CN105112388A

CN105112388A - 对胰蛋白酶抗性提高的β-1,4-内切木聚糖酶及其制备方法与用途

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Publication number: CN105112388A
Application number: CN201510567342.6A
Authority: CN
Inventors: 姚冬生; 吴秀秀; 谢春芳; 刘大岭
Original assignee: Jinan University
Current assignee: Guangdong Fang Can Animal Health Care Co ltd
Priority date: 2015-09-08
Filing date: 2015-09-08
Publication date: 2015-12-02
Anticipated expiration: 2035-09-08
Also published as: CN105112388B

Abstract

本发明公开了一种对胰蛋白酶抗性提高的β-1,4-内切木聚糖酶。该酶是由氨基酸序列为SEQ？ID？NO.1的β-1,4-内切木聚糖酶中制造两个氨基酸取代而产生的，对胰蛋白酶抗性更强的β-1,4-内切木聚糖酶，所述的氨基酸取代是第68位和101位的取代。本发明通过蛋白质工程技术对XynA分子的关键氨基酸残基进行了改造，提供了一种对胰蛋白酶抗性提高的XynA突变体，其对胰蛋白酶的抗性半衰期比野生型XynA延长了160分钟，其他酶学性质与野生型酶基本一致，该突变体酶可用于做饲料添加剂。

Description

对胰蛋白酶抗性提高的β-1,4-内切木聚糖酶及其制备方法与用途

技术领域

本发明涉及β-1,4-内切木聚糖酶，特别涉及到对胰蛋白酶抗性提高的β-1,4-内切木聚糖酶。

背景技术

木聚糖是半纤维素中含量最丰富的组分之一，在植物细胞壁中的含量仅次于纤维素，约占细胞干重的35％。广泛存在于农业副产品如玉米芯、麦麸、米糠、秸秆、甘蔗渣等之中，是一种重要的饲料原料。

木聚糖的主链由β-D-木糖残基经β-1,4-糖苷键连接，侧链上连有多种不同类型的取代基，比如主链木糖残基的C-2、C-3位可单独或同时发生乙酰化等，其化学结构见图1。

木聚糖的完全降解需要多种水解酶的共同参与，β-1,4内切木聚糖酶能够以内切方式作用于木聚糖主链产生不同长度的木寡糖和少量的木糖，木聚糖酶是木聚糖降解酶中最关键的酶。

动物对木聚糖的利用是在包括木聚糖酶在内的多种饲料用酶的作用下分解成寡糖和单糖之后吸收。

饲料用酶是在进入养殖动物消化道之后发挥作用的，在消化道中的蛋白酶对饲用酶的分解是影响饲用酶使用效率的重要原因，所以，具有蛋白酶抗性是饲用酶十分重要的性质。

目前，广泛使用的木聚糖酶对胰蛋白酶的抗性都较低，作为饲料用酶，其在动物消化道内受到胰蛋白酶的分解，作用效果受到了明显的影响。

发明内容

本发明的首要目的是提供一种对胰蛋白酶抗性提高的β-1,4-内切木聚糖酶，它是通过蛋白质工程技术对XynA分子的关键氨基酸残基进行改造后得到的一种对胰蛋白酶抗性提高的XynA突变体，克服作为饲料用酶的木聚糖酶对胰蛋白酶抗性差的缺点，提高木聚糖酶作为饲料用酶的使用效果和价值。

本发明是对β-1,4-内切木聚糖酶的基因(称为XynA基因)进行定点突变。由枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)中获得的β-1,4-内切木聚糖酶，已经被测序，GENBANK登录号为CP010052.1。该酶的成熟蛋白的氨基酸序列为SEQIDNO.1。

根据本发明所述的一种定点突变改造的XynA，是由氨基酸序列为SEQIDNO.1的β-1,4-内切木聚糖酶中制造多个氨基酸取代而产生的，对胰蛋白酶抗性提高的β-1,4-内切木聚糖酶，所述的氨基酸取代是第68和101位的取代。

根据本发明所述的定点突变改造的β-1,4-内切木聚糖酶的进一步特征，所述在第68位的氨基酸取代是用谷酰胺取代赖氨酸；在101位的氨基酸取代是用丝氨酸取代精氨酸；所述的定点突变改造的β-1,4-内切木聚糖酶的氨基酸序列为SEQIDNO.2。

本发明所述的作用于木聚糖的突变体β-1,4-内切木聚糖酶(XynA^K68Q/R101S)，经人工肠液(pH6.0，1mg/mL胰蛋白酶溶液)处理，其对胰蛋白酶的抗性半衰期比野生型酶延长了160分钟，其他酶学性质与野生型酶基本一致。

进一步地，本发明提供了一种DNA分子，其编码本发明所述的对胰蛋白酶抗性提高的β-1,4-内切木聚糖酶。

优选地，本发明所述的DNA分子的核苷酸序列为SEQIDNO.3。

本发明的另一个目的是提供一种载体，其含有本发明所述的DNA分子。

本发明的又一个目的是提供一种宿主细胞，其含有本发明所述的DNA分子，或者含有本发明所述的载体。

上述载体和宿主细胞都可以通过本领域公知的技术手段进行制备。

本发明还提供了本发明所述的对胰蛋白酶抗性提高的β-1,4-内切木聚糖酶的生产方法，包括：在适于β-1,4-内切木聚糖酶表达的条件下培养本发明所述的宿主细胞，并从宿主细胞中分离所述的β-1,4-内切木聚糖酶。

当本发明所述的DNA分子以合适的取向和正确的阅读框插入到所述的载体，或者转入所述的宿主细胞中，所述的DNA分子可以在相应的原核表达系统中表达。许多宿主-载体系统都可以用来表达蛋白质编码序列。宿主-载体系统包括但不限于：用噬菌体、质粒或粘粒转化的细菌；含有酵母载体的微生物，如酵母；用病毒感染的哺乳动物细胞系统；用病毒感染的昆虫细胞系统；用细菌感染的植物细胞系统。本发明优选的载体包括病毒载体、质粒、粘粒或者寡核苷酸。

本发明优选的宿主为原核系统如大肠杆菌BL21(DE3)；本发明优选的蛋白质表达方法为IPTG诱导表达。

附图说明

图1是木聚糖的化学结构。

图2为纯化后的XynAK68Q/R101SSDS-PAGE电泳检测图，其中，M为分子量Marker；1为纯化后的XynAK68Q/R101S样品。

图3为采用DNS法进行木聚糖酶活性的测定的原理图。

图4显示野生型及其突变体在胰蛋白酶溶液中的残留活性。

具体实施方式

本文中所采用的术语，除非另有说明，均为本领域技术人员所通常理解的含义。以下提供在本发明中使用的一些特殊术语的定义。

“wtXynA”表示野生型β-1,4-内切木聚糖酶，其基因以斜体wtXynA表示。

“XynA^K68Q/R101S”表示突变体β-1,4-内切木聚糖酶XynA^K68Q/R101S，其基因以XynA^K68Q/R101S表示。

实施例1：β-1,4-内切木聚糖酶基因的PCR扩增和测序

1、本发明以枯草芽孢杆菌来源的β-1,4-内切木聚糖酶基因(GENBANK：CP010052.1)序列作为参考，采用软件Primer5设计并合成两条寡核苷酸引物，试剂盒法提取枯草芽孢杆菌中的基因组，通过PCR法扩增XynA目的基因。

两条PCR引物如下：

正向引物F(SEQIDNO.4)：

5’CGGAATTCATGTTTAAGTTTAAAAAGAATTTCT3’；

反向引物R(SEQIDNO.5)：

5’CCAAGCTTTTACCACACTGTTACGTTAGA3’。

PCR扩增XynA基因的反应体系如下：

PCR程序设定为：

94℃预变性2分钟；

4℃，30s；56℃，30s；，68℃，1分钟；30个循环；

68℃，5分钟。

PCR扩增产物经1％的琼脂糖凝胶电泳后，用DNA回收试剂盒进行胶回收，得到大约650bp的片段。

实施例2：β-1,4-内切木聚糖酶基因(XynA)的TA克隆

1.在一个新的灭菌的PCR管中加入下列成分：

抽吸混匀并短暂离心，16℃水浴过夜。

连接产物转化DH5α感受态细胞扩增后用质粒抽提试剂盒抽提质粒，用PCR鉴定重组质粒，把PCR验证为阳性的菌株取菌液送样Invitrogen公司测序，确定测序成功。

实施例3：pET32a-XynA重组质粒的构建及转化

1.EcoRI、HindIII双酶切重组pMD18-T载体和载体pET32a；

表1EcoRI、HindIII双酶切pMD18-T-XynA和pET32a(单位：μL)

37℃双酶切30分钟后，1.5％琼脂糖凝胶电泳检测酶切效果。

2.酶切产物切胶回收，将酶切纯化回收的pET32a载体和目的基因XynA以浓度比1:3-1:10的比例混合，16℃过夜连接。

表2双酶切pET32a载体片段和XynA插入片段的连接：(单位：μL)

10×缓冲液	pET32a	XynA	T4DNA连接酶	H₂O	合计(μL)
						1.0	1.0	7.5	0.5	0.0	10.0

EcoRI和HindIII酶切鉴定重组质粒后，把验证为阳性的菌株取菌液送样Invitrogen公司测序，确定测序成功。

实施例4：定点突变

1、经过利用酶促反应理论和蛋白分子之间相互识别的原理，对以下位点的氨基酸进行定点突变：

(1)对于第68位氨基酸的氨基酸突变，设计引物如下：

XynA^K68Q

正向突变引物(SEQIDNO.6)：

5’GGAAATTTTGTTGTTGGTC*AAGGTTGGACTACAGG3’

反向突变引物(SEQIDNO.7)：

5’CCTGTAGTCCAACCTTG*ACCAACAACAAAATTTCC3’

其中*为突变碱基，引物交由北京奥科生物技术有限公司合成。

(2)对于第101位氨基酸突变，设计引物如下：

XynA^R101S

正向突变引物(SEQIDNO.8)：

5’CTTTATATGGTTGGACGAGC*TCACCTCTC3’

反向突变引物(SEQIDNO.9)：

5’GAGAGGTGAG*CTCGTCCAACCATATAAAG3’

PCR程序设定为：

94℃预变性2分钟；

94℃，30s；63℃，30s；68℃，65s；5个循环；

94℃，30s；59℃，30s；68℃，65s；25个循环；

68℃，5分钟。

PCR反应后连接测序。基因定点突变是采用重叠延伸PCR的方法，依次对2个位点进行突变，最终得到的DNA序列可表达为本发明所述的对胰蛋白酶抗性提高的β-1,4-内切木聚糖酶。

实施例5：野生型XynA与突变体XynA^K68Q/R101S基因分别导入大肠杆菌BL21(DE3)及重组蛋白的IPTG的诱导表达

1.将含量为200ng的野生型XynA质粒和重组XynA^K68Q/R101S质粒分别加入至含200μL感受态细胞的1.5mL离心管中，轻轻旋转混匀，冰浴30分钟；42℃热击90sec。取出立即冰浴3分钟，加入600μL的LB液体培养基，37℃，75rpm，缓慢摇动1h。将感受态细胞涂布于Amp⁺的LB固体培养基上，每个直径90mm的平板涂布200μL，37℃培养12h，抽提重组质粒，用EcoRI和HindIII酶切鉴定重组质粒。

2.重组蛋白的诱导表达

按照探索好的条件诱导表达蛋白酶：

(1)分别取50μL甘油保存的野生型重组菌，分别接种于1支5mL的含100μg/mLAmp的LB液体培养基中，37℃，250rpm过夜培养。

(2)过夜培养物按照1:100的比例接种2.5mL于含100μg/mLAmp的250mL的LB液体培养基中，37℃，250rpm培养至OD₆₀₀为1.0时加入IPTG至终浓度为0.5mM，37℃250rpm振荡培养，4h后收菌。

实施例6：野生型XynA及突变体XynA^K68Q/R101S重组蛋白的纯化及SDS-PAGE电泳检测

1.使用超声波细胞破碎仪对菌体进行细胞破壁，破壁前加入DEAE阴离子层析平衡缓冲液至25mL对菌液进行重悬。待菌液破壁完全澄清后，破碎液4℃10000g离心10分钟，收集上清即为蛋白样品粗提物，蛋白粗提物经过阴离子层析和Ni离子层析进行纯化，得到的Ni离子层析的洗脱峰经硫酸铵沉淀过夜后，用分子筛G-25脱盐，得到纯蛋白，步骤如下：

(1)首先用pH7.4的0.02mol/LNaH₂PO₄缓冲液平衡层析柱2-3个柱体积。

(2)待基线平衡后，以0.5mL/分钟的流速上样。

(3)上样结束后，以同样的流速，分别用平衡缓冲液和含1mol/LNaCl的洗脱缓冲液洗脱，280nm紫外吸收法检测，收集得到的淋洗峰和洗脱峰。

(4)阴离子交换层析得到的淋洗峰作为Ni离子层析的上样样品。首先用pH6.5的含0.02mol/LNaH₂PO₄和0.5mol/LNaCl的缓冲液平衡层析柱2个柱体积。

(5)然后以0.5mL/分钟的流速上样。

(6)再以相同的缓冲液，0.5mL/分钟的流速洗脱2个柱体积。

(7)最后用含100mM咪唑的洗脱缓冲液，以0.5mL/分钟的流速洗脱1.5个柱体积，280nm紫外吸收法检测并收集所出的洗脱峰。

(8)洗脱峰经80％饱和硫酸铵沉淀后用5mLpH7.4的0.02moL/LNaH₂PO₄缓冲液溶解。

(9)进行阳离子交换层析。

(10)收集得到的酶液，进行蛋白含量和酶活性的测定。将收集到的酶液取1mL用9mL95％酒精-20℃沉淀过夜，离心干燥蛋白后，进行SDS-PAGE分析。

2.SDS-PAGE电泳检测

(1)配置10mL15％的分离胶，混匀后用移液枪往玻板中灌胶，直到离短玻板顶部2～3厘米处停止，然后用蒸馏水封住胶面，可轻轻抬起制胶器一端然后放下使胶面平整，聚合40分钟后到弃蒸馏水，用滤纸吸去多余水分；

(2)配置4mL5％的浓缩胶，均匀的灌在分离胶之上，插入相应规格的梳子同时应避免产生气泡，聚合30分钟待胶凝固；

(3)装好电泳槽，在槽内灌电泳缓冲液，体积宜大于电泳槽体积的一半，把制好的胶移入电泳槽中，小心拔去样品梳子；

(4)依次点样，点样量不宜过多，15μL每孔为合适；

(5)电泳开始时先设置120V跑胶，指示剂至浓缩胶部分将电压改为180V继续电泳，目的条带跑到中间位置时可停止电泳；

(6)小心剥下凝胶，考马斯亮蓝R-250染色30分钟后，脱色液脱色至背景较浅蛋白条带清晰即可；

(7)凝胶成像并观察结果。

由电泳检测结果：在20.4KD处得到单一的蛋白条带，如图2。表明样品经纯化后得到XynA^K68Q/R101S。

实施例7：野生型XynA及突变体XynA^K68Q/R101S重组蛋白的胰蛋白酶抗性检测

1.纯化后的酶液与人工模拟肠液(pH6.810mg/mL胰蛋白酶溶液)按照质量比10:1混合，于37℃保温，每隔30分钟取样，DNS法测定酶活力，以胰蛋白酶溶液处理0分钟的酶液活力为100％，计算各组酶的相对活力，考查野生型酶在胰蛋白酶中的稳定性。实验共进行3批次的培养，每批每个样品设2个平行进行测量，残余酶活力取6个测量数据的平均值。

2.酶活力测定：

本实验采用DNS法进行木聚糖酶活性的测定，此法的原理是利用DNS(3,5－二硝基水杨酸)溶液与还原糖溶液共热后被还原成棕红色的氨基化合物(见图3)，并且在一定范围内生成的棕红色氨基化合物与体系中还原糖的量成正比关系，因此可用比色测定酶活，该法具有操作简便，快速，且杂质干扰少的优点。具体酶活力测定包括标准曲线的制作，样品活性组及样品灭活组的制作。

(1)标准曲线的制作

标准木糖溶液浓度：1mg/mL

取96孔板一个，按下表依次进行，做出标准曲线，如下表：

(2)木聚糖酶活力的测定(DNS法)

将燕麦木聚糖以质量分数1％的浓度，溶解于pH6.0的0.04moL/LNa₂HPO₄-0.02moL/L柠檬酸缓冲液，做为底物。酶溶液也用相同的缓冲液适当稀释。取70μL底物溶液加10μL稀释过的酶溶液，60℃反应10分钟，加入200μL的DNS试剂终止反应，100℃显色10分钟，冷却后，于540nm处测量反应液的光吸收值，根据标准曲线计算生成的还原糖的量，同时做底物+灭活酶的对照。

木聚糖酶的活力单位(Μ)定义为：在上述测活条件下，每分钟水解木聚糖生成1μmoL木糖所需要的酶量。

计算公式为：Ea＝N×V₁×C×6.667/(V₂×T)

式中：Ea为木聚糖酶的酶活力，Μ/mL；

N：酶液的稀释倍数；

V₁：反应液的最终体积，mL；

C：从标准曲线上计算得出的木糖的浓度，mg/mL；

(C＝活性组还原糖含量—灭活组还原糖含量)

V₂：反应液中酶液的体积，mL；

T：酶解反应的时间，分钟；

6.667：换算系数(将mg/mL转换为μmoL/mL)。

3.XynA及突变体XynA^K68Q/R101S重组蛋白在胰蛋白酶溶液中的稳定性

在37℃用人工模拟肠液处理野生型和突变体，每隔30分钟取样测野生型和突变体的残留酶活力，结果表明：XynA^K68Q/R101S的残留酶活力明显比野生型XynA高，如图3。对野生型及突变体在胰蛋白酶溶液中稳定性的半衰期作图分析，XynA的半衰期为127分钟；XynA^K68Q/R101S的半衰期为287分钟，比野生型延长了160分钟。

Claims

1.一种对胰蛋白酶抗性提高的β-1,4-内切木聚糖酶，其特征在于：它是由氨基酸序列为SEQIDNO.1的β-1,4-内切木聚糖酶中制造两个氨基酸取代而产生的，对胰蛋白酶抗性更强的β-1,4-内切木聚糖酶，所述的氨基酸取代是第68位和101位的取代。

2.根据权利要求1所述的对胰蛋白酶抗性提高的β-1,4-内切木聚糖酶，其特征在于：所述在第68位的氨基酸取代是用谷酰胺取代赖氨酸；在101位的氨基酸取代是用丝氨酸取代精氨酸；所述的定点突变改造的β-1,4-内切木聚糖酶的氨基酸序列为SEQIDNO.2。

3.一种DNA分子，其特征在于：其编码权利要求2所述的对胰蛋白酶抗性提高的β-1,4-内切木聚糖酶。

4.根据权利要求3所述的DNA分子，其特征在于：其核苷酸序列为SEQIDNO.3。

5.一种载体，其特征在于：其含有权利要求3或4所述的DNA分子。

6.一种宿主细胞，其特征在于：其含有权利要求3或4所述的DNA分子，或者含有权利要求5所述的载体。

7.一种根据权利要求1所述的对胰蛋白酶抗性提高的β-1,4-内切木聚糖酶的生产方法，其特征在于，所述方法包括：在适于β-1,4-内切木聚糖酶表达的条件下培养权利要求6所述的宿主细胞，并从菌体中分离所述的β-1,4-内切木聚糖酶。

8.根据权利要求1所述的胰蛋白酶抗性提高的β-1,4-内切木聚糖酶在饲料和食品中的应用。