CN105087596B - 一种cd20核酸适配体及其应用 - Google Patents

Abstract

一种CD20核酸适配体，其特征在于，该适配体由SEQ No.1所示的序列组成。在该适配体的两端可进行基团修饰，所述基团为氨基、氨基、羧基、巯基、荧光分子、胆固醇或聚乙二醇的任一种或多种；所述适配体的碱基可做任何修饰，所述修饰为硫代、氨基、氟基、甲氧基或羧基任一种或多种修饰。上述核酸适配体在制备用于检测和/或治疗CD20阳性肿瘤制剂中的应用。制备的治疗CD20阳性肿瘤制剂能选择性的结合CD20阳性的肿瘤细胞，而与CD20阴性的细胞结合较弱。

Description

一种CD20核酸适配体及其应用

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体地说，本发明涉及CD20核酸适配体，以及所述适配体在制备治疗CD20阳性肿瘤药物中的应用及其在制备检测和/或治疗CD20阳性肿瘤细胞制剂中的应用。

背景技术

非霍奇金淋巴瘤(NHL)是世界上严重威胁人类健康的肿瘤之一，在过去的50年中，NHL在世界范围内有着稳定的增长趋势，不容忽视。据统计，它占所有癌症病例数的5.1％，在男性常见肿瘤中排名第八位，在女性中是第11位。2008年，共有355900新增NHL病例，造成了191400人的死亡。已有研究表明，大多数的NHL来源于B细胞。NHL可在不同的年龄阶段发生，尤其是在60岁以上的人群身上。

临床上治疗NHL的传统方法就是化疗。然而，由于细胞毒药物在杀伤肿瘤细胞的同时也会对正常组织产生损伤，从而限制了化疗的进度和用药程度，所以化疗很难将患者体内肿瘤细胞完全去除，导致了肿瘤的复发或者转移。并且，多重化疗药物联合使用会使患者对药物产生耐药性。所以亟需研发新型的针对NHL的治疗手段。

近些年靶向治疗得到了人们的关注。靶向治疗是指将抗肿瘤药物通过靶向分子特异性地呈递到肿瘤细胞上，使得药物在肿瘤组织上有更高的富集而在正常组织中含量很少，则药物对肿瘤组织的杀伤增强而对正常组织杀伤较弱，从而有助于清除体内的肿瘤细胞，并大大降低毒副作用。靶向治疗是有希望改善抗肿瘤化疗疗效的重要方向之一。

靶向治疗系统的构建，需要靶向分子和抗肿瘤药物。其中，靶向分子可以与肿瘤细胞上的肿瘤靶点特异结合。一个理想的肿瘤靶点应在肿瘤细胞膜表面高表达，而在正常组织或阴性组织中低表达或不表达。CD20是一个33-37kDa的膜蛋白，它的表达严格遵循B细胞造血系统。CD20抗原表达于90％以上的B淋巴瘤细胞，而不表达于造血干细胞、原始B淋巴细胞、正常血细胞以及其他正常组织。由于80％-85％的NHL来源于B细胞，并且这些细胞中将近95％的细胞高表达CD20，所以CD20是靶向治疗NHL的重要靶点。

美罗华是一个CD20的单克隆抗体，它是首个被FDA批准的靶向治疗NHL的药物。尽管美罗华临床上产生了一定的疗效，但是它仍有一些弊病，比如一些患者对其不敏感，且一些患者使用一段时间后药物则不再有疗效，并对进一步的治疗产生了抵抗反应。故此，研发一种新型的靶向CD20阳性NHL的治疗策略是很必要的。

近些年，除了单克隆抗体，一些其他类别的靶向分子也得到了人们的关注。核酸适配体(aptamer)就是其中之一。核酸适配体是一段短链的DNA或RNA，它们可通过碱基之间的配对以及相互作用产生特有的三维结构，从而与靶标高亲和、高特异地结合。同时，与抗体相比，核酸适配体还有一些独特的优势，如可大批量合成、成本低、易修饰、易穿透肿瘤组织、免疫原性低等等。因此，核酸适配体在肿瘤的靶向治疗有重要的应用潜能。然而。到目前为止，科学文献中还没有报导过针对CD20的核酸适配体。

发明内容

本发明的目的是提供一种新的CD20核酸适配体，所述核酸适配体能够与CD20表位肽及CD20阳性的肿瘤相结合，所述核酸适配体包括如下核酸序列(SEQ ID NO：1)：5’-TGCGTGTGTAGTGTGTCTGTGTGTGTGTAGCGTGTCTGCTCTTAGGGATTTGGGCGG-3’(下文中，也将该核酸适配体称为“CZ17”)。

进一步地，本发明提供了一种SEQ ID NO：1所示核苷酸序列经截断后的核酸适配体序列，所示经截断后的核酸适配体的核苷酸序列具有与CD20表位肽及CD20阳性的肿瘤相结合的能力，优选地，所述经截断后的核酸适配体的核苷酸序列为5’-TGTAGCGTGTCTGCTCTT-3’。

进一步地，本发明所述核酸适配体，在核酸适配体的两端，可以进行基团修饰，所述修饰的基团可以是选自氨基、羧基、巯基、荧光分子、生物素、胆固醇或聚乙二醇基团修饰。本发明的一个实施例中，提供了在CZ17的两端分别进行生物素、另一端进行荧光素修饰后得到的经修饰的核酸适配体分子，经修饰后的核酸适配体分子，具有与CD20表位肽以及CD20阳性的肿瘤细胞相结合。

本发明的再一方面，可以对所述的核酸适配体的碱基进行修饰，如硫代、氨代、氟代、甲氧基修饰，得到碱基修饰后的核酸适配体分子，优选地，对所述碱基进行硫代修饰，硫代修饰的方式为将碱基磷酸基团中的氧原子用硫原子替代。本发明的一优选实施例中，将所述核酸适配体中所有的碱基A进行硫代，得到硫代核酸适配体CZ17，经硫代修饰后，其具有较未经修饰的核酸适配体更为优异的稳定性，可抗核酸酶。

本发明所述核酸适配体，还能够选择性的结合CD20阳性的肿瘤细胞，而与CD20阴性的细胞结合较弱。

更为重要的是，对本发明所述核酸适配体碱基进行修饰后，如对其中的碱基A进行硫代修饰，相比其它非硫代修饰的单链DNA序列，该硫代修饰的核酸适配体具有了一定的抵抗核酸酶的能力，在血清中的存在时间显著延长。

基于此，该核酸适配体可以直接携带细胞毒性药物(如阿霉素)，选择性的杀伤CD20阳性的肿瘤细胞，因此，本发明的再一方面，提供了本发明所述核酸适配体在制备用于检测和/或治疗CD阳性的肿瘤(如NHL)制剂中的应用。

本发明的有益效果在于：本发明的CD20核酸适配体具有：(1)能和CD20表位肽以较高的亲合力结合，Kd值为100.7nM；(2)能选择性的结合CD20阳性的肿瘤细胞，而与CD20阴性的细胞结合较弱；(3)优选地可以直接携带细胞毒性药物阿霉素，选择性的结合并杀伤CD20阳性的肿瘤细胞。

本发明的又一方面，提供了一种组合物，该组合物包括本发明所述的核酸适配体，以及制药上可接受的载体或赋形剂。

本发明中，所述载体如可以是纳米药物载体，将本发明所述核酸适配体偶联到所述纳米药物载体上(纳米载体如脂质体、胶束、纳米粒等)，可以作为CD20靶向分子，用于CD20阳性肿瘤的靶向治疗，将适配体偶联到纳米载体上的方法，本发明技术人员可以根据现已有的制剂技术进行。或者本发明所述的载体也可以是造影剂粒子(如纳米铁、包裹了造影剂的纳米粒等)，将所述适配体偶联到造影剂粒子上，作为CD20靶向分子，用于CD20阳性肿瘤的靶向显影，将适配体偶联到造影粒子上的方法，本发明技术人员可以根据现已有的制剂技术进行。或者，本发明所述的载体还可以是染色分子(如辣根过氧化物酶)，作为CD20靶向分子，用于CD20阳性肿瘤的组化染色。

本发明的又一方面，提供了一种药物组合物，所述药物组合物，包括本发明所述的核算适配体、以及选自至少一种抗肿瘤药物，和制药上可接受的载体或赋形剂。

本发明中，所述的核酸适配体和至少一种抗肿瘤药物，所述复合体是所述核酸适配体与化疗药物形成的复合体，该复合体可用于CD20阳性的肿瘤的治疗。

本发明中，抗肿瘤药物，选自抗代谢类抗肿瘤药(如甲氨蝶呤、氟尿嘧啶、氟尿苷、吉西他滨或雷替曲塞)、抗生素类抗肿瘤药物(如丝裂霉素C、博来霉素、阿霉素、多柔比星、表柔比星、吡柔比星或米妥蒽醌)、植物碱类抗肿瘤药(如长春碱、紫杉醇或羟基喜树碱)、激素类抗肿瘤药(如他莫昔芬、来曲唑或强的松)、铂类抗癌药(如顺铂、卡铂、奥沙利铂、奈达铂或乐铂)或抗肿瘤小分子靶向药物(如吉非替尼、伊马替尼或拉帕替尼)。

由于本发明所述核酸适配体能够选择性的结合CD阳性的肿瘤细胞，而与CD20阴性的细胞结合较弱，因此本发明的又一方面，提供所述适配体作为CD20阳性的肿瘤化疗靶向药物载体的应用，将化疗药物结合于所述核酸适配体上，进行肿瘤放化疗时，可以选择性地杀伤CD20阳性的肿瘤细胞，而对正常细胞没有毒性，所述的化疗药物，可以是选自代谢类药物如甲氨蝶呤、氟尿嘧啶、氟尿苷、吉西他滨、雷替曲塞，抗癌抗生素类药物如丝裂霉素C、博来霉素、阿霉素、多柔比星、表柔比星、吡柔比星，植物碱类如长春碱、紫杉醇、羟基喜树碱，抗肿瘤激素类如他莫昔芬、来曲唑、强的松，杂类如顺铂、卡铂、米妥蒽醌，抗肿瘤小分子靶向药物如吉非替尼、伊马替尼或拉帕替尼，更优选地，所述化疗药物选自氟尿嘧啶、氟尿苷、甲氨蝶呤、顺铂、吉西他滨、雷替曲塞、丝裂霉素、博莱霉素、长春碱、紫杉醇、羟基喜树碱、卡铂、他莫昔芬、来曲唑、强的松、吉非替尼、伊马替尼或拉帕替尼。

本发明所述核酸适配体还可以偶联到纳米药物载体上，如脂质体、胶束、纳米粒等，作为CD20靶向分子，用于CD20阳性肿瘤的靶向治疗，基于此，本发明还提供了一种药物组合物，所述药物包括本发明所述的核酸适配体，至少一种抗肿瘤药物，和药物可接受的载体，所述核酸适配体与至少一种抗肿瘤药物以复合体形式存在，所述载体为载药纳米粒。

附图说明

图1为本发明优选的CD20核酸适配体的特异性结果。

图2为本发明优选的CD20核酸适配体的和靶标结合的Kd值。

图3为本发明优选的CD20核酸适配体与细胞结合的结果。

图4为CZ17经截断后与CD20核算适配体及CD20阳性的肿瘤细胞结合的结果。

图5为本发明优选的CD20核酸适配体与阿霉素结合结果。

图6为本发明优选的CD20核酸适配体-Dox与细胞结合结果。

图7为本发明优选的CD20核酸适配体-Dox对细胞杀伤作用的结果。

具体实施方式

本发明针对CD20蛋白的结构特点，设计了一种全新的DNA适配体。该适配体能够与CD20结构结合，其核酸适配体由(1)所示的序列组成：

5’-TGCGTGTGTAGTGTGTCTGTGTGTGTGTAGCGTGTCTGCTCTTAGGGATTTGGGCGG-3’.(1)

本发明的CD20核酸适配体由(1)所示的序列组成。本领域人员应当理解，虽然本文采用了术语“由方法......组成”的表达方式，但是在上述序列基础上进行微小的变动(例如增加、缺少或取代一个或多个，例如1、2或3个)而不影响所述序列与CD20相互结合的其他核酸序列也包括在该序列的等同范围之内。

本发明一个优选的实施方案为CD20核酸适配体的核酸序列可通过DNA合成仪大规模合成生产，或通过PCR反应来合成。

在上述序列的两端进行基团修饰，如氨基、羧基、巯基、荧光分子、胆固醇、聚乙二醇等，所产生的衍生物与CD20核酸适配体具有等同效果。

在上述序列的碱基做任何修饰，如硫代、氨基、氟基、甲氧基修饰后所产生的衍生物与CD20核酸适配体具有等同效果。

本发明还提供了核酸适配体在制备用于检测和/或治疗CD20阳性肿瘤制剂中的应用。在一个优选的实施方案中采用FITC标记的适配子，适配体的核苷酸序列采用SEQ No.1所示序列。

特异性是评价核酸适配子的一个重要指标，为了验证本发明的CD20核酸适配体是否具有一定的靶标特异性，检测了其与其他蛋白的结合情况。由于白蛋白是血液中含量最丰富的蛋白，可能会造成非特异性吸附的干扰，故检测了适配体与牛白蛋白(BSA)的结合。将BSA通过共价键连接到磁珠上，与标记了FITC的适配体反应后进行检测。同等长度随机DNA(合成)作为随机对照。结果表明，与随机对照相比，优选的CZ17与BSA有极弱的反应(图1B)，而与CD20多肽反应后荧光信号明显增大(图1A)，说明CZ17与BSA有着较弱的交叉反应。

为了检测本发明的CD20核酸适配体和靶标多肽结合的亲和力，采用不同浓度FITC标记的CD20核酸适配体与靶标多肽包被的磁珠孵育，流式细胞仪检测平均荧光强度，在一个优选的实施例方式中，用非线性回归分析测得CD20核酸适配体与靶标多肽的Kd值为100.7nM。

为了评估本发明的CD20核酸适配体是否能够与CD20阳性肿瘤细胞结合，选取高表达CD20的肿瘤细胞系Raji，Ramos以及不表达CD20的肿瘤细胞系Jurkat，分别和标记有FITC的CD20核酸适配体孵育，流式细胞仪检测荧光信号。同等长度随机DNA库作为随机对照。在优选地实施方式中，结果显示，CD20核酸适配体和Raji，Ramos细胞孵育后的荧光强度明显高于随机对照，而与Jurkat细胞反应后荧光强度与随机对照一致。上述实验结果表明本发明的CD20核酸适配体和CD20阳性肿瘤细胞的结合强，和CD20阴性细胞结合弱，所述CD20核酸适配体能够识别表达CD20蛋白的肿瘤细胞表面的CD20结构。

为了验证本发明的CD20核酸适配体是否可以选择性地携带抗肿瘤药物到肿瘤细胞上，我们优选了一种很重要的治疗肿瘤的化疗药物阿霉素(Dox)，将其以不同配比浓度与CD20核酸适配体进行孵育，得到适配体-Dox复合物，通过荧光光谱分析表明阿霉素已迁入到适配体中。游离的阿霉素不可区分肿瘤细胞和正常细胞，导致细胞中阿霉素的富集程度一样，毒副作用比较大。由于适配体可与肿瘤细胞上特异表达的CD20结合，则适配体-阿霉素复合物有可能特异性地被CD20阳性肿瘤细胞摄取，而阴性细胞没有这样的亲和作用从而减少了阿霉素的富集。为了验证这个理论，发明人通过共聚焦成像检测了适配体-阿霉素在CD20-阳性细胞Raji以及阴性细胞Jurkat的摄入。设立游离Dox组与适配体-dox组，分别与CD20-阳性细胞Raji以及阴性细胞Jurkat孵育，共聚焦显微镜观察细胞内dox含量。结果显示，游离Dox组在两种细胞中的含量都很高，说明游离阿霉素对细胞没有选择性，而适配体-dox组中，Raji细胞中的荧光明显高于Jurkat细胞。从结果中可以看出，适配体-Dox在CD20阳性肿瘤细胞中的摄入明显多于阴性细胞，适配体-Dox能够被CD20阳性淋巴瘤细胞选择性的摄取。并通过实验进一步验证了本发明的CD20核酸适配体携带抗肿瘤药物比游离的抗肿瘤药物具有减弱CD20阴性细胞毒性的功能。

下面结合实施例对本发明作进一步说明，以下所举实施例是为便于更好地理解本发明，但并不用来限定本发明，本领域技术人员可以对本发明做各种修改或改动，这些等价形式同样落于本申请权利要求书所限定的范围。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的实验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到。

本发明的实施例中所用的试剂如下：

试剂

核酸适配体CZ17，Invitrogen公司合成，序列为SEQ ID NO：1所示，下文中也称“适配子”。

CD20表位肽(或称CD20多肽)，北京赛百盛公司(氨基酸序列为：NIYNCEPANPSEKNSPSTQYCYSIQ)，本文中也称“靶标多肽”。

牛血清白蛋白，天津灏洋生物科技有限公司

单分散磁珠，链酶亲和素包被磁珠，普洛麦格公司(磁珠表面为链霉亲和素修饰)。

EDC，Sigma公司。

细胞系：人B细胞淋巴瘤细胞Raji、人B细胞淋巴瘤细胞Ramos、人T细胞淋巴瘤细胞Jurkat，中国医学科学院细胞中心。

RPMI1640，(中国医学科学院基础医学研究所细胞中心)

胎牛血清(FBS)(Hyclone公司)

实施例1CD20核酸适配体的特异性

靶标和磁珠的连接：用于检测的靶标为25个氨基酸长度的多肽，序列为NIYNCEPANPSEKNSPSTQYCYSIQ，其来自CD20蛋白的细胞膜外区域。多肽用含1％DMSO的双蒸水溶解。2ug多肽和5×10⁵磁珠混合，在40mM EDC水溶液中室温反应2h，PBS洗5次，最后重悬于PBS中，于4℃保存。用相同的方法处理BSA和磁珠的连接。

流式细胞分析：为了检测核酸适配体与靶标的特异性结合，将FITC标记的适配子在200ul结合缓冲液中分别和CD20多肽或BSA包被的磁珠于37℃反应30min，PBS洗四遍，用流式细胞仪分析。同等长度随机DNA(合成)作为随机对照。

结果如图1所示，与随机对照相比，CZ17与BSA有极弱的反应(图1B)，而与CD20多肽反应后荧光信号明显增大(图1A)，说明CZ17与BSA有着较弱的交叉反应。图中黑色曲线是由随机库单链DNA产生的对照荧光信号，灰色曲线是CZ17产生的荧光信号。实施例2CD20核酸适配体的与靶标多肽的亲和力

K_d值的测定：将靶标多肽包被的磁珠(实施例1)与不同浓度的FITC标记的核酸适配体在200u1结合缓冲液中于37℃反应30min，PBS洗四遍，流式细胞仪检测平均荧光强度，同等长度的随机文库作为阴性对照用于非特异性的结合，适配子和靶标结合的平均荧光强度减去随机文库非特异性结合的平均荧光强度，根据公式Y＝B max X/(Kd+X)(Y：平均荧光强度，X：所用的aptamer的浓度，B是一个常数，max是最大值的意思)计算核酸适配体和靶标结合的Kd值。

如图2所示，得出CZ17与靶标多肽的Kd值为100.7nM，结果表明，CZ17具有比较好的靶标特异性。

实施例3CD20核酸适配体与肿瘤细胞的结合

将人B细胞淋巴瘤细胞Raji、人B细胞淋巴瘤细胞Ramos、人T细胞淋巴瘤细胞Jurkat，将细胞分别培养在含有10％FBS、常规浓度青霉素和链霉素的1640培养基中(Gibco)，细胞于37℃、5％CO₂培养箱中培养，所有试验所用细胞均是处于对数生长期的细胞；分别收集5×10⁵的Raji、Ramos和Jurkat细胞，将其和FITC标记的适配体在200ul结合缓冲液中于37℃反应30min，PBS洗一遍，用流式细胞仪分析；同等长度随机DNA库作为随机对照。

结果显示，CZ17和Raji，Ramos细胞孵育后的荧光强度明显高于随机对照，见图3A和图3B所示，而与Jurkat细胞反应后荧光强度与随机对照一致，见图3C所示。上述实验结果表明CZ17和CD20阳性肿瘤细胞的结合强，和CD20阴性细胞结合弱，CZ17能够识别表达CD20蛋白的肿瘤细胞表面的CD20结构。图中黑色曲线是由随机库单链DNA产生的对照荧光信号，灰色曲线是CZ17产生的荧光信号。

实施4经截断后的CZ17与CD20表位肽及CD20阳性肿瘤的结合

将截短后的序列5’-TGTAGCGTGTCTGCTCTT-3’经FITC标记后与CD20和BSA包被的磁珠反应(方法同实施例1)，流式细胞仪检测磁珠表面的荧光强度。结果显示该截短的序列和CD20仍有较高的结合，而和BSA的结合确很弱(结果见图4)。相同的方法(同实施例3)检测该序列和CD20阳性细胞Raji及阴性细胞Jurkat的结合，发现该序列和CD20阳性细胞Raji有较高的结合力，而和阴性细胞Jurkat的结合确很弱(结果见图5)。黑色曲线是由随机库单链DNA产生的对照荧光信号，灰色曲线是CZ17产生的荧光信号。

实施例5CD20核酸适配体携带药物的靶向性

荧光光谱分析阿霉素(Dox)嵌入到适配子中：预先在95℃放置5min，立刻冰浴使其温度迅速降低，取不同量的适配子和3nM阿霉素混匀，适配子和阿霉素的摩尔比例依次为：0，0.0001，0.003，0.01，0.1，1和2。在黑色96孔板中37℃静置1h，得到适配体-Dox复合物，测量适配体-Dox的荧光光谱值。Dox的激发光谱为480nm。发射光谱为520-700nm。荧光光谱分析表明阿霉素已迁入到适配体中(见图5)游离的阿霉素不可区分肿瘤细胞和正常细胞，导致细胞中阿霉素的富集程度一样，毒副作用比较大。由于适配体可与肿瘤细胞上特异表达的CD20结合，则适配体-阿霉素复合物有可能特异性地被CD20阳性肿瘤细胞摄取，而阴性细胞没有这样的亲和作用从而减少了阿霉素的富集。为了验证这个理论，我们通过共聚焦成像检测了适配体-阿霉素在CD20-阳性细胞Raji以及阴性细胞Jurkat的摄入。设立游离Dox组与适配体-dox组，分别与CD20-阳性细胞Raji以及阴性细胞Jurkat孵育，共聚焦显微镜观察细胞内dox含量。

细胞摄入实验

共聚焦显微镜检测：收集Raji和Jurkat细胞，离心去除培养基后用PBS洗一遍，将1.5uM dox和适配子-dox(适配子和阿霉素的复合体)分别和这两种细胞于37℃反应2h，离心后用PBS洗两遍，再用4％多聚甲醛室温固定10min，PBS洗2遍后将细胞悬液滴在载玻片上，封片，荧光共聚焦显微镜检测细胞内dox含量。

结果显示，游离Dox组在两种细胞中的含量都很高，说明游离阿霉素对细胞没有选择性(见图6A和6B)，而适配体-dox组中，Raji细胞中的荧光明显高于Jurkat细胞(见图6C和6D)。从结果中我们可以看出，适配体-Dox在CD20阳性肿瘤细胞中的摄入明显多于阴性细胞，适配体-Dox能够被CD20阳性淋巴瘤细胞选择性的摄取。

为了进一步验证适配体-Dox能否选择性被CD20阳性肿瘤细胞摄取，采用游离Dox和适配子-dox复合体分别和Raji，Jurkat孵育，用流式细胞仪检测其荧光强度的变化。具体操作步骤为：收集Raji和Jurkat细胞，PBS洗一遍，将3uM dox和适配子-dox分别和两种细胞于37℃反应4h，PBS洗两遍，流式仪检测。结果表明，对于阳性细胞Raji，游离Dox组和适配子-dox复合体组的荧光强度没有明显变化(图6E)，而在阴性细胞中，适配子-dox组的荧光强度明显低于游离Dox(图6F)。图中1代表适配子-dox，2代表游离-dox。

实施例6

由实施例4的结果可知，适配体-dox被CD20阴性细胞选择性摄取程度减弱，因此推测dox对阴性细胞的毒性作用有可能减弱。为了验证这个观点，设立适配体组，游离Dox组和适配体-dox组，分别与Raji以及Jurkat细胞孵育，MTS方法检测细胞的活力情况。具体地，采用3uM适配子、游离dox和适配子-dox分别和Raji和Jurkat细胞于37℃孵育4h，PBS洗两遍，加入新鲜培养基孵育48h后MTS法检测细胞的增殖。

结果如图6所示，对于CD20阴性的Jurkat细胞，dox组细胞的存活率为39.5％，而适配子-dox组细胞存活率为91.6％，显示适配子-dox对Jurkat细胞的杀伤显著低于游离Dox(p＜0.01)(图6B)。然而，对于CD20阳性的Raji细胞，Dox组中细胞的存活率为49.9％，适配子-dox组中的存活率为43.1％，显示适配子-dox对MUC1阳性的A549细胞的杀伤作用和游离的dox没有显著差别(图7A)。上述实验结果表明适配体-dox能够减弱Dox对CD20阴性细胞的毒性，而并不影响Dox对CD20阳性细胞的杀伤。需要注意的是，单纯适配体组中，两种细胞的存活率都接近100％，表明适配体对这两种细胞并无毒性。

Claims (20)

1.一种核酸适配体，其为SEQ ID NO：1所示核苷酸序列，或SEQ ID NO：1所示核苷酸序列经缺失后的序列，其中，所述缺失后的核苷酸序列为：5’-TGTAGCGTGTCTGCTCTT-3’。

2.根据权利要求1所述的核酸适配体，其特征在于所述核酸适配体的两端任选地进行氨基、羧基、巯基、荧光分子、生物素、胆固醇或聚乙二醇基团修饰。

3.根据权利要求1所述的核酸适配体，其特征在于所述核酸适配体的碱基A均为硫代修饰。

4.权利要求1-3中任意一权利要求所述核酸适配体在制备用于检测和/或治疗CD20阳性的肿瘤制剂中的应用。

5.一种CD20靶向药剂混合物，所述靶向药剂混合物包括权利要求1-3中任意一权利要求所述的核酸适配体，以及选自制药上可接受的载体或赋形剂。

6.根据权利要求5所述的靶向药剂混合物，其中所述载体选自纳米药物载体、肿瘤显影剂或染色分子。

7.根据权利要求6所述的靶向药剂混合物，其中所述纳米药物载体选自脂质体、胶束或纳米粒。

8.根据权利要求6所述的靶向药剂混合物，其中所述肿瘤显影剂选自铁磁性纳米粒或包裹了显影剂的纳米粒。

9.根据权利要求6所述的靶向药剂混合物，其中所述染色分子为如辣根过氧化酶。

10.权利要求5-9任一项所述靶向药剂混合物在制备CD20阳性肿瘤的靶向治疗药物中的应用。

11.一种药物组合物，所述药物组合物包括权利要求1-2中任意一权利要求所述核酸适配体，至少一种抗肿瘤药物，以及制药上可接受的载体或赋形剂。

12.根据权利要求11所述药物组合物，其特征在于所述核酸适配体和至少一种抗肿瘤药物是以复合体形式存在。

13.根据权利要求12所述药物组合物，其中所述抗肿瘤药物选自抗代谢类抗肿瘤药、抗生素类抗肿瘤药物、植物碱类抗肿瘤药、激素类抗肿瘤药、铂类抗癌药或抗肿瘤小分子靶向药物。

14.根据权利要求13所述药物组合物，其中所述抗代谢类抗肿瘤药选自甲氨蝶呤、氟尿嘧啶、氟尿苷、吉西他滨或雷替曲塞。

15.根据权利要求13所述药物组合物，其中所述抗生素类抗肿瘤药物选自丝裂霉素C、博来霉素、阿霉素、多柔比星、表柔比星、吡柔比星或米妥蒽醌。

16.根据权利要求13所述药物组合物，其中所述植物碱类抗肿瘤药选自长春碱、紫杉醇或羟基喜树碱。

17.根据权利要求13所述药物组合物，其中所述激素类抗肿瘤药选自他莫昔芬、来曲唑或强的松。

18.根据权利要求13所述药物组合物，其中所述铂类抗癌药选自顺铂、卡铂、奥沙利铂、奈达铂或乐铂。

19.根据权利要求13所述药物组合物，其中所述抗肿瘤小分子靶向药物选自吉非替尼、伊马替尼或拉帕替尼。

20.权利要求13-19任一项所述药物组合物，包括权利要求1-5中任意一权利要求所述的核酸适配体，至少一种抗肿瘤药物，和药物可接受的载体或赋形剂，所述核酸适配体与至少一种抗肿瘤药物以复合体形式存在，所述载体为载药纳米粒。