CN105112333A - 一种具有良好肠道定殖能力的长双歧杆菌及筛选方法和应用 - Google Patents
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- CN105112333A CN105112333A CN201510549092.3A CN201510549092A CN105112333A CN 105112333 A CN105112333 A CN 105112333A CN 201510549092 A CN201510549092 A CN 201510549092A CN 105112333 A CN105112333 A CN 105112333A
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Abstract
本发明涉及一种具有良好肠道定殖能力的长双歧杆菌，名称为CCFM？729，分类名称为Bifidobacterium？longum，保藏编号为：CGMCC？No.10932，保藏日期：2015年05月28日，保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物菌种保藏中心，北京市朝阳区北辰西路1号院3号。本发明长双歧杆菌(Bifidobacterium？longum)CCFM？729最初来源于出生一周龄的婴儿粪便，体外实验表明其具有耐酸、耐胆盐特性，细胞实验表明其能很好地粘附结肠癌细胞HT-29，动物实验表明其能在小鼠体内定殖10天甚至更长的一段时间，其在肠道定殖能力方面的优良特性，具有巨大的应用及商业价值，其可用于制作双歧杆菌菌粉以及与嗜热链球菌、保加利亚乳杆菌联合发酵生产酸奶，制成益生菌巧克力等，具有广阔的应用前景。
Description
技术领域
本发明属于微生物技术领域，尤其是一种具有良好肠道定殖能力的长双歧杆菌及用途。
背景技术
双歧杆菌作为重要的肠道益生菌，其在抑制肠道有害菌的生长繁殖、抵抗病原茵的感染方面发挥着重要作用，双歧杆菌能够产生醋酸、丙酸、丁酸和乳酸等有机酸刺激肠道蠕动，促进排便，防止便秘。双歧杆菌还能够刺激人体免疫系统，从而提高抗病能力、延缓衰老等。然而，双歧杆菌如果能够发挥上述作用，必须能够在人体内长期存在，即定殖。研究发现，部分双歧杆菌具有肠道定殖的能力。比如，S.Fujiwara等发现具有链霉素和利福平抗性的长双歧杆菌SBT2929能够在人体内长期定殖并且影响肠道微生物的组成和代谢；NathanP.McNulty等发现，Bifidobacteriumanimalissubsp.lactis能够在摄入高糖膳食的无菌鼠体内定殖28天以上。
检测双歧杆菌能否在肠道内定殖的方法主要有三种：一是利用双歧杆菌的选择培养基将粪便梯度稀释后平板涂布进行菌落计数；二是利用API50CHL的试剂盒结合末端转录PCR进行粪便中双歧杆菌的鉴定；三是利用DGGE(变性梯度凝胶电泳)的方法，提取粪便的宏基因组然后扩增菌的16SV3区，与目标双歧杆菌进行条带比对确定双歧杆菌能否在肠道内定殖。平板计数的方法，存在比较明显的缺陷：由于部分双歧杆菌存在比较苛刻的生存条件，所以不能够在培养基上进行培养，因此即使是能够在肠道内定殖的双歧杆菌用此方法鉴定也可能出现假阴性的结果；并且，选择培养基不能够将不同种的双歧杆菌很好地区分开来。试剂盒的方法较为新颖，弥补了选择培养基存在的不足，可以较好地进行双歧杆菌定殖能力的考量。同时，PCR-DGGE的方法由于技术相对比较成熟，且操作简便，能够很好地区分不同种的双歧杆菌，且从条带的亮度上可以大致地看出双歧杆菌在肠道内的定殖能力强弱。
人体肠道中双歧杆菌的数量随年龄的增长比例在减少，肠道微生物种类和比例的失衡会带来许多的健康问题，诸如便秘、腹泻、免疫力低下等，因此需要采取措施使肠道中的双歧杆菌增殖。使肠道中双歧杆菌增加的办法有两种：一是口服含双歧杆菌的饮品或生物制剂；二是补充双歧因子(如低聚糖等)促进人体固有双歧杆菌的繁殖。鉴于WHO对低聚糖，如低聚木糖、低聚果糖等的推荐摄入量，实验表明其对双歧杆菌的增殖存在一定的局限性且效果不太明显，因此补充双歧因子的方法作用不大。口服含双歧杆菌的饮品或者生物制剂，只要双歧杆菌能够克服肠道的不利环境，就能在肠道内直接地发挥作用。所以，筛选出能够在肠道内定殖的双歧杆菌并且做成相关产品，具有巨大的应用及商业价值。
通过检索，尚未发现与本发明专利申请相关的专利公开文献。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术的不足之处，提供一种具有耐酸、耐胆盐特性，细胞实验表明其能很好地粘附结肠癌细胞HT-29，动物实验表明其能在小鼠体内定殖10天甚至更长的一段时间，其在肠道定殖能力方面的优良特性，具有巨大的应用及商业价值的具有良好肠道定殖能力的长双歧杆菌及用途，该长双歧杆菌能够应用于生产双歧杆菌菌粉、酸奶和双歧杆菌益生菌巧克力中。
本发明解决其技术问题所采用的技术方案是：
一种具有良好肠道定殖能力的长双歧杆菌，名称为CCFM729，分类名称为Bifidobacteriumlongum，保藏编号为：CGMCCNo.10932，保藏日期：2015年05月28日，保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物菌种保藏中心，北京市朝阳区北辰西路1号院3号。
而且，所述长双歧杆菌具有如下性质：
⑴具有耐酸性，在pH3.0-9.0环境条件下生长良好，在pH2.5环境下存活良好；
⑵能够耐胆盐，在0.3％胆盐存在的条件下存活良好；
⑶具有粘附性，能够较好地粘附在结肠癌细胞HT-29上；
⑷能够在小鼠体内定殖10天以上的时间。
一种如上所述的具有良好肠道定殖能力的长双歧杆菌的筛选方法，步骤如下：
⑴收集若干份出生一周龄的婴儿粪便，将粪便样品在含有低聚果糖的MRS+0.5‰-1‰(质量百分数)半胱氨酸培养基中富集12h；
⑵梯度稀释涂布于添加0.02％(质量百分数)溴甲酚紫的MRS+0.5‰-1‰(质量百分数)半胱氨酸的固体平板上，培养24-48h；
⑶挑取变色圈明显的单菌落，反复划线得到纯化的单菌落；
⑷将纯化的单菌落液体培养24h后，进行果糖-6-磷酸盐磷酸酮酶的测定，快速鉴定其是否为双歧杆菌；
⑸选取F6PPK阳性的菌，提取其16SrDNA进行测序；
⑹选取测序结果鉴定为双歧杆菌的乳酸菌进行耐酸、耐胆盐以及粘附试验；
⑺选取耐酸、耐胆盐以及粘附性能好的双歧杆菌进行肠道定殖能力试验，其中，耐酸：pH＝2～9，耐胆盐：胆盐0.3％、质量分数，粘附试验：对结肠癌细胞HT-29具有粘附能力；
⑻扩增出小鼠粪便菌群的16SV3区，变性梯度凝胶电泳检测小鼠粪便中的目标菌，筛选出肠道定殖能力优良的双歧杆菌，即得具有良好肠道定殖能力的长双歧杆菌。
而且，具体步骤如下：
(一)乳酸菌的分离筛选
⑴收集若干份出生一周龄的婴儿粪便，将粪便样品在含有低聚果糖的MRS+0.5‰-1‰(质量百分数)半胱氨酸培养基中富集12h；
⑵将粪便样品进行梯度稀释后涂布于添加了质量百分数为0.02％溴甲酚紫的MRS+0.5‰-1‰半胱氨酸的固体平板上，培养24-48h；
⑶选取变色圈明显，并且符合乳酸菌基本形态的单菌落进行平板划线纯化，筛选分离出乳酸菌；
⑷将上述单菌落于液体MRS+0.5‰-1‰(质量百分数)半胱氨酸中培养24h后进行革兰氏染色，选取革兰氏阳性菌进行后续试验；
(二)双歧杆菌的初步鉴定：果糖-6-磷酸盐磷酸酮酶测定法
⑴将步骤(一)所筛选得到的乳酸菌在液体MRS+0.5‰-1‰(质量百分数)半胱氨酸中培养24h，然后取1mL培养物8000rpm离心2min；
⑵用含0.05％(质量百分数)半胱氨酸的pH＝6.5的0.05MKH2PO4溶液洗涤两次；
⑶重悬于200uL添加了0.25％(质量百分数)TritonX-100的上述磷酸盐缓冲液；
⑷添加50uL浓度为6mg/mL氟化钠和10mg/mL碘乙酸钠的混合液以及50uL浓度为80mg/mL的果糖-6-磷酸，37℃孵育1h；
⑸添加300uL浓度为0.139g/mL、pH为6.5的盐酸羟胺，并于室温放置10min；
⑹分别添加200uL15％(质量百分数)的三氯乙酸和4MHCl；
⑺添加200uL含有5％(质量百分数)三氯化铁的0.1MHCl，若体系迅速变为红色，即为F6PPK阳性，可初步断定其为双歧杆菌；
(三)双歧杆菌的分子生物学鉴定
⑴单菌的基因组抽提
A.将步骤(二)所筛选得到的乳酸菌培养过夜，取培养过夜的菌悬液1mL于1.5mL离心管，10000rpm离心2min，弃上清得菌体；
B.用1mL无菌水吹打洗菌体后，10000rpm离心2min，弃上清得菌体；
C.加入200uLSDS裂解液，80℃水浴30min；
D.加入酚-氯仿溶液200uL于菌体裂解液中，其中酚-氯仿溶液的组成成分及体积比为：Tris饱和酚：氯仿：异戊醇＝25：24：1，颠倒混匀后，12000rpm离心5-10min，取上清200uL；
E.加入400uL冰乙醇或冰异丙醇于200uL上清中，-20℃静置1h，12000rpm离心5-10min，弃上清；
F.加入500uL70％(体积百分数)冰乙醇重悬沉淀，12000rpm离心1-3min，弃上清；
G.60℃烘箱烘干，或者自然晾干；
H.50uLddH2O重溶沉淀以备PCR；
⑵16SrDNAPCR
A.细菌16SrDNA50uLPCR反应体系：
10×Taqbuffer，5uL；dNTP，5uL；27F，0.5uL；1492R，0.5uL；Taq酶，0.5uL；
模板，0.5uL；ddH2O，38uL。
B.PCR条件：
95℃5min；95℃10s；55℃30s；72℃30s；step2-430×；72℃5min；12℃2min；
⑶制备1％琼脂糖凝胶，之后将PCR产物与10000×loadingbuffer混合，上样量5uL，120V跑30min，然后进行凝胶成像；
⑷将16SrDNA的PCR产物进行测序分析，将得到的序列结果使用BLAST在GeneBank中进行搜索和相似性比对，选取测序结果鉴定为双歧杆菌的乳酸菌，-80℃保藏备用；
(四)双歧杆菌的耐酸、耐胆盐检测
⑴取步骤(三)中-80℃保藏的双歧杆菌，在MRS+0.5‰-1‰(质量百分数)半胱氨酸的固体平板划线一次，在厌氧工作站培养24-48h之后转接到MRS+0.5‰-1‰(质量百分数)半胱氨酸的液体试管当中，传代两次；
⑵以4％的接种量分别接种到pH＝7.0±0.2的MRS+0.5‰-1‰(质量百分数)半胱氨酸的液体试管，其为空白对照组；pH＝2、pH＝2.5、pH＝3、pH＝4、pH＝5、pH＝6、pH＝8、pH＝9的MRS+0.5‰-1‰(质量百分数)半胱氨酸的液体试管，该几组为耐酸实验组；MRS+0.5‰-1‰(质量百分数)半胱氨酸+0.1％、0.2％、0.3％、0.4％牛胆盐的液体试管中，该几组为耐胆盐实验组；
⑶将接种于上述液体试管当中的菌悬液振荡混匀后，迅速将其以200uL/孔的量转移到96孔板上，每组做三个平行，每隔两个小时用酶标仪测定其OD600的值；
⑷在每一个时间点，将实验组数据与对照组数据进行比较，数据相差越小说明其耐受性能越好，比较菌的耐受性强弱；
⑸因人体肠道内环境中胃酸的pH在2.5左右，分泌的胆盐含量为0.1％～0.5％，摄入的活菌通过肠道的时间在2小时，所以选取在2小时内在pH＝2.5环境下存活良好、在0.3％胆盐存在的条件下存活良好的双歧杆菌进行后续试验；
(五)双歧杆菌对结肠癌细胞HT-29的粘附能力测定
⑴将放置于液氮罐中的HT-29细胞的冻存管迅速置于37℃水浴锅中使其融化；
⑵将其与PRMI-1640完全培养基混合后，置于培养皿中，于5％二氧化碳培养箱37℃传代培养，每隔一天换一次培养液；
其中，所述PRMI-1640完全培养基为PRMI-1640基础培养基+10％(质量百分数)胎牛血清+1％(质量百分数)青链霉素；
⑶待传代细胞3-4次后，再次长满80％细胞培养板之后，胰酶消化，PBS清洗后，离心，用PRMI-1640基础培养基调整细胞浓度为105cells/mL，并且在事先置入载玻片的细胞培养板中培养6h；
⑷将步骤(四)所筛选得到的双歧杆菌过夜培养，用PRMI-1640基础培养基调整过夜培养的菌悬液的浓度为107cfu/mL，与上述HT-29细胞共培养4h；
⑸PBS清洗4次，然后用甲醇固定5-10min，甲醇的添加量以铺满细胞培养板为宜，之后用姬姆萨染液进行染色；
⑹用PBS洗液冲洗染液至无色，于37℃培养箱干燥过夜或者常温放置至自然干燥；
⑺取出载玻片，在100倍的油镜下进行观察，选取属于具有强粘附能力的乳酸菌；其中，20个随机选取的视野当中总的细菌数大于100个，即属于粘附能力强的菌；
(六)双歧杆菌在小鼠肠道内的定殖情况测定
试验小鼠为6-8周龄SPF级雌性小鼠，每天灌胃重悬于生理盐水中的步骤(五)所筛选得到的乳酸菌，菌浓度为108cfu/mL，灌胃周期为14天，在灌胃前采集小鼠粪便一次，灌胃中和灌胃结束后隔天采集小鼠粪便，之后用FastDNAkitforsoil提取小鼠的粪便基因组，扩增基因组的16SV3区，变性梯度凝胶电泳检测小鼠粪便中的目标菌，筛选出肠道定殖能力优良的双歧杆菌，即得具有良好肠道定殖能力的长双歧杆菌。
如上所述的具有良好肠道定殖能力的长双歧杆菌在生产双歧杆菌菌粉中的应用。
而且，所述双歧杆菌菌粉的制备步骤如下：
⑴培养基的制备：长双歧杆菌的发酵培养基为添加质量百分数为0.5‰-1‰的L-半胱氨酸的MRS培养基，pH为6.8±0.2；
⑵保护剂的制备：使用水与冻干保护剂原料混合，制备得到含有100g/L～150g/L脱脂奶粉、100g/L～200g/L海藻糖、100g/L～150g/L蔗糖、余量为水的冻干保护剂；
⑶将长双歧杆菌CCFM729菌种按照2-4％的接种量接种到在115℃下灭菌20min的步骤⑴中培养基中，然后在温度37℃的条件下于厌氧工作站中培养24h，6000×g离心15min；用pH＝7.2的磷酸盐缓冲液清洗2-3次；之后用步骤⑵中冻干保护剂重悬，使菌的浓度达到1010cfu/mL；然后将该菌悬液在37℃厌氧的条件下培养1h，再在-20℃预冻12h；最后进行真空冷冻干燥得到所述的双歧杆菌菌粉。
如上所述的具有良好肠道定殖能力的长双歧杆菌在生产酸奶中的应用或在生产双歧杆菌益生菌巧克力中的应用。
而且，所述长双歧杆菌发酵菌株复配使用。
而且，所述发酵菌株为嗜热链球菌和保加利亚乳杆菌。
而且，所述酸奶的制备步骤如下：
⑴首先制作双歧杆菌酸奶发酵剂，所述双歧杆菌酸奶发酵剂为权利要求6所述的双歧杆菌菌粉；
⑵培养基的制备：将脱脂乳粉按照12-15：100(g/mL)的比例与水混合，然后105℃灭菌20min，得脱脂乳；
⑶将步骤⑴中双歧杆菌酸奶发酵剂与嗜热链球菌、保加利亚乳杆菌按照质量比为1:1:1的比例添加到步骤⑵的脱脂乳中，搅拌均匀；
⑷发酵8-12h，发酵温度为：37℃，发酵完成后在4℃冷藏8h左右，即得酸奶；
或者，所述双歧杆菌益生菌巧克力的制备步骤如下：
⑴首先制作双歧杆菌菌粉，所述双歧杆菌菌粉为权利要求6所述的双歧杆菌菌粉；
⑵将市售可可粉、可可脂、砂糖按比例混合并于热水中不断搅拌至膏状；
⑶将步骤⑴中双歧杆菌菌粉加入到步骤⑵所得膏状物中，并迅速搅拌，倒入模具，自然冷却，即得益生菌巧克力。
本发明取得的优点和有益效果是：
1、本发明长双歧杆菌(Bifidobacteriumlongum)CCFM729最初来源于出生一周龄的婴儿粪便，体外实验表明其具有耐酸、耐胆盐特性，细胞实验表明其能很好地粘附结肠癌细胞HT-29，动物实验表明其能在小鼠体内定殖10天甚至更长的一段时间，其在肠道定殖能力方面的优良特性，具有巨大的应用及商业价值。
2、本发明长双歧杆菌可以应用于制作双歧杆菌菌粉以及与嗜热链球菌、保加利亚乳杆菌联合发酵生产酸奶等，制作出来的酸奶具有较佳的口感和质地，具有广阔的应用前景。
3、本发明长双歧杆菌可以经发酵后真空冷冻干燥制成菌粉，并与可可粉、可可脂、砂糖等相结合制作成益生菌巧克力，制成的双歧杆菌益生菌巧克力的活菌数达到109cfu/g，兼具口感丝滑、美味以及改善肠道菌群的益生功能，将拥有广阔的市场前景。
附图说明
图1为本发明长双歧杆菌CCFM729的菌落形态图；
图2为本发明长双歧杆菌CCFM729的菌体形态(1000×)图；
图3为本发明长双歧杆菌CCFM729的生长曲线图；
图4为本发明长双歧杆菌CCFM729对结肠癌细胞HT-29的粘附图；
图5为本发明长双歧杆菌CCFM729在小鼠肠道内的定殖情况DGGE示意图，其中Pre、gavage、postday2、postday10以及M分别表示灌胃双歧杆菌前、灌胃时、灌胃结束2天、灌胃结束10天以及Marker。
具体实施方式
下面结合实施例，对本发明进一步说明；下述实施例是说明性的，不是限定性的，不能以下述实施例来限定本发明的保护范围。
本发明中所使用的原料，如无特殊说明，均为常规的市售产品；本发明中所使用的方法，如无特殊说明，均为本领域的常规方法。
一种具有良好肠道定殖能力的长双歧杆菌，名称为CCFM729，分类名称为Bifidobacteriumlongum，保藏编号为：CGMCCNo.10932，保藏日期：2015年05月28日，北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物菌种保藏中心。
利用形态特征、培养性状和生理生化特征等微生物学特性以及16SrDNA等分子生物学手段对该乳酸菌鉴定为长双歧杆菌(Bifidobacteriumlongum)CCFM729进行检测，该长双歧杆菌CCFM729的生物学特性如下：
菌落特征：在MRS+0.5‰(质量百分数)半胱氨酸的培养基上生长良好，形成乳白色、半透明、凸面圆形菌落，直径约3mm，菌落表面光滑、湿润，边缘整齐，如图1所示。细胞形态长而弯曲，棍棒状，部分呈哑铃形，无运动性，不产芽孢，如图2所示。
生长特性：该菌株的最低生长温度为20℃，最高生长温度为45℃，该菌株以37℃的生长温度为最佳，最高和最低初始生长pH为9.0和3.0，最适生长初始pH为6.8；本发明长双歧杆菌CCFM729菌株的延迟期相对较短，4h左右开始进入对数生长期12h就达到稳定期。生长曲线如图3所示。
上述具有良好肠道定殖能力的长双歧杆菌是通过大量实验从若干份婴儿粪便中筛选出来的，其具体筛选方法如下：
(一)乳酸菌的分离筛选
⑴收集若干份出生一周龄的婴儿粪便，将粪便样品在含有低聚果糖的MRS+0.5‰-1‰(质量百分数)半胱氨酸培养基中富集12h；
⑵将粪便样品进行梯度稀释后涂布于添加了质量百分数为0.02％溴甲酚紫的MRS+0.5‰-1‰半胱氨酸的固体平板上，培养24-48h；
(3)选取变色圈明显，并且符合乳酸菌基本形态(乳白色、半透明、圆形、菌落表面湿润、边缘整齐等)的单菌落进行平板划线纯化，筛选分离出乳酸菌；
(4)将上述单菌落于液体MRS+0.5‰-1‰(质量百分数)半胱氨酸中培养24h后进行革兰氏染色，选取革兰氏阳性菌进行后续试验。
(二)双歧杆菌的初步鉴定(F6PPK测定)
⑴将步骤(一)中所筛选得到的乳酸菌在液体MRS+0.5‰-1‰半胱氨酸中培养24h，然后取1mL培养物8000rpm离心2min；
⑵用含0.05％半胱氨酸的pH＝6.5的0.05MKH2PO4洗涤两次；
⑶重悬于200uL添加了0.25％TritonX-100的上述磷酸盐缓冲液；
⑷添加50uL浓度为6mg/mL氟化钠和10mg/mL碘乙酸钠的混合液以及50uL浓度为80mg/mL的果糖-6-磷酸，37℃孵育1h；
⑸添加300uL浓度为0.139g/mL、pH为6.5的盐酸羟胺，并于室温放置10min；
⑹分别添加200uL15％的三氯乙酸和4MHCl；
⑺添加200uL含有5％三氯化铁的0.1MHCl，若体系迅速变为红色，即为F6PPK阳性，可初步断定其为双歧杆菌。
(三)双歧杆菌的分子生物学鉴定
⑴单菌的基因组抽提
A.取培养过夜的菌悬液1mL于1.5mL离心管，10000rpm离心2min，弃上清得菌体；
B.用1mL无菌水吹打洗菌体后，10000rpm离心2min，弃上清得菌体；
C.加入200uLSDS裂解液，80℃水浴30min；
D.加入酚-氯仿(Tris饱和酚：氯仿：异戊醇的体积比为25：24：1)200uL于菌体裂解液中，颠倒混匀后12000rpm离心5-10min，取上清200uL；
E.加入400uL冰乙醇(或冰异丙醇)于200uL上清中，-20℃静置1h左右，12000rpm离心5-10min，弃上清；
F.加入500uL70％(体积百分数)冰乙醇重悬沉淀，12000rpm离心1-3min，弃上清；
G.60℃烘箱烘干，或者自然晾干；
H.50uLddH2O重溶沉淀以备PCR。
⑵16SrDNAPCR
A.细菌16SrDNA50uLPCR反应体系：
10×Taqbuffer，5uL；dNTP，5uL；27F，0.5uL；1492R，0.5uL；Taq酶，0.5uL；
模板，0.5uL；ddH2O，38uL。
B.PCR条件：
95℃5min；95℃10s；55℃30s；72℃30s；step2-430×；72℃5min；12℃2min；
⑶制备1％琼脂糖凝胶，之后将PCR产物与10000×loadingbuffer混合，上样量5uL，120V跑30min，然后进行凝胶成像。
⑷将16SrDNA的PCR产物进行测序分析，将得到的序列结果使用BLAST在GeneBank中进行搜索和相似性比对，选取测序结果鉴定为双歧杆菌的乳酸菌，-80℃保藏备用。
(四)长双歧杆菌CCFM729生长曲线的绘制及耐酸、耐胆盐检测
取-80℃保藏的长双歧杆菌CCFM729，将其在MRS+0.5‰半胱氨酸的固体平板上划线培养。在37℃厌氧工作站培养48小时后，从生长良好的长双歧杆菌单菌落上挑取双歧杆菌细胞接种到MRS+0.5‰半胱氨酸的液体培养基中于厌氧工作站内静置培养36小时，培养温度为37℃。然后按2％的接种量将此活化后的长双歧杆菌CCFM729培养液接种到MRS+0.5‰半胱氨酸的液体培养基中于厌氧工作站内静置培养36小时，培养温度为37℃，每隔3小时取5mL培养液使用紫外分光光度计测600nm下的OD值并进行梯度稀释后平板涂布计数，根据结果绘制长双歧杆菌CCFM729的生长曲线，其结果如图3所示。从图3中可以看出：长双歧杆菌CCFM729在MRS+0.5‰半胱氨酸的培养基中生长迅速，延滞期较短，大约在3h之后进入对数期，21h左右进入稳定期。随着培养时间的延长，菌株生长产酸，pH不断降低，进入稳定期后，pH下降趋势渐缓。36h培养结束时，培养液的pH值为4.12，培养液中活菌浓度可以达到5.6×109cfu/mL。
耐酸、耐胆盐检测：(1)取-80℃保藏的双歧杆菌，在MRS+0.5‰-1‰(质量百分数)半胱氨酸的固体平板划线一次，在厌氧工作站培养24-48h之后转接到MRS+0.5‰-1‰(质量百分数)半胱氨酸的液体试管当中，传代两次；
(2)以4％的接种量分别接种到pH＝7.0±0.2的MRS+0.5‰-1‰(质量百分数)半胱氨酸的液体试管(空白对照组)；pH＝2、pH＝2.5、pH＝3、pH＝4、pH＝5、pH＝6、pH＝8、pH＝9的MRS+0.5‰-1‰(质量百分数)半胱氨酸的液体试管(耐酸实验组)；MRS+0.5‰-1‰(质量百分数)半胱氨酸+0.1％、0.2％、0.3％、0.4％牛胆盐的液体试管中(耐胆盐实验组)；
(3)将接种于上述液体试管当中的菌悬液振荡混匀后，迅速将其以200uL/孔的量转移到96孔板上，每组做三个平行，每隔两个小时用酶标仪测定其OD600的值；
(4)在每一个时间点，将实验组数据与对照组数据进行比较，数据相差越小说明其耐受性能越好，比较菌的耐受性强弱；
(5)因人体肠道内环境中胃酸的pH在2.5左右，分泌的胆盐含量约为0.3％，摄入的活菌通过肠道的时间在2小时左右，所以选取在2小时内在pH＝2.5环境下存活良好、在0.3％胆盐存在的条件下存活良好的双歧杆菌进行后续试验。
经检测，该菌具有耐酸性，在pH3.0-9.0环境条件下生长良好，在pH2.5环境下存活良好；
且其能够耐胆盐，在0.3％胆盐存在的条件下存活良好。
(五)长双歧杆菌CCFM729对结肠癌细胞HT-29的粘附能力测定
⑴将放置于液氮罐中的HT-29细胞的冻存管迅速置于37℃水浴锅中使其融化；
⑵将其与PRMI-1640完全培养基(PRMI-1640基础培养基+10％胎牛血清+1％青链霉素)混合后，置于培养皿中，于5％二氧化碳培养箱37℃传代培养，每隔一天换一次培养液；
⑶待传代细胞3-4次后，再次长满(80％)细胞培养板之后，胰酶消化，PBS清洗后，离心，用PRMI-1640基础培养基调整细胞浓度为105cells/mL，并且在事先置入载玻片的细胞培养板中培养6h；
⑷将步骤(四)所筛选得到的双歧杆菌过夜培养，用PRMI-1640调整过夜培养的菌悬液的浓度为107cfu/mL，与上述HT-29细胞共培养4h；
⑸PBS清洗4次，然后用甲醇固定5-10min，甲醇的量以铺满细胞培养板为宜，之后用姬姆萨染液进行染色；
⑹用PBS洗液冲洗染液至无色，于37℃培养箱干燥过夜(或者常温放置至自然干燥)；
⑺用100倍的油镜进行观察，如图4所示。从图4结果可以看出，长双歧杆菌CCFM729能够很好地粘附于结肠癌细胞HT-29的表面，且按照C.N.JACOBSEN的说法，长双歧杆菌CCFM729属于具有强粘附能力的乳酸菌。
(六)长双歧杆菌CCFM729在小鼠肠道内的定殖情况测定
试验小鼠为6-8周龄SPF级雌性小鼠，每天灌胃重悬于生理盐水中的长双歧杆菌CCFM729，菌浓度为108cfu/mL。灌胃周期为14天，在灌胃前采集小鼠粪便一次，灌胃中和灌胃结束后隔天采集小鼠粪便。之后用FastDNAkitforsoil提取小鼠的粪便基因组，扩增基因组的16SV3区，然后跑DGGE，结果如图5所示。由图5的结果可以看出，长双歧杆菌CCFM729在灌胃之前在小鼠的粪便中检测不到，在灌胃中可以检测到，在灌胃结束后的2、4、6、8、10天均可以检测到，由此结果可以推测，长双歧杆菌CCFM729可以在小鼠体内定殖至少10天，甚至是更长的一段时间。
本发明具有良好肠道定殖能力的长双歧杆菌具有如下性质：
⑴具有耐酸性，在pH3.0-9.0环境条件下生长良好，在pH2.5环境下存活良好；
⑵能够耐胆盐，在0.3％胆盐存在的条件下存活良好；
⑶具有粘附性，能够较好地粘附在结肠癌细胞HT-29上；
⑷能够在小鼠体内定殖10天，甚至更长的时间。
本发明具有良好肠道定殖能力的长双歧杆菌的相关应用：
应用例1：应用于双歧杆菌菌粉的制作中
(1)培养基的制备：所述长双歧杆菌的发酵培养基为添加质量百分数0.5‰L-半胱氨酸的MRS培养基，所述发酵培养基的pH为6.8±0.2；
(2)保护剂的制备：使用水与冻干保护剂原料混合制备得到含有100g/L脱脂奶粉、100g/L海藻糖、150g/L蔗糖、余量为水的冻干保护剂；
(3)将长双歧杆菌CCFM729菌种按照2-4％的接种量接种到在115℃下灭菌20min的步骤⑴中培养基中，然后在温度37℃的条件下于厌氧工作站中培养24h，6000×g离心15min；用pH＝7.2的磷酸盐缓冲液清洗2-3次；之后用步骤⑵中冻干保护剂重悬，使菌的浓度达到1010cfu/mL；然后将该菌悬液在37℃厌氧的条件下培养1h，再在-20℃预冻12h；最后进行真空冷冻干燥得到所述的双歧杆菌菌粉。
(4)经平板涂布计数，所得的双歧杆菌菌粉菌的浓度达到1010cfu/g，真空包装并冷藏1个月后，活菌数仍保持在1010cfu/g。
应用例2：双歧杆菌与嗜热链球菌等复合菌株复配生产酸奶
⑴首先制作双歧杆菌酸奶发酵剂，所述双歧杆菌酸奶发酵剂为应用例1中制得的双歧杆菌菌粉；
⑵培养基的制备：将脱脂乳粉按照12-15：100(g/mL)的比例与水混合，然后105℃灭菌20min，得脱脂乳；
⑶将步骤⑴中双歧杆菌酸奶发酵剂与嗜热链球菌、保加利亚乳杆菌按照1:1:1的比例添加到步骤⑵的脱脂乳中；
⑷发酵8-12h，发酵温度为：37℃，发酵完成后在4℃冷藏8h左右，即得酸奶。
⑸经平板涂布计数，所得的酸奶活菌数达到109cfu/g，在2-6℃冷藏7天，仍具有较佳的口感，活菌数仍能够达到108cfu/g。
应用例3：双歧杆菌用于制作双歧杆菌益生菌巧克力
⑴首先制作双歧杆菌菌粉，所述双歧杆菌菌粉为权利要求6所述的双歧杆菌菌粉；
⑵将市售可可粉、可可脂、砂糖按适当比例混合并于热水中不断搅拌至膏状；
⑶将步骤⑴中双歧杆菌菌粉加入到步骤(2)所得膏状物中，并迅速搅拌，倒入模具，自然冷却，即得益生菌巧克力。
(5)将巧克力压碎并平板涂布计数，所得的益生菌巧克力活菌数达到109cfu/g，在2-6℃冷藏半个月，活菌数仍能够达到108cfu/g。
Claims (10)
1.一种具有良好肠道定殖能力的长双歧杆菌，其特征在于：名称为CCFM729，分类名称为Bifidobacteriumlongum，保藏编号为：CGMCCNo.10932，保藏日期：2015年05月28日，保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物菌种保藏中心，北京市朝阳区北辰西路1号院3号。
2.根据权利要求1所述的具有良好肠道定殖能力的长双歧杆菌，其特征在于：所述长双歧杆菌具有如下性质：
⑴具有耐酸性，在pH3.0-9.0环境条件下生长良好，在pH2.5环境下存活良好；
⑵能够耐胆盐，在0.3％胆盐存在的条件下存活良好；
⑶具有粘附性，能够较好地粘附在结肠癌细胞HT-29上；
⑷能够在小鼠体内定殖10天以上的时间。
3.一种如权利要求1或2所述的具有良好肠道定殖能力的长双歧杆菌的筛选方法，其特征在于：步骤如下：
⑴收集若干份出生一周龄的婴儿粪便，将粪便样品在含有低聚果糖的MRS+0.5‰-1‰(质量百分数)半胱氨酸培养基中富集12h；
⑵梯度稀释涂布于添加0.02％(质量百分数)溴甲酚紫的MRS+0.5‰-1‰(质量百分数)半胱氨酸的固体平板上，培养24-48h；
⑶挑取变色圈明显的单菌落，反复划线得到纯化的单菌落；
⑷将纯化的单菌落液体培养24h后，进行果糖-6-磷酸盐磷酸酮酶的测定，快速鉴定其是否为双歧杆菌；
⑸选取F6PPK阳性的菌，提取其16SrDNA进行测序；
⑹选取测序结果鉴定为双歧杆菌的乳酸菌进行耐酸、耐胆盐以及粘附试验；
⑺选取耐酸、耐胆盐以及粘附性能好的双歧杆菌进行肠道定殖能力试验，其中，耐酸：pH＝2～9，耐胆盐：胆盐0.3％、质量分数，粘附试验：对结肠癌细胞HT-29具有粘附能力；
⑻扩增出小鼠粪便菌群的16SV3区，变性梯度凝胶电泳检测小鼠粪便中的目标菌，筛选出肠道定殖能力优良的双歧杆菌，即得具有良好肠道定殖能力的长双歧杆菌。
4.根据权利3所述的具有良好肠道定殖能力的长双歧杆菌的筛选方法，其特征在于：具体步骤如下：
(一)乳酸菌的分离筛选
⑴收集若干份出生一周龄的婴儿粪便，将粪便样品在含有低聚果糖的MRS+0.5‰-1‰(质量百分数)半胱氨酸培养基中富集12h；
⑵将粪便样品进行梯度稀释后涂布于添加了质量百分数为0.02％溴甲酚紫的MRS+0.5‰-1‰半胱氨酸的固体平板上，培养24-48h；
⑶选取变色圈明显，并且符合乳酸菌基本形态的单菌落进行平板划线纯化，筛选分离出乳酸菌；
⑷将上述单菌落于液体MRS+0.5‰-1‰(质量百分数)半胱氨酸中培养24h后进行革兰氏染色，选取革兰氏阳性菌进行后续试验；
(二)双歧杆菌的初步鉴定：果糖-6-磷酸盐磷酸酮酶测定法
⑴将步骤(一)所筛选得到的乳酸菌在液体MRS+0.5‰-1‰(质量百分数)半胱氨酸中培养24h，然后取1mL培养物8000rpm离心2min；
⑵用含0.05％(质量百分数)半胱氨酸的pH＝6.5的0.05MKH2PO4溶液洗涤两次；
⑶重悬于200uL添加了0.25％(质量百分数)TritonX-100的上述磷酸盐缓冲液；
⑷添加50uL浓度为6mg/mL氟化钠和10mg/mL碘乙酸钠的混合液以及50uL浓度为80mg/mL的果糖-6-磷酸，37℃孵育1h；
⑸添加300uL浓度为0.139g/mL、pH为6.5的盐酸羟胺，并于室温放置10min；
⑹分别添加200uL15％(质量百分数)的三氯乙酸和4MHCl；
⑺添加200uL含有5％(质量百分数)三氯化铁的0.1MHCl，若体系迅速变为红色，即为F6PPK阳性，可初步断定其为双歧杆菌；
(三)双歧杆菌的分子生物学鉴定
⑴单菌的基因组抽提
A.将步骤(二)所筛选得到的乳酸菌培养过夜，取培养过夜的菌悬液1mL于1.5mL离心管，10000rpm离心2min，弃上清得菌体；
B.用1mL无菌水吹打洗菌体后，10000rpm离心2min，弃上清得菌体；
C.加入200uLSDS裂解液，80℃水浴30min；
D.加入酚-氯仿溶液200uL于菌体裂解液中，其中酚-氯仿溶液的组成成分及体积比为：Tris饱和酚：氯仿：异戊醇＝25：24：1，颠倒混匀后，12000rpm离心5-10min，取上清200uL；
E.加入400uL冰乙醇或冰异丙醇于200uL上清中，-20℃静置1h，12000rpm离心5-10min，弃上清；
F.加入500uL70％(体积百分数)冰乙醇重悬沉淀，12000rpm离心1-3min，弃上清；
G.60℃烘箱烘干，或者自然晾干；
H.50uLddH2O重溶沉淀以备PCR；
⑵16SrDNAPCR
A.细菌16SrDNA50uLPCR反应体系：
10×Taqbuffer，5uL；dNTP，5uL；27F，0.5uL；1492R，0.5uL；Taq酶，0.5uL；模板，0.5uL；ddH2O，38uL。
B.PCR条件：
95℃5min；95℃10s；55℃30s；72℃30s；step2-430×；72℃5min；12℃2min；
⑶制备1％琼脂糖凝胶，之后将PCR产物与10000×loadingbuffer混合，上样量5uL，120V跑30min，然后进行凝胶成像；
⑷将16SrDNA的PCR产物进行测序分析，将得到的序列结果使用BLAST在GeneBank中进行搜索和相似性比对，选取测序结果鉴定为双歧杆菌的乳酸菌，-80℃保藏备用；
(四)双歧杆菌的耐酸、耐胆盐检测
⑴取步骤(三)中-80℃保藏的双歧杆菌，在MRS+0.5‰-1‰(质量百分数)半胱氨酸的固体平板划线一次，在厌氧工作站培养24-48h之后转接到MRS+0.5‰-1‰(质量百分数)半胱氨酸的液体试管当中，传代两次；
⑵以4％的接种量分别接种到pH＝7.0±0.2的MRS+0.5‰-1‰(质量百分数)半胱氨酸的液体试管，其为空白对照组；pH＝2、pH＝2.5、pH＝3、pH＝4、pH＝5、pH＝6、pH＝8、pH＝9的MRS+0.5‰-1‰(质量百分数)半胱氨酸的液体试管，该几组为耐酸实验组；MRS+0.5‰-1‰(质量百分数)半胱氨酸+0.1％、0.2％、0.3％、0.4％牛胆盐的液体试管中，该几组为耐胆盐实验组；
⑶将接种于上述液体试管当中的菌悬液振荡混匀后，迅速将其以200uL/孔的量转移到96孔板上，每组做三个平行，每隔两个小时用酶标仪测定其OD600的值；
⑷在每一个时间点，将实验组数据与对照组数据进行比较，数据相差越小说明其耐受性能越好，比较菌的耐受性强弱；
⑸因人体肠道内环境中胃酸的pH在2.5左右，分泌的胆盐含量为0.1％～0.5％，摄入的活菌通过肠道的时间在2小时，所以选取在2小时内在pH＝2.5环境下存活良好、在0.3％胆盐存在的条件下存活良好的双歧杆菌进行后续试验；
(五)双歧杆菌对结肠癌细胞HT-29的粘附能力测定
⑴将放置于液氮罐中的HT-29细胞的冻存管迅速置于37℃水浴锅中使其融化；
⑵将其与PRMI-1640完全培养基混合后，置于培养皿中，于5％二氧化碳培养箱37℃传代培养，每隔一天换一次培养液；
其中，所述PRMI-1640完全培养基为PRMI-1640基础培养基+10％(质量百分数)胎牛血清+1％(质量百分数)青链霉素；
⑶待传代细胞3-4次后，再次长满80％细胞培养板之后，胰酶消化，PBS清洗后，离心，用PRMI-1640基础培养基调整细胞浓度为105cells/mL，并且在事先置入载玻片的细胞培养板中培养6h；
⑷将步骤(四)所筛选得到的双歧杆菌过夜培养，用PRMI-1640基础培养基调整过夜培养的菌悬液的浓度为107cfu/mL，与上述HT-29细胞共培养4h；
⑸PBS清洗4次，然后用甲醇固定5-10min，甲醇的添加量以铺满细胞培养板为宜，之后用姬姆萨染液进行染色；
⑹用PBS洗液冲洗染液至无色，于37℃培养箱干燥过夜或者常温放置至自然干燥；
⑺取出载玻片，在100倍的油镜下进行观察，选取属于具有强粘附能力的乳酸菌；其中，20个随机选取的视野当中总的细菌数大于100个，即属于粘附能力强的菌；
(六)双歧杆菌在小鼠肠道内的定殖情况测定
试验小鼠为6-8周龄SPF级雌性小鼠，每天灌胃重悬于生理盐水中的步骤(五)所筛选得到的乳酸菌，菌浓度为108cfu/mL，灌胃周期为14天，在灌胃前采集小鼠粪便一次，灌胃中和灌胃结束后隔天采集小鼠粪便，之后用FastDNAkitforsoil提取小鼠的粪便基因组，扩增基因组的16SV3区，变性梯度凝胶电泳检测小鼠粪便中的目标菌，筛选出肠道定殖能力优良的双歧杆菌，即得具有良好肠道定殖能力的长双歧杆菌。
5.如权利要求1或2所述的具有良好肠道定殖能力的长双歧杆菌在生产双歧杆菌菌粉中的应用。
6.根据权利要求5所述的具有良好肠道定殖能力的长双歧杆菌在生产双歧杆菌菌粉中的应用，其特征在于：所述双歧杆菌菌粉的制备步骤如下：
⑴培养基的制备：长双歧杆菌的发酵培养基为添加质量百分数为0.5‰-1‰的L-半胱氨酸的MRS培养基，pH为6.8±0.2；
⑵保护剂的制备：使用水与冻干保护剂原料混合，制备得到含有100g/L～150g/L脱脂奶粉、100g/L～200g/L海藻糖、100g/L～150g/L蔗糖、余量为水的冻干保护剂；
⑶将长双歧杆菌CCFM729菌种按照2-4％的接种量接种到在115℃下灭菌20min的步骤⑴中培养基中，然后在温度37℃的条件下于厌氧工作站中培养24h，6000×g离心15min；用pH＝7.2的磷酸盐缓冲液清洗2-3次；之后用步骤⑵中冻干保护剂重悬，使菌的浓度达到1010cfu/mL；然后将该菌悬液在37℃厌氧的条件下培养1h，再在-20℃预冻12h；最后进行真空冷冻干燥得到所述的双歧杆菌菌粉。
7.如权利要求1或2所述的具有良好肠道定殖能力的长双歧杆菌在生产酸奶中的应用或在生产双歧杆菌益生菌巧克力中的应用。
8.根据权利要求7所述的具有良好肠道定殖能力的长双歧杆菌在生产酸奶中的应用，其特征在于：所述长双歧杆菌发酵菌株复配使用。
9.根据权利要求8所述的具有良好肠道定殖能力的长双歧杆菌在生产酸奶中的应用，其特征在于：所述发酵菌株为嗜热链球菌和保加利亚乳杆菌。
10.根据权利要求7所述的具有良好肠道定殖能力的长双歧杆菌在生产酸奶中的应用，其特征在于：所述酸奶的制备步骤如下：
⑴首先制作双歧杆菌酸奶发酵剂，所述双歧杆菌酸奶发酵剂为权利要求6所述的双歧杆菌菌粉；
⑵培养基的制备：将脱脂乳粉按照12-15：100(g/mL)的比例与水混合，然后105℃灭菌20min，得脱脂乳；
⑶将步骤⑴中双歧杆菌酸奶发酵剂与嗜热链球菌、保加利亚乳杆菌按照质量比为1:1:1的比例添加到步骤⑵的脱脂乳中，搅拌均匀；
⑷发酵8-12h，发酵温度为：37℃，发酵完成后在4℃冷藏8h左右，即得酸奶；
或者，所述双歧杆菌益生菌巧克力的制备步骤如下：
⑴首先制作双歧杆菌菌粉，所述双歧杆菌菌粉为权利要求6所述的双歧杆菌菌粉；
⑵将市售可可粉、可可脂、砂糖按比例混合并于热水中不断搅拌至膏状；
⑶将步骤⑴中双歧杆菌菌粉加入到步骤⑵所得膏状物中，并迅速搅拌，倒入模具，自然冷却，即得益生菌巧克力。
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Cited By (37)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN107043705A (zh) * | 2016-12-30 | 2017-08-15 | 大连医科大学 | 用于建立临床营养菌种资源库的益生菌筛选方法 |
| CN107603919A (zh) * | 2017-11-01 | 2018-01-19 | 江苏微康生物科技有限公司 | 一种耐热型长双歧杆菌及其筛选方法和菌粉制备方法 |
| CN108220206A (zh) * | 2018-03-12 | 2018-06-29 | 江南大学 | 一种长双歧杆菌及其应用 |
| CN108486000A (zh) * | 2018-03-12 | 2018-09-04 | 江南大学 | 一种双歧杆菌单菌发酵乳制备方法及其应用 |
| CN109055269A (zh) * | 2018-08-22 | 2018-12-21 | 江南大学 | 长双歧杆菌婴儿亚种ccfm687、其发酵食品及其应用 |
| US10322151B2 (en) | 2015-06-15 | 2019-06-18 | 4D Pharma Research Limited | Compositions comprising bacterial strains |
| US10391128B2 (en) | 2015-11-23 | 2019-08-27 | 4D Pharma Research Limited | Compositions comprising bacterial strains |
| US10391130B2 (en) | 2015-06-15 | 2019-08-27 | 4D Pharma Research Limited | Compositions comprising bacterial strains |
| US10456444B2 (en) | 2014-12-23 | 2019-10-29 | 4D Pharma Research Limited | Pirin polypeptide and immune modulation |
| US10471108B2 (en) | 2015-11-20 | 2019-11-12 | 4D Pharma Research Limited | Compositions comprising bacterial strains |
| US10485830B2 (en) | 2016-12-12 | 2019-11-26 | 4D Pharma Plc | Compositions comprising bacterial strains |
| US10493112B2 (en) | 2015-06-15 | 2019-12-03 | 4D Pharma Research Limited | Compositions comprising bacterial strains |
| US10500237B2 (en) | 2015-06-15 | 2019-12-10 | 4D Pharma Research Limited | Compositions comprising bacterial strains |
| US10583158B2 (en) | 2016-03-04 | 2020-03-10 | 4D Pharma Plc | Compositions comprising bacterial strains |
| US10610549B2 (en) | 2016-07-13 | 2020-04-07 | 4D Pharma Plc | Composition comprising bacterial strains |
| US10610550B2 (en) | 2015-11-20 | 2020-04-07 | 4D Pharma Research Limited | Compositions comprising bacterial strains |
| CN111000247A (zh) * | 2019-12-31 | 2020-04-14 | 扬州江大食生一生食品有限公司 | 一种复合益生菌粉的制备方法 |
| CN111187734A (zh) * | 2019-12-25 | 2020-05-22 | 生合生物科技（扬州）有限公司 | 长双歧杆菌bl986、由其制备的冻干粉及冻干粉的应用 |
| US10736926B2 (en) | 2015-06-15 | 2020-08-11 | 4D Pharma Research Limited | Compositions comprising bacterial strains |
| US10744166B2 (en) | 2015-11-23 | 2020-08-18 | 4D Pharma Research Limited | Compositions comprising bacterial strains |
| US10851137B2 (en) | 2013-04-10 | 2020-12-01 | 4D Pharma Research Limited | Polypeptide and immune modulation |
| CN112111419A (zh) * | 2019-06-21 | 2020-12-22 | 大江生医股份有限公司 | 乳双歧杆菌tci604及其代谢产物的应用 |
| CN112210511A (zh) * | 2020-10-10 | 2021-01-12 | 内蒙古普泽生物制品有限责任公司 | 一种具有抑制ht-29细胞增殖及益生功能的长双歧杆菌及应用 |
| US10987387B2 (en) | 2017-05-24 | 2021-04-27 | 4D Pharma Research Limited | Compositions comprising bacterial strain |
| US11007233B2 (en) | 2017-06-14 | 2021-05-18 | 4D Pharma Research Limited | Compositions comprising a bacterial strain of the genus Megasphera and uses thereof |
| US11013773B2 (en) | 2011-07-14 | 2021-05-25 | 4D Pharma Research Limited | Lactic acid bacterial strains |
| US11123378B2 (en) | 2017-05-22 | 2021-09-21 | 4D Pharma Research Limited | Compositions comprising bacterial strains |
| US11123379B2 (en) | 2017-06-14 | 2021-09-21 | 4D Pharma Research Limited | Compositions comprising bacterial strains |
| CN113846030A (zh) * | 2021-09-26 | 2021-12-28 | 黄淮学院 | 鸡肠源益生乳酸菌制剂的真空冷冻干燥工艺 |
| US11224620B2 (en) | 2016-07-13 | 2022-01-18 | 4D Pharma Plc | Compositions comprising bacterial strains |
| US11266698B2 (en) | 2011-10-07 | 2022-03-08 | 4D Pharma Research Limited | Bacterium for use as a probiotic for nutritional and medical applications |
| CN114847483A (zh) * | 2022-04-26 | 2022-08-05 | 微康益生菌(苏州)股份有限公司 | 长双歧杆菌bl21及包含其的菌剂在制备预防、缓解或治疗结直肠癌的产品中的应用 |
| CN115354009A (zh) * | 2022-10-20 | 2022-11-18 | 东北农业大学 | 一种具有菌毛的长双歧杆菌婴儿亚种及其应用 |
| CN115960753A (zh) * | 2022-09-15 | 2023-04-14 | 上海理工大学 | 一种基于体内进化筛选定殖能力强乳酸菌的方法 |
| US11723933B2 (en) | 2014-12-23 | 2023-08-15 | Cj Bioscience, Inc. | Composition of bacteroides thetaiotaomicron for immune modulation |
| CN117264853A (zh) * | 2023-11-17 | 2023-12-22 | 中国农业大学 | 一种缓解溃疡性结肠炎的富硒动物双歧杆菌h15的筛选方法与应用 |
| US12048720B2 (en) | 2017-06-14 | 2024-07-30 | Cj Bioscience, Inc. | Compositions comprising bacterial strains |
Citations (16)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN1480528A (zh) * | 2002-09-06 | 2004-03-10 | I | 双歧杆菌和含有它们的制品 |
| US20040202749A1 (en) * | 2001-07-12 | 2004-10-14 | Kazuyoshi Sotoyama | Bifidobacterium longum |
| CN1724648A (zh) * | 2005-06-11 | 2006-01-25 | 江南大学 | 一种用预培养方式提高乳酸菌冻干活性的方法 |
| WO2010003916A1 (en) * | 2008-07-11 | 2010-01-14 | Chr. Hansen A/S | New probiotic bifidobacterium longum |
| CN101649303A (zh) * | 2009-05-08 | 2010-02-17 | 内蒙古蒙牛乳业（集团）股份有限公司 | 一种双歧杆菌及其应用和含有双歧杆菌的食品组合物 |
| CN101679938A (zh) * | 2007-03-28 | 2010-03-24 | 营养健康有限公司 | 益生双歧杆菌菌株 |
| CN101703107A (zh) * | 2009-11-30 | 2010-05-12 | 内蒙古伊利实业集团股份有限公司 | 含有巧克力颗粒的酸奶及其生产方法 |
| CN102100252A (zh) * | 2009-12-18 | 2011-06-22 | 光明乳业股份有限公司 | 发酵乳制品及其制备方法和原料组合物，植物乳杆菌应用 |
| CN102159085A (zh) * | 2008-09-19 | 2011-08-17 | 美赞臣营养品公司 | 益生菌婴儿产品 |
| CN102206599A (zh) * | 2011-04-11 | 2011-10-05 | 天津科技大学 | 一种耐氧耐酸性长双歧杆菌 |
| CN102599242A (zh) * | 2012-03-23 | 2012-07-25 | 光明乳业股份有限公司 | 一种发酵酸奶制备方法及制得的酸奶 |
| CN102604833A (zh) * | 2012-03-23 | 2012-07-25 | 光明乳业股份有限公司 | 一种发酵乳多联发酵剂的制备方法及其产品 |
| CN102604855A (zh) * | 2011-12-15 | 2012-07-25 | 上海交通大学 | 一株长双歧杆菌sqs7-31及其制备方法和应用 |
| CN102703600A (zh) * | 2012-07-10 | 2012-10-03 | 光明乳业股份有限公司 | 一种植物乳杆菌肠道定殖性的定性、定量测定方法 |
| CN103275893A (zh) * | 2013-05-06 | 2013-09-04 | 哈尔滨美华生物技术股份有限公司 | 长双歧杆菌和动物双歧杆菌的复合菌剂及其制备方法 |
| CN104621314A (zh) * | 2015-01-26 | 2015-05-20 | 文昌中椰科技有限公司 | 一种椰香巧克力组合物及其制备方法 |
-
2015
- 2015-08-31 CN CN201510549092.3A patent/CN105112333A/zh active Pending
Patent Citations (16)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US20040202749A1 (en) * | 2001-07-12 | 2004-10-14 | Kazuyoshi Sotoyama | Bifidobacterium longum |
| CN1480528A (zh) * | 2002-09-06 | 2004-03-10 | I | 双歧杆菌和含有它们的制品 |
| CN1724648A (zh) * | 2005-06-11 | 2006-01-25 | 江南大学 | 一种用预培养方式提高乳酸菌冻干活性的方法 |
| CN101679938A (zh) * | 2007-03-28 | 2010-03-24 | 营养健康有限公司 | 益生双歧杆菌菌株 |
| WO2010003916A1 (en) * | 2008-07-11 | 2010-01-14 | Chr. Hansen A/S | New probiotic bifidobacterium longum |
| CN102159085A (zh) * | 2008-09-19 | 2011-08-17 | 美赞臣营养品公司 | 益生菌婴儿产品 |
| CN101649303A (zh) * | 2009-05-08 | 2010-02-17 | 内蒙古蒙牛乳业（集团）股份有限公司 | 一种双歧杆菌及其应用和含有双歧杆菌的食品组合物 |
| CN101703107A (zh) * | 2009-11-30 | 2010-05-12 | 内蒙古伊利实业集团股份有限公司 | 含有巧克力颗粒的酸奶及其生产方法 |
| CN102100252A (zh) * | 2009-12-18 | 2011-06-22 | 光明乳业股份有限公司 | 发酵乳制品及其制备方法和原料组合物，植物乳杆菌应用 |
| CN102206599A (zh) * | 2011-04-11 | 2011-10-05 | 天津科技大学 | 一种耐氧耐酸性长双歧杆菌 |
| CN102604855A (zh) * | 2011-12-15 | 2012-07-25 | 上海交通大学 | 一株长双歧杆菌sqs7-31及其制备方法和应用 |
| CN102599242A (zh) * | 2012-03-23 | 2012-07-25 | 光明乳业股份有限公司 | 一种发酵酸奶制备方法及制得的酸奶 |
| CN102604833A (zh) * | 2012-03-23 | 2012-07-25 | 光明乳业股份有限公司 | 一种发酵乳多联发酵剂的制备方法及其产品 |
| CN102703600A (zh) * | 2012-07-10 | 2012-10-03 | 光明乳业股份有限公司 | 一种植物乳杆菌肠道定殖性的定性、定量测定方法 |
| CN103275893A (zh) * | 2013-05-06 | 2013-09-04 | 哈尔滨美华生物技术股份有限公司 | 长双歧杆菌和动物双歧杆菌的复合菌剂及其制备方法 |
| CN104621314A (zh) * | 2015-01-26 | 2015-05-20 | 文昌中椰科技有限公司 | 一种椰香巧克力组合物及其制备方法 |
Non-Patent Citations (7)
Cited By (63)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US11013773B2 (en) | 2011-07-14 | 2021-05-25 | 4D Pharma Research Limited | Lactic acid bacterial strains |
| US11266698B2 (en) | 2011-10-07 | 2022-03-08 | 4D Pharma Research Limited | Bacterium for use as a probiotic for nutritional and medical applications |
| US10851137B2 (en) | 2013-04-10 | 2020-12-01 | 4D Pharma Research Limited | Polypeptide and immune modulation |
| US11414463B2 (en) | 2013-04-10 | 2022-08-16 | 4D Pharma Research Limited | Polypeptide and immune modulation |
| US10456444B2 (en) | 2014-12-23 | 2019-10-29 | 4D Pharma Research Limited | Pirin polypeptide and immune modulation |
| US11723933B2 (en) | 2014-12-23 | 2023-08-15 | Cj Bioscience, Inc. | Composition of bacteroides thetaiotaomicron for immune modulation |
| US10973872B2 (en) | 2014-12-23 | 2021-04-13 | 4D Pharma Research Limited | Pirin polypeptide and immune modulation |
| US11040075B2 (en) | 2015-06-15 | 2021-06-22 | 4D Pharma Research Limited | Compositions comprising bacterial strains |
| US11389493B2 (en) | 2015-06-15 | 2022-07-19 | 4D Pharma Research Limited | Compositions comprising bacterial strains |
| US11433106B2 (en) | 2015-06-15 | 2022-09-06 | 4D Pharma Research Limited | Compositions comprising bacterial strains |
| US11331352B2 (en) | 2015-06-15 | 2022-05-17 | 4D Pharma Research Limited | Compositions comprising bacterial strains |
| US10493112B2 (en) | 2015-06-15 | 2019-12-03 | 4D Pharma Research Limited | Compositions comprising bacterial strains |
| US10500237B2 (en) | 2015-06-15 | 2019-12-10 | 4D Pharma Research Limited | Compositions comprising bacterial strains |
| US11273185B2 (en) | 2015-06-15 | 2022-03-15 | 4D Pharma Research Limited | Compositions comprising bacterial strains |
| US10780134B2 (en) | 2015-06-15 | 2020-09-22 | 4D Pharma Research Limited | Compositions comprising bacterial strains |
| US10744167B2 (en) | 2015-06-15 | 2020-08-18 | 4D Pharma Research Limited | Compositions comprising bacterial strains |
| US10736926B2 (en) | 2015-06-15 | 2020-08-11 | 4D Pharma Research Limited | Compositions comprising bacterial strains |
| US10391130B2 (en) | 2015-06-15 | 2019-08-27 | 4D Pharma Research Limited | Compositions comprising bacterial strains |
| US10864236B2 (en) | 2015-06-15 | 2020-12-15 | 4D Pharma Research Limited | Compositions comprising bacterial strains |
| US10322151B2 (en) | 2015-06-15 | 2019-06-18 | 4D Pharma Research Limited | Compositions comprising bacterial strains |
| US10610550B2 (en) | 2015-11-20 | 2020-04-07 | 4D Pharma Research Limited | Compositions comprising bacterial strains |
| US11058732B2 (en) | 2015-11-20 | 2021-07-13 | 4D Pharma Research Limited | Compositions comprising bacterial strains |
| US10471108B2 (en) | 2015-11-20 | 2019-11-12 | 4D Pharma Research Limited | Compositions comprising bacterial strains |
| US10744166B2 (en) | 2015-11-23 | 2020-08-18 | 4D Pharma Research Limited | Compositions comprising bacterial strains |
| US10391128B2 (en) | 2015-11-23 | 2019-08-27 | 4D Pharma Research Limited | Compositions comprising bacterial strains |
| US10583158B2 (en) | 2016-03-04 | 2020-03-10 | 4D Pharma Plc | Compositions comprising bacterial strains |
| US10610549B2 (en) | 2016-07-13 | 2020-04-07 | 4D Pharma Plc | Composition comprising bacterial strains |
| US10610548B2 (en) | 2016-07-13 | 2020-04-07 | 4D Pharma Plc | Compositions comprising bacterial strains |
| US10960031B2 (en) | 2016-07-13 | 2021-03-30 | 4D Pharma Plc | Compositions comprising bacterial strains |
| US10967010B2 (en) | 2016-07-13 | 2021-04-06 | 4D Pharma Plc | Compositions comprising bacterial strains |
| US11224620B2 (en) | 2016-07-13 | 2022-01-18 | 4D Pharma Plc | Compositions comprising bacterial strains |
| US10485830B2 (en) | 2016-12-12 | 2019-11-26 | 4D Pharma Plc | Compositions comprising bacterial strains |
| US10898526B2 (en) | 2016-12-12 | 2021-01-26 | 4D Pharma Plc | Compositions comprising bacterial strains |
| US10543238B2 (en) | 2016-12-12 | 2020-01-28 | 4D Pharma Plc | Compositions comprising bacterial strains |
| CN107043705A (zh) * | 2016-12-30 | 2017-08-15 | 大连医科大学 | 用于建立临床营养菌种资源库的益生菌筛选方法 |
| US11123378B2 (en) | 2017-05-22 | 2021-09-21 | 4D Pharma Research Limited | Compositions comprising bacterial strains |
| US11376284B2 (en) | 2017-05-22 | 2022-07-05 | 4D Pharma Research Limited | Compositions comprising bacterial strains |
| US11382936B2 (en) | 2017-05-22 | 2022-07-12 | 4D Pharma Research Limited | Compositions comprising bacterial strains |
| US10987387B2 (en) | 2017-05-24 | 2021-04-27 | 4D Pharma Research Limited | Compositions comprising bacterial strain |
| US11123379B2 (en) | 2017-06-14 | 2021-09-21 | 4D Pharma Research Limited | Compositions comprising bacterial strains |
| US11007233B2 (en) | 2017-06-14 | 2021-05-18 | 4D Pharma Research Limited | Compositions comprising a bacterial strain of the genus Megasphera and uses thereof |
| US11779613B2 (en) | 2017-06-14 | 2023-10-10 | Cj Bioscience, Inc. | Compositions comprising a bacterial strain of the genus Megasphera and uses thereof |
| US12048720B2 (en) | 2017-06-14 | 2024-07-30 | Cj Bioscience, Inc. | Compositions comprising bacterial strains |
| US11660319B2 (en) | 2017-06-14 | 2023-05-30 | 4D Pharma Research Limited | Compositions comprising bacterial strains |
| CN107603919A (zh) * | 2017-11-01 | 2018-01-19 | 江苏微康生物科技有限公司 | 一种耐热型长双歧杆菌及其筛选方法和菌粉制备方法 |
| CN108220206A (zh) * | 2018-03-12 | 2018-06-29 | 江南大学 | 一种长双歧杆菌及其应用 |
| CN108486000B (zh) * | 2018-03-12 | 2020-02-11 | 江南大学 | 一种双歧杆菌单菌发酵乳制备方法及其应用 |
| CN108486000A (zh) * | 2018-03-12 | 2018-09-04 | 江南大学 | 一种双歧杆菌单菌发酵乳制备方法及其应用 |
| CN109055269A (zh) * | 2018-08-22 | 2018-12-21 | 江南大学 | 长双歧杆菌婴儿亚种ccfm687、其发酵食品及其应用 |
| CN109055269B (zh) * | 2018-08-22 | 2021-03-30 | 江南大学 | 长双歧杆菌婴儿亚种ccfm687、其发酵食品及其应用 |
| CN112111419A (zh) * | 2019-06-21 | 2020-12-22 | 大江生医股份有限公司 | 乳双歧杆菌tci604及其代谢产物的应用 |
| CN112111419B (zh) * | 2019-06-21 | 2022-05-27 | 大江生医股份有限公司 | 乳双歧杆菌tci604及其代谢产物的应用 |
| CN111187734A (zh) * | 2019-12-25 | 2020-05-22 | 生合生物科技（扬州）有限公司 | 长双歧杆菌bl986、由其制备的冻干粉及冻干粉的应用 |
| CN111000247A (zh) * | 2019-12-31 | 2020-04-14 | 扬州江大食生一生食品有限公司 | 一种复合益生菌粉的制备方法 |
| CN112210511A (zh) * | 2020-10-10 | 2021-01-12 | 内蒙古普泽生物制品有限责任公司 | 一种具有抑制ht-29细胞增殖及益生功能的长双歧杆菌及应用 |
| CN113846030A (zh) * | 2021-09-26 | 2021-12-28 | 黄淮学院 | 鸡肠源益生乳酸菌制剂的真空冷冻干燥工艺 |
| CN114847483A (zh) * | 2022-04-26 | 2022-08-05 | 微康益生菌(苏州)股份有限公司 | 长双歧杆菌bl21及包含其的菌剂在制备预防、缓解或治疗结直肠癌的产品中的应用 |
| CN114847483B (zh) * | 2022-04-26 | 2024-01-05 | 微康益生菌(苏州)股份有限公司 | 长双歧杆菌bl21及包含其的菌剂在制备预防、缓解或治疗结直肠癌的产品中的应用 |
| CN115960753A (zh) * | 2022-09-15 | 2023-04-14 | 上海理工大学 | 一种基于体内进化筛选定殖能力强乳酸菌的方法 |
| CN115354009A (zh) * | 2022-10-20 | 2022-11-18 | 东北农业大学 | 一种具有菌毛的长双歧杆菌婴儿亚种及其应用 |
| US12077749B2 (en) | 2022-10-20 | 2024-09-03 | Northeast Agricultural University | Bifidobacterium longum subsp. infantis with fimbriae and applications thereof |
| CN117264853A (zh) * | 2023-11-17 | 2023-12-22 | 中国农业大学 | 一种缓解溃疡性结肠炎的富硒动物双歧杆菌h15的筛选方法与应用 |
| CN117264853B (zh) * | 2023-11-17 | 2024-02-27 | 中国农业大学 | 一种缓解溃疡性结肠炎的富硒动物双歧杆菌h15的筛选方法与应用 |
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