲醇(R-PAC)；或者受体底物为取代的苯甲醛，其中R为卤素、硝基、羟基、烷氧基或者烃基，取代位置为邻位、间位或对位，产物为R-苯基乙酰基甲醇(R-PAC)的第一类类似物。

第二类催化合成反应为

该反应中，供体底物为丙酮酸，受体底物为吡啶甲醛(R＝H)或取代的吡啶甲醛，其中对于所述取代的吡啶甲醛，取代基R为卤素、硝基、羟基、烷氧基或者烃基，取代位置为甲酰基的邻位、间位或对位；产物为R-苯基乙酰基甲醇(R-PAC)的第二类类似物。

第三类催化合成反应为：

该反应中，供体底物为丙酮酸，受体底物为呋喃甲醛(R＝H)或取代的呋喃甲醛，其中对于所述取代的呋喃甲醛，取代基R为卤素、硝基、羟基、甲氧基或者烃基，取代位置为甲酰基的邻位或间位；产物为R-苯基乙酰基甲醇(R-PAC)的第三类类似物。

上述催化合成反应具体可通过以下方法实现：

在1.0-3.0mL反应混合物中含有20-80mM供体底物、10-40mM受体底物、50-100mM(pH 7.0-8.5)的HEPES或PBS或Tris-HCl缓冲液、0.5-5mM ThPP、1-10mM MgCl₂、50-100mMKCl、0.25-2.0mM DTT、以及1-20％DMSO；

反应混合物在50-90℃预孵育5-15min后，加入100-300mg重组菌株Ecoli-Tm-AHAS-CSU引发反应并在同样的温度下继续孵育0.5-3小时；

然后，离心收集上清液，用氯仿或乙酸乙酯萃取2-3次，有机相合并后以无水MgSO₄或无水Na₂SO₄干燥，过滤除去固形物，滤液于25-45℃下减压蒸干，所得残余物用硅胶柱进行纯化，洗脱剂为石油醚-乙酸乙酯V/V,3:1。

本发明具有以下有益效果：

本发明构建的菌株可以被直接用于催化反应，而无需纯化TmAHAS-CSU蛋白。这是由于该菌株所过表达的Tm-AHAS-CSU蛋白具有极佳的热稳定性，且只有在70-90℃的范围内才具有较强的催化活性，而在这样的反应温度下，菌株中其它蛋白都已变性，不会对反应产生任何影响。

该构建方法的各个环节均能够通过常用的基因工程技术完成。

附图说明

图1为编码Tm-AHAS-CSU基因的克隆(A)及重组质粒pET28a-TmAHAS-CSU的构建(B)。

图2为重组菌株Ecoli-Tm-AHAS-CSU的诱导表达结果。

图3为重组菌株Ecoli-Tm-AHAS-CSU的活性测定结果。

具体实施方式

海栖热袍菌(Thermotoga maritime)是一种特殊的严格厌氧细菌，生长于55～90℃环境中，如海底温泉、火山口附近等。由于这种菌能生存于高温条件下，其体内所表达的各种酶也就具有很好的热稳定性，因此，海栖热袍菌源的耐高温酶已成为研究和开发的热点，如耐高温木聚糖酶、纤维二糖磷酸化酶及α-葡萄糖苷酶等已被克隆表达，并在饲料工业、造纸工业、能源工业以及食品医药等领域得到了广泛的应用。本发明根据GenBank中AHAS催化亚基的基因序列设计引物，以海栖热袍菌基因组DNA为模板，通过PCR扩增技术得到目标酶基因，目的片段全长为1746bp。将目的片段连接到pET28a载体上，得到重组质粒pET28a-TmAHAS-CSU；将该重组质粒以热击法转入E.coli Rosetta(DE3)感受态细胞中以构建过表达TmAHAS-CSU的重组菌株Ecoli-TmAHAS-CSU，进而以该重组菌株为催化剂立体选择性地制备R-PAC及其类似物。

所用材料：

海栖热袍菌全基因组DNA购自德国菌种保藏中心；E.coli Rosetta(DE3)感受态细胞，pET28a原核表达载体以及实验中用到的各种试剂盒及试剂均为商品化产品，可以方便地购买。

培养基及试剂的配制：

1、LB(Luria-Bertani)液体培养基：分别称取5g酵母提取物，10g胰蛋白胨，10gNaCl，溶解于800mL二次蒸馏水(ddH₂O)中，然后用2M NaOH将pH调至7.0，再用ddH₂O稀释至1L，121℃下高压灭菌20min，4℃保存待用；

2、LB固体培养基：分别称取0.5g酵母提取物，1g胰蛋白胨，1g NaCl，1.5g琼脂，溶解于90mL ddH₂O中，然后用2M NaOH将pH调至7.0，再用ddH₂O稀释至100mL，121℃下高压灭菌20min，待液体冷却至60℃左右，平均倒入6个灭菌的培养皿中，冷却后置于4℃保存备用；

3、异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷(IPTG)溶液：称取0.24g IPTG，溶解于10mL无菌水中，使其终浓度为100mM，分装后于4℃保存待用；

构建过程具体包含以下操作步骤：

1、编码海栖热袍菌乙酰乳酸合酶催化亚基(TmAHAS-CSU)基因的克隆及重组质粒pET28a-TmAHAS-CSU的构建：

1)编码TmAHAS-CSU基因的克隆：以海栖热袍菌全基因组DNA为模板，利用现代分子生物学技术克隆编码Tm-AHAS-CSU的基因，所设计的引物分别为(下划线部分为限制性内切酶的识别序列，分别为NdeI和BamHI)：

正向引物：GGAATTCCATATGATGCTTCTGGACGAGATC

反向引物：CGCGGATCCTCATACTTTCCCCTCCCTAC

参见图1，(A)M泳道为核酸Maker，1、2、3、4泳道均为PCR产物；(B)M泳道为核酸Maker，泳道1为目的基因AHAS-CSU，泳道2为载体pET28a，泳道3为重组质粒pET28a-TmAHAS-CSU NdeI单酶切结果，泳道4为重组质粒pET28a-TmAHAS-CSU NdeI和BamHI双酶切结果。

图1(A)结果显示目的条带出现在1.5kb-2.0kb之间，与TmAHAS-CSU编码基因(1.746kb)理论值大小基本一致，初步表明PCR扩增出了目的基因。

2)重组质粒pET28a-TmAHAS-CSU的构建：利用通用分子生物学技术将1)中获得的基因片段插入载体pET28a中，构建pET28a-TmAHAS-CSU重组质粒。

图1(B)结果显示重组质粒双酶切后存在两条带，一条在1.5-2.0kb之间，为目的基因，另一条在5.0-7.0kb之间，为pET-28a，而重组质粒单酶切处理后，只有一条带，略高于7.0kb，为目的基因与pET-28a大小之和，进一步确定重组质粒构建成功。

2、过表达Tm-AHAS-CSU菌株的构建、Tm-AHAS-CSU蛋白的表达及功能鉴定：

1)重组质粒pET28a-TmAHAS-CSU的转化：

(1)将E.coli Rosetta(DE3)感受态细胞200μL(OD₆₀₀＝0.3)置于冰上，缓慢融化。

(2)取重组质粒pET28a-TmAHAS-CSU 30ng(约5μL)，加入到已融化的感受态细胞中，缓慢吹吸混匀，冰上静置30min。

(3)之后将其放入42℃水浴锅中，热击90s后，再放置冰上冰浴2.5min。

(4)向转化后的感受态细胞中加入800μL的LB培养基，放置于恒温摇床上，100-120rpm、37℃培养1h。

(5)将所得菌液收集并于3000rpm离心2min，弃去大部分上清即得过表达Tm-AHAS-CSU的菌株Ecoli-Tm-AHAS-CSU。

2)重组菌株Ecoli-Tm-AHAS-CSU的诱导表达：

(1)将重组菌株Ecoli-Tm-AHAS-CSU保存液置于冰上融化，用接种环沾取少量，划线于固体培养基(含有卡那霉素50μg/mL；氯霉素34μg/mL)上，放于37℃恒温培养箱中培养2h，之后将平板翻转，继续培养12h；

(2)挑取大小适中、表面光滑的单克隆菌落，接种于5mL的LB液体培养基(含有卡那霉素50μg/mL；氯霉素34μg/mL)中，37℃、180rpm条件下摇床上震荡12h。

(3)取上一步菌液5mL加入到500mL LB液体培养基(含有卡那霉素50μg/mL；氯霉素34μg/mL)中，37℃、220rpm培养2-3h。

(4)测得菌液OD600达到0.4-0.6之间时，加入IPTG(终浓度为0.5mM)，25℃、200rpm诱导4h。

(5)收集菌液，4℃、6000rpm离心10min后，弃去上清，收集菌体沉淀并称重。

图2为重组菌株Ecoli-Tm-AHAS-CSU的诱导表达结果。图中泳道M为ProteinMaker，泳道1为未诱导全菌，2为诱导全菌。对比泳道1和2可发现泳道2在66kD处明显有蛋白的过表达，这与预期结果一致，说明Tm-AHAS-CSU已成功表达。以上实验证实过表达Tm-AHAS-CSU的菌株Ecoli-Tm-AHAS-CSU已成功构建。

3)比色法测定重组菌株Ecoli-Tm-AHAS-CSU的活性：

原理：两分子的丙酮酸在ThPP及Mg²⁺存在下被AHAS催化形成乙酰乳酸，乙酰乳酸在强酸性条件下脱羧生成乙偶姻(3-羟基丁酮)，乙偶姻在含胍基化合物(如肌酸)的存在下与α-碱萘酚形成红色络物，该络合物在A₅₂₅处有最大的吸收峰。利用该反应就可对所得到的重组菌株Ecoli-Tm-AHAS-CSU的活性进行检测。

检测：200μL反应混合物中含有50mM K₃PO₄(pH 7.0)，1mM ThPP，10mM MgCl₂，50mM丙酮酸，80℃预孵育10min后加入30mg E.coli Rosetta(DE3)菌株(阴性对照)或重组菌株Ecoli-Tm-AHAS-CSU引发反应。在同样的温度下继续孵育45min后，向反应体系中加入30μL4M H₂SO₄，于65℃条件下再孵育15min以终止反应；取100μL反应产物，加入90μL 0.17％的肌酸、90μL1.7％的α-萘酚(4M NaOH溶液)后，于65℃水浴中孵育15min，室温放置15min，6000rpm离心后测定体系525nm的吸收值，以不加菌株的样品为空白，加E.coli Rosetta(DE3)菌株的样品作为阴性对照。测定结果如图3所示。图3为重组菌株Ecoli-Tm-AHAS-CSU的活性测定结果，曲线1：空白；曲线2：阴性对照；曲线3：Ecoli-Tm-AHAS-CSU菌株。

以上结果进一步证实所构建的Ecoli-Tm-AHAS-CSU菌株可以过表达Tm-AHAS-CSU蛋白。

3、以Ecoli-Tm-AHAS-CSU菌株为催化剂制备R-PAC及其类似物：

1)R-PAC制备：反应式如下。

2.0mL反应混合物中含有100mM HEPES缓冲液(pH 7.0)，1mM ThPP，5mM MgCl₂，60mM KCl，0.5mM DTT，50mM丙酮酸，30mM苯甲醛及4％DMSO，80℃预孵育10min后加入200mg重组菌株Ecoli-Tm-AHAS-CSU引发反应并在同样的温度下继续孵育1小时。之后离心收集上清液，用氯仿萃取(2mL×3)，有机相合并后以少量无水MgSO₄干燥，过滤除去固形物，滤液于30℃下减压蒸干，所得残余物用硅胶柱进行纯化，洗脱剂为石油醚-乙酸乙酯(V/V,3:1)。收集到的含有R-PAC的部分合并，减压蒸馏除去溶剂，得到R-PAC纯品7.4mg，产率82.2％。HRESI-MS(负离子模式)m/z:149.0605(100％)[M-H]^-,理论值：150.0671；[α]²⁰ _D-183°(c3.1,MeOH)。¹H-NMR(400MHz,CDCl₃)δ2.09(s,3H),2.30(s,1H,OH),5.14(s,1H),7.30(m,5H)。

由于与受体底物苯甲醛具有相似的化学性质，我们可以预期，当采用以下的化合物作为受体底物时：

其中R为卤素(Cl、Br等)、硝基、羟基、烷氧基或者烃基，取代位置为邻位、间位或对位；仍能够很好地反应得到相应的类似产物

2)(R)-3-吡啶基乙酰甲醇制备：反应式如下。

2.0mL反应混合物中含有100mM HEPES缓冲液(pH 7.0)，1mM ThPP，5mM MgCl₂，60mM KCl，0.5mM DTT，50mM丙酮酸，30mM 3-吡啶甲醛及4％DMSO，80℃预孵育10min后加入200mg重组菌株Ecoli-Tm-AHAS-CSU引发反应并在同样的温度下继续孵育1小时。之后离心收集上清液，用氯仿萃取(2mL×3)，有机相合并后以少量无水MgSO₄干燥，过滤除去固形物，滤液于30℃下减压蒸干，所得残余物用硅胶柱进行纯化，洗脱剂为石油醚-乙酸乙酯(V/V,2:1)。收集到的含有目标化合物的部分合并，减压蒸馏除去溶剂，得到(R)-3-吡啶基乙酰甲醇纯品7.0mg，产率77.8％。HRESI-MS(负离子模式)m/z:150.0618(100％)[M-H]^-,理论值：151.0633；[α]²⁰ _D-164°(c 4.1,MeOH)。¹H-NMR(400MHz,CDCl₃)δ2.12(s,3H),2.23(s,1H,OH),5.43(s,1H),7.40(m,1H),7.83(d,1H,J＝7Hz),8.53(d,1H,J＝6Hz),8.78(s,1H)。

由于与受体底物吡啶甲醛具有相似的化学性质，我们可以预期，当采用以下的化合物作为受体底物时：

其中R为H、卤素(Cl、Br等)、硝基、羟基、烷氧基或者烃基，取代位置为甲酰基的邻位、间位或对位；仍能够很好地反应得到相应的类似产物

3)(R)-3-呋喃基乙酰甲醇制备：反应式如下。

2.0mL反应混合物中含有100mM HEPES缓冲液(pH 7.0)，1mM ThPP，5mM MgCl₂，60mM KCl，0.5mM DTT，50mM丙酮酸，30mM 3-呋喃甲醛及4％DMSO，80℃预孵育10min后加入200mg重组菌株Ecoli-Tm-AHAS-CSU引发反应并在同样的温度下继续孵育1小时。之后离心收集上清液，用氯仿萃取(2mL×3)，有机相合并后以少量无水MgSO₄干燥，过滤除去固形物，滤液于30℃下减压蒸干，所得残余物用硅胶柱进行纯化，洗脱剂为石油醚-乙酸乙酯(V/V,3:1)。收集到的含有目标化合物的部分合并，减压蒸馏除去溶剂，得到(R)-3-呋喃基乙酰甲醇纯品6.7mg，产率79.8％。HRESI-MS(负离子模式)m/z:139.0445(100％)[M-H]^-,理论值：140.0473；[α]²⁰ _D-123°(c 3.5,MeOH)。¹H-NMR(400MHz,CDCl₃)δ2.11(s,3H),2.30(s,1H,OH),5.33(s,1H),6.15(d,1H,J＝6),7.25(m,2H)。

由于与受体底物呋喃甲醛具有相似的化学性质，我们可以预期，当采用以下的化合物作为受体底物时：

其中R为H、卤素(Cl、Br等)、硝基、羟基、甲氧基或者烃基，取代位置为甲酰基的邻位或间位；仍能够很好地反应得到相应的类似产物

Claims

1.过表达海栖热袍菌乙酰乳酸合酶催化亚基的菌株的用途，其特征在于：所述用途是指该菌株直接用于立体选择性地催化合成R-苯基乙酰基甲醇(R-PAC)或其类似物，催化反应温度为70-90℃；所述类似物为以下三类中任意一种化合物：

第三类：R为H、卤素、硝基、羟基、甲氧基或者烃基，取代位置为甲酰基的邻位或间位；

所述过表达海栖热袍菌乙酰乳酸合酶催化亚基的菌株是经由以下步骤构建得到的：

上游引物：GGAATTCCATATGATGCTTCTGGACGAGATC

下游引物：CGCGGATCCTCATACTTTCCCCTCCCTAC

以上引物中，下划线部分为限制性内切酶的识别序列；

2.根据权利要求1所述的用途，其特征在于：步骤4)中，重组质粒pET28a-TmAHAS-CSU的转化方法具体如下：

4.1)所用E.coli感受态细胞为E.coli Rosetta(DE3)或E.coli BL21(DE3)；

4.2)取OD₆₀₀＝0.1-0.4的感受态细胞100-300μL，置于冰上缓慢融化；

3.采用权利要求1中所述的过表达海栖热袍菌乙酰乳酸合酶催化亚基的菌株催化合成R-苯基乙酰基甲醇(R-PAC)或其类似物的方法，其特征在于：

催化合成反应为

4.采用权利要求1中所述的过表达海栖热袍菌乙酰乳酸合酶催化亚基的菌株催化合成R-苯基乙酰基甲醇(R-PAC)或其类似物的方法，其特征在于：

催化合成反应为

5.采用权利要求1中所述的过表达海栖热袍菌乙酰乳酸合酶催化亚基的菌株催化合成R-苯基乙酰基甲醇(R-PAC)或其类似物的方法，其特征在于：

催化合成反应为：

6.根据权利要求3至5任一所述的催化合成R-苯基乙酰基甲醇(R-PAC)或其类似物的方法，其特征在于：

在1.0-3.0mL反应混合物中含有20-80mM供体底物、10-40mM受体底物、50-100mM pH7.0-8.5的HEPES或PBS或Tris-HCl缓冲液、0.5-5mM ThPP、1-10mM MgCl₂、50-100mM KCl、0.25-2.0mM DTT、以及1-20％DMSO；

上述反应混合物在70-90℃预孵育5-15min后，加入100-300mg重组菌株Ecoli-Tm-AHAS-CSU引发反应并在同样的温度下继续孵育0.5-3小时；

然后，离心收集上清液，用氯仿或乙酸乙酯萃取2-3次，有机相合并后以无水MgSO₄或无水Na₂SO₄干燥，过滤除去固形物，滤液于25-45℃下减压蒸干，所得残余物用硅胶柱进行纯化，洗脱剂为体积比3:1的石油醚-乙酸乙酯。