CN105078889B - 一种用于治疗软骨疾病的脂质体递送系统及其制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明属医药技术领域，为解决目前缺乏有效安全的软骨siRNA递送系统，限制RNAi在治疗软骨疾病中的应用，提供一种软骨siRNA脂质体递送系统及其制备方法。包括脂质体、脂质体修饰物和小核酸药物，脂质体为磷脂酰胆碱、胆固醇、Dlin‑KC2‑DMA；脂质体修饰物为聚乙二醇脂质共轭物，小核酸药物为Ihh siRNA。本发明修饰了脂质体纳米为基础的软骨RNA干扰递送系统，形成的复合物带有正电荷，安全、体积小能分布到全层软骨组织中。载体实验证实，能将siRNA递送入软骨细胞，成功敲除软骨细胞内的相应基因，突破了软骨组织中基因敲除的瓶颈；可作为一个靶向基因来治疗PTOA。
Description
技术领域
本发明属于医药技术领域，具体涉及一种用于治疗软骨疾病的脂质体递送系统及其制备方法。
背景技术
印度刺猬蛋白（Indian Hedgehog, Ihh）与创伤性骨关节炎（Post-traumaticosteoarthritis, PTOA）相关，在膝关节前交叉韧带（Anterior Cruciate Ligament, ACL）损伤的早期阶段Ihh表达增高，而ACL损伤后最终将发展成为PTOA。在动物实验中，运用条件性基因敲除小鼠敲除成年小鼠关节软骨中的Ihh基因能够减缓ACL损伤导致PTOA的发生降低。因此，敲除Ihh基因可以作为一个靶向基因来治疗PTOA。然而，目前的Ihh基因敲除技术无法运用转基因小鼠以外的其他动物及人体PTOA的治疗，并且化学的Ihh抑制剂能够产生严重的毒副作用，包括：前脑无裂畸形、唇腭裂、肢体发育障碍等。因此，目前非常有必要找到一种安全有效的方法敲除关节软骨内Ihh基因来治疗PTOA。
关节软骨表层非常致密，由软骨细胞和细胞外基质组成，而后者主要由II胶原和被其包绕的蛋白多糖组成。一些临床I-III期的实验研究证实通过RNA干扰的方式沉默特定的基因能够对人体疾病起到有效的治疗作用（Pignatello R, Sarpietro MG, CastelliF. Synthesis and biological evaluation of a new polymeric conjugate andnanocarrier with osteotropic properties. J Funct Biomater March 2012; 3(1):79-99. Zhang G, Guo B, Wu H, Tang T, Zhang BT, Zheng L, He Y, Yang Z, Pan X,Chow H, To K, Li Y, Li D, Wang X, Wang Y, Lee K, Hou Z, Dong N, Li G, LeungK, Hung L, He F, Zhang L, Qin L. A delivery system targeting bone formationsurface to facilitate RNAi-based anabolic therapy. Nat Med 2012; 18(2):307-14）。然而，鉴于关节软骨的组织结构特点，其表面又带有大量负电荷，单独的siRNA不能进入软骨细胞内，目前尚缺乏有效并且安全的软骨siRNA递送系统，限制了RNAi在治疗软骨疾病中的应用。
脂质体具有良好的生物相容性，已被广泛用作药物载体，能够使包封的药物具有较好的稳定性，并且在一定程度上能够降低药物的毒副作用。在骨组织领域运用比较成熟的是一种脂质体纳米递送系统（Lipid Nanoparticle, LNP），它为骨靶向脂质体（Zhang G,Guo B, Wu H, Tang T, Zhang BT, Zheng L, He Y, Yang Z, Pan X, Chow H, To K, LiY, Li D, Wang X, Wang Y, Lee K, Hou Z, Dong N, Li G, Leung K, Hung L, He F,Zhang L, Qin L. A delivery system targeting bone formation surface tofacilitate RNAi-based anabolic therapy. Nat Med. 2012; 18(2):307-14），但由于骨组织与软骨组织是不同的组织，这类脂质体纳米递送系统的脂质体上面携带骨靶向分子，能够定向地将脂质体与骨组织结合，而无法与骨以外的组织结合，因此这类脂质体纳米递送系统并不能运用于软骨组织。
申请号为201110156949.7，名称为基于小核酸药物成骨治疗的骨靶向递送系统及其制备方法的发明专利，提供了一种基于小核酸药物成骨治疗的骨靶向递送系统及其制备方法。该骨靶向递送系统包括脂质体、骨靶向分子和小核酸药物，所述骨靶向分子选自双磷酸盐、8个天门冬氨酸多肽重复序列、6个天门冬氨酸-丝氨酸-丝氨酸多肽重复序列和针对成骨样细胞筛选出的适配子中的一种或几种，所述小核酸药物选自具有促进骨形成功能的小干扰核糖核酸、微小核糖核酸的模拟物和微小核糖核酸的阻断剂中的一种或几种。本发明相比传统的骨靶向递送系统具有更强的专属性和特异性，小核酸药物转染效率高，能够达到较高的沉默效率。而该专利所制备的骨靶向递送系统是脂质体肌肉注射或者静脉注射，然后脂质体通过靶向分子将脂质体带入骨组织，从而作用于骨组织，但是该骨靶向递送系统无法将脂质体靶向进入软骨组织中。
发明内容
本发明为了解决目前缺乏有效并且安全的软骨siRNA递送系统，限制了RNAi在治疗软骨疾病中的应用，提供了一种用于治疗软骨疾病的脂质体递送系统及其制备方法。
本发明由如下技术方案实现的：一种用于治疗软骨疾病的脂质体递送系统，包括脂质体、脂质体修饰物和小核酸药物，所述脂质体为磷脂酰胆碱DPPC、胆固醇、Dlin-KC2-DMA；所述脂质体修饰物为聚乙二醇脂质共轭物C-PEG，所述小核酸药物为Ihh siRNA；所述磷脂酰胆碱DPPC浓度为35mg/ml，占脂质体和脂质体修饰物的质量百分比为11.72%；胆固醇浓度为9.5mg/ml，占脂质体和脂质体修饰物的质量百分比为23.85%；聚乙二醇脂质共轭物C-PEG浓度为50mg/ml，占脂质体和脂质体修饰物的质量百分比为16.74%；Dlin-KC2-DMA的浓度为28.5mg/ml，占脂质体和脂质体修饰物的质量百分比为47.69%。所述小核酸药物的靶序列为SEQ ID NO：2，即Ihh siRNA的第1708-1734位碱基序列。
所述Ihh siRNA在Genebank 中Sequence Name：ACC NM_053384.1，碱基序列为SEQID NO：1，其正义链为：5'-rGrArArGrGrArGrCrCrUrGrGrArUrGrUrCrCrUrUrGrCrCAC -3'；反义链为：5'-rGrUrGrGrCrArArGrGrArCrArUrCrCrArGrGrCrUrCrCrUrUrCrCrC -3'；本发明选用Ihh siRNA碱基序列中第1708-1734位碱基序列作为靶序列。
| 正义链的开始位点 | 2085 | 反义链的开始起点 | 2109 |
| 正义链的长度 | 25 | 反义链的长度 | 27 |
| 正义链的分子量 | 7980.9 | 反义链的分子量 | 8583.2 |
| 总的分子量 | 16564.0 | GC比例 | 57.9 |
用于治疗软骨疾病的脂质体递送系统的制备方法包括以下步骤：
（1） 混合脂质体：将2ul磷脂酰胆碱DPPC、15ul胆固醇、2ul聚乙二醇脂质共轭物、10ul的Dlin-KC2-DMA混合，然后加入乙醇将脂质体溶解，形成A液；
（2） 将20uM、10ul的Ihh siRNA加入55ul的柠檬酸盐缓冲液，形成B液；
（3） 将A液加入B液中混合均匀,形成AB混合液；
（4） 在AB混合液中加入400ul的PBS缓冲液洗涤，然后在超滤离心管中12000r离心5min；
（5） 用PBS重复洗涤离心3次，离心后所获得的80-100ul液体即为软骨siRNA脂质体递送系统。
所述柠檬酸盐缓冲液的浓度为50mM,pH为4。
本发明修饰了脂质体纳米为基础的软骨RNA干扰递送系统（Lipid Nanoparticle(LNP)-based cartilage RNAi Delivery System）。包装形成LNP-siRNA复合物系统，此复合物带有正电荷，并且安全、体积小能够分布到全层软骨组织中。本发明把包含有siRNA的脂质体注射入关节腔内，利用阴阳电荷相互吸引而将脂质体变相地靶向递送入关节软骨细胞，成功敲除软骨细胞内的Ihh基因。本发明安全有效的敲除关节软骨内Ihh基因，可以作为一个靶向基因来治疗PTOA。通过载体实验证实，修饰后的LNP能够将Ihh-siRNA递送入软骨细胞，成功敲除软骨细胞内的Ihh基因。突破了软骨组织中基因敲除的瓶颈，解决了这一难题。本发明安全有效的敲除关节软骨内Ihh基因，可以作为一个靶向基因来治疗PTOA。
本发明所述的脂质体采用的是通用脂质体，可以递送任何siRNA，siRNA是一种小RNA分子，不同的蛋白均可通过其相应的siRNA将此蛋白的基因敲除，使得这个蛋白不表达。例如，Ihh蛋白的siRNA可以将Ihh蛋白的基因敲除，使得Ihh蛋白表达下降甚至不表达。本发明通过脂质体将Ihh siRNA递送入关节软骨后，通过PCR法证实siRNA发挥了效应，变相地证实本脂质体包裹siRNA后能够进入关节软骨并且可以发挥作用。经过使用条件性转基因小鼠证实敲除Ihh基因能够抑制骨关节炎的发生；Ihh-siRNA目前主要用于关节疾病的治疗，而由于关节软骨表面携带负电荷，通过电荷的作用，可以使得进入关节腔的脂质体向关节软骨表面移动，而不是四处扩散。
为说明本发明的用于治疗软骨疾病的脂质体递送系统，结合附图进一步说明如下：
图1为用于治疗软骨疾病的脂质体递送系统的结构示意图，图中：球体为由DLin-KC2-DMA、DPPC、胆固醇以及C16 PEG2000 Ceramide构成；C16 PEG2000 Ceramide是两亲性的，一端亲脂，所以能插入膜结构，PEG2000的部分亲水，所以朝向水相；DPPC和胆固醇组成膜结构；DLin-KC2-DMA的化学结构和DPPC相似，参与组成膜结构；球体内部包裹Ihh siRNA。该化学组成的纳米颗粒具有高效性，即给药剂量低于类似化合物就有很好的效果。
图2为脂质体递送siRNA进入鸡的肥大软骨细胞的实验结果图，结果显示本发明所述脂质体递送系统可以将siRNA递送入细胞内，而单纯的siRNA无法进入细胞内。
图3为共聚焦显微镜显示脂质体可以将siRNA或者beacon这类小分子包装，并送入软骨细胞中，其中白色圆圈区域显示的为红色荧光，图3中，使用的是GAPDH-beacon，它进入细胞内，自身不发荧光，但如果存在GAPDH的RNA，那么GAPDH-Beacon就可以和GAPDH结合，并发出荧光。在大鼠的关节腔内注射脂质体与GAPDH-beacon，48小时后，处死大鼠，去其膝关节软骨做冰冻切片，共聚焦显微镜下观察，可看到脂质体与GAPDH-beacon组的软骨细胞内有红色荧光，即表示脂质体可以递送GAPDH-beacon进入软骨组织细胞内。而单独的GAPDH-beacon无法进入软骨细胞，对照组在共聚焦显微镜下观察未发现荧光。
图4为活体荧光分子断层扫描显示脂质体能够递送Beacon进入软骨细胞：在大鼠的右膝关节腔内注射脂质体与GAPDH-beacon复合物，左膝关节注射单独的GAPDH-beacon，在荧光分子断层扫描系统在680nm波长处扫描不同时间点大鼠的双膝关节，发现右膝关节内有荧光存在，并且荧光存在可长达一周，而左膝关节内没有，表明脂质体能够递送GAPDH-beacon进入大鼠关节软骨细胞，而单独的GAPDH-beacon无法进入。通过该检测结果说明：本发明所制备的脂质体递送系统能够将siRNA或beacon递送入软骨细胞中。
图5为应用脂质体将Ihh siRNA递送入大鼠关节软骨1周后，Ihh的敲除率：在大鼠的右膝关节腔内注射脂质体与Ihh siRNA复合物，左膝关节注射单独的Ihh siRNA。一周后，处死大鼠，分别刮取左右膝关节软骨，提取总RNA，qPCR显示右膝关节软骨细胞中Ihh的mRNA水平不足左膝关节的60%。即脂质体能够成功将Ihh siRNA递送入活体动物关节软骨细胞内，并且Ihh siRNA能够正常发挥作用，敲除膝关节内的Ihh基因。
附图说明
图1为脂质体的结构示意图；图2为脂质体递送siRNA进入鸡的肥大软骨细胞的实验结果图，图中DAPI为蓝色荧光，显示细胞核位置；图3为脂质体递送Beacon进入软骨组织内的软骨细胞的共聚焦显微镜显示结果图；图4为脂质体递送Beacon进入软骨细胞的活体荧光分子断层扫描显示结果图；图5为脂质体将Ihh siRNA递送入大鼠关节软骨1周后，Ihh的敲除结果示意图。图6为磷脂酰胆碱（DPPC）的分子式；图7为胆固醇的分子式；图8为聚乙二醇脂质共轭物（C16 PEG2000 Ceramide）的分子式；图9为所制备的LNP-siRNA复合物系统处理大鼠后大鼠体内Ihh mRNA的Real-time PCR检测结果图；图10为所制备的LNP-siRNA复合物系统的大鼠体内关节软骨损伤治疗的关节软骨HE染色图。
具体实施方式
实施例1：一种用于治疗软骨疾病的脂质体递送系统，包括脂质体、脂质体修饰物和小核酸药物，所述脂质体为磷脂酰胆碱DPPC、胆固醇、Dlin-KC2-DMA；所述脂质体修饰物为聚乙二醇脂质共轭物（C16 PEG2000 Ceramide）C-PEG，所述小核酸药物为Ihh siRNA；其靶序列为SEQ ID NO：2，即Ihh siRNA的第1708-1734位碱基序列；所述磷脂酰胆碱DPPC浓度为35mg/ml，占脂质体和脂质体修饰物的质量百分比为11.72%；胆固醇浓度为9.5mg/ml，占脂质体和脂质体修饰物的质量百分比为23.85%；聚乙二醇脂质共轭物C-PEG浓度为50mg/ml，占脂质体和脂质体修饰物的质量百分比为16.74%；Dlin-KC2-DMA的浓度为28.5mg/ml，占脂质体和脂质体修饰物的质量百分比为47.69%。
用于治疗软骨疾病的脂质体递送系统即LNP-siRNA复合物系统的制备方法，包括以下步骤：
（1） 混合脂质体：将2ul磷脂酰胆碱DPPC、15ul胆固醇、2ul聚乙二醇脂质共轭物、10ul的Dlin-KC2-DMA混合，然后加入6ul乙醇，将脂质体充分溶解，形成A液，共为35ul；
（2） 将20uM、10ul的Ihh siRNA加入55ul的柠檬酸盐缓冲液，形成B液，共为65ul；
（3） 将A液缓慢加入B液中，振荡器振荡，将其混合均匀,形成AB混合液；
（4） 在AB混合液中加入400ul的PBS洗涤，共500ul，然后在超滤离心管中12000r离心5min；
（5） 用PBS重复洗涤离心3次，离心后所获得的80-100ul液体即为软骨siRNA脂质体递送系统。
所述柠檬酸盐缓冲液的浓度为50mM,pH为4。
实验例1：验证脂质体递送系统进入软骨细胞
1.脂质体递送siRNA进入鸡的肥大软骨细胞
实验材料：17天鸡胚胸骨上1/3的软骨细胞，脂质纳米微粒（LNP），阴性对照siRNA（Negative Control siRNA）。0.3%不含EDTA的胰蛋白酶，0.9%的胶原酶，0.3%的透明质酸酶[I型，Sigma公司，货号H3506-1G]。
实验方法：如实施例1所述方法配制LNP-siRNA复合物。获取15个17天鸡胚胸骨上1/3的软骨细胞，切成碎片，放于50ml离心管中，然后加入三种消化液各1ml，共3ml（消化液配制：0.3%不含EDTA的胰蛋白酶，0.9%的胶原酶，0.3%的透明质酸酶按体积1:1:1配制），置于37℃水浴箱30分钟后，小心吸取上层液体，然后再次加入加入三种消化液各1ml，共3ml，在37℃水浴箱中孵育1-1.5小时，每隔10分钟振荡一次；然后加入相同体积的培养液终止酶，共加入培养液6ml反应。然后过滤除去未消化的团块和杂质。滤液在1100rpm下离心5分钟，除去上清液；离心所得沉淀加入10ml细胞培养液，吹打混匀细胞然后接种于平板上。间隔2天换液一次，待细胞贴壁并长到占平板80%时，传代，接种于6孔板上。待细胞再次长到60-80%时，实验组加入LNP-siRNA复合物40ul，对照组只加入5uM的siRNA 40ul。24小时后换液，显微镜下观察。
细胞培养液的配制：F-12 (500ml) + 10%胎牛血清Fetal Bovine Serum fromGIBCO(50ml) + [P+S]（青霉素+链霉素）(5ml)。
结果显示：荧光显微镜检测见图2，由于Negative Control siRNA自身携带绿色荧光，因此荧光显微镜下观察到实验组（LNP-siRNA组）细胞包浆内存在绿色荧光，表明siRNA进入了细胞内，即LNP能够有效能将siRNA递送入细胞内。对照组（Free-siRNA组）未见荧光，不加载运体的单纯siRNA无法进入细胞胞浆。
2.脂质体递送Beacon进入小鼠软骨组织内的软骨细胞
实验材料：小鼠6只，脂质纳米微粒（LNP），GAPDH.beacon。
实验方法：采用实施例1所述方法配制LNP-GAPDH.beacon复合物。小鼠右膝关节内注射LNP-GAPDH.beacon复合物40ul，左膝关节内注射相同剂量的GAPDH.beacon。48小时后，处死小鼠，刮取小鼠膝关节软骨，制备冰冻切片，共聚焦显微镜下观察。观察显示：小鼠右膝关节软骨能够看到红色荧光，而左膝关节软骨无法观察到荧光。
Beacon即分子信标的结构是一种在5’和3’末端自身形成一个8个碱基左右的发夹结构的茎环双标记寡核苷酸探针，两端的核酸序列互补配对，标记在一端的荧光基团与标记在另一端的淬灭基团紧紧靠近，因此不会产生荧光。荧光基团被激发后产生的光子被淬灭剂淬灭，由荧光基团产生的能量以红外而不是可见光形式释放出来，所以当通过LNP转运GAPDH-Beacon进入细胞内后，跟GAPDH的mRNA结合，就可以在红外光下看到荧光，即说明了LNP的可靠性。在运用GAPDH-Beacon时，使用共聚焦显微镜在680nm处看到荧光，或者通过FMT在680nm处扫描大鼠看到直观的荧光。
右膝关节内注射LNP-GAPDH.beacon复合物，共聚焦显微镜下观察到红色荧光，表明LNP能够将GAPDH.beacon有效地递送入关节软骨内。左膝关节内为单纯的GAPDH.beacon，共聚焦显微镜下无荧光，表明单纯的GAPDH.beacon并不能进入关节软骨内，实验结果如图3。
在图3中，使用的是GAPDH-beacon，它进入细胞内，自身不发荧光，但如果存在GAPDH的mRNA，那么GAPDH-Beacon就可以和GAPDH mRNA结合，并发出荧光。在小鼠的关节腔内注射脂质体与GAPDH-beacon，48小时后，处死小鼠，取其膝关节软骨做冰冻切片，共聚焦显微镜下观察，可看到脂质体与GAPDH-beacon组的软骨细胞内有红色荧光，即表示脂质体可以递送GAPDH-beacon进入软骨组织细胞内。而单独的GAPDH-beacon无法进入软骨细胞，因此对照组注射单纯的GAPDH.beacon在共聚焦显微镜下观察未发现荧光。
实验例2：对所制备的LNP-siRNA复合物系统处理大鼠后大鼠体内Ihh mRNA表达量的验证：
实验材料：Wistar大鼠10只。脂质纳米微粒（LNP），Ihh.siRNA溶液：取浓度为20uM的Ihh.siRNA 10ul，稀释至40ul后备用。
实验方法：如实施例1所述方法配制LNP-Ihh.siRNA复合物。大鼠右膝关节内注射LNP-Ihh.siRNA复合物40ul，左膝关节内注射Ihh.siRNA溶液40ul注入左膝关节。48小时后，处死大鼠，刮取大鼠全膝关节软骨，提取总RNA后，反转录成cDNA，进行Real-time PCR检测。
Ihh mRNA引物：正义链：5'-CAGGAAGGACCCATTCCGTC-3'；反义链：5'-AAGTCACAAACCCAGGTCCC -3'。
结果显示：大鼠右膝关节与左膝关节相比，Ihh mRNA的表达下降了80%。说明LNP能够有效地将将Ihh.siRNA递送入关节软骨内，并且发挥效应，使得Ihh mRNA表达下降。结果如图9。
实验例3：对所制备的LNP-siRNA复合物系统的大鼠体内关节软骨损伤治疗效果的实验验证：
实验材料：成年的wistar大鼠30只，分为三组，每组10只。脂质纳米微粒（LNP），Ihh.siRNA溶液：取浓度为20uM的Ihh.siRNA 10ul，稀释至40ul后备用。
实验方法：将LNP与Ihh.siRNA按照实施例1所述方法制备成LNP-Ihh.siRNA复合物。将30只大鼠分为3组，每组各10只，第一组为：假手术组，将大鼠右膝关节囊打开后，不切断前交叉韧带（ACL），重新缝合，术后第二天起每周注射Ihh.siRNA 溶液40ul注入右膝关节，即Sham+siRNA组；第二组为：实验组，将大鼠右膝关节囊打开后，切断前交叉韧带（ACL）后逐层缝合，术后第二天起每周注射LNP-Ihh.siRNA复合物40ul，即ACLT+LNP.siRNA组；第三组为：对照组，将大鼠右膝关节囊打开后，切断前交叉韧带（ACL）后逐层缝合，术后第二天起每周注射Ihh.siRNA 溶液40ul注入右膝关节，即ACLT+siRNA组。术后8周处死全部大鼠，取右膝关节福尔马林固定脱钙后，切片行。
HE染色结果见图10，结果显示，在Sham+siRNA组中，关节表面完整无破坏，ACLT+siRNA组中，关节表面损伤严重，细胞排列杂乱，而在ACLT+LNP.siRNA组中，关节软骨破坏较轻，细胞成簇。说明ACL切断后，与对照组相比较，关节腔中注射LNP-Ihh.siRNA复合物能够有效地减轻软骨损伤。
序列表
<110>
<120>一种用于治疗软骨疾病的脂质体递送系统及其制备方法
<160>2
<170> PaUentIn Version 3.5
<210> 1
<211> 2272
<212> RNA
<213> 人工序列
<223> IHH siRNA的序列
<400> 1
1 agagtcgagg cgccgagggg gacagcacgc cgccaccagc cagggccccg ggcccccgcc
61 ccgcacctga gtcccgccgg ccttgagccg cgtcgcgttg cccatggcgc ccccgcctgg
121 agtccccaag agccacccag acgcctgagt ccccgaagct gtgccagcca cgcacccacc
181 catcagccca ccaggcgccc tcgcccgtcg ctctcccggg ctacccggcc atgtctcccg
241 cctggctccg gccccgactg cgcttctgtc tgctcctgct gctgctgctt ctggtgccgg
301 cggcgcgggg ctgcgggccg ggccgggtgg tgggcagccg ccggaggccg cctcgtaaac
361 tcgtgcctct tgcctacaag cagttcagcc ccaacgtgcc ggagaagacc ctgggcgcca
421 gcgggcgcta cgaaggcaag atcgcgcgca gctctgagcg cttcaaggag ctcaccccca
481 actacaatcc cgacatcatc ttcaaagacg aggagaacac cggtgccgac cgcctcatga
541 cccagcgctg caaggaccgt ctgaactcac tggccatctc tgtcatgaac cagtggccgg
601 gtgtgaagct gcgggtgacg gaaggctggg atgaagacgg ccatcactca gaggaatctt
661 tacactatga gggccgcgcg gtggatatca ccacctcaga ccgcgaccga aataagtacg
721 gactactggc gcgcttagca gtggaggccg gcttcgactg ggtgtattac gagtccaagg
781 cccacgttca ttgctctgtc aagtctgagc actcggctgc tgccaagaca ggtggctgct
841 ttcctgccgg agcccaggtc cacctagaaa ctggggagcg tgtggccctg tcagctgtga
901 agccaggaga ccgggtcctg gccatggggg aagatggcaa ccccaccttc agcgatgtgc
961 tcattttcct ggaccgtgag ccaaacaggc tgagagcttt ccaggtcatc gagactcagg
1021 atcctccacg tcggctggca ctcacgcctg cccacctgct cttcattgcg gacaatcata
1081 cagaaccagc agcccgcttc cgggccacgt ttgccagcca cgtgcagcca ggccaatatg
1141 tgctggtagc aggggtccca ggcctccagc ctgctcgggt ggcagccatc tccacccacg
1201 tggcccttgg gtcctatgct cctctcacga ggcacgggac actcgtggtg gaggatgtgg
1261 tagcctcctg cttcgcagct gtgtctgacc accatctggc tcagttggcc ttctggcccc
1321 tgcgactgtt tcccagcttg ccatggggca gctggacccc aagtgaaggt gttcactggt
1381 accctcagct gctctaccgc ctggggcgtc tcttgctaga agagagcacc ttccatccac
1441 tgggcatgtc tggggcagga agctgaaggc actctaacca ctgccctcct ggaactgcta
1501 tgctggatcc aaagacctcc tcaccaggaa ggttctggcc ctggaaggcg cctggcccga
1561 ggatgcctcc gtcctctgct ccagagtgga gacatctttg agacttgacc aggtagtgct
1621 ggaccccgcc ccctcgtctt ggtgtagagg tagagctatg aactgagctg acaagggtgt
1681 ggtaggctct ctttccctag agaccttaag acccagctag ctctgactgc gattcacaca
1741 ccccacctac ctgcacagga aggacccatt ccgtctgcct tcggactgct tactctagtg
1801 tttctcggga cctgggtttg tgactttact gttggcaact gaccacagta tgaagagagg
1861 ctgcccgcag gtgggctcac acctcagttg atgctgctag attccctagg agccagcagg
1921 gagctggctg gattcattgc ctcccagaac tgaaagaccg tcagcctgga catcctgaaa
1981 catgaccttc cctgcaggcc acactcctcc agactcctga gtctttgcgg tcaatgggca
2041 gattctctga tccaggaaat gtgaccctac cacctgggac tggggaagga gcctggatgt
2101 ccttgccacc cctgcccagg ctaagctcct ttttctgctg atccacactt ccaccccctc
2161 ctccagtctg tctccttcac cttatttatt tgcatggagg ggggaaccca tgggagaatt
2221 ttgggaatgt tttggtcttt cttttgtaat aaaaattatt taagttgtta ga
<210> 2
<211> 27
<212> RNA
<213> 人工序列
<223> 靶序列
<400> 2
1 aagacccagc tagctctgac tgcgatt
Claims (3)
1.一种软骨siRNA脂质体递送组合物，包括脂质体、脂质体修饰物和小核酸药物，其特征在于：所述脂质体为磷脂酰胆碱DPPC、胆固醇、Dlin-KC2-DMA；所述脂质体修饰物为聚乙二醇脂质共轭物C16聚乙二醇神经酰胺，所述小核酸药物为Ihh siRNA；所述磷脂酰胆碱DPPC浓度为35mg/ml，占脂质体和脂质体修饰物的质量百分比为11.72%；胆固醇浓度为9.5mg/ml，占脂质体和脂质体修饰物的质量百分比为23.85%；聚乙二醇脂质共轭物C16聚乙二醇神经酰胺浓度为50mg/ml，占脂质体和脂质体修饰物的质量百分比为16.74%；Dlin-KC2-DMA的浓度为28.5mg/ml，占脂质体和脂质体修饰物的质量百分比为47.69%；
制备方法包括以下步骤：
（1）混合脂质体：将2µl磷脂酰胆碱DPPC、15µl胆固醇、2µl聚乙二醇脂质共轭物C16聚乙二醇神经酰胺、10µl的Dlin-KC2-DMA混合，然后加入乙醇将脂质体溶解，形成A液；
（2）将20µM、10µl的Ihh siRNA加入55µl的柠檬酸盐缓冲液，形成B液；
（3）将A液加入B液中混合均匀，形成AB混合液；
（4）在AB混合液中加入400µl的PBS缓冲液洗涤，然后在超滤离心管中12000r离心5min；
（5）用PBS重复洗涤离心3次，离心后所获得的80-100µl液体即为软骨siRNA脂质体递送组合物。
2.根据权利要求1所述的一种软骨siRNA脂质体递送组合物，其特征在于：所述小核酸药物的靶序列为SEQ ID NO：2，即Ihh siRNA的第1708-1734位碱基序列。
3.根据权利要求1所述的一种软骨siRNA脂质体递送组合物，其特征在于：所述柠檬酸盐缓冲液的浓度为50mM，pH为4。
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