CN105154377B - 重组鸡白痢沙门菌、制备方法及应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种重组鸡白痢沙门菌、制备方法及应用，属于动物细菌基因工程技术领域。重组鸡白痢沙门菌的名称为鸡白痢沙门菌C79‑13ΔcrpΔasd(pYA3493‑HN)，保藏编号：CCTCC NO:M 2015305，其表达的鸡新城疫病毒保护性抗原基因‑HN基因是鸡新城疫病毒重要的免疫原性基因片段，具有良好的免疫保护性。重组菌株衍生于鸡白痢沙门菌标准菌株C79‑13，完全保留了C79‑13针对鸡白痢沙门菌的免疫效力，且其毒力比C79‑13更弱，具有良好的生物安全性，可同时提供针对鸡白痢沙门菌和鸡新城疫两种病原的保护力。同时，该重组菌株不含抗性标记，完全符合疫苗生物安全性要求。

Description

重组鸡白痢沙门菌、制备方法及应用

技术领域

本发明涉及一种重组鸡白痢沙门菌，具体涉及一种不含抗性标记的表达鸡新城疫病毒主要保护性抗原的减毒鸡白痢沙门菌，以及该重组鸡白痢沙门菌的制备方法和应用，属于动物细菌基因工程技术领域。

背景技术

沙门菌(Salmonella)是一种胞内寄生的革兰氏阴性肠道杆菌，具有侵袭性。最常见的沙门菌属有鼠伤寒沙门菌、猪霍乱沙门菌、肠炎沙门菌和鸡白痢沙门菌等。沙门菌对人和动物均有较强的致病力，可引起人体和动物的胃肠道疾病，沙门菌在外界环境中的生存力较强，在利用基因工程的方法致弱后，仍具有较强的侵袭力。

最初预防沙门菌的疫苗为全菌体灭活苗，但该类疫苗只能激发机体的体液免疫，且容易引起副作用，此外，还存在需多次免疫及无交叉保护等不足之处，因而不能广泛应用。此后，该领域众多学者模拟沙门菌肠道自然感染的方式，给动物口服减毒沙门菌，结果发现，可诱导机体产生更好的体液免疫和细胞免疫，因此该方法受到众多学者的普遍重视(Li,Q.,Hu,Y.,Xu,Y.,et al..2014.A gene knock-in method used to purify plasmidpSPI12from Salmonella enterica serovar Pullorum and characterization ofIpaJ.J Microbiol Methods,98,128-133.)。

由于肠炎伤寒沙门菌Ty21a及猪霍乱沙门菌疫苗菌株C500的致弱背景不清晰，各国研究者们尝试应用基因工程的方法，研究遗传背景清晰的伤寒减毒基因缺失疫苗株，用于口服免疫研究，例如cya/crp缺失株(Curtiss R,Goldschmidt RM,Fletchall NB,etal.1988.Avirulent Salmonella typhimurium delta cya delta crp oral vaccinestrains expressing a streptococcal colonization and virulence antigen,Vaccine,6(2):155-60.)、asd基因缺失株(Galán J E,Nakayama K,Curtiss IIIR.Cloning and characterization of theΔasd gene of Salmonella typhimurium:usein stable maintenance of recombinant plasmids in Salmonella vaccine strains[J].Gene,1990,94(1):29-35.)等。

减毒沙门菌除本身可作为疫苗外，也可作为载体来表达外源抗原基因。近年来，以减毒沙门菌为载体表达肿瘤、病毒、细菌、寄生虫等的外源保护性抗原基因，研制多联基因工程疫苗已成为该领域的研究热点，为研制新型基因工程疫苗开辟了新的途径(李正,程相朝.减毒沙门氏菌在疫苗和疫苗载体方面的研究进展[J].中国畜牧兽医，2012,01:40-44)。

以减毒沙门菌为载体的基因工程疫苗的优越性主要表现在(胡娇.猪霍乱沙门菌C500Δasd缺失株的构建及其作为疫苗活载体的初步应用[D].扬州大学,2010；Xu,F.,Ulmer,J.B.2003.Attenuated salmonella and Shigella as carriers for DNAvaccines.J Drug Target,11(8-10):481-488.)：

(1)能入侵机体的淋巴免疫系统，有效刺激机体的体液免疫及细胞免疫；

(2)既可携带原核重组表达质粒也可携带真核重组表达质粒；

(3)可通过口服、鼻内接种等自然感染途径，刺激黏膜淋巴细胞产生分泌型IgA，形成保护屏障，防止经黏膜感染的微生物对宿主细胞的侵袭及定殖；

(4)减毒沙门菌本身具有免疫佐剂的功能，免疫时无需加入额外的免疫佐剂，其脂多糖(LPS)是内在佐剂，LPS可刺激机体产生多种细胞因子，增强DC捕获并加工MHC-Ⅰ类抗原的能力，有助于进一步将抗原呈递给特异性淋巴B、T细胞；

(5)免疫具有持续性，减毒沙门菌入侵机体后，可在宿主体内生存并有限繁殖，因其已被减毒，最终可被宿主清除，只要减毒沙门菌在宿主体内存活，其重组质粒表达的外源蛋白就能对宿主产生连续性的刺激，从而省去了多次加强免疫所带来的麻烦；

(6)可将多种病原的不同保护性抗原基因或同种病原的不同抗原基因同时串联至表达质粒上，产生针对多种抗原的免疫反应，从而起到一种疫苗预防多种疾病的目的；

(7)重组减毒沙门菌疫苗表达的抗原蛋白不需要在体外提纯，减少了疫苗生产及加工处理程序，且易于储存和运输，疫苗成本较低；

(8)该疫苗接种方式简单，易于大规模接种，接种后可稳定表达外源基因。

鸡白痢沙门菌(Salmonella enteria serovar Pullorum,S.Pullorum)是引起鸡白痢的宿主特异性致病菌，多侵害20日龄以内雏鸡，发病率和致死率都很高。由于该菌能水平传播和垂直传播，给家禽养殖业带来严重的经济损失，中国农业部将其列为二类疫病。疫苗免疫预防被认为是防控该病的有效手段。近年来，人们对通过基因工程技术使沙门菌毒力减弱，进而将减毒沙门菌作为疫苗或疫苗活载体的途径愈感兴趣。沙门菌通过基因工程的方法减毒后，其对宿主的致病性大大降低，但仍可保留良好的侵袭力和免疫原性(XinZhang,Sandra M.Kelly,Wendy Bollen,Roy Curtiss III.1999.Protection and immuneresponses induced by attenuated Salmonella typhimuriumUK-1strains.MicrobialPathogenesis,26(3):121–130.)。

黏膜免疫与多价疫苗是未来免疫预防传染病的重要方向，以细菌为载体的重组活疫苗是最有发展前景的研究领域之一，特别是以减毒沙门氏菌作为活疫苗表达载体的研究更是受到了广泛的关注(Geng S.,Jiao,X.,Barrow,P.et al..2014.Virulencedeterminants of Salmonella Gallinarum biovar Pullorum identified by PCRsignature-tagged mutagenesis and the spiC mutant as a candidate liveattenuated vaccine,Vet Microbiol,168(2-4):388-394)。沙门氏菌属侵袭性胞内菌，可将外源质粒DNA直接呈递给抗原递呈细胞(APC)，携带质粒DNA的细菌在APC细胞内发生溶解或以宿主吞噬小体进入胞质，并将DNA释放到细胞核，从而使抗原基因在体内进行表达，并诱导相应的细胞免疫和体液免疫反应(Pham,O.H.,McSorley,S.J.2015.Protective hostimmune responses to Salmonella infection.Future Microbiology,10(1):101-110；Duerkop,B.A.,Vaishnava,S.,Hooper,L.V.2009.Immune responses to the microbiotaat the intestinal mucosal surface.Immunity,31(3):368-376)，已被证明是携带外源基因的良好载体(Nandre,R.M.,Lee,J.H.2014.Construction of a recombinant-attenuated Salmonella Enteritidis strain secreting Escherichia coli heat-labile enterotoxin B subunit protein and its immunogenicity and protectionefficacy against salmonellosis in chickens.Vaccine,32(3):425-431)。以前，人们通常将编码某种蛋白的基因克隆到一些质粒载体上，然后将其转化入某种减毒沙门氏菌中，依此途径来获得外源基因的表达。但遗憾的是，此种方法获得的重组沙门氏菌中外源抗原表达量较低，且常常遇到的另一个问题是在体内外源基因表达的不稳定。同时，该种方法获得的重组减毒沙门氏菌往往采用了携带抗性基因的表达质粒，以期作为重组菌在体内生长的主要遗传标记。近年来，出于生物安全的考虑，此类含有抗性选择系统的质粒已不再被人们所接受。

质粒平衡表达系统是解决上述问题的最佳途径。其中，效果最好、应用最多的是沙门氏菌的asd⁺平衡表达系统(Han,Y.W.,Kim,S.B.,Rahman,M.2011.Systemic and mucosalimmunity induced by attenuated Salmonella enterica serovar Typhimuriumexpressing ORF7of porcine reproductive and respiratory syndrome virus,CompImmunol Microbiol Infect Dis,34(4):335-345.)。asd基因编码的天冬氨酸β-半乳糖脱氢酶是合成二氨基庚二酸(DAP)所必需的酶，同时，DAP又是革兰阴性菌细胞壁主要化学成分肽聚糖四肽侧链的一个组分，因此，asd基因的突变株在无外源DAP条件下不能形成完好的细胞壁，最终溶菌死亡。同时，由于哺乳动物组织中不含DAP，因此突变菌在动物体内均被降解。将含有asd基因的重组质粒pYA3493-HN转化本发明所应用的Salmonella PullorumC79-13ΔcrpΔasd，质粒上的asd基因可与缺失突变菌形成互补，从而解决突变菌不能在DAP阴性环境中生存的问题。

新城疫(Newcastle disease,ND)是由新城疫病毒(Newcastle disease virus,NDV)引起的一种高度接触性、烈性传染病，给养禽业造成了巨大的经济损失，世界动物卫生组织(OIE)将其列为A类疾病(梅春升,周世霞,马立保.新城疫疫苗及其应用研究进展.国外畜牧学-猪与禽,2006:50-53)。该病广泛流行于世界许多国家，是当今全球范围内最严重的家禽传染病之一(Kaleta,E.,Baldauf,C.Newcastle disease in free-living and petbirds[M].In:Alexan-der,D.J.(Ed.),Newcastle Disease.Kluwer Acedemic Press,Boston,MA.1988,197-246.)。1926年，ND首次发现于印度尼西亚西爪哇地区，研究者Doyle于1927年首次在英国新城(Newcastle upon Tyen)附近的一次家禽流行病中分离到病毒，故随后命名该病毒为新城疫病毒(Kraneveld,F.Over een in Ned-Indie heerschendeZiete under het pluimves[J].Ned.Indisch Bl.Diergeneesk.1926(38),448-450；Doyle,T.A hitherto unrecorded disease of fowls due to filter passing virus[J].J.Comp.Pathol.Therap.,1927(40),144-169.)。随后，新城疫在世界各地包括韩国、印度、斯里兰卡、日本、澳大利亚和菲律宾相继爆发。历史上，由于新城疫曾爆发于印度Ranikhet地区，曾被称为Ranikhet病。

ND发生至今，给世界各国养禽业带来了巨大的经济损失，疫苗接种是预防ND的有效措施，世界各地的禽病研究者们为控制这一疾病，悉心探索，研制出了有效的灭活疫苗、弱毒疫苗和基因工程疫苗。疫苗的使用减少了ND对养禽业的影响(徐凤宇,李淑君,高云航,等.鹅新城疫新型疫苗研究进展[J].中国兽药杂志,2013,03:63-66)。目前较为常用的疫苗为弱毒苗和油乳灭活苗。相比之下，弱毒活疫苗价格低廉，免疫效果好，但易造成病毒在环境中的传播；灭活苗相对比较安全，但也存在免疫期较短，制作成本高和使用不便等缺点。随着新毒株的不断出现以及传统疫苗的种种缺陷，研制出更安全、经济、高效的新型疫苗成为当下新城疫疫苗研究的热点(宫晓,程增青,李陆梅,等.鸡新城疫疫苗研究及应用概况[J].湖北畜牧兽医,2013,09:65-67)。

NDV为禽副黏病毒I型(APMV-I)，属于副黏病毒科、腮腺炎病毒属，是禽I型黏附病毒(APMV-1)的重要成员(Cattoli G,Susta L,Terregino C,Brown C.Newcastle disease:a review of field recognition and current methods of laboratorydetection.Journal of veterinary diagnostic investigation[J].Officialpublication of the American Association of Veterinary LaboratoryDiagnosticians,Inc 2011,23(4):637-656)。NDV所编码的6种蛋白可根据其在病毒囊膜表面的分布位置不同，分为内部蛋白和外部蛋白。内部蛋白包括N、P和L，外部蛋白包括HN、F和M。其中内部蛋白与病毒基因组构成核衣壳，外部蛋白存在于病毒囊膜上。NDV编码蛋白的6种基因中有5种基因只编码专一蛋白，只有P基因可以同时编码三种蛋白(P蛋白、V蛋白和W蛋白)(Lamb,R.,Parks,G.Paramyxoviridae:the viruses and their replication[M].In:Knipe,D.M.,Howley.Fields Virology.,5th ed.Lippincott Williams&Wilkins,Philadelphia.2007,1449–1496；Steward,M.,Vipond,I.B.,Millar,N.S.,et al.RNAediting in Newcastledisease virus[J].J.Gen.Virol.1993,74(12),2539-2547)。其中P蛋白与L蛋白紧密结合成交叉样核糖核蛋白复合物，N蛋白与该复合物结合连同病毒基因组RNA组成病毒粒子的核心，非糖基化的基质蛋白位于包膜下方，负责病毒的装配与合成；F和HN蛋白为表面糖蛋白，可中和抗原，分别参与病毒与宿主细胞膜的吸附及融合过程，F和HN蛋白分别以三聚体和四聚体的纤突形式存在，长约8nm。

病毒囊膜表面的HN(haemagglutinin-neuraminidaseprotem,血凝素-神经氨酸酶蛋白)是该病毒的主要结构蛋白，与病毒的吸附、入侵有关。HN蛋白同时也是重要的宿主保护性蛋白，能诱导机体产生中和抗体，是研究新型新城疫基因工程疫苗的首选目的基因之一(Cheminay Cd,Hensel M.Rational design of Salmonella recombinant vaccines[J].International Journal of Medical Microbiology,2008,298(1-2):87-98)。目前，我国对于ND主要采用传统疫苗进行免疫预防，存在生产成本高、有残余毒力，不能刺激机体产生细胞免疫和黏膜免疫等问题。以减毒沙门菌为载体携带外源DNA疫苗的策略则为新城疫的高效免疫提供了可能(Shifeng Wang,Kong Q,Curtiss R.New technologies indeveloping recombinant attenuated Salmonella vaccine[J].Microb.Pathog.,2013,58(11):17-28)。

发明内容

本发明的目的是提供一种重组鸡白痢沙门菌，其为不含抗性标记的表达鸡新城疫病毒主要保护性抗原的减毒鸡白痢沙门菌。

其次，本发明提供一种上述重组鸡白痢沙门菌的制备方法。

再者，本发明提供一种上述重组鸡白痢沙门菌在制备基因工程疫苗中的应用。

最后，本发明提供一种采用了上述重组鸡白痢沙门菌的基因工程疫苗。

为了实现以上目的，本发明所采用的技术方案是：

重组鸡白痢沙门菌，其名称为鸡白痢沙门菌(Salmonella enteria serovarPullorum)C79-13ΔcrpΔasd(pYA3493-HN)，保藏编号：CCTCC NO:M 2015305，保藏日期：2015年5月15日，保藏单位：中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，保藏地址：中国.武汉.武汉大学(湖北省武汉市武昌珞珈山武汉大学保藏中心)。

上述不含抗性标记的表达鸡新城疫病毒主要保护性抗原的重组鸡白痢沙门菌缺失了沙门菌基因组中必需的细胞壁形成相关基因asd基因(需要含asd基因的质粒存在于菌体内或在外源添加DAP的培养基中才能正常生长、繁殖)，同时携带有含鸡新城疫病毒HN基因的质粒pYA3493-HN，该重组菌保留了亲本株C79-13Δcrp作为鸡白痢沙门菌减毒疫苗候选菌株的免疫特性，由于需要pYA3493-HN存在重组菌株才能存活，因此大大提高了质粒pYA3493-HN(也就是HN基因)在重组菌株中的稳定性，使得质粒pYA3493-HN能在该重组菌株中稳定表达asd基因，且能够稳定表达鸡新城疫病毒HN蛋白。而asd基因表达产物提供沙门菌株必需的细胞壁形成相关成分，HN基因表达产物提供良好的针对鸡新城疫病毒的免疫原性，使之具有良好的免疫保护力。

重组鸡白痢沙门菌(CCTCC NO:M 2015305)的制备方法，包括以下步骤：

1)原核表达质粒pET-32a-HN的构建：将新城疫病毒HN基因克隆至原核表达载体pET-32a；

2)重组质粒pYA3493-HN的构建：将构建正确的原核表达质粒pET-32a-HN进行双酶切，并与经相同双酶切的穿梭质粒pYA3493连接，转化至大肠杆菌，并筛选阳性克隆；

3)重组鸡白痢沙门菌的构建：将重组质粒pYA3493-HN转化至减毒鸡白痢沙门菌C79-13ΔcrpΔasd缺失株中，即得。

步骤1)中新城疫病毒HN基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

步骤2)中双酶切为Bam H I和HindⅢ双酶切。

步骤3)中减毒鸡白痢沙门菌C79-13ΔcrpΔasd缺失株由河南科技大学动物疫病与公共卫生重点实验室构建并保存，已在《鸡白痢沙门菌C79-13ΔcrpΔasd平衡致死系统的构建及其生物学特性的研究.中国免疫学杂志》(陈松彪,李静,尚珂等.中国免疫学杂志,2014,08(017):1083-1087)一文中公开，公众可向河南科技大学动物疫病与公共卫生重点实验室申请获得，自申请日起二十年内有效。

重组鸡白痢沙门菌(CCTCC NO:M 2015305)在制备疫苗(或基因工程疫苗)中的应用，可将重组鸡白痢沙门菌与医药领域常规采用的载体混合制备。例如，从重组鸡白痢沙门菌培养液中收集菌体，与脱脂奶粉(50％)混合(菌体与脱脂奶粉的体积比2:1)，冷冻干燥，即得。

疫苗(或基因工程疫苗)，其包含重组鸡白痢沙门菌(CCTCC NO:M 2015305)。

本发明的有益效果：

本发明中重组鸡白痢沙门菌(CCTCC NO:M 2015305)表达的鸡新城疫病毒保护性抗原基因-HN基因是鸡新城疫病毒重要的免疫原性基因片段，具有良好的免疫保护性。重组菌株衍生于鸡白痢沙门菌标准菌株C79-13，完全保留了C79-13针对鸡白痢沙门菌的免疫效力，且其毒力比C79-13更弱，具有良好的生物安全性，可同时提供针对鸡白痢沙门菌和鸡新城疫两种病原的保护力。同时，该重组菌株不含抗性标记，完全符合疫苗生物安全性要求。

本发明利用asd基因缺失的鸡白痢沙门菌减毒疫苗株C79-13ΔcrpΔasd构建重组菌株，将含有能够原核表达鸡新城疫病毒HN基因的重组质粒pYA3493-HN转至C79-13ΔcrpΔasd基因缺失株中，正阳重组质粒与C79-13ΔcrpΔasd基因缺失株形成互补，满足细菌生长需要，进而稳定共存，形成不含抗性标记并能表达鸡新城疫病毒保护性抗原的重组菌株C79-13ΔcrpΔasd(pYA3493-HN)。

本发明中重组鸡白痢沙门菌可用于制备针对鸡白痢沙门菌和鸡新城疫的二联基因工程疫苗，与现有的弱毒苗及(佐剂)灭活苗相比，具有制备过程简单、省时，且易于储存运输的特点，显著降低了疫苗的生产成本。并且，目前市场上各种商品化鸡新城疫疫苗的免疫效果普遍较差，而新城疫病毒危害日益严重，采用该重组菌株制成的基因工程疫苗将具有广阔的市场应用前景。

保藏证明和存活证明说明

保藏菌株：鸡白痢沙门菌C79-13ΔcrpΔasd(pYA3493-HN)(Salmonella enteriaserovar Pullorum C79-13ΔcrpΔasd(pYA3493-HN))，保藏编号：CCTCC NO:M 2015305，保藏日期：2015年5月15日，保藏单位：中国典型培养物保藏中心(简称：CCTCC)，保藏地址：中国.武汉.武汉大学(湖北省武汉市武昌珞珈山武汉大学保藏中心)。

附图说明

图1为实施例1中能够原核表达的鸡新城疫保护性抗原基因片段构建流程图；

图2为重组沙门菌所用的穿梭质粒pYA3493的图谱；

图3为重组菌质粒pYA3493-HN的PCR鉴定图；

图4为重组菌质粒pYA3493-HN的酶切鉴定结果电泳图；

图5为重组菌C79-13ΔcrpΔasd(pYA3493-HN)的构建流程图；

图6为重组菌C79-13ΔcrpΔasd(pYA3493-HN)的PCR鉴定图；

图7为重组菌C79-13ΔcrpΔasd(pYA3493-HN)中沙门菌invA基因扩增图；

图8为SDS-PAGE及Western blotting法检测重组菌C79-13ΔcrpΔasd(pYA3493-HN)中蛋白的表达；

图9为重组菌C79-13ΔcrpΔasd(pYA3493-HN)、亲本株C79-13ΔcrpΔasd和野生株C79-13的生长曲线图；

图10为重组菌C79-13ΔcrpΔasd(pYA3493-HN)的遗传稳定性试验结果；

图11为重组菌C79-13ΔcrpΔasd(pYA3493-HN)在免疫雏鸡后针对新城疫病毒的HI抗体水平的检测结果；

图12为重组菌C79-13ΔcrpΔasd(pYA3493-HN)在免疫雏鸡后针对沙门菌血清IgG抗体水平的检测结果；

图13为重组菌C79-13ΔcrpΔasd(pYA3493-HN)免疫雏鸡后总sIgA抗体水平的检测。

具体实施方式

下述实施例仅对本发明作进一步详细说明，但不构成对本发明的任何限制。

实施例1

本实施例中重组鸡白痢沙门菌的名称为鸡白痢沙门菌C79-13ΔcrpΔasd(pYA3493-HN)(Salmonella enteria serovar Pullorum C79-13ΔcrpΔasd(pYA3493-HN))，保藏编号：CCTCC NO:M 2015305，保藏日期：2015年5月15日，保藏单位：中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，保藏地址：中国.武汉.武汉大学。

重组鸡白痢沙门菌的制备方法，包括以下步骤：

(1)制备能够原核表达的鸡新城疫保护性抗原HN蛋白的基因片段

a.制备原核表达质粒pET-32a-HN所需的引物设计，其序列如下表1所示。

表1制备原核表达质粒pET-32a-HN所需的引物序列

表1中引物的下划线部分为酶切位点。

其中，引物序列pH1如SEQ ID NO.2所示，引物序列pH2如SEQ ID NO.3所示。

b.制备能够原核表达的HN片段

利用刘一尘构建的pMD18-T-HN(刘一尘.鸡IL-18变构基因与新城疫病毒HN基因融合表达载体的构建及体外抗马立克病肿瘤细胞的研究[D].四川农业大学,2008.)为模板，通过PCR扩增出HN基因。HN基因片段的PCR扩增体系为：10×PCR Buffer 2.5μL；dNTPs各(200umol/L)1μL；rTaq酶2U/μL；上游引物/下游引物各100pmol；Mg²⁺1.5mmol/L0.5μL；模板(PMD18-T-HN)2μg；加ddH₂O至25μL；PCR扩增程序为：94℃4min；94℃1min；69.5℃1min 30s；72℃1min 40s；30个循环；72℃5min。

扩增完成后，取PCR产物5μL，加入1μL 6×Loading Buffer，用0.8％的琼脂糖凝胶(含EB)进行电泳，电泳参数为：电压80V，电流25mA，电功率2w，观察电泳结果。电泳后用AxyPrep DNA凝胶回收试剂盒进行目的基因回收和纯化(按照该试剂盒的说明书操作)。将纯化后的HN基因片段与原核表达载体pET-32a分别进行Bam H I和HindⅢ双酶切(反应体系25μL；其中10×Buffer K 2.5μL；目的基因和载体分别为20.5μL；BamH I 1μL；HindⅢ1μL；37℃，4h)，0.8％的琼脂糖凝胶电泳回收(电压80V，电流25mA，电功率2w)，利用T4DNA连接酶连接(连接体系为10μL，其中pET-32a 3μL；T4DNA连接酶2μL；HN基因片段5μL；16℃，4h)后，采用常规的热击法转化大肠杆菌表达宿主菌BL21(DE3)。挑选阳性单菌落扩大培养提取质粒，进行PCR(扩增体系为：10×PCR Buffer2.5μL；dNTPs各(200umol/L)1μL；rTaq酶2U/μL；上游引物/下游引物各100pmol；Mg2+1.5mmol/L 0.5μL；模板(PMD18-T-HN)2ug；加ddH₂O至25μL；扩增程序为：94℃4min；94℃1min；69.5℃1min 30s；72℃1min 40s；30个循环；72℃5min)、双酶切(反应体系25μL，其中10×Buffer K 2.5μL；重组质粒为20.5μL；BamH I 1μL；HindⅢ1μL；37℃，4h)和测序鉴定，最终得到能够原核表达鸡新城疫HN基因片段，基因片段长度为1713bp(如SEQ ID NO.1所示)。能够原核表达的鸡新城疫保护性抗原基因片段构建流程图见图1。

(2)重组质粒pYA3493-HN的构建与鉴定

将带有Bam H I、HindⅢ酶切位点的重组质粒pET-32a-HN和穿梭质粒pYA3493(穿梭质粒pYA3493的图谱见图2)进行双酶切(反应体系25μL，其中10×Buffer K 2.5μL；质粒20.5μL；BamH I 1μL；HindⅢ1μL；37℃，4h)，回收酶切产物，利用T4DNA连接酶连接(连接体系为10μL，其中pYA34933μL；T4DNA连接酶2μL；HN基因片段5μL；16℃，4h)后，采用常规的热击法转化asd基因缺失的大肠杆菌χ6097(由华中农业大学转赠)，筛选阳性克隆，提取质粒，经PCR(扩增体系为：10×PCR Buffer 2.5μL；dNTPs各(200umol/L)1μL；rTaq酶2U/μL；上游引物/下游引物各100pmol；Mg2+1.5mmol/L0.5μL；模板(PMD18-T-HN)2ug；加ddH₂O至25μL；扩增程序为：94℃4min；94℃1min；69.5℃1min 30s；72℃1min 40s；30个循环；72℃5min)和双酶切鉴定(反应体系25μL，其中10×Buffer K 2.5μL；重组质粒为20.5μL；BamH I 1μL；HindⅢ1μL；37℃，4h)，最终得到构建正确的重组质粒pYA3493-HN。重组菌质粒pYA3493-HN的PCR鉴定图见图3。其中，M：DNA Marker(DL 2 000)；1：阴性对照；2-3：pYA3493-HN。重组菌质粒pYA3493-HN的酶切鉴定结果电泳图见图4。其中，M：DNA Marker(DL 5 000)；1-2：Bam HI+HindⅢ双酶切pYA3493-HN。其中，PCR扩增体系及扩增条件如步骤(1)所述。

(3)表达鸡新城疫病毒HN蛋白的重组沙门菌菌株C79-13ΔcrpΔasd(pYA3493-HN)的构建与鉴定

a.鉴定重组的沙门菌C79-13ΔcrpΔasd(pYA3493-HN)所需引物的设计，其DNA序列如下表2所示。

表2鉴定重组沙门菌C79-13ΔcrpΔasd(pYA3493-HN)所需引物的DNA序列

其中，引物序列pi1如SEQ ID NO.4所示，引物序列pi2如SEQ ID NO.5所示。

b.重组沙门菌C79-13ΔcrpΔasd(pYA3493-HN)的构建及鉴定

将鉴定正确的重组质粒pYA3493-HN电转至缺失菌株C79-13ΔcrpΔasd感受态细胞中，基因导入仪(SCIENTZ-2C)电击参数设置：电压2000V、电阻200Ω、电容25μF、放电时间4-6ms，构建流程图见图5。在DAP阴性平板上，挑取单菌落于LB液体培养基中培养12h，以培养菌液为模板，分别以表1中所示的pH1/pH2为引物，进行目的片段的扩增；再用沙门菌特异基因invA基因(GenBank:M90846.1)的特异性引物pi1/pi2(见表2)对重组沙门菌特异性鉴定。结果表明含有pYA3493-HN质粒的重组鸡白痢沙门菌构建正确，将其命名为鸡白痢沙门菌菌株(S.Pullorum)C79-13ΔcrpΔasd(pYA3493-HN)，并送交中国典型培养物保藏中心(CCTCC)用于专利程序的保藏。重组菌C79-13ΔcrpΔasd(pYA3493-HN)的PCR鉴定图见图6。其中，M：DNA Marker(DL 2 000)；1-2：C79-13ΔcrpΔasd(pYA3493-HN)。重组菌C79-13ΔcrpΔasd(pYA3493-HN)中沙门菌invA基因扩增图见图7。其中，M：DNA Marker(DL 1 000)；1：阴性对照；2-5：C79-13ΔcrpΔasd(pYA3493-HN)中的invA基因扩增。

实施例2

本实施例中重组鸡白痢沙门菌(CCTCC NO:M 2015305)在制备基因工程疫苗中的应用，包括：将重组菌C79-13ΔcrpΔasd(pYA3493-HN)在LB固体培养基上划线培养，挑取单菌落于LB液体培养基，培养至活菌浓度达到2.5×10¹⁰CFU/mL。将菌液低速离心收集菌体，按照沙门菌C79-13ΔcrpΔasd(pYA3493-HN)：50％脱脂奶粉(体积：体积)为2：1的比例混合。按1.5mL/每瓶的量进行分装，置真空冷冻干燥机中冻干，冻干后进行压盖，储存于-20℃，备用。

试验例

1、表达鸡新城疫病毒HN蛋白的重组沙门菌菌株C79-13ΔcrpΔasd(pYA3493-HN)的生物学特性

(1)重组菌C79-13ΔcrpΔasd(pYA3493-HN)的表达特性分析

分别挑取重组菌C79-13ΔcrpΔasd(pYA3493-HN)单菌落和ΔcrpΔasdC79-13(pYA3493)的单菌落于4mL LB液体培养基中，37℃、180r/min培养12h，4℃放置12h，按1:100的比例转接LB液体培养基继续培养6h，8000r/min离心10min收集菌体。菌体经PBS洗涤后重悬于0.1mL PBS中，加入等体积的2×SDS上样缓冲液，混匀后煮沸5min进行全菌体SDS-PAGE，并进一步进行Western Blotting分析。第一抗体为鸡抗NDV阳性血清(1:500稀释)，第二抗体为AP标记兔抗鸡IgG(1:3 000稀释)，同时设含空质粒pYA3493的C79-13ΔcrpΔasd为对照。结果显示本发明的重组菌能够表达HN蛋白(见图8中A)，且表达蛋白能够与鸡NDV阳性血清发生特异性反应(见图8中B)，HN蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.6所示。图8A中，M：蛋白分子质量标准；1-3:重组菌表达；4:空载体对照。图8B中，M：蛋白分子量标准；1-2：重组菌的表达；3：空载体对照。

(2)重组菌C79-13ΔcrpΔasd(pYA3493-HN)的生长特性鉴定

分别挑取重组菌株C79-13ΔcrpΔasd(pYA3493-HN)及其亲本菌株C79-13ΔcrpΔasd和野生株C79-13单菌落接种于相应的液体培养基中进行培养，菌液用无菌PBS连续10倍稀释，选3个合适的稀释度取100μL均匀涂于相应的固体板上，每个稀释度重复3次，培养后进行计数，取其平均值计算母液细菌浓度。菌液以终浓度均为10⁶CFU/mL进行转接，连续培养12h，每隔1h测定波长为600nm的光密度(OD)值，绘制3种菌的生长曲线，以观察重组菌的生长特性。从重组菌的生长曲线(见图9)可以看出，重组菌C79-13ΔcrpΔasd(pYA3493-HN)、亲本菌株C79-13ΔcrpΔasd在培养过程中，生长状态与野生株C79-13基本相似，只是生长速度稍慢于野生鸡白痢沙门菌。

(3)重组菌C79-13ΔcrpΔasd(pYA3493-HN)的表型鉴定

将重组菌株C79-13ΔcrpΔasd(pYA3493-HN)及其亲本株C79-13ΔcrpΔasd和野生株C79-13分别活化培养，然后将各菌株分别转接于含阿拉伯糖、葡萄糖、乳糖、麦芽糖、甘露醇、山梨醇、蔗糖、鼠李糖及木糖相应培养基以观察其对糖类的发酵情况，并通过VP试验、MR试验、H₂S产生试验进一步研究其它生化特性。结果显示，重组菌C79-13ΔcrpΔasd(pYA3493-HN)在DAP阴性平板上生长良好，表明重组质粒pYA3493-HN在C79-13ΔcrpΔasd菌株内能够表达DAP并与C79-13ΔcrpΔasd形成互补，进一步的生化鉴定结果显示，重组菌株的生化特性与野生株C79-13相比发生了明显改变，但与C79-13ΔcrpΔasd基本保持一致，即其失去了利用葡萄糖、阿拉伯糖、麦芽糖、山梨醇和木糖等碳源的能力，也不能分解H₂S。

(4)重组菌C79-13ΔcrpΔasd(pYA3493-HN)的遗传稳定性

将重组菌C79-13ΔcrpΔasd(pYA3493-HN)在LB固体板上划线培养，挑取单菌落于LB液体培养基中培养，按1:100的比例转接到LB液体培养基中培养，连续转接60次。培养产物每隔10次用表1所述的引物pH1/pH2进行PCR扩增鉴定，PCR扩增体系鸡扩增条件如实施例1所述，检测重组质粒pYA3493-HN在C79-13ΔcrpΔasd中的遗传稳定性。鉴定结果表明，均可从各次转接培养产物中扩增储1713bp的特异性DNA条带(见图10)。图10中，M：DNA Marker(DL 2 000)；1-7：分别问C79-13ΔcrpΔasd(pYA3493-HN)转接第10次、20次、30次、40次、50次、60次和70次的PCR鉴定结果；8：阴性对照。

2、以雏鸡为动物模型分析重组菌的免疫原性

(1)雏鸡免疫试验设计

各试验组鸡只在免疫前分别随机选取3只进行血清母源抗体检测，待喂养5日，母源抗体降到4Log₂以下的相似值后，进行统一口服免疫。将5～6日龄的雄性雏鸡120只随机分成4组，每组30只。菌株免疫剂量参考前期毒力学试验结果，选择攻毒后鸡群无死亡且脏器无明显病变的剂量。按下表3进行分组和免疫，首先对雏鸡进行处理，在免疫前12h，对雏鸡禁食和禁水，然后用200μL 10％的NaHCO₃溶液进行灌胃，中和鸡体内的胃酸，从而减少胃酸对细菌的杀伤。灌胃30min后开始免疫。分别于免疫后7d、14d、21d、28d、35d扑杀鸡只，进行采血、收集小肠冲洗液，HI及间接ELISA方法检测抗体水平(HI、IgG和IgA抗体)，具体操作步骤如下所述。

表3雏鸡免疫试验分组

1.1血凝抑制试验(HI)检测雏鸡血清中HI抗体水平

取洗干净并晾干的96孔板，自左向右每孔加入50μL生理盐水；用微量移液器吸取被检血清液50μL加入第1孔，混匀后吸出50μL加入第2孔中，依次类推稀释至第10孔，并从中弃去50μL，血清稀释度一次为1:2¹～2¹⁰；除第11孔做为红细胞对照组不加抗原外，其余每孔加入50μL四单位抗原；轻微震荡后静置20min；每孔再加0.5％红细胞悬液50μL，轻轻震荡混匀，静置30min后观察结果。

1.2免疫鸡血清沙门菌IgG抗体水平的测定

抗原的制备：从超低温冰箱中取出S.Pullorum C79-13并进行活化培养，将培养好的菌液离心，收集菌体并用PBS洗涤，然后用PBS按1:50的比例浓缩菌液，浓缩后的菌液经超声破碎至菌液澄清，用分光光度计测定其OD值，并通过公式：蛋白浓度(mg/mL)＝1.45×OD_280nm-0.74×OD_260nm，计算蛋白含量，用PBS适量稀释该菌体蛋白溶液，并选择合适的浓度作为包被抗原，-20℃储存备用。运用“棋盘法”确定血清抗体最佳稀释度。

具体操作步骤如下：

a.包被：用包被液将制备好的鸡白痢沙门菌C79-13抗原以合适的稀释倍数进行稀释，包被96孔板，每孔包被100μL，4℃过夜；

b.洗涤：吸弃包被液，每孔中加入100μL洗涤液，浸泡2min后，弃液，重复洗涤3次；

c.封闭：每孔加入封闭液100μL，37℃放置2h；

d.洗涤：吸弃封闭液，同上述洗涤方法，重复洗涤3次；

e.一抗孵育：每孔加入血清抗体100μL，37℃放置2h；

f.洗涤：甩干孔中的液体，重复洗涤5次；

g.二抗孵育：每孔加入HRP标记的兔抗鸡IgG(稀释倍数为1:3 000)100μL，37℃放置2h；

h.洗涤：甩干孔中的液体，重复洗涤5次；

i.显色：每孔加入100μL TMB底物显色液，避光反应10min；

j.终止：每孔加入100μL终止液，用酶标仪测量其OD_450nm值。

1.3免疫鸡消化道粘膜sIgA抗体水平的测定

免疫后7d、14d、21d、28d、35d随机挑选3只试验鸡，参照已有文献(张淼丹,张明亮,张俊峰,等.表达PRRSV GP5蛋白重组减毒猪霍乱沙门菌C78-1的构建及生物学特性[J].中国兽医科学,2013,09:975-981.)的方法，扑杀鸡只并采集其完整的小肠，剪成小段，去除胰腺和多余的脂肪并挤出内容杂物，用含含100μg/mL PMSF的PBS缓冲液灌洗小肠。10 000×g离心1min收集小肠液并制备免疫雏鸡及对照的小肠样本，-70℃的环境下备用保存备用；采用黏膜免疫ELISA试剂盒检测方法来检测免疫鸡只肠道冲洗液sIgA水平。

检测前准备工作：

a.提前取出试剂盒，使其温度平衡至室温；

b.用ddH₂O稀释(1:25)浓缩洗涤液；

c.将标准品离心后，加入1.0mL样品稀释液，待其充分溶解后(浓度为10ng/mL)，进行倍比稀释，样品稀释液作为空白孔(0ng/mL)。

操作步骤：

a.加样：除空白孔外，其余孔相应加入加100μL标准品或待测样品，加样时将样品加至孔底部，轻微震荡混匀，酶标板加膜，37℃放置1.5h；

b.弃去孔内液体，每孔加入100μL现配制的生物素化抗体工作液，酶标板加膜，37℃放置1h；

c.弃去孔内液体，洗涤3次，最后一次洗涤后拍干孔内液体；每孔加酶结合物工作液100μL(使用前15min内配置)，酶标板加上覆膜，37℃孵育0.5h；

d.弃去液体，洗涤5次，方法同上；

e.每孔加入100μL TMB底物显色液，37℃避光静置15min；

f.每孔加终止液50μL，终止反应；

g.提前打开酶标仪预热，设置好检测波长，测量OD_450nm值。

检测结果如下：

①HI抗体水平检测结果：C79-13ΔcrpΔasd(pYA3493-HN)重组菌株免疫雏鸡后，在一定时期内可以有效刺激机体新城疫HI抗体水平的增长，增长幅度较IV系疫苗免疫组偏低，但差异不明显，两组均显示免疫后21d时抗体水平达到最高值，之后两周开始缓慢降低(见图11)。

②免疫雏鸡血清沙门菌IgG抗体水平检测结果：以S.Pullorum C79-13菌体蛋白作为抗原，运用间接ELISA方法检测重组菌株C79-13ΔcrpΔasd(pYA3493-HN)免疫血清IgG抗体水平。经试验得出最佳抗原包被浓度为2mg/mL，最佳抗体稀释度为100倍稀释。ELISA结果表明，重组菌株C79-13ΔcrpΔasd(pYA3493-HN)免疫组与C79-13Δcrp免疫组均能诱导有效的体液免疫反应，其OD值与PBS对照组相比，在免疫后第21d均呈差异极显著(P<0.01)，且产生的IgG抗体水平基本相似。这表明异重组菌株依然保持良好的沙门菌的体液免疫反应(见下表4及图12)。

表4免疫鸡只血清中抗沙门菌IgG抗体的检测

③免疫鸡消化道粘膜sIgA抗体水平检测结果：重组菌株C79-13ΔcrpΔasd(pYA3493-HN)可诱导机体产生良好的粘膜抗体(见图13)。免疫后第14d可检测到sIgA抗体，且该抗体的分泌量在第21d达到最高水平。重组空载体菌株与重组菌株抗体水平相当，均略低于新城疫Ⅳ系疫苗组。

3、重组菌株的初步临床保护效果观察

(1)重组疫苗菌株对雏鸡的安全性试验

从某种鸡场购买200只雏公鸡，以1.0×10⁹CFU的免疫剂量，口服免疫本发明制备的冻干重组减毒沙门菌疫苗，连续观察7d，发现免疫前后雏鸡并无体征和神经变化，说明本发明制备的冻干将重组减毒沙门菌疫苗是安全的。

(2)实施例2制备的冻干减毒沙门菌疫苗对雏鸡的免疫保护试验

对上述免疫鸡群，每组选择10只鸡，在免疫后第21天，用S.Pullorum菌野生株C79-13对该两组鸡只进行攻毒，口服攻毒剂量为10⁸CFU/mL(100倍LD₅₀)；选择C79-13ΔcrpΔasd(pYA3493-HN)、Ⅳ系及PBS免疫组的鸡只，每组选择10只鸡，在免疫后第21天，用F₄₈E₈株NDV液(500μL 10³ELD₅₀)(Sawant PM,Verma PC,Subudhi PK,et al.Immunomodulation ofbivalent Newcastle disease DNA vaccine induced immune response by co-deliveryof chicken IFN-gamma and IL-4genes[J].Veterinary immunology andimmunopathology 2011,144(1-2):36-44.)对该三组鸡只进行攻毒。攻毒后每天到鸡舍观察并记录鸡只的精神状态、发病和死亡情况，评价免疫效果(见下表5)。

表5重组菌株C79-13ΔcrpΔasd(pYA3493-HN)抵抗NDV F₄₈E₈感染的免疫保护力

免疫后21天，以口服的方式进行攻毒S.Pullorum C79-13，连续观察14天，评价重组菌免疫鸡群对S.Pullorum的免疫保护作用。观察结果显示，重组菌株C79-13ΔcrpΔasd(pYA-HN)后，能100％抵抗野生株的感染；PBS对照组的存活率为零，该重组菌株对野生株的攻毒感染起到了较高免疫保护作用。

在图9、图11、图12、图13中，重组菌株C79-13ΔcrpΔasd(pYA3493-HN)简写为C79-13ΔcrpΔasd(pYA-HN)。

Claims (5)

1.重组鸡白痢沙门菌，其特征在于：其为鸡白痢沙门菌C79-13∆crp∆asd(pYA3493-HN)，保藏编号：CCTCC NO: M 2015305。

2.如权利要求1所述的重组鸡白痢沙门菌的制备方法，其特征在于：包括以下步骤：

1）原核表达质粒pET-32a-HN的构建：将新城疫病毒HN基因克隆至原核表达载体pET-32a；所述新城疫病毒HN基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；

2）重组质粒pYA3493-HN的构建：将构建正确的原核表达质粒pET-32a-HN进行双酶切，并与经相同双酶切的穿梭质粒pYA3493连接，转化至大肠杆菌，并筛选阳性克隆；

3）重组鸡白痢沙门菌的构建：将重组质粒pYA3493-HN转化至减毒鸡白痢沙门菌C79-13Δcrp∆asd缺失株中，即得。

3.根据权利要求2所述的重组鸡白痢沙门菌的制备方法，其特征在于：步骤2）中双酶切为Bam H I和Hind Ⅲ双酶切。

4.如权利要求1所述的重组鸡白痢沙门菌在制备疫苗中的应用。

5.疫苗，其特征在于：其包含如权利要求1所述的重组鸡白痢沙门菌。

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