CN105131098A - 一种与植物光合作用活性相关的hpe109蛋白及其编码基因与应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种与植物光合作用活性相关的HPE109蛋白及其编码基因与应用。本发明的HPE109蛋白是如下a)或b)或c)的蛋白质:a)氨基酸序列是序列表中序列2所示的蛋白质;b)在序列表中序列2所示的蛋白质的N端和/或C端连接标签得到的融合蛋白质;c)将序列表中序列2所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的具有相同功能的蛋白质。通过实验证明:HPE109蛋白参与了叶绿体生物发生的维持,从而极大的影响了光合作用的进行,对于高效的光能利用有着重要的作用,因此该基因具有重要的应用价值。
Description
技术领域
本发明属于生物技术领域,具体涉及一种与植物光合作用活性相关的HPE109蛋白及其编码基因与应用。
背景技术
光合作用是指绿色植物(包括光合藻类)在光照条件下利用太阳能把二氧化碳和水固定为有机物并释放出氧气的过程,它是地球上所有生物赖以生存的物质基础。因此,对光合作用进行深入研究不仅是一个重大的科学问题更是一个重要的粮食问题和能源问题。
叶绿体是绿色植物和光合藻类细胞内进行光合作用的细胞器,而叶绿体中的类囊体膜更是光合作用的直接场所。高等植物内囊体膜上附着着四大超级大分子蛋白复合体——光系统II、光系统I、细胞色素b6f和ATP酶复合体。通过内囊体膜上四大复合物植物将吸收的光能转变为化学能。但如果植物吸收的光能超过其可以利用的能量,叶绿体中会积累过量的活性氧,损伤类囊体膜上的蛋白复合物,从而造成光氧化损伤,导致叶绿体的生物发生异常引起光合效率的下降。除了基本的四大复合物蛋白外,植物进化出了大量的调控机制来维持这一复杂的光化学过程。
发明内容
本发明的一个目的是提供一种蛋白质。
本发明提供的蛋白质是如下a)或b)或c)的蛋白质:
a)氨基酸序列是序列表中序列2所示的蛋白质;
b)在序列表中序列2所示的蛋白质的N端和/或C端连接标签得到的融合蛋白质;
c)将序列表中序列2所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的具有相同功能的蛋白质。
本发明的另一个目的是提供与上述蛋白质相关的生物材料。
本发明提供的与上述蛋白质相关的生物材料为下述A1)至A20)中的任一种:
A1)编码上述蛋白质的核酸分子;
A2)含有A1)所述核酸分子的表达盒;
A3)含有A1)所述核酸分子的重组载体;
A4)含有A2)所述表达盒的重组载体;
A5)含有A1)所述核酸分子的重组微生物;
A6)含有A2)所述表达盒的重组微生物;
A7)含有A3)所述重组载体的重组微生物;
A8)含有A4)所述重组载体的重组微生物;
A9)含有A1)所述核酸分子的转基因植物细胞系;
A10)含有A2)所述表达盒的转基因植物细胞系;
A11)含有A3)所述重组载体的转基因植物细胞系;
A12)含有A4)所述重组载体的转基因植物细胞系;
A13)含有A1)所述核酸分子的转基因植物组织;
A14)含有A2)所述表达盒的转基因植物组织;
A15)含有A3)所述重组载体的转基因植物组织;
A16)含有A4)所述重组载体的转基因植物组织;
A17)含有A1)所述核酸分子的转基因植物器官;
A18)含有A2)所述表达盒的转基因植物器官;
A19)含有A3)所述重组载体的转基因植物器官;
A20)含有A4)所述重组载体的转基因植物器官。
上述相关生物材料中,A1)所述核酸分子为如下1)或2)或3)所示的基因:
1)其编码序列是序列表中序列1的cDNA分子或DNA分子;
2)与1)限定的核苷酸序列具有75%或75%以上同一性,且编码权利要求1所述的蛋白质的cDNA分子或基因组DNA分子;
3)在严格条件下与1)或2)限定的核苷酸序列杂交,且编码权利要求1所述的蛋白质的cDNA分子或基因组DNA分子。
本发明还有一个目的是提供上述蛋白质或上述相关生物材料的新用途。
本发明提供了上述蛋白质或上述相关生物材料在调控植物光合作用活性中的应用;
所述调控植物光合作用活性是通过调控植物光系统活性和/或光合相关蛋白含量和/或叶绿素含量和/或叶绿体发育体现的。
上述应用中,所述光系统为光系统II和/或光系统I;
所述光合相关蛋白为D1蛋白和/或D2蛋白和/或PsaA/B蛋白和/或Cytf蛋白和/或CF1蛋白和/或RbcL蛋白;
所述叶绿素为叶绿素a和/或叶绿素b。
本发明还提供了上述蛋白质或上述相关生物材料在培育光合作用活性提高的转基因植物中的应用。
上述应用中,所述光合作用活性提高体现在如下1)-5)中的至少一种:
1)光系统II活性提高;
2)光系统I活性提高;
3)光合相关蛋白含量提高;
4)叶绿素a含量提高;
5)叶绿素b含量提高;
所述光合相关蛋白具体为D1蛋白和/或D2蛋白和/或PsaA/B蛋白和/或Cytf蛋白和/或CF1蛋白和/或RbcL蛋白。
上述应用中,所述植物为单子叶植物或双子叶植物;所述双子叶植物具体为拟南芥(哥伦比亚型)。
本发明的最后一个目的是提供一种培育光合作用活性提高的转基因植物的方法。
本发明提供的培育光合作用活性提高的转基因植物的方法包括将上述蛋白质的编码基因导入受体植物中,得到转基因植物的步骤;所述转基因植物的光合作用活性高于所述受体植物。
上述方法中,所述蛋白质的编码基因的核苷酸序列是序列表中序列1所示的DNA分子;
所述转基因植物的光合作用活性高于所述受体植物体现在如下1)-5)中的至少一种:
1)所述转基因植物的光系统II活性比所述受体植物高;
2)所述转基因植物的光系统I活性比所述受体植物高;
3)所述转基因植物的光合相关蛋白含量比所述受体植物高;
4)所述转基因植物的叶绿素a含量比所述受体植物高;
5)所述转基因植物的叶绿素b含量比所述受体植物高;
所述光合相关蛋白具体为D1蛋白和/或D2蛋白和/或PsaA/B蛋白和/或Cytf蛋白和/或CF1蛋白和/或RbcL蛋白。
上述方法中,所述受体植物为单子叶植物或双子叶植物;所述受体植物具体为权利要求1所述的蛋白质表达降低的植物突变体。
本发明通过对拟南芥突变体hpe109和互补植株的生理生化功能研究,发现了一个参与植物光合作用的HPE109蛋白。通过试验证明:该HPE109蛋白参与了叶绿体生物发生的维持,从而极大的影响了光合作用的进行,对于高效的光能利用有着重要的作用,因此该基因具有重要的应用价值。
附图说明
图1为野生型拟南芥(WT)、互补植株(hpe109com)和突变体hpe109(hpe109)的生长表型。
图2为野生型拟南芥(WT)、互补植株(hpe109com)和突变体hpe109(hpe109)中hpe109的检测。
图3为野生型拟南芥(WT)、互补植株(hpe109com)和突变体hpe109(hpe109)的慢诱导曲线和P700氧化还原动力学曲线。
图4为野生型拟南芥(WT)、互补植株(hpe109com)和突变体hpe109(hpe109)的光合相关蛋白检测。
图5为野生型拟南芥(WT)、互补植株(hpe109com)和突变体hpe109(hpe109)中叶绿素a和叶绿素b的含量检测。
图6为野生型拟南芥(WT)、互补植株(hpe109com)和突变体hpe109(hpe109)的叶绿体超微结构。
具体实施方式
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明,均为常规方法。
下述实施例中所用的材料、试剂等,如无特殊说明,均可从商业途径得到。
下述实施例中的野生型拟南芥为哥伦比亚型(ArabidopsisthalianaColumbia),在文献“ChloroplastSmallHeatShockProteinHSP21InteractswithPlastidNucleoidProteinpTAC5andIsEssentialforChloroplastDevelopmentinArabidopsisunderHeatStress.LinlinZhong,theplantcell,2013”中公开过,公众可从中国科学院植物研究所获得。
下述实施例中的MS培养基由溶质和溶剂组成,溶剂为水,溶质及其在培养基中的浓度为MS盐(Duchefa公司,货号M0222.0050)4.4g/L,蔗糖24g/L,植物凝胶4.4g/L,pH5.8。
下述实施例中的tris硼酸缓冲液由溶质和溶剂组成,溶剂为水,溶质及其在培养基中的浓度为:50mMtris硼酸,150mM氯化钠,pH7.4。
下述实施例中的孵育缓冲液是将脱脂牛奶(体积分数为1%)粉溶解于tris硼酸缓冲液中得到的。
实施例1、hpe109基因的获得
1、拟南芥突变体hpe109的发现
将拟南芥突变体库种子(ABRC,ArabidopsisBiologicalResourceCenter,编号为CS31109-2)播种于MS培养基上培养,生长2周后,得到植株叶片发黄的突变体植株,将其命名为突变体hpe109;生长4周后,继续对突变体hpe109观察发现:相对于野生型拟南芥(WT),突变体hpe109生长明显迟缓,并且新叶发黄,表现出叶绿素高荧光(图1)。
2、hpe109基因的获得
将上述步骤1获得的突变体hpe109与Ler背景的野生型拟南芥(ABRC,ArabidopsisthalianaLandsberg)的进行杂交,得到杂交子代,杂交子代分离出的突变体hpe109表型的植株比例接近1/4;将F1代自交,得到F2代,提取F2代中具有突变体hpe109表型的植株的基因组DNA,并进行图位克隆,使用短核苷酸多态性分子标记进行基因座位与表型的连锁分析,当重组率远小于50%时将其粗定位在5号染色体分子标记K11I1和MZA15之间,进一步测序表明:突变为hpe109基因外显子1294后的连续31个碱基的删除。hpe109基因的核苷酸序列如序列表中序列1所示,hpe109基因编码的蛋白的氨基酸序列如序列表中序列2所示。
实施例2、互补植株的获得及光和作用活性分析
一、互补植株的获得
1、人工合成序列表中序列1所示的hpe109基因,将其插入到pBI121载体(中国质粒载体菌株细胞基因保藏中心,货号BiovectorpBI121)的XbaI和BamHI酶切位点间,且保持pBI121载体的其他序列不变,得到重组载体pBI121-hpe109。
2、将步骤1得到的重组载体转入农杆菌GV3101(中国质粒载体菌株细胞基因保藏中心,货号3571877),得到重组菌。
3、用步骤2得到的重组菌侵染实施例1中的突变体hpe109,培养,得到T0代转基因拟南芥的种子,将T0代转基因拟南芥的种子经表面灭菌后均匀地播撒于含40μg/mL卡那霉素的MS培养基上,一周后将生长正常的阳性苗移入土中生长,培养,收种子,即得到T1代转基因拟南芥(拟互补植株),将表型恢复的T1代转基因拟南芥幼苗挑选出来用于后续鉴定。
4、互补植株(hpe109com)的鉴定
分别提取野生型拟南芥(WT)、拟互补植株和突变体hpe109(hpe109)的总RNA和总蛋白,分别制备hpe109的探针和蛋白抗体,使用northernblot和westernblot方法进行检测,得到互补植株(hpe109com)。具体步骤如下:
(1)以野生型拟南芥(WT)的基因组DNA为模板,采用上游引物(AGGGGAGTTAAGCCTGACG)和下游引物(TTGTTGCAAATGCAAGGCG)进行PCR扩增,得到大小为500bp的DNA片段,使用32P标记采用Prime-a-GeneLabelingSystem(美国promega公司,货号U1100)中的标准方法制备hpe109的探针;提取突变体hpe109的总RNA,跑核酸胶后转膜与hpe109的探针进行杂交。检测到hpe109的拟互补植株即为互补植株(hpe109com)。
(2)将步骤(1)获得的大小为500bp的DNA片段插入到pET28a(中国质粒载体菌株细胞基因保藏中心,货号1225387)载体的EcoRI和BamHI酶切位点间,得到重组载体;将重组载体转入大肠杆菌BL21(DE3)(全式金公司,货号CD601-03),得到重组菌;37℃条件下ITPG(ITPG浓度为1mM)诱导培养重组菌,得到培养液;离心,收集菌体;使用超声波细胞粉碎机(宁波新芝生物科技有限公司)对菌体进行超声破碎(超声功率200W,超5秒停5秒,共超100次),离心,收集上清液(含有HPE109蛋白);使用镍柱(镍柱购买自美国Novagen公司,货号70751)对上清液进行纯化,得到大小为55kDa的HPE109蛋白;由北京塞百盛公司将纯化后的HPE109蛋白免疫兔子制备得到HPE109蛋白抗体;提取突变体hpe109的总蛋白,跑蛋白胶后转膜与HPE109蛋白抗体(将5000倍稀释(用tris硼酸缓冲液稀释)的HPE109蛋白抗体加入孵育缓冲液)孵育(室温孵育6小时)。检测到HPE109蛋白的拟互补植株即为互补植株(hpe109com)。
结果如图2所示:从图中可以看出,野生型拟南芥(WT)和互补植株(hpe109com)中均检测到了hpe109基因和HPE109蛋白,而突变体hpe109(hpe109)均未检测到hpe109基因和HPE109蛋白。说明本发明的突变体hpe109(hpe109)为hpe109基因功能完全缺失的突变体,而互补植株(hpe109com)为成功导入了hpe109基因并表达HPE109蛋白的转hpe109拟南芥。
二、表型
将野生型拟南芥(WT)、互补植株(hpe109com)和突变体hpe109(hpe109)的种子播种于MS培养基上进行培养,分别在培养2、3、4、5周后,用荧光成像仪分别对野生型拟南芥(WT)、互补植株(hpe109com)和突变体hpe109(hpe109)的表型进行观察。
结果如图1所示:相对于野生型拟南芥(WT),随着培养时间的增加,突变体hpe109植株的叶片逐渐发黄,生长明显迟缓,并且新叶发黄,表现出叶绿素高荧光,而互补植株(hpe109com)和野生型拟南芥的生长状态无显著差异。说明hpe109缺失导致了植物光合功能受损,并且该基因能够完全互补这种表型缺失。
三、光合作用活性分析
1、光系统活性
对正常生长的3周大小的野生型拟南芥(WT)、互补植株(hpe109com)和突变体hpe109(hpe109)的幼苗进行光合作用活性分析,使用慢诱导曲线和P700氧化还原动力学曲线分别对野生型拟南芥、互补植株(hpe109com)和突变体hpe109的光系统II和光系统I活性进行分析,分析的方法参照文献“LowPSIIaccunulationisinvolvedinefficientassemblyofphotosystemIIinArabidopsisthaliana.LianweiPeng,theplantcell,2006”。
结果如图3所示:突变体hpe109中的光系统II和光系统I活性均下降到野生型和互补植株的一半左右。说明突变体hpe109中光合作用活性明显下降,而导入hpe109的互补植株的光和作用活性明显提高,说明hpe109基因可以调控植物光合作用的光系统活性。
2、光合相关蛋白的分析
分别提取野生型拟南芥(WT)、互补植株(hpe109com)和突变体hpe109(hpe109)的总蛋白,采用蛋白免疫印迹方法分析野生型拟南芥(WT)、互补植株(hpe109com)和突变体hpe109(hpe109)中的主要光合相关蛋白(D1、D2、PsaA/B、Cytf、CF1、RbcL)含量。检测方法参照文献“LowPSIIaccunulationisinvolvedinefficientassemblyofphotosystemIIinArabidopsisthaliana.LianweiPeng,theplantcell,2006”。
结果如图4所示:突变体hpe109中的光合相关蛋白含量明显减少,而导入hpe109的互补植株的光合相关蛋白含量明显提高,突变体hpe109中的D1、D2、PsaA/B、Cytf、CF1、RbcL蛋白含量均降低到野生型和互补植株的1/4-1/2水平,说明hpe109基因可以调控植物光合相关蛋白的含量。
四、叶绿素含量检测及叶绿体结构的观察
1、叶绿素含量检测
为了进一步研究hpe109的缺失对植物叶绿体的影响,分别对野生型拟南芥(WT)、互补植株(hpe109com)和突变体hpe109(hpe109)中叶绿素a和叶绿素b的含量进行检测。具体步骤如下:将待检测植株的叶片用80%丙酮进行抽提,4000rmp离心,测定OD663.2和OD646.8值,计算公式为叶绿素a浓度(μg/gFW)=12.21×OD663.2-2.81×OD646.8;叶绿素b浓度(μg/gFW)=20.13×OD646.8-5.03×OD663.2)。
结果如图5所示:野生型拟南芥的叶绿素a和叶绿素b的含量分别为7.79±0.58和2.80±0.26,互补植株(hpe109com)的叶绿素a和叶绿素b的含量和野生型拟南芥无显著差异,而突变体hpe109中分别为5.76±0.16和2.03±0.13;突变体hpe109中的整体叶绿素含量下降到野生型拟南芥和互补植株(hpe109com)的60%左右。说明hpe109基因可以调控植物叶绿素的含量。
2、叶绿体超微结构的观察
使用JEM-1230型透射电子显微镜(JEOL公司)分别对野生型拟南芥(WT)、互补植株(hpe109com)和突变体hpe109(hpe109)中的叶绿体超微结构进行观察。
结果如图6所示:突变体hpe109中的叶绿体没有发育成典型的纺锤形,并且发生光合作用的类囊体膜数量明显减少,而野生型拟南芥和互补植株(hpe109com)的叶绿体超微结构无显著差异,均为正常的纺锤形。
以上结果均表明hpe109的缺失导致了整个叶绿体光合体系的严重受损,从而导致整体光合作用活性的下降,而导入了hpe109基因的互补植株的光合作用活性明显得到了恢复,与野生型无显著差异。说明hpe109基因具有调控植株光合作用活性的功能。
Claims (10)
1.蛋白质,是如下a)或b)或c)的蛋白质:
a)氨基酸序列是序列表中序列2所示的蛋白质;
b)在序列表中序列2所示的蛋白质的N端和/或C端连接标签得到的融合蛋白质;
c)将序列表中序列2所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的具有相同功能的蛋白质。
2.与权利要求1所述的蛋白质相关的生物材料,为下述A1)至A20)中的任一种:
A1)编码权利要求1所述的蛋白质的核酸分子;
A2)含有A1)所述核酸分子的表达盒;
A3)含有A1)所述核酸分子的重组载体;
A4)含有A2)所述表达盒的重组载体;
A5)含有A1)所述核酸分子的重组微生物;
A6)含有A2)所述表达盒的重组微生物;
A7)含有A3)所述重组载体的重组微生物;
A8)含有A4)所述重组载体的重组微生物;
A9)含有A1)所述核酸分子的转基因植物细胞系;
A10)含有A2)所述表达盒的转基因植物细胞系;
A11)含有A3)所述重组载体的转基因植物细胞系;
A12)含有A4)所述重组载体的转基因植物细胞系;
A13)含有A1)所述核酸分子的转基因植物组织;
A14)含有A2)所述表达盒的转基因植物组织;
A15)含有A3)所述重组载体的转基因植物组织;
A16)含有A4)所述重组载体的转基因植物组织;
A17)含有A1)所述核酸分子的转基因植物器官;
A18)含有A2)所述表达盒的转基因植物器官;
A19)含有A3)所述重组载体的转基因植物器官;
A20)含有A4)所述重组载体的转基因植物器官。
3.根据权利要求2所述的相关生物材料,其特征在于:A1)所述核酸分子为如下1)或2)或3)所示的基因:
1)其编码序列是序列表中序列1的cDNA分子或DNA分子;
2)与1)限定的核苷酸序列具有75%或75%以上同一性,且编码权利要求1所述的蛋白质的cDNA分子或基因组DNA分子;
3)在严格条件下与1)或2)限定的核苷酸序列杂交,且编码权利要求1所述的蛋白质的cDNA分子或基因组DNA分子。
4.权利要求1所述的蛋白质或权利要求2或3所述的相关生物材料在调控植物光合作用活性中的应用;
所述调控植物光合作用活性是通过调控植物光系统活性和/或光合相关蛋白含量和/或叶绿素含量和/或叶绿体发育体现的。
5.根据权利要求4所述的应用,其特征在于:所述光系统为光系统II和/或光系统I;
所述光合相关蛋白为D1蛋白和/或D2蛋白和/或PsaA/B蛋白和/或Cytf蛋白和/或CF1蛋白和/或RbcL蛋白;
所述叶绿素为叶绿素a和/或叶绿素b。
6.权利要求1所述的蛋白质或权利要求2或3所述的相关生物材料在培育光合作用活性提高的转基因植物中的应用。
7.根据权利要求6所述的应用,其特征在于:所述光合作用活性提高体现在如下1)-5)中的至少一种:
1)光系统II活性提高;
2)光系统I活性提高;
3)光合相关蛋白含量提高;
4)叶绿素a含量提高;
5)叶绿素b含量提高;
所述光合相关蛋白具体为D1蛋白和/或D2蛋白和/或PsaA/B蛋白和/或Cytf蛋白和/或CF1蛋白和/或RbcL蛋白。
8.一种培育光合作用活性提高的转基因植物的方法,包括将权利要求1所述的蛋白质的编码基因导入受体植物中,得到转基因植物的步骤;所述转基因植物的光合作用活性高于所述受体植物。
9.根据权利要求8所述的方法,其特征在于:所述蛋白质的编码基因的核苷酸序列是序列表中序列1所示的DNA分子;
所述转基因植物的光合作用活性高于所述受体植物体现在如下1)-5)中的至少一种:
1)所述转基因植物的光系统II活性比所述受体植物高;
2)所述转基因植物的光系统I活性比所述受体植物高;
3)所述转基因植物的光合相关蛋白含量比所述受体植物高;
4)所述转基因植物的叶绿素a含量比所述受体植物高;
5)所述转基因植物的叶绿素b含量比所述受体植物高;
所述光合相关蛋白具体为D1蛋白和/或D2蛋白和/或PsaA/B蛋白和/或Cytf蛋白和/或CF1蛋白和/或RbcL蛋白。
10.根据权利要求8或9所述的方法,其特征在于:所述受体植物为单子叶植物或双子叶植物;
所述受体植物具体为权利要求1所述的蛋白质表达降低的植物突变体。
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