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CN105085694A - 一种单环刺螠内脏糖胺聚糖的制备方法及其应用 - Google Patents

一种单环刺螠内脏糖胺聚糖的制备方法及其应用 Download PDF

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CN105085694A
CN105085694A CN201410215610.3A CN201410215610A CN105085694A CN 105085694 A CN105085694 A CN 105085694A CN 201410215610 A CN201410215610 A CN 201410215610A CN 105085694 A CN105085694 A CN 105085694A
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Inventor
牛庆凤
陈荫
王斌
李涛
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Zhejiang Ocean University ZJOU
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Zhejiang Ocean University ZJOU
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Abstract

本发明涉及一种单环刺螠内脏糖胺聚糖的制备方法，该方法利用单环刺螠内脏，绞碎匀浆、脱脂以及抽滤后获得单环刺螠内脏干粉，然后将内脏干粉通过木瓜蛋白酶和胰蛋白酶水解，从水解液中提取内脏糖胺聚糖粗品，透析、冷冻干燥后得内脏糖胺聚糖；还涉及了该内脏糖胺聚糖在预防和调节血脂的食品、保健品及药品中的应用。该发明提取方法简单，得率可达6％-7％，大大降低了内脏多糖的蛋白含量，从而提高了糖胺聚糖的纯度，为预防和调节血脂开辟了新的途径。

Description

一种单环刺螠内脏糖胺聚糖的制备方法及其应用
技术领域
本发明涉及从单环刺螠内脏中提取糖胺聚糖的方法及该糖胺聚糖的应用，属于对单环刺螠综合加工利用的技术方法。
背景技术
单环刺螠(Urechisunicinctus)俗名海肠、海肠子，属于螠虫动物门Echiurioidea螠纲Echiurida、无管螠目Xenopneusta、刺螠科Urchidae，体粗大，长约100-300mm，宽约25-27mm，体表满布大小不等的粒状突起，吻圆锥形，腹刚毛1对，粗大，肛门周围有一圈9-13条褐色尾刚毛，分布于俄罗斯、日本、朝鲜和我国黄渤海沿岸，是我国北方沿海泥沙岸潮间带下区及潮下带浅水区底栖生物的常见种。单环刺螠个体肥大，肉味鲜美，体壁肌富含蛋白质和多种人体必需氨基酸，自古以来，在我国、日本和朝鲜沿海均作为名贵的海鲜食品，有较高的经济价值。
目前单环刺螠已实现人工养殖，由于人们的传统做法只食用其体壁，因此在生产加工环节中单环刺螠的内脏作为废弃物被丢弃，造成了资源的很大浪费，也对环境造成了严重的污染。事实上，内脏占单环刺螠身体质量的2/3，研究发现单环刺螠内脏中蛋白质含量为18.25％，脂肪含量为0.12％，总糖含量为4.09％，含有丰富的Ca、Mg、Fe、Zn等元素，同时也含有丰富的EPA、DHA和DPA等。
随着对海洋生物资源的开发和糖类药物研究的日益重视，海洋动物活性多糖的研究也越来越受到广泛的关注，如海参糖胺聚糖具有提高免疫、抗肿瘤、抗凝血等多种活性，是海参中主要的活性物质，海参糖胺聚糖的提取方法也有较多研究，如申请号为201010112839.6(申请公布号CN101787084A)的中国发明专利《一种刺参糖胺聚糖的制备方法》、专利号为ZL200910305363.5(授权公告号CN101624426B)的中国发明专利《一种玉足海参糖胺聚糖的提取方法》等。海参内脏中也含有丰富的多糖活性物质，对海参废弃内脏多糖的研究不仅避免了资源的浪费，还提高了海参加工的附加产值。而单环刺螠不光长得像裸体海参，其营养价值比起海参也不逊色，以海参内脏多糖研究为指导，对单环刺螠内脏多糖进行深入研究，以期筛选出活性多糖成分，为单环刺螠内脏的废物再利用，提高单环刺螠的经济产值提供重要参考。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是针对现有技术而提供一种利用单环刺螠内脏提取单环刺螠内脏糖胺聚糖的制备方法。
本发明所要解决的另一个技术问题提供一种上述单环刺螠内脏糖胺聚糖的应用。
本发明解决第一个技术问题所采用的技术方案为：1、一种单环刺螠内脏糖胺聚糖的制备方法，其特征在于包括以下步骤：
(1)预处理：取新鲜单环刺螠内脏，绞碎匀浆，加入3～4倍体积丙酮，磁力搅拌过夜后，抽滤取沉淀，将沉淀烘干后粉碎得单环刺螠内脏干粉；
(2)酶解：按料液比(g/ml)1:18～20，在内脏干粉中加入蒸馏水，75～80℃水浴提取4～5h后，调节pH值为6～7，加入内脏干粉重量1～1.2％的木瓜蛋白酶，55～65℃水浴消化4～5h，调节pH值为8.2～9.0，加入内脏干粉重量0.5～0.6％的胰蛋白酶，55～65℃水浴消化3～4h，调节pH值为7.0，100℃下灭活5～15分钟；
(3)提取：6000rpm离心8min取上清液，浓缩至原体积的1/15后，加入乙醇至醇含量为80％，静置过夜，6000rpm离心8min取沉淀，得内脏糖胺聚糖粗品；
(4)纯化：按料液比(mg/ml)1:100，将内脏糖胺聚糖粗品溶解于蒸馏水后透析，冷冻干燥得内脏糖胺聚糖。
作为优选，所述透析法截留的分子量为3.5～4.1kDa。
一种如权利要求1所述的单环刺螠内脏糖胺聚糖在预防和调节血脂的食品、保健品及药品中的应用。
作为优选，所述单环刺螠内脏糖胺聚糖的单糖组成包括葡萄糖、氨基葡萄糖、甘露糖、半乳糖、岩藻糖、木糖、鼠李糖、葡萄糖醛酸以及氨基半乳糖，以摩尔比计，葡萄糖：氨基葡萄糖：甘露糖：半乳糖：岩藻糖：木糖：鼠李糖：葡萄糖醛酸：氨基半乳糖的比例为5.37：1.38：1：1.38：2.4：1.05：0.87：0.52：1.38，重均分子量为3.5～4.1kDa。
为使所述单环刺螠内脏糖胺聚糖获得较好的抗脂质过氧化活性，所述单环刺螠内脏糖胺聚糖清除自由基的有效浓度为2.47～10mg/ml。
与现有技术相比，本发明的优点在于：利用单环刺螠废弃内脏为原料，通过两步酶解法提取获得重均分子量在3.5～4.1kDa之间的糖胺聚糖，该提取方法简单，得率可达6％-7％，采用木瓜蛋白酶与胰蛋白酶相结合水解，大大降低了内脏多糖的蛋白含量，从而提高了糖胺聚糖的纯度。同时，该单环刺螠内脏糖胺聚糖在体外抗脂质过氧化模型中具有良好的抗脂质过氧化活性，10mg/ml时对自由基的清除率接近90％，因此该内脏糖胺聚糖可进一步加工成预防和调节血脂的食品、保健品及药品，从而为预防和调节血脂开辟新的途径。
附图说明
图1为本发明中单环刺螠内脏糖胺聚糖的PMP柱前衍生高效液相色谱图；
图2为10种单糖标准品的PMP柱前衍生高效液相色谱图；
图3为本发明中单环刺螠内脏糖胺聚糖的高效凝胶渗透色谱图；
图4为本发明中单环刺螠内脏糖胺聚糖的脂质过氧化消除曲线。
具体实施方式
以下结合附图实施例对本发明作进一步详细描述。
实施例1：单环刺螠内脏糖胺聚糖制备一
取新鲜的单环刺螠，用剪刀从其肛门插入，沿腹部剖开，或沿着背部剖开，取出所有内脏，将取出的内脏清洗干净后用绞肉机粉碎匀浆，加入4倍体积的丙酮脱脂，磁力搅拌(200rpm)过夜后，抽滤取沉淀，将沉淀烘干后粉碎得单环刺螠内脏干粉。在制得的内脏干粉中，按料液比(g/ml)1:20加入蒸馏水，80℃水浴提取4h后，调节pH值为7，加入内脏干粉重量1％的木瓜蛋白酶，60℃水浴消化4h，调节pH值为9.0；加入内脏干粉重量0.5％的胰蛋白酶，60℃水浴消化3h，调节pH值为7.0，100℃下灭活5分钟，以使未反应的酶失活。将制得的酶解液6000rpm离心8min取上清液，将上清液浓缩至原体积的1/15，加入乙醇至醇含量为80％，静置过夜，6000rpm离心8min取沉淀，得内脏糖胺聚糖粗品。按料液比(mg/ml)1:100，将内脏糖胺聚糖粗品溶解于蒸馏水后过3500透析袋透析，冷冻干燥得棕色絮状的内脏糖胺聚糖，本实施例中内脏糖胺聚糖的得率为6.5％。
实施例2：单环刺螠内脏糖胺聚糖制备二
取新鲜的单环刺螠，用剪刀从其肛门插入，沿腹部剖开，或沿着背部剖开，取出所有内脏，将取出的内脏清洗干净后用绞肉机粉碎匀浆，加入3倍体积的丙酮脱脂，磁力搅拌(200rpm)过夜后，抽滤取沉淀，将沉淀烘干后粉碎得单环刺螠内脏干粉。在制得的内脏干粉中，按料液比(g/ml)1:18加入蒸馏水，75℃水浴提取5h后，调节pH值为6，加入内脏干粉重量1.4％的木瓜蛋白酶，65℃水浴消化4h，调节pH值为8.5，加入内脏干粉重量0.6％的胰蛋白酶，65℃水浴消化4h，调节pH值为7.0，100℃下灭活15分钟，以使未反应的酶失活。将制得的酶解液6000rpm离心8min取上清液，将上清液浓缩至原体积的1/15，加入乙醇至醇含量为80％，静置过夜，6000rpm离心8min取沉淀，得内脏糖胺聚糖粗品。按料液比(mg/ml)1:100，将内脏糖胺聚糖粗品溶解于蒸馏水后过3500透析袋透析，冷冻干燥得棕色絮状的内脏糖胺聚糖，本实施例中内脏糖胺聚糖的得率为7％。
实施例3：单环刺螠内脏糖胺聚糖制备三
取新鲜的单环刺螠，用剪刀从其肛门插入，沿腹部剖开，或沿着背部剖开，取出所有内脏，将取出的内脏清洗干净后用绞肉机粉碎匀浆，加入4倍体积的丙酮脱脂，磁力搅拌(200rpm)过夜后，抽滤取沉淀，将沉淀烘干后粉碎得单环刺螠内脏干粉。在制得的内脏干粉中，按料液比(g/ml)1:18加入蒸馏水，80℃水浴提取4h后，调节pH值为6，加入内脏干粉重量1.2％的木瓜蛋白酶，55℃水浴消化5h，调节pH值为8.2，加入内脏干粉重量0.6％的胰蛋白酶，55℃水浴消化4h，调节pH值为7.0，100℃下灭活15分钟，以使未反应的酶失活。将制得的酶解液6000rpm离心8min取上清液，将上清液浓缩至原体积的1/15，加入乙醇至醇含量为80％，静置过夜，6000rpm离心8min取沉淀，得内脏糖胺聚糖粗品。按料液比(mg/ml)1:100，将内脏糖胺聚糖粗品溶解于蒸馏水后过3500透析袋透析，冷冻干燥得棕色絮状的内脏糖胺聚糖，本实施例中内脏糖胺聚糖的得率为6％。
实施例2：单环刺螠内脏糖胺聚糖组成确认
2.1单糖组成
采用PMP柱前衍生高效液相色谱法测定由实施例1或实施例2或实施例3获得的单环刺螠内脏多糖的单糖组成。
2.1.1样品的全水解
取适量样品，用2mol·L-1TFA在110℃进行全水解6h，反复加甲醇旋转蒸发除去TFA至无酸味，用适量蒸馏水洗出。
2.1.2衍生条件
取100μL上述标准品溶液置1.5mL的EP管中，加入100μL0.3mol·L-1NaOH溶液，120μL0.5mol·L-1PMP溶液，70℃衍生1h，反应完加入100μL0.3mol·L-1HCl溶液中和，加500μL氯仿反复萃取离心，上清用0.22μm微孔滤膜过滤，采用高效液相色谱分析。
2.1.3色谱条件
色谱柱：AgilentXDB-C18色谱柱(4.6mm×150mm，5μm)；流动相：磷酸盐缓冲液(pH6.7)/CH3CN(82:18，V/V)；流速：1.0mL·min-1；柱温：30℃；进样量：20μL；检测器：DAD(245nm)。
2.1.4样品单糖组成测定
全水解完的样品与标准品在相同条件下衍生，进样20μL，高效液相色谱分析，记录色谱图。与各单糖标准品的出峰时间对照，确定样品单糖组成，结果如图1所示。由图1、图2对比可知，内脏糖胺聚糖的单糖组成非常复杂，既含有中性糖、又含有酸性糖和碱性糖的杂多糖，而中性糖中还包括的六碳糖、五碳糖和六碳甲基糖。单糖组成中葡萄糖(Glc)是最主要成分，其次还含有氨基葡萄糖(GlcN)、甘露糖(Man)、半乳糖(Gal)和岩藻糖(Fuc)，还含有少量的木糖(Xyl)、鼠李糖(Rha)、葡萄糖醛酸(GlcUA)和氨基半乳糖(GalN)。比例分别为Man:GlcN:Rha:GlcUA:GalN:Glc:Gal:Xyl:Fuc＝1:1.38:0.87:0.53:0.52:5.37:1.38:1.05:2.40。
本实施例中中使用的溶液配制如下：
单糖标准品溶液：分别精确称取等摩尔干燥至恒重的Man、GlcN、Rha、GlcUA、GalUA、GalN、Glc、Gal、Xyl、Ara和Fucu10种单糖标准品，加水充分溶解，配制成1.0mg·mL-。
磷酸盐缓冲液：准确称取13.6g磷酸二氢钾和1.89g氢氧化钠，用水定容至1L的容量瓶中，充分溶解后，过0.22μm的滤膜，超声脱气即得。
磷酸盐缓冲液-乙腈溶液：临用前将上述磷酸盐缓冲液和进口分析纯的乙腈按照82：18的比例配制，脱气后即得，现配现用。
0.3mol·L-1NaOH溶液：精密称取0.60g氢氧化钠定容于50mL的容量瓶中。
0.3mol·L-1HCl溶液：吸取1.25mL的浓盐酸定容于50mL的容量瓶中。
PMP溶液的配制：精密称取87.1mgPMP，用甲醇定容于1.0mL的容量瓶中，现用现配。
2.2分子量测定
采用高效凝胶渗透色谱法测定单环刺螠内脏糖胺聚糖的分子量，结果如图3所示。2.2.1测定过程中高效凝胶渗透色谱的色谱条件为：
色谱柱：TSK-GELG3000SWxL凝胶色谱柱(300mm×7.8mm)；柱温：35℃；流动相：0.1mol·L-1的Na2SO4；流速：0.5mL·min-1；检测器：示差检测器(RID)。
2.2.2标准曲线制作
以系列标准葡聚糖为分子量标准品，分别取6个不同分子量的标准葡聚糖，用流动相溶解配制成5mg·mL-1的溶液，分别进样20μL，记录色谱图，以保留时间TR为横坐标，以分子量对数Log(Mw)为纵坐标绘制标准曲线并得出回归方程。
2.2.3样品分子量测定
称取适量样品，加流动相溶解成5mg·mL-1的溶液，用0.22μm微孔滤膜过滤，进样20μL，记录色谱图。将样品溶液的保留时间代入由标准右旋糖酐制作的回归方程即可得出样品分子量的对数值，再将其转换即可得出样品的分子量。如图3呈现单一和较对称的峰，表明单环刺螠内脏多糖的分子量分布比较集中，和分子量标准曲线比对，计算得到内脏糖胺聚糖的分子量主要集中在4.1kDa左右。由此可知，单环刺螠内脏糖胺聚糖为分子量分布较为单一的低聚糖。
2.3理化性质测定
以牛血清蛋白为标准品，采用Folin-酚法测定蛋白含量，以硫酸钾为标准品，采用氯化钡-明胶比浊法测定硫酸根含量，测定结果蛋白含量低于4％，硫酸基含量约为8％。2.3.1溶液的配制
①4％Na2CO3溶液，②0.2mol·L-1NaOH溶液，③1％CuSO4溶液，④2％酒石酸钾钠溶液。使用前将①与②等体积混合配成Na2CO3-NaOH溶液，将③与④混合配成硫酸铜-酒石酸钾钠溶液，然后将这两种溶液按50:1混合得溶液甲，溶液乙由Folin-酚试剂用前稀释一倍得到。
标准品溶液：准确称取干燥至恒重的标准牛血清蛋白10.0mg，置10mL容量瓶中少量水溶解，加水至刻度，得到1.0mg·mL-1的标准牛血清蛋白溶液，取5mL于50mL容量瓶中定容，得到0.1mg·mL-1的标准牛血清蛋白溶液。
供试液：准确称取干燥至恒重的各多糖样品5.0mg，加1mL蒸馏水，配制成5mg·mL-1溶液。
2.3.2蛋白质含量的测定
标准曲线的绘制
分别吸取标准牛血清蛋白溶液0、100、200、400、600、800、1000μL，加水补至1.0mL，分别加入2.5mL试剂甲，漩涡振荡，室温放置10min，再分别加入0.25mL试剂乙，再次漩涡振荡，室温放置30min后，紫外分光光度计650nm处测定吸光值。以标准牛血清蛋白的质量数为横坐标，相应的吸光值为纵坐标绘制标准曲线。
样品的测定
分别吸取供试液适量，同样的方法与标准牛血清蛋白平行操作三次，650nm处测定吸光值，根据标准曲线计算各多糖的蛋白含量的平均值，换算成百分含量。
2.3.3硫酸基测定：
溶液配制
0.5％明胶溶液：1.25g明胶在60～70℃溶解于10mL水中，定容至250mL，4℃冰箱静置过夜。
氯化钡-明胶溶液：0.5gBaCl2溶解于100mL0.5％明胶溶液中，4℃冰箱静置过夜。
K2SO4溶液：称105℃干燥恒重的K2SO4108.75mg，以水定容至100mL，即得硫酸基标准液(硫酸根质量浓度)600μg·mL-1。
稀盐酸配制：1mL浓盐酸加水稀释至30mL。
标准曲线的绘制
分别取上述标准硫酸盐溶液0、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5mL，补水至1.0mL。加入稀盐酸1.0mL，再加入氯化钡-明胶溶液0.5mL，混匀，25℃放置20min，在500nm处测定其吸光值。以硫酸基标准液的质量数为横坐标，相应的吸光值为纵坐标绘制标准曲线。
样品的测定
准确称取5mg样品溶于4mL，1mol·L-1HCl中，封管，于105℃的烘箱中反应12h，使硫酸根游离。准确移取上述溶液适量，按标准曲线的测定方法平行三次，测定其吸光值，代入线性回归方程计算各多糖样品的硫酸基含量的平均值，最后，换算成百分含量。)
实施例3：体外抗脂质过氧化活性测定
研究表明海洋糖胺聚糖能够有效的降低脂质过氧化物的产生，通过自由基的清除达到调节心血管并延缓衰老的作用。单环刺螠内脏多糖作为低分子量的硫酸酯化类糖胺聚糖，还未对其进行深入的活性研究。为快速表征单环刺螠内脏糖胺聚糖对脂质过氧化物的清除作用以期在调节血脂和预防心血管疾病方面得到应用，采用体外抗脂质过氧化模型对其清除自由基活性进行评价。
3.1体外抗脂质过氧化模型的建立
卵磷脂通常被用作细胞模型而进行体外的脂质过氧化的研究，卵磷脂体系中的抗氧化性的测定通常采用硫代巴比妥酸(TBA)法，卵磷脂中的C2位上所含的极低密度脂蛋白和低密度脂蛋白中的不饱和脂肪酸在铁离子的催化作用下，经震荡能发生过氧化，由此可以建立以铁离子诱发卵磷脂C2位上的极低密度脂蛋白和低密度脂蛋白、过不饱和脂肪酸的氧化模型，用以评价样品的抗氧化活性。
3.2体外抗脂质过氧化活性测定
分别加入1.0mL，取2,4,6,8,10mg/mL的多糖溶液，吸取0.4mL卵黄的悬液(V卵黄:25V0.1mol/LpH7.45PBS)，再加入0.4mL25mmol/L的FeSO4·7H2O，用PBS补充至4mL，振荡15min，取出后加入1.0mL20％的TCA静置，3500r/min离心10min，吸取4mL上清液加入2mL硫代巴比妥酸(0.8％)，加塞放入沸水浴中反应15min，在分光光度计532nm处比色测定吸光度值，以空白管(6mLPBS)归零，未加样品管的吸光度为A0，样品管的吸光度为A，以Vc作为阳性对照,样品抗氧化活性用对卵黄脂蛋白脂质过氧化的抑制率表示：
抑制率I％＝(A0-A)/A0×100％
公式中：A0—对照管的吸光度；A—样品的吸光度。
以TBA法检测多糖样品的脂质过氧化清除能力，样品配制成加入不同浓度梯度(0，2，4，6，8和10mg/mL)，以BHT和Vc作为阳性对照,样品抗氧化活性用对卵黄脂蛋白脂质过氧化的抑制率表示。
由图4通过对比分析得，内脏多糖中的类糖胺聚糖体现出良好的体外抗脂质过氧化活性，在10mg/mL时对自由基的清除率接近90％，其半数清除浓度为2.47mg/mL，表明单环刺螠内脏多糖存在较好的脂质过氧化物清除作用，推测单环刺螠内脏类糖胺聚糖是单环刺螠内脏中的活性成分。

Claims (5)

1.一种单环刺螠内脏糖胺聚糖的制备方法，其特征在于包括以下步骤：
(1)预处理：取新鲜单环刺螠内脏，绞碎匀浆，加入3～4倍体积丙酮，磁力搅拌过夜后，抽滤取沉淀，将沉淀烘干后粉碎得单环刺螠内脏干粉；
(2)酶解：按料液比(g/ml)1:18～20，在内脏干粉中加入蒸馏水，75～80℃水浴提取4～5h后，调节pH值为6～7，加入内脏干粉重量1～1.4％的木瓜蛋白酶，55～65℃水浴消化4～5h，调节pH值为8.2～9.0，加入内脏干粉重量0.5～0.6％的胰蛋白酶，55～65℃水浴消化3～4h，调节pH值为7.0，100℃下灭活5～15分钟；
(3)提取：6000rpm离心8min取上清液，浓缩至原体积的1/15后，加入乙醇至醇含量为80％，静置过夜，6000rpm离心8min取沉淀，得内脏糖胺聚糖粗品；
(4)纯化：按料液比(mg/ml)1:100，将内脏糖胺聚糖粗品溶解于蒸馏水后透析，冷冻干燥得内脏糖胺聚糖。
2.如权利要求1所述的单环刺螠内脏糖胺聚糖的制备方法，其特征在于：所述透析法截留的分子量为3.5～4.1kDa。
3.一种如权利要求1所述的单环刺螠内脏糖胺聚糖在预防和调节血脂的食品、保健品及药品中的应用。
4.如权利要求3所述的单环刺螠内脏糖胺聚糖在预防和调节血脂方面的食品、保健品及药品应用，其特征在于：所述单环刺螠内脏糖胺聚糖的单糖组成包括葡萄糖、氨基葡萄糖、甘露糖、半乳糖、岩藻糖、木糖、鼠李糖、葡萄糖醛酸以及氨基半乳糖，以摩尔比计，葡萄糖：氨基葡萄糖：甘露糖：半乳糖：岩藻糖：木糖：鼠李糖：葡萄糖醛酸：氨基半乳糖的比例为5.37：1.38：1：1.38：2.4：1.05：0.87：0.52：1.38，重均分子量为3.5～4.1kDa。
5.如权利要求3或4所述的单环刺螠内脏糖胺聚糖在预防和调节血脂方面的食品、保健品及药品应用，其特征在于：所述单环刺螠内脏糖胺聚糖清除自由基的有效浓度为2.47～10mg/ml。
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* Cited by examiner, † Cited by third party
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CN107412126A (zh) * 2017-08-06 2017-12-01 长沙小新新能源科技有限公司 一种基于海洋生物提取物的保湿霜
CN112516174A (zh) * 2020-12-12 2021-03-19 烟台大学 一种包含海肠内脏的产品及其制备方法
CN113583084A (zh) * 2021-07-28 2021-11-02 中日友好医院(中日友好临床医学研究所) 单环刺螠浸出液蛋白质提取物及其提取方法与应用

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Title
焦绪栋等: "单环刺螠废弃内脏中粗多糖的提取工艺优化", 《食品科学》 *

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