CN105147667B - Skp1癌蛋白及其靶向药物在肿瘤治疗中的应用 - Google Patents

Abstract

Skp1癌蛋白及其靶向药物在肿瘤治疗中的应用。用于制备肿瘤靶向药物的方法包括：筛选能够有效降低Skp1肿瘤蛋白高表达的化合物；以及利用所述化合物制备相应的肿瘤靶向药物。根据本发明的肿瘤靶向药物通过结合Skp1抑制SCF E3连接酶活性，能够抑制肿瘤细胞增殖及细胞周期从而达到抗肿瘤效果。

Description

Skp1癌蛋白及其靶向药物在肿瘤治疗中的应用

技术领域

本发明属于医药领域，涉及公开一种新型癌蛋白Skp1(S-phase kinase-associated protein 1,中文名S期激酶相关蛋白1)及其靶向药物，更具体的涉及能靶向Skp1的化合物(Evodiamine，Liriodenine,6-O-angeloylplenolind等)即以下所述式I化合物)在治疗肿瘤性疾病中的应用。

背景技术

肿瘤是威胁人类健康的头号杀手。2012年世界范围内约新增1410万癌症病例，共有820万癌症死亡病例和3260万癌症患者(5年内诊断)，并且这些数字仍在持续增长中。随着现代医学的发展，人们逐渐认识到肿瘤的形成、发展是由于癌基因突变或者过表达造成的，由此发现促进癌症发生发展的癌蛋白并开发相应的小分子靶向药物，在肿瘤治疗中具有关键作用。

目前靶向治疗药物在肿瘤的治疗中已取得显著的效果。例如，吉非替尼和厄洛替尼是靶向EGFR(表皮生长因子受体)的小分子化合物，可以有效抑制EGFR的磷酸化，已成为肺癌临床治疗的一线药物；STI-571(格列卫)是靶向Bcr-Abl的酪氨酸激酶竞争性抑制剂，目前已经成为治疗慢性髓样白血病(CML)病人的一线用药。但这些激酶抑制剂在治疗过程中会由于激酶蛋白突变而出现耐药，导致治疗失败。因此，迫切需要发现新的治疗靶点并开发新的靶向治疗药物以改善患者预后。

Skp1-Cul1-F-盒蛋白(SCF)复合体在蛋白质的泛素化修饰和降解中发挥重要作用。SCF复合体由Skp1、Cullin1、F-盒蛋白及Rbx1四部分组成，其中Cullin1、多种F-box蛋白、Rbx1已经发现在肺癌等多种癌症中过表达。由于F-box蛋白负责特异底物的识别，其在癌症发生发展中的功能以及特异靶向药物研究也最为广泛。目前研究最为清楚的F-box蛋白包括Skp2、Fbxw7、β-TrCP等。Skp2与β-TrCP在许多肿瘤组织中高表达，而且与肿瘤的转移以及预后密切相关，而Fbxw7具有一定的抑癌作用。NIPA也属于F-box蛋白，可以调控cyclinB1的降解参与细胞周期有丝分裂进程的调控，但其在肿瘤中的作用尚不清楚。研究还发现，特异性靶向Skp2的抑制剂对一些肿瘤细胞具有细胞毒作用，但迄今没有报道Skp1能否做癌症的治疗靶点。

发明内容

发明人首次使用免疫印迹技术(Western blot)，对56例病人的癌及癌旁正常组织进行了Skp1表达检测，结果发现，Skp1蛋白在这些肺癌病人肿瘤组织中的表达显著高于其对应的癌旁正常组织，高表达率为33/56(58.9％)；用免疫组化技术对这些标本进行检测，验证了Western blot检测的结果。进一步分析发现，Skp1在肺癌中的表达水平与病人的生存期成负相关，Skp1高表达患者的生存期显著短于Skp1低表达的病人。

进一步，发明人利用高通量分子对接计算模拟方法筛选靶向Skp1的小分子化合物，发现30个可以与Skp1结合而影响其功能的抑制剂，并研究了其中3个与Skp1结合能量值较高的小分子化合物的抗癌作用及分子机理。发明人发现，3个代表性的化合物吴茱萸碱(Evodiamine)、鹅掌秋碱(Liriodenine),6-氧-安杰莱普诺啉(6-O-angeloylplenolin，简称6-OAP)通过结合Skp1、影响Skp1与F-box蛋白的相互作用，显示显著的抗肿瘤作用。这3个化合物可以有效降低F-box蛋白稳定性；上述F-box蛋白包括但不限于Skp2、NIPA等F-box蛋白。

一方面，本发明提供了Skp1作为一种新的癌蛋白与肿瘤病人的预后显著负相关的分子标记。其中，所述肿瘤为包括但不限于肺癌、多发性骨髓瘤、头颈部鳞状细胞癌、前列腺癌、肝癌、食道癌、胃癌、结肠癌、黑色素瘤、白血病、淋巴瘤、直肠癌、脑瘤、皮肤癌。

另一方面，本发明提供的如结构式Ⅰ所示的小分子化合物在制备预防、治疗与Skp1高表达相关的肿瘤疾病的药物中的应用。本发明证明了Evodiamine，Liriodenine,6-O-angeloylplenolin可以特异性的结合Skp1，并显著干扰Skp1与F-box蛋白相互作用，进一步抑制SCF E3连接酶NIPA、Skp2、β-TrCP等的活性，导致其相应底物Cyclin B1、p27、IκBα等的累积，从而显著抑制肿瘤细胞增殖，抑制细胞周期，使癌细胞有丝分裂受到抑制，产生显著的抗肿瘤功能。其中，所述肿瘤为包括但不限于肺癌、多发性骨髓瘤、头颈部鳞状细胞癌、前列腺癌、肝癌、食道癌、胃癌、结肠癌、黑色素瘤、白血病、淋巴瘤、直肠癌、脑瘤、皮肤癌。

再一方面，本发明提供了一种筛选Skp1靶向药物的方法，该方法为针对Skp1与Skp2相互作用氨基酸位点进行高通量分子对接方法。根据本发明的一个对接方法的实例如下：

Skp1的蛋白晶体结构(PDB蛋白数据库号为：2AST)为分子对接的受体，来自chemdiv公司的化合物和文献已报道的天然化合物-共21008个小分子化合物为分子对接配体。这些化合物的3D结构模型大部分下载自PubChem化合物数据库，剩余的化合物利用ChemDraw程序和化合物的二维结构进行三维结构模型，并在Chem3D Ultra程序中遵循能量最低和分子动力学原则进行优化模拟。21008化合物和Skp1分子对接利用Autodock Vina程序进行刚性对接和柔性对接两部对接，化合物在Skp1蛋白对接位点包括Skp1与Skp2蛋白相互结合的两个口袋。第一个口袋用来对接的氨基酸位点包括：97位谷氨酰胺(Q97),100位亮氨酸(L100),101位苯丙氨酸(F101),104位异亮氨酸(I104),123位缬氨酸(V123),139位苯丙氨酸(F139)和141位异亮氨酸(I141)；第二个口袋包括135位异亮氨酸(I135),136位精氨酸(R136),141位异亮氨酸(I141),143天冬酰胺(N143),144位天冬氨酸(D144),150位谷氨酸(E150),153位缬氨酸(V153)和157位天冬酰胺(N157)。最后根据化合物与Skp1两个结合口袋中的氨基酸对接时的Pi-Pi相互作用力，氢键作用力以及分子距离计算得到结合能量值，根据结合能量值选择排名在前的化合物进行下一步验证。

再一方面，本发明提供一种预防、治疗与Skp1高表达相关的肿瘤的药物组合物。其中，所述肿瘤包括但不限于肺癌、多发性骨髓瘤、头颈部鳞状细胞癌、前列腺癌、肝癌、食道癌、胃癌、结肠癌、黑色素瘤、白血病、淋巴瘤、直肠癌、脑瘤、皮肤癌。

该药物组合物中包含如结构式Ⅰ所示的小分子化合物。还可以包含一种或多种药学上可接受的载体或赋形剂。所述载体或赋形剂可以包括甘油、乙醇、缓冲盐水、生理盐水及其组合。所述药物组合物还可以进一步包含渗透促进剂、抗氧化剂等。

本发明测试结果表明，Evodiamine、Liriodenine、6-O-angeloylplenolin通过结合Skp1抑制SCF E3连接酶活性，抑制肿瘤细胞增殖及细胞周期达到抗肿瘤效果。

根据本发明的另一方面，提供了一种用于制备肿瘤靶向药物的方法，包括：

筛选能够有效降低Skp1肿瘤蛋白高表达的化合物；以及

利用所述化合物制备相应的肿瘤靶向药物。

上述化合物优选具有上述结构式Ⅰ之一。

上述肿瘤可以为肺癌、多发性骨髓瘤、头颈部鳞状细胞癌、前列腺癌、肝癌、食道癌、胃癌、结肠癌、黑色素瘤、白血病、淋巴瘤、直肠癌、脑瘤、皮肤癌。

上述肿瘤靶向药物优选是针对Skp1与Skp2相互作用结合口袋以及其中的活性氨基酸位点。所述活性氨基酸位点可以为结合口袋1中的Q97、L100、F101、I104、V123、F139和I141以及结合口袋2中的I135、R136、I141、N143、D144、E150，V153和N157。

附图说明

以下，结合附图来详细说明本发明的实施方案，其中：

图1是检测Skp1在肺癌组织与癌旁组织中的表达；其中图1A与图1C是通过免疫印迹与免疫组化比较Skp1在肺癌与癌旁组织中的表达；图1B和图1D是对免疫印迹与免疫组化进行量化后统计结果。

图2是对比Skp1高表达与低表达肺癌病人的生存时间。

图3是检测小分子干扰RNA敲低Skp1表达后对肺癌细胞软琼脂克隆形成能力和增殖能力影响；其中图3A是免疫印迹检测小分子干扰RNA敲低Skp1后检测Skp1的表达；图3B是小分子干扰RNA敲低Skp1后对肺癌细胞软琼脂克隆形成能力的影响；图3C和图3D是通过小分子干扰RNA敲低Skp1后检测细胞增殖能力。

图4是Skp1与Skp2相互作用结构示意图；其中图4A、4B和图4C是参考蛋白数据库中的三维晶体结构(PDB参考号:2AST)显示Skp1与Skp2相互作用形成两个结合口袋；图1B、1C还分别显示两个结合口袋中Skp1中与Skp2相互作用的活性氨基酸位点。图4D是Skp1的两个口袋与小分子化合物的高通量分子对接示意图。

图5是检测Skp1结合药物对SCF复合物的完整性以及蛋白稳定性影响；其中图5A是检测Skp1结合药物处理A549细胞后对F-box蛋白稳定性影响；图5B是检测Skp1结合药物处理A549细胞后对Skp1与F-box相互作用影响。

图6是检测Skp1结合药物对肺癌细胞周期分布的影响。

具体实施方式

除非特别指明，以下实施例中所用的试剂均为分析纯级试剂，且可从正规渠道商购获得。

实施例1

为比较肺癌和癌旁组织中Skp1表达含量，利用免疫印迹与免疫组化技术对肺癌与癌旁组织中的Skp1表达进行检测，肺癌与癌旁组织标本来源于中山大学附属肿瘤医院。一方面利用液氮研磨技术对标本中的蛋白进行提取，并进行免疫印迹检测Skp1的表达(见图1A)，并通过image J软件对免疫印迹条带进行灰度扫描，得到Skp1相对于内参蛋白Actin的比值(见图1B)，即相对表达量，统计后发现肺癌组织中Skp1相对表达量显著高于癌旁组织。另外一方面对肺癌和癌旁组织的石蜡切片进行免疫组化染色(见图1C)，然后对肺癌和癌旁组织中的Skp1表达通过免疫组化积分进行量化，并统计发现肺癌组织中Skp1显著高于癌旁(见图1D),进一步证明Skp1在癌组织中高表达，在癌症发生发展中具有重要功能。

实施例2

为进一步统计Skp1表达与肺癌患者生存预后的关系，我们利用中山大学肿瘤医院提供的肺癌患者生存时间，通过SPSS软件比较Skp1高表达患者与低表达患者的生存时间，统计数据显示Skp1高表达患者生存时间显著低于低表达患者(见图2)，说明Skp1表达与患者预后相关，与癌症的发生发展关系密切。

实施例3

为进一步检测Skp1蛋白在癌细胞生长转化中的作用，我们在肺癌细胞A549和H1975中用小分子干扰RNA观察Skp1表达降低后对肺癌细胞转化能力的影响。通过免疫印迹检测1号和2号小分子干扰RNA都可以显著降低Skp1的表达(见图3A)。然后将1.2％低熔点琼脂糖与2×细胞培养基(含有不同浓度的6-OAP)以1:1的体积比混合制备1ml 0.6％的底层琼脂，取对数期细胞，胰酶消化后吹散成单个细胞悬液，计数，并调细胞浓度，将0.6％低熔点琼脂糖与2×细胞培养基(含1×103个细胞)以1:1的体积比混合，制备0.3％的上层琼脂，室温凝固。置于37℃，5％CO2的细胞培养箱中培养2周，然后拍照对比显示对照组细胞克隆数目显著多于Skp1干扰组(见图3B)。进一步利用细胞计数观察Skp1表达降低后对癌细胞增殖能力影响，在肺癌细胞A549和H1975中干扰Skp1表达后取24、48、72、96小时的对照组和干扰组进行计数，统计发现对照组细胞增殖能力显著高于Skp1干扰组(见图3C和D)。以上结果说明Skp1干扰后可以明显降低肺癌细胞的增殖和转化能力，Skp1可以作为潜在的治疗靶点开发肿瘤靶向药物。

实施例4

为了开发直接结合Skp1的靶向药物，参考蛋白数据库(PDB)中Skp1与Skp2形成的三维晶体结构(PDB参考号：2AST)，进一步分析晶体结构发现Skp1与Skp2相互作用形成两个结合口袋(见图4A)；图4B、4C还分别显示两个结合口袋中Skp1中与Skp2相互作用的活性氨基酸位点；结合口袋1中的活性氨基酸位点(Q97,L100,F101,I104,V123,F139,I141，见图4B)和口袋2中的活性氨基酸位点(I135,R136,I141,N143,D144,E150,V153，N157见图4C)可以作为化合物相互作用的受体，天然化合物作为配体，通过ChemDraw Ultra软件画出化合物的三维结构后，利用AutoDock工具进行分子对接(见图4D)，最后分析化合物与Skp1的结合作用力，从而筛选出如结构式Ⅰ所示的化合物为潜在的Skp1靶向药物。

实施例5

Skp1靶向药物结合具有潜在干扰Skp1与F-box蛋白结合，以及降低F-box蛋白稳定性的作用。用10μM的6-OAP、Evo、Lir处理A549细胞3h后裂解细胞，利用抗Skp2一抗进行免疫沉淀实验，检测相对于对照组细胞，加药处理后Skp2与Skp1结合量(Input为细胞内Skp1与Skp2总蛋白量内参对照，IP为用Skp2一抗沉淀Skp2以及与Skp2相结合的Skp1蛋白，IgG为相对Skp2一抗的正常免疫球蛋白)。通过免疫印迹发现IgG组免疫沉淀没有检测到Skp1和Skp2，说明免疫沉淀实验没有非特异结合。对照组细胞Skp2与Skp1具有显著的相互作用，加入6-OAP，Evo，Lir处理后，相互作用明显减弱(见图5A)。通过免疫印迹进一步发现用5μM和10μM的6-OAP、Evo、Lir处理A549细胞后,F-box蛋白Skp2以及NIPA蛋白水平都显著下调(见图5B)，说明小分子化合物6-OAP、Evo、Lir都可以通过特异性结合Skp1干扰Skp1与F-box蛋白的结合，并降低F-box蛋白的稳定性。

实施例6

用10μM的6-OAP、Evo、Lir处理A549和H1975细胞24小时以后，收集细胞经70％乙醇固定，4℃过夜后经由PI染色检测细胞周期分布，发现6-OAP、Evo、Lir都可明显诱导细胞阻滞在细胞周期G2/M期(见图6A和B)，说明Skp1靶向药物能通过作用域Skp1引起细胞周期阻滞，并抑制肿瘤细胞的生长。

本领域技术人员应当理解，上述实施例或实例只是用于说明本发明而非用于对其作出任何限制。例如，本发明的高通量分子对接方法不受说明书中给出的实例限制，本领域技术人员可以利用能够有效实现高通量分子对接的任何合适方法。

Claims (2)

1.Skp1在制备筛选治疗肺癌的药物试剂中的用途，包括：

筛选能够有效降低Skp1肿瘤蛋白高表达的化合物；以及利用所述化合物制备相应的肿瘤靶向药物，所述肿瘤靶向药物是针对Skp1与Skp2相互作用结合口袋以及其中的活性氨基酸位点，根据化合物与Skp1两个结合口袋中的氨基酸对接时的Pi-Pi相互作用力，氢键作用力以及分子距离计算得到结合能量值，根据结合能量值选择排名在前的化合物，

所述活性氨基酸位点为结合口袋1中的Q97、L100、F101、I104、V123、F139和I141以及结合口袋2中的I135、R136、I141、N143、D144、E150，V153和N157。

2.根据权利要求1所述的用途，其特征在于，所述化合物选自包括如以下结构式Ⅰ所示的小分子化合物：