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CN105137072A - 一种结核分枝杆菌lam检测试剂盒、制备方法以及使用方法 - Google Patents

一种结核分枝杆菌lam检测试剂盒、制备方法以及使用方法 Download PDF

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CN105137072A CN201510218677.7A CN201510218677A CN105137072A CN 105137072 A CN105137072 A CN 105137072A CN 201510218677 A CN201510218677 A CN 201510218677A CN 105137072 A CN105137072 A CN 105137072A
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Abstract

本发明涉及一种基于纳米免疫磁珠-近红外荧光标记法的结核分枝杆菌脂阿拉伯甘露聚糖(LMA)检测试剂盒。本试剂盒中，以近红外荧光染料标记靶向于LAM的单克隆抗体，靶向于LAM的多克隆抗体包被在纳米磁珠表面。采用双抗体夹心法原理，磁性分离结合物和游离物，采用便携式高灵敏度低噪声激发式荧光检测仪检测磁性结合物的荧光强度，从而检测待检样品中LAM含量。本发明适用于临床病理标本中的LAM检测，具有快速、灵敏、抗杂散荧光干扰、发射荧光保存时间长的特点。

Description

一种结核分枝杆菌LAM检测试剂盒、制备方法以及使用方法
技术领域
本发明属于生物领域，具体涉及一种结核分枝杆菌脂阿拉伯甘露聚糖(LMA)检测试剂盒、制备方法以及使用方法。
技术背景
本发明建立了一种检测结核分枝杆菌菌体相关成分LAM的纳米磁珠-近红外荧光标记-检测试剂盒。包括单克隆抗体的近红外荧光染料标记方法和纳米磁珠的多克隆抗体包被方法以及系列相关试剂。本发明以近红外荧光染料作为标记，采用免疫分析原理，制备检测LAM双抗体夹心法近红外荧光试剂盒。采用便携式流动进样荧光检测器进行磁珠-结合物荧光强度测定。定量检测时，将样本检测值代入标准方程，即可分析检测样本中靶蛋白的浓度；定性检测则以阴性对照的荧光强度的2倍作为反应体系的cutoff值，大于2倍cutoff值为阳性，反之则为阴性。该试剂盒适用于病理样本中结核分枝杆菌菌体LAM的检测。本发明具有快速、高敏、兼顾定性及精准定量的特点。
结核病是一种古老的传染性疾病，目前全世界有1/3的人口受结核分枝杆菌的感染，每年有近800万人死于肺结核；耐药性和多重耐药性菌株的大量出现，又为结核病的控制带来更大的困难；更多的研究还证实结核分枝杆菌能增强HIV-1病毒的复制，因此在艾滋病感染者中，双重感染者众多，成为导致AIDS患者死亡的主要原因。我国目前的TB患者数量居世界第二位,是世界上22个TB高负担国家之一，2000年我国第4次TB流行病学抽样调查资料显示,我国MTB感染率为44.5％,活动性TB患者451万,每年死亡人数达13万。
目前对于结核分枝杆菌的检验手段主要有涂片镜检法，该方法需要检测人员具有熟练的检验技能，方法检测灵敏度低，一般需标本中存在103CFU/ml个细菌才有10～15％的阳性率,并且对细菌无法进行准确的鉴定；培养法，主要在传染病医院进行该项工作，检测周期较长，一般需要6周时间才能发报告，晚近出现的全自动微生物鉴定仪虽然大大缩短了检验周期，通常需要2周左右时间，这仍未根本解决效率的问题，并且存在着成本高昂的缺陷，单纯的试剂成本在120元/测试，且需要大型的设备；血清学检验方法主要集中在对结核分枝杆菌相关抗体的检测，由于结核感染患者存在免疫力低下的问题，往往不表达相关抗体，或者由于成人感染结核菌几率多，由于免疫记忆，许多曾感染者也可检测出相关抗体，这就为判断造成麻烦；分子生物学的手段近来广范运用于临床检测，诸如PCR法、探针检测法等，这些方法特异性好，但需要特殊的检测仪器，推广运用存在问题，超高的灵敏度也带来了难以克服的问题-假阳性；结核感染T细胞斑点试验用于检测结核感染后特异性T细胞分泌的γ-干扰素，并据此结果判断是否感染了结核，该方法特点是繁琐，成本高，不宜推广，目前主要在西方国家作筛查使用；结核分枝杆菌特异性噬菌体扩增试验也曾在结核病实验室发挥过作用，也存在繁琐、成本高，在结果判断中需要足够的经验的缺点。该方法的假阳性率为3％～7％,假阴性率为15％～40％。与培养的阳性符合率为75％～95％,特异性为88％～99％。
本发明将纳米磁珠法与近红外荧光标记法结合起来，利用纳米磁珠表面羧基活化后可与抗体表面的氨基共价结合，从而将抗体固定到纳米磁珠表面，发挥了纳米磁珠比表面积大，吸附性强，悬浮稳定性好，有利于抗原抗体反应顺利进行的特点；同时近红外荧光染料具有灵敏度高、选择性好的优点，它的激发光以及发射光光谱均在近红外区域，可最大限度减少环境中杂散荧光物质的干扰等优点。建立起结核分枝杆菌菌体LAM的近红外荧光标记-纳米磁珠检测方法，LAM检测限量达1.0ng/ml水平。
发明内容
为了克服上述缺陷，提供以下技术方案：
一种基于纳米免疫磁珠-近红外荧光标记法的结核分枝杆菌LAM检测试剂盒，所述试剂盒由近红外荧光染料标记的单克隆抗体、多克隆抗体包被的纳米磁珠、磁性分离器、蛋白标准品、缓冲液组成；其中，近红外荧光染料标记的单克隆抗体为兔抗LAM；包被纳米磁珠的多克隆抗体为兔多抗LAM。建立L-阿拉伯糖标准品梯度浓度和荧光发射值之间的工作曲线，将所测得的发射荧光强度，代入方程即可完成样品中目标多糖含量的定量(定性)检测。
优选地，所述近红外荧光染料为激发光波长为777nm,发射光波长为790nm的荧光分子，优选NHS活化的近红外荧光染料DyLight800。
所述的一种基于纳米免疫磁珠-近红外荧光标记法的结核分枝杆菌LAM检测试剂盒的制备方法，步骤如下：
(1)制备近红外荧光染料标记的LAM单克隆抗体；
将Dylight800(购自Thermofisher公司)用PBS缓冲液(PH7.4)稀释10倍，取1.4μL与20μg兔抗LAM单克隆抗体(1mg/ml)(购自MossmanAssociatesInc公司)轻柔混合均匀后于室温避光反应2小时；反应结束后，将标记产物放入透析袋中，4℃，PBS缓冲液透析4小时。标记好的抗体溶液中添加终浓度为1.5％BSA和0.1％Tween20,叠氮化钠0.1‰，4℃保存；使用前将标记产物以PBS稀释2000倍；
(2)LAM多克隆抗体的制备
1)LAM的提纯：
将MTBH37RV接种在罗氏鸡蛋培养基上，37℃培养3～4周，收取菌落置于5mlEP管中，100℃水浴灭活2小时，用2mlPBS(PH7.4)缓冲液洗涤2次，离心弃上清(8000r/min)；加入2ml氯仿/甲醇(2∶1)混合液脱脂3次，离心弃上清(8000r/min)；加入2mlPBS(PH7.4)悬浮，冰浴超声破碎(超声10s，停10s，共30min)，8000r/min离心取上清，加入2ml40％的苯酚萃取70℃，1小时，8000r/min离心取上清，用蒸馏水透析2天，采用SephacrylS-100凝胶柱层析，用NaCl(0.05mmol/L)溶液洗脱，流速0.5ml/min。EP管收集。
2)LAM的定量：
取浓硫酸1ml，9％苯酚200μl，标本200μl，混匀后避光反应30分钟，空白调零，以L-阿拉伯糖为多糖标准，制作浓度范围0.1～3.0mg/ml的标准曲线，测吸光度(A485)值，直线回归计算标本中多糖含量；
3)LAM多克隆抗体制备：
以本实验室制备的LAM为免疫原，委托江南大学食品学院代为制备LAM多克隆抗体，制成后的抗体为兔抗LAM多克隆抗体，浓度为1mg/ml。
(3)制备LAM多克隆抗体包被的纳米磁珠(购自武汉哇哇噻纳技术开发有限公司北京生物技术研究所)；
1)纳米磁珠的预处理：
轻轻混匀磁珠悬浮液，吸取0.01ml悬浮液(25mg/ml)加入1.5mlEP试管中；再加入0.1ml重蒸水，轻轻混匀并将试管架置磁板上，静置2分钟后吸取上清液；重复上述步骤1次；
加入1ml0.1M的乙磺酸溶液(pH＝5.0，MES)，重悬磁珠；
2)纳米磁珠的活化
将上述EP管置于磁板上，用1mlMES洗涤2次，弃上清；
临用前配置终浓度为0.1M的MES，其内含EDC和NHS的浓度均为40g/L(加入上述两种物质后，置于振荡器上充分混匀15分钟，待用)。用该液重悬磁珠；
用磁板吸附磁珠，弃上清，再用MES清洗一次，吸附磁珠后，弃上清；
3)磁珠与蛋白的链接；
在已处理好的磁珠中加入50μLLAM多克隆抗体(1mg/ml)和500μLPBS(PH5.5)，混匀，室温，置于摇床上持续震荡，孵育2小时；
用PBS缓冲液(PH5.5，0.05％Tween)清洗3次，弃上清；
加入1mlTris缓冲液(0.1M，0.1％BSA)，混匀，室温，置于摇床上持续震荡，孵育2小时；
加入1mlPBS缓冲液(PH5.5，0.05％Tween)，静置2分钟，弃上清；重复3次，加入1mlPBS缓冲液(PH5.5)，弃上清，重复3次。弃上清时，试管需置于磁板上；
加入1mlPBS缓冲液(pH＝7.4，0.05％Tween-20，0.1％BSA，0.05NaN3)，待用；
(4)制备LAM系列标准品；
LAM(本室制备，1mg/ml)，PBS(PH7.4)缓冲液稀释至0.5、1.0、2.5、5.0、10.0、20.0ng/ml。
(1)各取50μL各浓度的LAM标准品于EP管中，另取1支EP管加入50μLPBS(PH7.4)缓冲液作为阴性对照；
(2)以上各管加入荧光标记的LAM单抗50μL，37℃反应30分钟；
(3)取完成预处理纳米免疫磁珠100μL，用PBS缓冲液(PH7.4)稀释至1000μL；吸取50μL免疫磁珠，加入所述试管中，37℃反应15分钟；加入500μLddH2O，磁板上静置2分钟，弃上清，重复该步骤3次；
所述预处理纳米免疫磁珠的处理方法为：
制备LAM多克隆抗体包被的纳米磁珠(购自武汉哇哇噻纳技术开发有限公司北京生物技术研究所)：
1)纳米磁珠的预处理：
轻轻混匀磁珠悬浮液，吸取0.01ml悬浮液(25mg/ml)加入1.5mlEP试管中；再加入0.1ml重蒸水，轻轻混匀并将试管架置磁板上，静置2分钟后吸取上清液；重复上述步骤1次；
加入1ml0.1M的乙磺酸溶液(pH＝5.0，MES)，重悬磁珠；
2)纳米磁珠的活化
将上述EP管置于磁板上，用1mlMES洗涤2次，弃上清；
临用前配置终浓度为0.1M的MES，其内含EDC和NHS的浓度均为40g/L(加入上述两种物质后，置于振荡器上充分混匀15分钟，待用)。用该液重悬磁珠；
用磁板吸附磁珠，弃上清，再用MES清洗一次，吸附磁珠后，弃上清；
3)磁珠与蛋白的链接；
在已处理好的磁珠中加入50μLLAM多克隆抗体(1mg/ml)和500μLPBS(PH5.5)，混匀，室温，置于摇床上持续震荡，孵育2小时；
用PBS缓冲液(PH5.5，0.05％Tween)清洗3次，弃上清；
加入1mlTris缓冲液(0.1M，0.1％BSA)，混匀，室温，置于摇床上持续震荡，孵育2小时；
加入1mlPBS缓冲液(PH5.5，0.05％Tween)，静置2分钟，弃上清；重复3次，加入1mlPBS缓冲液(PH5.5)，弃上清，重复3次。弃上清时，试管需置于磁板上；
加入1mlPBS缓冲液(pH＝7.4，0.05％Tween-20，0.1％BSA，0.05NaN3)，待用；
(4)各管加入100μLPBS缓冲液(PH7.4)，混匀，用便携式流动进样荧光检测器(为中科院理论物理所制备的样机，该设备固化为激发光波长为777nm，发射光波长为790nm)进行荧光强度测定；
(5)结果判断
定性检测以阴性对照荧光强度值的2倍作为Cutoff值；
定量检测以荧光发射强度和对应的LAM标准品浓度进行回归分析，建立标准曲线，并拟合方程。
有益效果：
1、典型的有机荧光染料的荧光寿命仅为几纳秒(ns)，这与很多生物样本的自发荧光衰减时间相当。而近红外荧光寿命长达数十纳秒(20-50ns)，这使得在光激发数纳秒以后，大多数的自发荧光背景己经衰减，而量子点荧光仍然存在，此时即可获得无背景干扰的荧光信号。此外，由于近红外荧光染料的摩尔消光系数比通常的有机荧光染料高出10-50倍，它发射的荧光强度是有机染料的10-20倍。
2、采用纳米磁珠作为包被载体，优点在于增加了抗原抗体的接触面积，增加了反应机会，同时由于反应是在液体环境中进行，有利于蛋白质的空间构象展开，可以大大加快反应速度，减少反应时间。
3、采用纳米磁珠作为反应环境介质，也为结合物和游离物的有效快速分离提供可能。
附图说明
图1LAM检测标准曲线图
图中，X轴：荧光发射强度；Y轴：标准品浓度
具体实施方式
本发明将结合附图通过以下实施例作进一步说明。实施例：
一种基于纳米免疫磁珠-近红外荧光标记法的结核分枝杆菌LAM检测试剂盒，所述试剂盒由近红外荧光染料标记的单克隆抗体、多克隆抗体包被的纳米磁珠、磁性分离器、蛋白标准品、缓冲液组成；其中，近红外荧光染料标记的单克隆抗体为兔抗LAM；包被纳米磁珠的多克隆抗体为兔多抗LAM。建立L-阿拉伯糖标准品梯度浓度和荧光发射值之间的工作曲线，将所测得的发射荧光强度，代入方程即可完成样品中目标多糖含量的定量(定性)检测。
优选地，所述近红外荧光染料为激发光波长为777nm,发射光波长为790nm的荧光分子，优选NHS活化的近红外荧光染料DyLight800。
所述的一种基于纳米免疫磁珠-近红外荧光标记法的结核分枝杆菌LAM检测试剂盒的制备方法，步骤如下：
(1)制备近红外荧光染料标记的LAM单克隆抗体；
将Dylight800(购自Thermofisher公司)用PBS缓冲液(PH7.4)稀释10倍，取1.4μL与20μg兔抗LAM单克隆抗体(1mg/ml)(购自MossmanAssociatesInc公司)轻柔混合均匀后于室温避光反应2小时；反应结束后，将标记产物放入透析袋中，4℃，PBS缓冲液透析4小时。标记好的抗体溶液中添加终浓度为1.5％BSA和0.1％Tween20,叠氮化钠0.1‰，4℃保存；使用前将标记产物以PBS稀释2000倍；
(2)LAM多克隆抗体的制备
1)LAM的提纯：
将MTBH37RV接种在罗氏鸡蛋培养基上，37℃培养3～4周，收取菌落置于5mlEP管中，100℃水浴灭活2小时，用2mlPBS(PH7.4)缓冲液洗涤2次，离心弃上清(8000r/min)；加入2ml氯仿/甲醇(2∶1)混合液脱脂3次，离心弃上清(8000r/min)；加入2mlPBS(PH7.4)悬浮，冰浴超声破碎(超声10s，停10s，共30min)，8000r/min离心取上清，加入2ml40％的苯酚萃取70℃，1小时，8000r/min离心取上清，用蒸馏水透析2天，采用SephacrylS-100凝胶柱层析，用NaCl(0.05mmol/L)溶液洗脱，流速0.5ml/min。EP管收集。
2)LAM的定量：
取浓硫酸1ml，9％苯酚200μl，标本200μl，混匀后避光反应30分钟，空白调零，以L-阿拉伯糖为多糖标准，制作浓度范围0.1～3.0mg/ml的标准曲线，测吸光度(A485)值，直线回归计算标本中多糖含量；
3)LAM多克隆抗体制备：
以本实验室制备的LAM为免疫原，委托江南大学食品学院代为制备LAM多克隆抗体，制成后的抗体为兔抗LAM多克隆抗体，浓度为1mg/ml。
(3)制备LAM多克隆抗体包被的纳米磁珠(购自武汉哇哇噻纳技术开发有限公司北京生物技术研究所)；
1)纳米磁珠的预处理：
轻轻混匀磁珠悬浮液，吸取0.01ml悬浮液(25mg/ml)加入1.5mlEP试管中；再加入0.1ml重蒸水，轻轻混匀并将试管架置磁板上，静置2分钟后吸取上清液；重复上述步骤1次；
加入1ml0.1M的乙磺酸溶液(pH＝5.0，MES)，重悬磁珠；
2)纳米磁珠的活化
将上述EP管置于磁板上，用1mlMES洗涤2次，弃上清；
临用前配置终浓度为0.1M的MES，其内含EDC和NHS的浓度均为40g/L(加入上述两种物质后，置于振荡器上充分混匀15分钟，待用)。用该液重悬磁珠；
用磁板吸附磁珠，弃上清，再用MES清洗一次，吸附磁珠后，弃上清；
3)磁珠与蛋白的链接；
在已处理好的磁珠中加入50μLLAM多克隆抗体(1mg/ml)和500μLPBS(PH5.5)，混匀，室温，置于摇床上持续震荡，孵育2小时；
用PBS缓冲液(PH5.5，0.05％Tween)清洗3次，弃上清；
加入1mlTris缓冲液(0.1M，0.1％BSA)，混匀，室温，置于摇床上持续震荡，孵育2小时；
加入1mlPBS缓冲液(PH5.5，0.05％Tween)，静置2分钟，弃上清；重复3次，加入1mlPBS缓冲液(PH5.5)，弃上清，重复3次。弃上清时，试管需置于磁板上；
加入1mlPBS缓冲液(pH＝7.4，0.05％Tween-20，0.1％BSA，0.05NaN3)，待用；
(4)制备LAM系列标准品；
LAM(本室制备，1mg/ml)，PBS(PH7.4)缓冲液稀释至1、5、25、125、625ng/ml。
(1)各取50μL各浓度的LAM标准品于EP管中，另取1支EP管加入50μLPBS(PH7.4)缓冲液作为阴性对照；
(2)以上各管加入荧光标记的LAM单抗50μL，37℃反应30分钟；
(3)取完成预处理纳米免疫磁珠100μL，用PBS缓冲液(PH7.4)稀释至1000μL；吸取50μL免疫磁珠，加入所述试管中，37℃反应15分钟；加入500μLddH2O，磁板上静置2分钟，弃上清，重复该步骤3次；
所述预处理纳米免疫磁珠的处理方法为：
制备LAM多克隆抗体包被的纳米磁珠(购自武汉哇哇噻纳技术开发有限公司北京生物技术研究所)：
1)纳米磁珠的预处理：
轻轻混匀磁珠悬浮液，吸取0.01ml悬浮液(25mg/ml)加入1.5mlEP试管中；再加入0.1ml重蒸水，轻轻混匀并将试管架置磁板上，静置2分钟后吸取上清液；重复上述步骤1次；
加入1ml0.1M的乙磺酸溶液(pH＝5.0，MES)，重悬磁珠；
2)纳米磁珠的活化
将上述EP管置于磁板上，用1mlMES洗涤2次，弃上清；
临用前配置终浓度为0.1M的MES，其内含EDC和NHS的浓度均为40g/L(加入上述两种物质后，置于振荡器上充分混匀15分钟，待用)。用该液重悬磁珠；
用磁板吸附磁珠，弃上清，再用MES清洗一次，吸附磁珠后，弃上清；
3)磁珠与蛋白的链接；
在已处理好的磁珠中加入50μLLAM多克隆抗体(1mg/ml)和500μLPBS(PH5.5)，混匀，室温，置于摇床上持续震荡，孵育2小时；
用PBS缓冲液(PH5.5，0.05％Tween)清洗3次，弃上清；
加入1mlTris缓冲液(0.1M，0.1％BSA)，混匀，室温，置于摇床上持续震荡，孵育2小时；
加入1mlPBS缓冲液(PH5.5，0.05％Tween)，静置2分钟，弃上清；重复3次，加入1mlPBS缓冲液(PH5.5)，弃上清，重复3次。弃上清时，试管需置于磁板上；
加入1mlPBS缓冲液(pH＝7.4，0.05％Tween-20，0.1％BSA，0.05NaN3)，待用；
(4)各管加入100μLPBS缓冲液(PH7.4)，混匀，用便携式流动进样荧光检测器(为中科院理论物理所制备的样机，该设备固化为激发光波长为777nm，发射光波长为790nm)进行荧光强度测定；
(5)结果判断
定性检测以阴性对照荧光强度值的2倍作为Cutoff值；
定量检测以荧光发射强度和对应的LAM标准品浓度进行回归分析，建立标准曲线，并拟合方程。
具体实例为：检测胸水中的LAM
取5ml胸水进行超声处理，超声裂解工作模式为：工作5s，休息10s，Φ3mm变幅杆，60％能量，共计30次循环。
标准品稀释至说明书中规定的各浓度，分别取50μL标准品、空白对照和处理后的胸水，加入A液50μL，37℃反应30分钟；
加入B液50μL，37℃反应15分钟。加入500μL重蒸水，磁力架上静置2分钟，弃上清，重复该步骤3次。
各管加入100μLPBS缓冲液(PH7.4)，用便携式流动进样荧光检测器进行荧光强度测定。
结果判断
定性检测以阴性对照荧光强度值的2倍作为Cutoff值；
定量检测以荧光发射强度和对应的标准品浓度进行回归分析，建立标准曲线，并拟合方程。
表1：不同浓度LAM标准品对应检测结果
由此表明，本发明方法中的各个参数均是最佳选择，可实现本发明的最优效果。
以上所述，仅是本发明的较佳实施例而已，并非是对本发明作其它形式的限制，任何熟悉本专业的技术人员可能利用上述揭示的技术内容加以变更或改型为等同变化的等效实施例。但是凡是未脱离本发明技术方案内容，依据本发明的技术实质对以上实施例所作的任何简单修改、等同变化与改型，仍属于本发明技术方案的保护范围。

Claims (4)

1.一种基于纳米免疫磁珠-近红外荧光标记法的结核分枝杆菌LAM检测试剂盒，其特征在于：所述试剂盒由近红外荧光染料标记的单克隆抗体、多克隆抗体包被的纳米磁珠、磁性分离器、蛋白标准品、缓冲液组成；其中，近红外荧光染料标记的单克隆抗体为兔抗LAM；包被纳米磁珠的多克隆抗体为兔多抗LAM。建立L-阿拉伯糖标准品梯度浓度和荧光发射值之间的工作曲线，将所测得的发射荧光强度，代入方程即可完成样品中目标多糖含量的定量(定性)检测。
2.根据权利要求1所述的一种基于纳米免疫磁珠-近红外荧光标记法的结核分枝杆菌LAM检测试剂盒，其特征在于：所述近红外荧光染料为激发光波长为777nm，发射光波长为790nm的荧光分子，优选NHS活化的近红外荧光染料DyLight800。
3.根据权利要求1所述的一种基于纳米免疫磁珠-近红外荧光标记法的结核分枝杆菌LAM检测试剂盒的制备方法，其特征在于步骤如下：
(1)制备近红外荧光染料标记的LAM单克隆抗体；
将Dylight800(购自Thermofisher公司)用PBS缓冲液(PH7.4)稀释10倍，取1.4μL与20μg兔抗LAM单克隆抗体(1mg/ml)(购自MossmanAssociatesInc公司)轻柔混合均匀后于室温避光反应2小时；反应结束后，将标记产物放入透析袋中，4℃，PBS缓冲液透析4小时。标记好的抗体溶液中添加终浓度为1.5％BSA和0.1％Tween20，叠氮化钠0.1‰，4℃保存；使用前将标记产物以PBS稀释2000倍；
(2)LAM多克隆抗体的制备
1)LAM的提纯：
将MTBH37RV接种在罗氏鸡蛋培养基上，37℃培养3～4周，收取菌落置于5mlEP管中，100℃水浴灭活2小时，用2mlPBS(PH7.4)缓冲液洗涤2次，离心弃上清(8000r/min，10min)；加入2ml氯仿∶甲醇＝2∶1混合液脱脂3次，离心弃上清(8000r/min，10min)；加入2mlPBS(PH7.4)悬浮，冰浴超声破碎(超声10s，停10s，共30min)，8000r/min，10min，取上清，加入2ml40％的苯酚萃取，70℃，1小时，8000r/min，10min取上清，用蒸馏水透析2天，采用SephacrylS-100凝胶柱层析，用NaCl(0.05mmol/L)溶液洗脱，流速0.5ml/min，用EP管收集2ml/管。
2)LAM的定量：
取浓硫酸1ml，9％苯酚200μl，标本200μl，混匀后避光反应30分钟，空白调零，以L-阿拉伯糖为多糖标准，制作浓度范围0.1～3.0mg/ml的标准曲线，测吸光度(A485)值，直线回归计算标本中多糖含量；
3)LAM多克隆抗体制备：
以本实验室制备的LAM为免疫原，委托江南大学食品学院代为制备LAM多克隆抗体，制成后的抗体为兔抗LAM多克隆抗体，浓度为1mg/ml。
(3)制备LAM多克隆抗体包被的纳米磁珠(购自武汉哇哇噻纳技术开发有限公司北京生物技术研究所)；
1)纳米磁珠的预处理：
轻轻混匀磁珠悬浮液，吸取0.01ml悬浮液(25mg/ml)加入1.5mlEP试管中；再加入0.1ml重蒸水，轻轻混匀并将试管架置磁板上，静置2分钟后吸取上清液；重复上述步骤1次；
加入1ml0.1M的乙磺酸溶液(pH＝5.0，MES)，重悬磁珠；
2)纳米磁珠的活化
将上述EP管置于磁板上，用1mlMES洗涤2次，弃上清；
临用前配置终浓度为0.1M的MES，其内含EDC和NHS的浓度均为40g/L(加入上述两种物质后，置于振荡器上充分混匀15分钟，待用)。用该液重悬磁珠；
用磁板吸附磁珠，弃上清，再用MES清洗一次，吸附磁珠后，弃上清；
3)磁珠与蛋白的链接；
在已处理好的磁珠中加入50μLLAM多克隆抗体(1mg/ml)和500μLPBS(PH5.5)，混匀，室温，置于摇床上持续震荡，孵育2小时；
用PBS缓冲液(PH5.5，0.05％Tween)清洗3次，弃上清；
加入1mlTris缓冲液(0.1M，0.1％BSA)，混匀，室温，置于摇床上持续震荡，孵育2小时；
加入1mlPBS缓冲液(PH5.5，0.05％Tween)，静置2分钟，弃上清；重复3次，加入1mlPBS缓冲液(PH5.5)，弃上清，重复3次。弃上清时，试管需置于磁板上；
加入1mlPBS缓冲液(pH＝7.4，0.05％Tween-20，0.1％BSA，0.05NaN3)，待用；
(4)制备LAM系列标准品；
LAM(本室制备，1mg/ml)，PBS(PH7.4)缓冲液稀释至1、5、25、125、625ng/ml。
4.一种使用权利要求1所述的基于纳米免疫磁珠-近红外荧光标记法的结核分枝杆菌LAM检测试剂盒的检测方法，其特征在于包括如下步骤：
(1)各取50μL各浓度的LAM标准品于EP管中，另取1支EP管加入50μLPBS(PH7.4)缓冲液作为阴性对照；
(2)以上各管加入荧光标记的LAM单抗50μL，37℃反应30分钟；
(3)取完成预处理纳米免疫磁珠100μL，用PBS缓冲液(PH7.4)稀释至1000μL；吸取50μL免疫磁珠，加入所述试管中，37℃反应15分钟；加入500μLddH2O，磁板上静置2分钟，弃上清，重复该步骤3次；
所述预处理纳米免疫磁珠的处理方法为：
制备LAM多克隆抗体包被的纳米磁珠(购自武汉哇哇噻纳技术开发有限公司北京生物技术研究所)：
1)纳米磁珠的预处理：
轻轻混匀磁珠悬浮液，吸取0.01ml悬浮液(25mg/ml)加入1.5mlEP试管中；再加入0.1ml重蒸水，轻轻混匀并将试管架置磁板上，静置2分钟后吸取上清液；重复上述步骤1次；
加入1ml0.1M的乙磺酸溶液(pH＝5.0，MES)，重悬磁珠；
2)纳米磁珠的活化
将上述EP管置于磁板上，用1mlMES洗涤2次，弃上清；
临用前配置终浓度为0.1M的MES，其内含EDC和NHS的浓度均为40g/L(加入上述两种物质后，置于振荡器上充分混匀15分钟，待用)。用该液重悬磁珠；
用磁板吸附磁珠，弃上清，再用MES清洗一次，吸附磁珠后，弃上清；
3)磁珠与蛋白的链接；
在已处理好的磁珠中加入50μLLAM多克隆抗体(1mg/ml)和500μLPBS(PH5.5)，混匀，室温，置于摇床上持续震荡，孵育2小时；
用PBS缓冲液(PH5.5，0.05％Tween)清洗3次，弃上清；
加入1mlTris缓冲液(0.1M，0.1％BSA)，混匀，室温，置于摇床上持续震荡，孵育2小时；
加入1mlPBS缓冲液(PH5.5，0.05％Tween)，静置2分钟，弃上清；重复3次，加入1mlPBS缓冲液(PH5.5)，弃上清，重复3次。弃上清时，试管需置于磁板上；
加入1mlPBS缓冲液(pH＝7.4，0.05％Tween-20，0.1％BSA，0.05NaN3)，待用；
(4)各管加入100μLPBS缓冲液(PH7.4)，混匀，用便携式流动进样荧光检测器(为中科院理论物理所制备的样机，该设备固化为激发光波长为777nm，发射光波长为790nm)进行荧光强度测定；
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