CN105072913B - 大规模生产果实细胞以及用此类细胞治疗疾病的方法 - Google Patents

Abstract

本发明的实施方案描述用于治疗、减轻、缓解或预防代谢综合征或代谢疾病的方法，所述方法包括施用包含体外生长的果实细胞的细胞系愈伤组织培养物的组合物。另外的实施方案进一步描述根据大规模方法制备的果实细胞。根据本发明的方法生产的葡萄浆果细胞的细胞系愈伤组织培养物包含白藜芦醇的量为至少1000mg/kg粉末。

Description

大规模生产果实细胞以及用此类细胞治疗疾病的方法

技术领域

本发明涉及大规模生产果实细胞的方法。本发明的一个实施方案涉及大规模体外生产果实细胞的方法，其包括初级和次生代谢物。本发明进一步涉及通过施用果实细胞的细胞系愈伤组织培养物治疗、预防、缓解或减轻与代谢综合征或代谢疾病相关联的一或多种病症或并发症的方法。

背景技术

大规模方法为本领域已知且为工业化生产各种材料所必需。由于大规模方法不能通过与小规模方法相同的方式进行，因此即使存在小规模生产方法，也必须设计大规模生产材料的特定方法。

营养保健品有时是使用合成方法制备的，提供希望的活性成分，如多酚，其是在果实细胞中天然发现。然而，使用合成方法未与活性成分一起提供有时有助于配制物的效力的天然成分。

其它类型的营养保健品是从天然植物中制备的；然而，所有已知的从植物中制备营养保健品的大规模生产方法包括从制备的植物细胞中提取，以获得希望的活性成分。然而，当提取例如含有多酚的植物时，在提取物中，多酚(包括白藜芦醇)的量可能非常高，因此，最终产物也许是苦味的。仅一部分植物可以被成功提取，因为仅其含有希望量的活性成分。

制备果实细胞的小规模方法为本领域已知；然而，大规模方法更难以设计，因为其趋于扩大初级代谢物的生产，同时使次生代谢物的产生最小化。由于活性成分如多酚是次生代谢物，因此其大规模生产是复杂的。

因此，本领域需要从天然物料制备果实细胞的大规模方法，其包括生产果实细胞的初级代谢产物和次生代谢产物。

代谢异常与肥胖症、胰岛素抗性、葡萄糖耐量下降、II型糖尿病(DMII)、血脂异常、脂肪肝、脂肪性肝炎、脂肪性变相关。这些异常使中风、心血管疾病的风险上升。代谢综合征的病因学被认为是多因素的，涉及遗传学影响和环境影响。

动脉粥样硬化是血管床疾病，是由血管壁中形成脂肪沉积物使得血管内血流通道狭窄引起的。这一过程可能影响所有的动脉，尤其是冠状动脉，并且可能导致最终的冠状动脉堵塞，结果是心脏病发作，其是美国早逝的主要原因。

脂肪肝疾病涵盖一系列的临床病症，其组织学特征主要在于肝的大泡性脂肪变性。脂肪肝疾病的组织病理学谱的范围是从简单的脂肪肝(脂肪变性)到脂肪性肝炎——脂肪肝的一种，其具有不同程度的纤维化。脂肪性肝炎可以是渐进性的，并且可以导致肝硬化、肝衰竭以及肝细胞性肝癌，并且可能是隐源性肝硬化的主要原因。脂肪肝疾病的通常的风险因素是肥胖症、II型糖尿病和高脂血症。

II型糖尿病是最普通的慢性人疾病，在美国影响成年人群的8％以及65岁以上年龄的人口的19％。

代谢综合征也称为“死亡四重奏”或“综合征X”或“胰岛素抗性综合征”，是一系列各种疾病的风险因素，所述疾病例如心血管疾病、中风和II型糖尿病(即胰岛素抗性)、高胰岛素血症、腹部肥胖症(由腹部内脂肪积聚引起)、升高的血清脂质以及高血压。25％在美国生活的成年人被诊断为患有代谢综合征。有人认为代谢综合征的病理生理学与胰岛素抗性相关。风险因素包括如下：升高的腰围(男性≥102cm，女性≥88cm)、升高的甘油三酯(>150mg/dL)、降低的高密度脂蛋白(HDL)胆固醇(男性<40mg/dL，女性<50mg/dL)、升高的血压(>130/85mm Hg)以及升高的空腹血糖(>100mg/dL)。其它风险因素也可能促成代谢综合征。另外，在不同人群中所述风险因素可能改变。

空腹血糖异常(IFG)是与胰岛素抗性相关联的血糖代谢障碍的糖尿病前状态，定义为空腹血糖水平101-126mg/dL。

糖耐量异常(IGT)是与胰岛素抗性相关联的血糖代谢障碍的糖尿病前状态，其定义与IFG的定义相似，或者定义为口服高葡萄糖饮食，通常是75克葡萄糖，之后两小时血糖水平141-199mg/dL。

许多代谢疾病的特征在于甘油三酯积聚和胰岛素抗性。

各种身体组织如肌肉、肝和胰腺组织中的甘油三酯积聚被认为是导致代谢疾病产生的器官特异性胰岛素抗性的重要因素。此外，组织中脂滴(其与术语脂肪粒(lipid body)相同)的积聚在胰岛素抗性的产生中早期出现，并 且与其严重性相关。

持续性高血压是一些疾病和失调的风险因素之一。高血压是缺血性中风，西方世界的第三大致死原因的单一最重要的可修正的风险因素。在血压(BP)读数高于120/80毫米汞柱(mm Hg)，中风的风险开始增加。多数对高血压的判断表明，当高血压定义为收缩血压(SBP)≥160mm Hg和/或舒张血压(DBP)≥95mm Hg时，中风的相对风险为大约4。

基于社区的研究证明在多达50-60％的患者中高血压促成心脏衰竭的产生。在高血压患者中，心脏衰竭的风险上升，男性上升2倍，女性上升3倍。根据弗雷明汉(Framingham)研究，高血压占心脏衰竭案例的约四分之一。

高血压不仅是确定的心血管风险因素，还增加动脉粥样硬化的风险。临床试验显示，在DBP最高的五分之一中，即使具有额外的高胆固醇和吸烟的风险，高血压仍然显著促成动脉粥样硬化的风险。

据报道，在85％-95％的患有慢性肾病(CKD)的患者中出现高血压。未控制的高血压是产生CKD的风险因素，并且是美国末期肾脏疾病的第二主要原因。

过去，多数注意力关注于DBP；但是现在认识到高SBP和高脉压差(SBP和DBP之间的数值差异)也是风险因素。重要的是，有人证明了，将SBP和DBP组合评估相较于评估2个单独因素改进了心血管风险预测。尽管如此，DBP仍然是重要的心血管风险因素。在Franklin等的研究中，单独的舒张高血压是心血管风险因素。患有单独的舒张高血压的对象占高血压人群的14％，且发现其心血管风险是具有正常BP的对象的约两倍(Schillaci等，2009)。此外，中国全国范围的数据库确定了，单独的舒张高血压是心血管疾病的独立的风险因素。

脂质过氧化是指细胞损害中的过程中的脂质氧化变质。脂质过氧化可能是一种若干风险因素可以通过其促进心血管疾病的机制。

发现脂质过氧化与心血管风险因素，如年龄、甘油三酯、吸烟、胆固醇高密度脂蛋白(HDL)和体重指数(BMI)，高度相关。

怀孕、卵巢切除和绝经后的女性显示比未怀孕、卵巢未切除和绝经前的女性更高的脂质过氧化水平，并且这些状态过程中的高脂质过氧化水平是其上升的CVD风险的原因，至少是部分原因。

从患有原发性高血压的患者费力的低密度脂蛋白(LDL)显示上升的氧化倾向。因此，氧化的LDL(Ox-LDL)可能倾向于加速的动脉粥样硬化，并且脂质过氧化的LDL的倾向可能是与LDL血浆浓度本身同样重要的动脉粥样硬化的风险因素。

流量介导的扩张(FMD)，内皮功能紊乱的表现，可以作为若干疾病的指标。FMD对于冠状动脉疾病有高度预测性，FMD每下降百分之一的优势比为1.32(p＝0.001)。不仅在动脉粥样硬化中，FMD还在系统性硬化中与疾病进展高度相关。FMD值与疾病持续时间负相关。

在绝经后的女性中，低FMD值与产生高血压的想到风险的升高相关。

FMD与缺血性晚期慢性心脏衰竭(ACHF)患者中升高的死亡风险相关(Shechter等，2009)。此外，无论对心脏衰竭(HF)和动脉粥样硬化风险因素的治疗情况如何，持续性低FMD均是慢性缺血性HF患者中的心脏事件的预测指标。

中风患者具有比非中风患者显著更低的流量介导的扩张(FMD)值。经调整年龄、性别和存在卵圆孔未闭(PFO)之后，FDM是隐源性中风的独立的预测指标。

最后，在患有杂合的家族性高胆固醇血症(heFH)的儿童中，所述儿童易感于提早的动脉粥样硬化，在结构性动脉粥样硬化性变化出现之前检测到降低的FMD。

已知源自含有多酚的果实的营养保健品的有益作用。红葡萄酒作为这些调节性成分的来源的用途因为其较高的乙醇含量和糖分而受限。此外，已经显示葡萄酒和酿酒葡萄的治疗性作用依赖于种类、位置、年份(年度气候)、加工等，及因此依赖红葡萄酒、葡萄或葡萄种子作为这些调节性化合物的来源导致无法进行原材料的均一的或一致的供应。此外，果实通常被残余的杀真菌剂、病原体、杀虫剂和污染物等污染。

此外，来自红葡萄酒和果实提取物的多酚的胃肠道输送的潜在益处受限于其靶组织和细胞的生物利用度。由于其通过肠道时的生物利用度的明显差异，在指定食物中某一多酚的丰度与其作为体内活性化合物的浓度之间无相关性可描绘。例如小肠中类黄酮的吸收范围为剂量的0-60％范围，消除半衰期为2-48小时。大多数多酚在肠道中经历广泛代谢，主要以甲基葡糖苷酸或葡糖苷酸硫酸盐形式存在于血清和尿液中。在已知的多酚中， 在红葡萄、红葡萄酒及其它食物如不同种类的浆果和花生中发现的植物抗毒素白藜芦醇(反式-3,5,4’-三羟基芪)(RES)已经引起众多关注。确信其是造成“法国悖论(French paradox)”的原因，这是与尽管高脂饮食但心血管疾病的低发生率相关的一个现象，是适度引用红葡萄酒的结果。然而，RES的物理化学性质如低水溶性及其高肝脏摄取有损于其生物利用度。此外，由于快速和广泛代谢随之形成各种代谢物，RES的口服生物利用度非常低。

关于RES活性和作用的研究主要依赖于白藜芦醇的三个来源，即纯合成的RES，天然植物来源的RES(例如Poligonum cupcidatum提取物)产物，或者较低程度的完整红葡萄或其产物(红葡萄酒、葡萄汁、葡萄提取物)。红葡萄细胞(RGC；Fruitura Bioscience Ltd,Israel)是一种天然的专利保护的培养细胞配制物，源自葡萄(Vitis vinifera L.)栽培品种的果实，包含多酚的全部基质，包括白藜芦醇及天然存在于红葡萄中的其它成分。

因此，需要可以在大规模生产方法中制备的天然(植物)组合物，其中活性成分的量是一致及复现的(例如克隆制品)，是高生物利用度的，及易于施用以治疗各种疾病和失调，包括与代谢失调或代谢疾病相关的病症或并发症。

发明内容

在本发明的实施方案中，提供了治疗、减轻、缓解或预防代谢综合征或代谢疾病的方法，所述方法包括施用包含体外生长的果实细胞的细胞系愈伤组织培养物的组合物。

根据一些实施方案，本发明提供用于治疗对象中的选自如下的一或多种病症的方法：冠心病(动脉粥样硬化)、血压、缺血性疾病、心脏衰竭、动脉粥样硬化、慢性肾病(CKD)和肾脏疾病、系统性硬化、慢性心脏衰竭、高血压、糖尿病、高脂血症、糖耐量异常、肝性脂肪变性、高血糖症、糖尿病前状态、新发糖尿病、胰岛素抗性、糖尿病、空腹血糖异常、高甘油三酯血症、抗炎症(脂联素)、高胆固醇血症、低HDL水平、脂肪肝和肥胖症，所述方法包括给所述对象施用包含体外生长的果实细胞的细胞系愈伤组织培养物的组合物的步骤。在一些实施方案中，所述对象被诊断为患有代谢综合征。

根据一些实施方案，果实细胞的细胞系愈伤组织培养物根据大规模方 法制备，所述方法包括：将果实细胞在瓶中生长；将果实细胞从瓶接种到第一生物反应器中；将果实细胞从第一生物反应器接种到另一个生物反应器中，其中另一个生物反应器是最后的生物反应器或者是中间生物反应器，及其中第一生物反应器和另一生物反应器至少一个是一次性的；及从最后的生物反应器中收获果实细胞；其中将从最后的生物反应器中收获的果实细胞干燥。

根据一些实施方案，使用补充有(enriched with)镁、磷酸盐或硝酸盐或者其组合的Gamborg B5培养基。

在一些实施方案中，一次性生物反应器是由一或多层聚乙烯制成的。在一些实施方案中，一次性生物反应器是由聚乙烯内层和外层及中间尼龙层制成的。

在一些实施方案中，提供用于治疗、减轻、缓解或预防代谢综合征或代谢疾病的方法，所述方法包括施用包含果实细胞的细胞系愈伤组织培养物的组合物，所述果实细胞是根据包括如下步骤的方法制备的：使果实细胞在瓶中生长；将果实细胞从所述瓶接种到第一生物反应器中；将果实细胞从所述第一生物反应器接种到另一个生物反应器中，其中所述另一生物反应器是最后的生物反应器或者是中间生物反应器，且其中所述第一生物反应器和另一个生物反应器的至少一个是一次性的；及从最后的生物反应器收获果实细胞；其中使从最后的生物反应器收获的果实细胞干燥。

在一些实施方案中，提供用于治疗、减轻、缓解或预防炎症的方法，所述方法包括施用包含果实细胞的细胞系愈伤组织培养物的组合物，所述果实细胞是根据包括如下步骤的方法制备的：使果实细胞在瓶中生长；将果实细胞从所述瓶接种到第一生物反应器中；将果实细胞从所述第一生物反应器接种到另一个生物反应器中，其中所述另一生物反应器是最后的生物反应器或者是中间生物反应器，且其中所述第一生物反应器和另一个生物反应器的至少一个是一次性的；及从最后的生物反应器收获果实细胞；其中使从最后的生物反应器收获的果实细胞干燥。

在一些实施方案中，所述组合物可以每天施用一次。

在一些实施方案中，提供粉末形式的组合物，其包含在大规模生产方法中体外生长的葡萄浆果细胞的细胞系愈伤组织培养物，其中葡萄浆果细胞的细胞系愈伤组织培养物源自葡萄浆果横切片、葡萄浆果皮、葡萄浆果 肉、葡萄种子、有种子或无种子栽培种的葡萄胚或者葡萄种皮中的一或多种；其中葡萄浆果细胞的细胞系愈伤组织培养物包含白藜芦醇的量为至少1000mg/kg粉末。

在一些实施方案中，所述组合物的特征在于在施用一次所述组合物后血浆中白藜芦醇的浓度的两个峰。

在一些实施方案中，提供降低在静止状态和/或在运动中的舒张血压和收缩血压和/或静息心率的方法，包括给所述对象施用包含体外生长的果实细胞的细胞系愈伤组织培养物的组合物的步骤。

附图说明

本发明附图(仅作为示例)加以描述。具体关于附图的详细描述，需要强调的是图中显示的事项只是为了举例及论述本发明优选的实施方案，及是为了提供确信最有效和易于理解的本发明的原理描述和观点而呈现。在这方面，未尝试显示比基本理解本发明必需的更详细的本发明的结构详情，结合附图的描述使得本领域技术人员了解可以实施的本发明的一些形式。

图1证实在角叉菜胶注射之前用RGC制备物、吲哚美辛和水(作为对照)处理的大鼠中足水肿的测量(体积％)，。使用重复测量的双向ANOVA，然后用Bonferroni事后检定进行统计学分析。对照组(1M)与阳性对照组(2M)的对比在2和4小时显示统计学显著差异(p<0.001)。对照组与RGC-制备物(3M)组的对比在2和4小时显示统计学显著差异(p<0.001)。

图2显示在研究期间通过热板(Hot Plate)测量的每组的痛觉过敏作用分布(结果以与时间成函数的“热板延时，自基线％”表示)。使用重复测量的双向ANOVA，然后用Bonferroni事后检定进行统计学分析。对照组(1M)与阳性对照组(2M)的对比在2和4小时显示统计学显著差异(p<0.05-0.01)。对照组与RGC(3M)对比在4小时显示统计学显著差异(p<0.01)。

图3显示通过热板测量的每组的痛觉过敏作用分布(结果以与时间成函数的“热板延时δ，基线-实际时间”表示)。使用重复测量的双向ANOVA，然后用Bonferroni事后检定进行统计学分析。对照组(1M)与阳性对照组(2M)的对比在2和4小时显示统计学显著差异(p<0.05-0.01)。对照组与RGC-处理的小鼠(3M)对比在4小时显示统计学显著差异(p<0.01)。

图4显示4个不同批次的在补充的Gamborg B5培养基的大规模一次性 生物反应器中生长的红葡萄细胞的生长曲线。在20直至40天，细胞经历指数生长，产生500gr/l鲜生物量。这些细胞继续生长并且可以达到更高的生物量。

图5显示高果糖饮食饲喂的大鼠中的收缩血压(BP)vs时间，补充或不补充不同量的红葡萄细胞(RGC)，在基线以及饮食3周后和5周后。

图6A是关于RGC中的白藜芦醇的LC-MS分析的UV色谱图(λ＝306nm)且图6B是关于RGC中的白藜芦醇的LC-MS分析的提取离子色谱图(m/z-227.0701-227.0737)。

图7显示阴性的代表性的反式-RES配糖体的ESI质谱(RT 4.64min,m/z389.1250)，其中白藜芦醇(m/z 227.0719)是m/z 389.1250的源内片段化产物离子。

图8提供了白藜芦醇(RES)在水中的溶解性结果，比较RGC-RES、合成的RES和植物RES的溶解性。

图9A和9B显示在施用一剂RGC RES之后反式-RES的血浆含量，其中图9A显示总反式-RES，图9B显示游离反式-RES。呈现的数值是平均数(n＝15)。

图10显示在食用RGC之后12周RGC对对象中血浆脂质过氧化的作用(一起显示施用了200mg和400mg RGC的对象)。

图11显示FMD值相对阳性的变化70％的对象的百分比(*p<0.05，**p<0.005)。

发明详述

在如下详细描述中，阐述了很多具体细节以充分理解本发明。然而，本领域技术人员应理解本发明可以不用这些具体细节而实施。在其它情况中，未详细描述熟知的方法、程序和成分免得使本发明模糊不清。

本发明的实施方案涉及治疗、减轻、缓解或预防代谢综合征或与代谢综合征相关的任何病症或并发症的方法，所述方法包括施用包含体外生长的果实细胞的细胞系愈伤组织培养物的组合物，所述病症或并发症例如高血压、糖尿病(diabetes)、高脂血症、糖耐量异常、肝性脂肪变性、高血糖症、糖尿病前状态、新发糖尿病、胰岛素抗性、糖尿病(DiabetesMellitus)、空腹血糖异常、高甘油三酯血症、高胆固醇血症、低HDL水平、脂肪肝和 肥胖症。在本发明的一些实施方案中，所述细胞在如下所描述的大规模方法中生长。

如本文所用，短语“果实细胞培养物”是指在大规模方法中体外生长的果实细胞的细胞系愈伤组织培养物。所述果实细胞培养物可以是单一细胞培养物(如本文所用，果实细胞系培养物或克隆培养物)或包含来源于具有不同基因型的果实(例如，不同品种)的细胞或来源于单一果实的若干细胞类型或组织的异源细胞培养物。本发明的细胞培养物可以源自果实的任何部分，例如，果皮、果肉、种皮和种仁(seed flesh)。

如本文所用，术语“治疗(treating)”是指预防一些或全部与疾病、病症或失调相关的症状。术语“治疗”也指缓解、改善或减轻症状或疾病的潜在原因，延长患有疾病的患者的预期寿命，预防疾病以及完全从疾病复原。

词语“治疗(treat)”或“治疗(treatment)”可以进一步指目的在于减缓(减轻)不想要的生理学变化或失调的治疗。为了本发明的目的，有益的或想要的临床结果包括但不限于缓和症状、减小疾病程度、稳定的(即不变坏)疾病状态、延迟或减缓疾病进展、改善或减轻疾病状态以及缓解(部分或全部)，无论可检测或不可检测。“治疗(treating)”还可以指与不接受治疗的预期存活相比延长存活。

词语“预防(prevent)”和“预防(prevention)”涉及用于保护或防止没有给定病症的个体进展到该病症的预防药或预防性手段。需要预防的个体包括易发或易感病症的那些个体。

如本文所用，术语“炎性失调”包括但不限于慢性炎性疾病和失调以及急性炎性疾病和失调。这在实施例4中进行了示例，其显示口服施用的根据本文描述的大规模方法制备的红葡萄细胞(RGC)有效地减弱了与大鼠中角叉菜胶诱导的后足炎症相关的足水肿和行为痛觉过敏，说明在大规模方法中制备的RGC的抗炎作用。不同的是，Gentilli等(2001)描述了，在角叉菜胶注射入足之前施用的高浓度白藜芦醇(50mg/kg体重)没有减少足水肿。如本文所用，术语“脂肪肝”是指由于脂质代谢失调，脂肪过度积聚于肝细胞的病症。其可能导致各种疾病如心绞痛、心肌梗塞、中风、动脉粥样硬化和胰腺炎。

此处“糖耐量异常”是基于美国糖尿病协会标准定义的。糖耐量异常是两小时75g口服葡萄糖耐受测试值140-199mg/dL(7.8-11.0mmol/l)。

此处“空腹血糖异常”是基于美国糖尿病协会标准定义的。空腹血糖异常定义为空腹血浆葡萄糖值100-125mg/dL(5.6-6.9mmol/l)。

“糖尿病”一般是指空腹血浆葡萄糖值等于或大于126mg/dL(7.0mmol/l)。

此处“胰岛素抗性”定义为空腹血液胰岛素水平高于20mcU/mL。

“新发糖尿病”通常基于个体中空腹血糖浓度7.0mmol/l或更高而定义。

“糖尿病前状态”是经常在新发糖尿病之前的病症，其特征可以是代谢综合征、糖耐量异常、空腹血糖异常或胰岛素抗性。

此处“代谢综合征”或“综合征X”是基于NCEP ATP III标准定义的，存在三个或更多个以下因素：1)升高的腰围(男性>102cm[>40in]，女性>88cm[>35in])；2)升高的甘油三酯(>150mg/dL)；3)低高密度脂蛋白(HDL)胆固醇(男性<40mg/dL，女性<50mg/dL)；4)不理想的血压(>130/85mm Hg)以及5)升高的空腹血糖(>100mg/dL)。

“高血糖症”是空腹血糖浓度7.0mmol/l或更高。

“肝性脂肪变性”是指描述脂质异常滞留于肝细胞内的过程。脂肪变性可能是因为肥胖症、胰岛素抗性、酒精中毒或病毒感染。

本发明的实施方式涉及治疗、减轻、缓解或预防代谢综合征或代谢疾病或与代谢综合征相关的任何病症或并发症的方法，所述方法包括施用基本由体外生长的果实细胞的细胞系愈伤组织培养物组成的组合物，所述病症或并发症例如高血压、糖尿病、高脂血症、糖耐量异常、肝性脂肪变性、高血糖症、糖尿病前状态、新发糖尿病、胰岛素抗性、糖尿病、空腹血糖异常、高甘油三酯血症、高胆固醇血症、低HDL水平、脂肪肝和肥胖症。

在本发明的实施方案中，提供通过给有需要的对象施用包含在根据本发明的实施方案的大规模方法中制备的葡萄细胞细胞培养物的药物或营养组合物或食品添加剂治疗炎性失调的方法。

根据一些实施方案，果实细胞的细胞系愈伤组织培养物是葡萄浆果细胞的细胞系愈伤组织培养物。根据一些实施方案，葡萄浆果细胞的细胞系愈伤组织培养物源自葡萄浆果横切片、葡萄浆果皮、葡萄浆果肉、葡萄种子、葡萄有种子或无种子栽培种的胚或葡萄种皮中的一或多种。

根据一些实施方案，提供用于降低对象中血压的方法，包括给所述对象施用包含体外生长的果实细胞的细胞系愈伤组织培养物的组合物的步 骤。所述对象可以是健康对象。在一些实施方案中，所述对象是强健(fit)的健康对象，其每周至少运动三次，每次至少半小时。

根据一些实施方案，术语“降低血压”是指降低在静止状态和/或在运动中的舒张血压和收缩血压和/或静息心率，包括给所述对象施用包含体外生长的果实细胞的细胞系愈伤组织培养物的组合物的步骤。

这在实施例8和表18-19中进行了示例，其显示在健康的适度训练的自行车运动员中补充RGC六周的作用，所述自行车运动员显示静置舒张血压和运动后峰值舒张血压的显著降低。RGC还导致静止收缩血压和静止心率与安慰剂组相比降低。

根据一些实施方案，所述组合物是营养组合物。根据一些实施方案，所述组合物是药物组合物。根据一些实施方案，所述组合物是食品添加剂。根据另一实施方案，所述营养组合物进一步包含营养可接受的载体。根据另一实施方案，所述药物组合物进一步包含药物可接受的载体。根据另一实施方案，所述组合物进一步包含食品添加剂可接受的载体。

如本文所用，短语“药物组合物”是指本文描述的活性成分(即如本文以下进一步描述的果实细胞培养物)的一或多种或其混合物与其它化学组分如生理学合适的载体和赋形剂的制剂。药物组合物的目的在于帮助给生物体使用化合物。根据本发明的一些实施方案，由于所述活性成分源自果实(例如葡萄)，如本文所述的药物组合物是营养组合物和/或食品添加剂。短语“食品添加剂”由FDA在21C.F.R.170.3(e)(1)定义，包括要添加到食品产品的任何液体或固体物料。此物料可以包括，例如，具有独特味道和/或风味或生理学作用的物质(例如维生素)。另外，所述果实细胞培养物和源自其的制剂可以提供给动物作为饲料添加剂。

本文的术语“活性成分”是指负责治疗效果的果实细胞培养物。所述果实细胞培养物的治疗效果可以源于所述果实细胞培养物内所包含的许多活性剂(例如多酚)或特定组合或比例的所述果实细胞培养物内所包含的活性剂。

根据进一步的实施方案，使体外生长的细胞系愈伤组织培养物干燥。

根据一些实施方案，所述细胞系愈伤组织培养物包含至少0.5％的多酚。根据进一步的实施方案，所述细胞系愈伤组织培养物包含至少2％的多酚。可以用本领域已知的方法如分光光度法Folin-Ciocalteau测试或HPLC分析 确定多酚含量。

如本文所用，术语“多酚”是指天然存在的植物有机化合物，其具有一个以上的苯酚基团。多酚可以是从简单分子如酚酸至大的高聚合的化合物如鞣酸。多酚的酚环通常与各种糖分子、有机酸和/或脂质缀合。这种缀合的化学结构中的差异导致各种多酚化合物的作用模式和健康性质中的化学分类和变化。举例的多酚包括但不限于花青素、生物类黄酮(包括以下亚类：黄酮、黄酮醇、异黄酮、黄烷醇和二氢黄酮)、原花青素、氧杂蒽酮、酚酸、芪类和木脂素。白藜芦醇(3,4,5-三羟基芪)是一种类型的多酚，是以其单体形式、反式白藜芦醇、顺式白藜芦醇、反式-葡糖苷和顺式-葡糖苷呈现的多酚芪。

含有多酚的果实的例子包括但不限于葡萄、苹果、蓝莓、李子干、小红莓、接骨木莓、越桔、龙胆、橙子、芒果、猕猴桃、石榴、黑莓、覆盆子、草莓、梨、樱桃、李形番茄、葡萄柚、菠萝、柿子、红加仑和吴茱萸果。

根据本发明的一个实施方案，果实是葡萄。葡萄可以是有色葡萄(例如红色、黑色、紫色、蓝色及之间所有颜色变化)。或者，葡萄可以是无色葡萄(例如绿色或白色或者之间的任何颜色)。

本发明这个方面的果实可以是野生或栽培变种。举例的栽培种葡萄包括属于葡萄属的那些葡萄。举例的葡萄属变种包括但不限于欧洲葡萄(Vitis vinifera,V.vinifera)、森林葡萄(V.silvestris)、V.muscadinia、圆叶葡萄(V.rotundifolia)、河岸葡萄(V.riparia)、夏特沃氏葡萄(V.shuttleworthii)、V.lubrisca、V.daviddi、山葡萄(V.amurensis)、V.romanelli、夏葡萄(V.aestivalis)、辛西安那葡萄(V.Cynthiana)、V.cineria、V.palmate、V.munsoniana、霜葡萄(V.cordifolia)、Hybrid A23-7-71、V.acerifolia、V.treleasei和桦叶葡萄(V.betulifolia)。

根据一些实施方案，果实细胞或细胞系愈伤组织培养物源自有色或无色葡萄。如本文所述，根据一些实施方案，果实细胞是从果实细胞培养物制备的。根据本发明的一些实施方案，果实细胞是从葡萄浆果细胞培养物制备的。根据一些实施方案，葡萄浆果细胞的培养物源自葡萄浆果横切片、葡萄浆果皮、葡萄浆果肉、葡萄种子、有种子或无种子栽培株的葡萄胚或者葡萄种皮中的一或多种。根据另一个实施方案，果实细胞培养物可以源 自植物的任何部分，包括但不限于胚乳、糊粉层、胚(或者其作为盾片和子叶的部分)、果皮、茎、叶、块茎、表皮毛(trichomes)和根。

根据本发明的一些实施方案，尽管物质包括多酚的量在果实中可以变化，但是使用制备果实细胞培养物的培养方案确保制备物及其含量的再现性。因此，从相同培养物制备的不同批次的果实细胞具有典型的HPLC指纹。根据一些实施方案，每个批次中不同物质的浓度可以变化，但是如上所述如果从相同的培养物制备，则所有批次的HPLC指纹是一致的。

根据进一步的实施方案，所述组合物是为了粘膜递送设计的。

根据一些实施方案，所述组合物是无味的。根据一些实施方案，所述组合物是有味的。

根据一些实施方案，所述组合物是口服的组合物。根据其它实施方案，所述组合物的形式是漱口水、条、泡沫、粉末、口香糖、口服喷雾、锭剂以及牙膏。根据另一实施方案，所述组合物是粉末形式。

根据一些实施方案，所述果实细胞培养物不包含酒精，从而避免酒精相关的作用如酒精中毒、肝中毒和心脏衰竭。

本发明的实施方案涉及治疗、减轻、缓解或预防代谢综合征或代谢疾病或与代谢综合征或代谢疾病相关的任何病症或并发症的方法，所述方法包括施用包含体外生长的果实细胞的细胞系愈伤组织培养物以及少于1％的酒精的组合物，所述病症或并发症例如高血压、糖尿病、高脂血症、糖耐量异常、肝性脂肪变性、高血糖症、糖尿病前状态、新发糖尿病、胰岛素抗性、糖尿病、空腹血糖异常、高甘油三酯血症、高胆固醇血症、低HDL水平、脂肪肝和肥胖症。

根据一些实施方案，果实细胞的细胞系愈伤组织培养物是葡萄浆果细胞的细胞系愈伤组织培养物。根据一些实施方案，所述葡萄浆果细胞的细胞系愈伤组织培养物源自葡萄浆果横切片、葡萄浆果皮、葡萄浆果肉、葡萄种子、有种子或无种子栽培种的葡萄胚或者葡萄种皮中的一或多种。根据进一步的实施方案，所述组合物是营养或药物组合物或食品添加剂。

根据一些实施方案，为了避免与糖摄入相关的问题(例如肥胖症、糖尿病、蛀牙)，所述果实培养物含有少于10％w/v甜味糖。如本文所用，短语“甜味糖”是指提供甜味的糖，例如蔗糖、葡萄糖和果糖。

本发明的实施方案涉及治疗、减轻、缓解或预防代谢综合征或代谢疾 病或与代谢综合征或代谢疾病相关的任何病症或并发症的方法，所述方法包括施用包含体外生长的果实细胞的细胞系愈伤组织培养物的低糖组合物，所述组合物包含低于10％的甜味糖，所述病症或并发症例如高血压、糖尿病(diabetes)、高脂血症、糖耐量异常、肝性脂肪变性、高血糖症、糖尿病前状态、新发糖尿病、胰岛素抗性、糖尿病(Diabetes Mellitus)、空腹血糖异常、高甘油三酯血症、高胆固醇血症、低HDL水平、脂肪肝和肥胖症。根据一些实施方案，所述甜味糖的量低于5％。根据一些实施方案，所述甜味糖的量低于2％。根据一些实施方案，所述甜味糖的量低于1％。根据一些实施方案，所述甜味糖的量为0.5-1％。

根据一些实施方案，果实细胞的细胞系愈伤组织培养物是葡萄浆果细胞的细胞系愈伤组织培养物。根据进一步的实施方案，所述组合物是营养或药物组合物或食品添加剂或功能食品和功能饮料。通常地，对象可以摄入的粉末的量可以是每剂至少1mg、5mg、10、mg、15mg、20mg、25mg、30mg、35mg、40mg、45mg、50mg、70mg、90mg、100mg、120mg、140mg、160mg、180mg、200mg、250mg、300mg、350mg、400mg、450mg、500mg、550mg、600mg、650mg、700mg、750mg、800mg、900mg、1000mg、1100mg、1500mg、1700mg、2000mg等等直到50克。在一些实施方案中，所述量是约5-10mg、10-20mg、20-30mg、30-40mg、40-50mg、50-60mg、60-70mg、70-80mg、90-100mg、100-200mg、200-300mg、300-400mg、400-500mg、500-600mg、600-700mg、700-800mg、800-900mg、900-1000mg、1-2g、2-3g、3-4g、4-5g、5-10g or 10-50g，取决于对象的年龄体重以及用药方案。在任何情况中，要施用的组合物的量取决于所治疗的对象、痛苦的严重性、施用方式、医生的判断等。所述组合物可以每天摄入一次到三次，或者如果需要每天多于三次。所述组合物可以长期摄入或摄入某一段时间，例如，至少一周、两周、一个月、两个月、三个月、四个月或更久。

如在实施例4中可见，在以高果糖饮食饲喂的大鼠中测量了体重、收缩血压、血浆甘油三酯、胰岛素和脂联素水平，在基线和饮食后三周和五周测量。高果糖饮食诱导了血压、血浆甘油三酯、胰岛素和脂联素水平的显著升高。测试了红葡萄培养物(RGC)对所饲喂的大鼠的作用。添加果实细胞培养物减少了高果糖饮食诱导的血压升高(图5)以及高果糖饮食诱导的 血浆甘油三酯和胰岛素水平的升高。进一步，以含有仅4mg白藜芦醇的红葡萄培养物给药治疗后两周已观察到果实细胞培养物对需要的作用。这可能是由于RGC中的天然白藜芦醇和其它多酚的独特的组合。在一些实施方案中，对于收缩血压、胰岛素抗性和甘油三酯水平的白藜芦醇有效剂量为4(200mg/Kg/天的RGC粉末)到16(800mg/Kg/天的RGC粉末)mg。

应注意所述高果糖饮食用于诱导SD大鼠中的代谢综合征。这一诱导得到以高果糖饮食饲喂的大鼠中收缩血压、甘油三酯和胰岛素水平升高的支持。在这一模型系统中，补充RGC不仅降低了BP还改善了代谢综合征的其它症状。

根据本发明的另一实施方案，所述细胞培养物可以源自植物的任何部分，包括但不限于胚乳、糊粉层、胚(或其部分，如盾片和子叶)、果皮、茎、叶、块茎、表皮毛和根。

适合口服施用的配制物可以以分立的单元制备，如粉末、丸剂、片剂、锭剂、胶囊、扁囊剂或药片，各含有预定量的果实细胞培养物。

短语“治疗有效量”是指(i)治疗特定疾病、病症或失调，(ii)减弱、改善或消除特定疾病、病症或失调的一或多种症状，或(iii)延迟特定疾病、病症或失调的一或多种症状的发作的本发明的化合物的量。在某些实施方案中，治疗有效量可以实现降低血糖水平、提高胰岛素分泌、降低胰高血糖素分泌、降低胰岛素抗性和提高胰岛素敏感性中的一或多种。

压缩的药片可以通过在合适的机器中压缩能自由流动形式如粉末或颗粒的活性成分而制备，任选地，所述活性成分与粘合剂、润滑剂、惰性稀释剂、防腐剂、表面活性剂或分散剂。模压的药片可以通过在合适的机器中模压用惰性液体稀释剂弄湿的粉末的活性成分的混合物而制备。任选地，所述药片可以包衣或刻字，并且任选地，配制所述药片以提供慢的或受控制的其活性成分的释放。

可以制备水性或油性悬浮液、可分散的粉末或颗粒、乳液、硬或软胶囊例如明胶胶囊、糖浆或酏剂用于口服施用。

可以通过提高风味水平或添加其它风味成分来影响更快速的吸收，所述风味成分如薄荷醇和薄荷醇衍生物、柠檬烯、香芹酮、异薄荷醇、桉油精、薄荷酮、嵌二萘、樟脑和樟脑衍生物，以及单萜天然产物、单萜衍生物和倍半萜，包括石竹烯和古巴烯。

所述配制物可以包含增强所述活性成分到血流的递送的其它物质。这样的物质的例子包括但不限于23-十二烷基醚、拟肽酶、氮酮、苯扎氯铵、西吡氯铵、溴化十六烷基三甲铵、环糊精、硫酸葡聚糖、月桂酸、月桂酸/丙二醇、溶血卵磷脂、薄荷醇、甲氧基水杨酸、油酸甲酯、油酸、卵磷脂、聚乙二醇、聚山梨醇酯80、EDTA钠盐、甘胆酸钠、甘氨脱氧胆酸钠、十二烷基硫酸钠、水杨酸钠、牛黄胆酸钠、牛去氧胆酸钠、亚砜和各种烷基糖苷。

其它调节(modification)也可以影响所述活性剂的释放速率。用于使主要配料软化的质地调节剂(texture modifier)可以加快释放，而硬的主要配料减慢释放。添加碱性物料如碳酸氢钠或氢氧化钠可以使唾液呈微碱性，这可以提高药物的进入血液的口腔/舌的吸收。

本发明的活性剂的吸收也可以受配制物的形状和大小的影响。例如，当咀嚼时，具有巨大的表面积的扁平条装口香糖可以更快地将活性物从口香糖释放到唾液中，而圆的或立方体的块可以更慢地释放药物和活性物。

在U.K.Patent Publication No.1,489,832；U.S.Patent No.4,753,805；EPPatent Publication No.0221850；和Italy Patent Publication No.1,273,487.中公开了口香糖片。这些专利公开了将活性剂添加到随后制成片状的口香糖。

也可以将着色剂添加到所述配制物。根据一些实施方案，所述着色剂包括食品质量的染料。根据一些实施方案，可以将成膜剂添加到所述配制物。可以添加到所述配制物的成膜剂包括甲基纤维素、明胶、羟丙基纤维素、乙基纤维素、羟乙基纤维素、羧甲基纤维素及其组合。根据另一实施方案本发明的果实细胞培养物以非着色浓度提供。

为了鼻吸入施用，所述活性成分可以以来自加压的包装或喷雾器(使用合适的助推剂，例如，二氟二氯甲烷、三氯氟甲烷、二氯四氟乙烷或二氧化碳)的气溶胶喷雾的形式方便地递送。在加压的气溶胶的情况中，可以通过提供阀来递送测量的量来确定剂量单元。在分配器中使用的胶囊和药筒(例如明胶的)可以配置为含有所述化合物和合适的粉末状主要配料如乳糖或淀粉的粉末状混合物。

根据一些实施方案，所述果实细胞培养物和源自其的制剂也可以作为食品添加剂提供，并口腔吸收。

根据一些实施方案，所述食品添加剂和食品成分组合物可以添加到跟 中食品产品。根据进一步的实施方案，将所述果实细胞培养物添加到吞咽前保留在嘴里的食品，从而增强进入血流的递送。这样的食品的例子包括巧克力、糖果和冰淇淋、乳制品、棒、面包、谷物、酸奶以及饮料。

如本文所用，短语“食品产品”描述基本由蛋白质、碳水化合物和/或脂肪组成的物料，其在生物体内用于维持生长、修复和至关重要的过程，以及提供能量。食品产品还可以含有补充物质，如矿物质、维生素和调味品。见Merriani-Webster's CollegiateDictionary,10th Edition,1993。如本文所用，短语“食品产品”进一步包括适合人或动物摄取的饮料。

含有一些实施方案的配制物的食品产品还可以包含另外的添加剂，例如，抗氧化剂、甜味剂、风味剂、颜色、防腐剂、营养添加剂如维生素和矿物质、氨基酸(即必需氨基酸)、乳化剂、pH控制剂如酸化剂、凝胶、止漠和释放剂、风味改进或增强剂、膨起(raising)或发酵剂、气体和螯合剂，其应用和作用是本领域众所周知的。

所述活性成分的毒性和治疗效力可以通过标准药物学程序体外确定，在细胞培养物中或在实验动物中确定。从这些体外和细胞培养物测定和动物研究获得的数据可以用于配制在人中使用的剂量范围。所述剂量可以根据所采用的给药形式和所利用的施用途径而改变。可以由医生根据病人的病症选择确切的配制物、施用途径和剂量(见例如Fingl,etal.,1975,"The Pharmacological Basis of Therapeutics",Ch.1p.1)。

在本发明的一些实施方案中，提供了用于治疗、缓和或预防代谢综合征的粉末形式的组合物，其包含所述大规模方法中的体外生长的葡萄浆果细胞的细胞系愈伤组织培养物，其中葡萄浆果细胞的细胞系愈伤组织培养物源自葡萄浆果横切片、葡萄浆果皮、葡萄浆果肉、葡萄种子、有种子或无种子栽培株的葡萄胚芽或者葡萄种皮中的一或多种；其中葡萄浆果细胞的细胞系愈伤组织培养物包含的白藜芦醇的量为至少1000mg/kg粉末。在本发明的一些实施方案中，根据本发明所述大规模方法的实施方案生产的葡萄细胞中至少90％的白藜芦醇是反式-葡糖苷白藜芦醇。

根据一些实施方案，所制备的果实细胞中不同多酚的相对量与其在农业葡萄果实中的相对量不同。这在实施例3、表9中清晰可见，其中将在根据本发明的实施方案大规模生产的干燥的葡萄细胞培养物中总的白藜芦醇与葡萄中白藜芦醇的量比较。根据一些实施方案，某些多酚的量在所制备 的果实细胞与其在农业葡萄果实中的量相比增加。根据一些实施方案，白藜芦醇的量在果实细胞中增加。根据一些实施方案，果实细胞(可以是葡萄细胞)在干燥为粉末之后其中白藜芦醇的量为1000-50000mg/kg。根据本发明的一些实施方案，在果实细胞干燥为粉末之后白藜芦醇的量大于1000mg/kg。根据本发明的一些实施方案，在果实细胞干燥为粉末之后白藜芦醇的量大于3000mg/kg。根据本发明的一些实施方案，在果实细胞干燥为粉末之后白藜芦醇的量大于5000mg/kg。根据本发明的一些实施方案，在果实细胞干燥为粉末之后白藜芦醇的量大于10000mg/kg。根据本发明的一些实施方案，在果实细胞干燥为粉末之后白藜芦醇的量大于20000mg/kg。根据本发明的一些实施方案，在果实细胞干燥为粉末之后白藜芦醇的量大于30000mg/kg。根据本发明的一些实施方案，在果实细胞干燥为粉末之后白藜芦醇的量大于40000mg/kg。根据本发明的一些实施方案，在果实细胞干燥为粉末之后白藜芦醇的量大于50000mg/kg。根据本发明的一些实施方案，在果实细胞干燥为粉末之后白藜芦醇的量大于60000mg/kg。根据本发明的一些实施方案，在果实细胞干燥为粉末之后白藜芦醇的量大于70000mg/kg。

根据一些实施方案，所制备的果实细胞中各种成分的相对量与其在农业葡萄果实中的相对量不同。根据一些实施方案，所述果实细胞中糖的相对量与农业葡萄果实中糖的相对量相比降低。

根据一些实施方案，干燥的果实细胞含有高达10％w/v甜味糖。根据本发明的一些实施方案，干燥的果实细胞含有高达15％w/v甜味糖。根据一个实施方案，干燥的果实细胞含有10-15％w/v甜味糖。根据一个实施方案，干燥的果实细胞含有15-20％w/v甜味糖。根据一些实施方案，根据本发明的大规模方法制备的果实细胞含有少于10％w/v甜味糖。根据一些实施方案，所述果实细胞含有少于5％w/v甜味糖。根据一些实施方案，所述果实细胞含有少于3％w/v甜味糖。根据一些实施方案，所述果实细胞含有少于2％w/v甜味糖。根据一些实施方案，所述果实细胞含有少于1％w/v甜味糖。根据一些实施方案，所述果实细胞含有约1％w/v甜味糖。如本文所用，短语“甜味糖”是指提供甜味的糖，如蔗糖、葡萄糖和果糖。

根据一个实施方案，干燥的果实细胞含有少于20％w/v甜味糖。根据一个实施方案，干燥的果实细胞含有少于30％w/v甜味糖。

根据一些实施方案，将果实细胞干燥，从而浓缩在其中发现的物质，包括糖。根据一些实施方案，所述物质浓缩5倍。根据一些实施方案，所述物质浓缩10倍。根据一些实施方案，所述物质浓缩15倍。根据一些实施方案，所述物质浓缩20倍。根据一些实施方案，所述物质浓缩25倍。根据一些实施方案，所述物质浓缩30倍。

根据一些实施方案，根据本发明的大规模方法制备的果实细胞是无味的；根据其它的实施方案，根据本发明的大规模制备的果实细胞是有味的。本发明的实施方案涉及用于大规模体外生产果实细胞的方法。在本发明的一些实施方案中，所述方法不包括提取果实细胞。出人意料的是，根据本文描述的大规模方法制造的所生产的果实细胞显示包含多酚的量高。

在本发明的一个实施方案中，提供体外生产生长的葡萄浆果细胞的细胞系愈伤组织培养物的大规模方法，所述方法包括：

将葡萄细胞在瓶中生长；

将葡萄细胞从瓶接种至第一生物反应器中；以及收获所产生的葡萄细胞。

在本发明的一些实施方案中，提供了体外生产生长的葡萄浆果细胞的细胞系愈伤组织培养物的大规模方法，所述方法包括：

将葡萄细胞在瓶中生长；

将葡萄细胞从瓶接种至第一生物反应器中；将葡萄细胞从所述第一生物反应器接种至另一个生物反应器，其中所述另一个生物反应器是最后的生物反应器或者是中间生物反应器，及可以提供使用一或多个中间生物反应器的一些更多的步骤及其中所述第一生物反应器和所述另一个生物反应器中的至少一个是一次性的；及

从最后的生物反应器中收获葡萄细胞；

其中将从最后的生物反应器收获的葡萄细胞干燥。

“一次性生物反应器”是指具有一次性包袋的生物反应器，其可以是代替培养容器的一次性使用的包袋。所述一次性包袋通常是由三层或更多层塑料薄片制成。在本发明的一些实施方案中，一层是由聚乙烯、聚对苯二甲酸乙二醇酯或LDPE制成，以提供机械稳定性。第二层是使用尼龙、PVA或PVC制成，其作为气体屏障。最后，接触层由PVA或PP制成或者是另一聚乙烯、聚对苯二甲酸乙二醇酯或LDPE层。对于医学应用，接触产物 的一次性使用的材料必须通过European Medicines Agency或者其它地区的相似权威机构认证。

根据本发明的一些实施方案，一次性生物反应器由一或多层的聚乙烯制成。在本发明的一些实施方案中，一次性生物反应器是由聚乙烯内层和外层及中间尼龙层制成。

通常地，有两种不同方法构建一次性使用的生物反应器，区别在于用于搅动培养基的方式。

一些一次性使用的生物反应器使用搅拌器，像常规生物反应器一样，但是搅拌器整合在塑料包袋中。密闭的包袋和搅拌器提前灭菌。在使用中，将包袋安装在生物反应器中，及将搅拌器与机械性或磁性驱动器连接。

其它一次性使用的生物反应器是通过摇摆运动搅动的。其它一次性使用的生物反应器是空气搅拌的(airlift)生物反应器，其中通过空气的导入搅动反应培养基及使其通气。这种类型的生物反应器不需要在一次性使用包袋内部的任何机械性搅动器。

根据一些实施方案，制备果实细胞的大规模方法包括许多随后的步骤。根据本发明的一些实施方案，在每个步骤中制备的果实细胞的量大于在先前步骤中制备的量。进一步地，在每个步骤中制备的果实细胞接种或收获以用作大规模方法中下一步的起始物。在大规模方法的最后步骤中，通常使果实细胞生长直至其达到生长曲线图的平台期。

使用本发明的大规模方法的优势在实施例章节中是清楚的并得到证实。如在实施例2、实验2中可见，使用补充的Gamborg B5培养基的红葡萄细胞(RGC)的生物量高于与在非补充的Gamborg B5培养基中获得的生物量。进一步地，甚至在大规模生物反应器中，使用含有不同浓度的镁、硝酸盐和磷酸盐(KNO₃、MgSO₄、MgNO₃、NaH₂PO₄)的Gamborg B5培养基导致所产生的细胞中的高水平白藜芦醇。

表4和实施例2、实验3显示在大规模一次性生物反应器中在补充的培养基中生长的葡萄细胞中总多酚及白藜芦醇水平高于在Erlenmeyer瓶中生长的葡萄细胞中获得的水平，即分别为910mg/l和203mg/l。与其它人的观测结果不同，这是首次证实在大规模一次性1000-5000升生物反应器中果实植物细胞系的成功生长，具有较高水平白藜芦醇和多酚产生。

表7和实施例2、实验7显示两种培养基IM1培养基和补充有镁、磷 酸盐和硝酸盐的Gamborg B5对于由细胞产生的白藜芦醇的量的影响。在由无菌的一次性透明塑料容器制成的20L生物反应器中评定该影响，并与在A.Decendit(1996)Biotechnology Letters中公开的数据进一步对比，其中细胞是生长在20L玻璃容器中的IM1培养基中。结果表明在一次性生物反应器中IM1培养基中生长的红葡萄细胞产生93mg/l白藜芦醇(表7)，其比在使用相同培养基(Decendit)的搅动的玻璃生物反应器中产生的水平的大约高3倍。此外，当这些细胞在一次性生物反应器中在补充的Gamborg B5培养基中生长时产生显著高水平的白藜芦醇，即387mg/l。因此，这个实验显示使用一次性生物反应器和含有不同浓度镁、硝酸盐和磷酸盐(KNO₃,MgSO₄,MgNO₃,NaH₂PO₄)的Gamborg B5培养基的优势以及使用一次性生物反应器和补充的Gamborg B5培养基组合的优势。

根据一些实施方案，使果实细胞在生物反应器中生长。根据一些实施方案，设计生物反应器以使得能够进行适当的混合及质量转移，同时使剪切力和流体动力压力强度最小化。根据本发明的一些实施方案，至少一个生物反应器是一次性生物反应器。其可以是第一生物反应器或者中间生物反应器或者最后的生物反应器或者其任意组合。根据本发明的一些实施方案，一次性的生物反应器是最后的生物反应器，之后收获细胞并干燥以形成粉末。

根据本发明一个举例的实施方案，第一步包括在瓶如Erlenmeyer或生物反应器中制备果实细胞。根据一些实施方案，第一步包括制备直至1.0L的果实细胞培养物。根据进一步的实施方案，第一步包括制备直至1.5L的果实细胞培养物。根据进一步的实施方案，第一步包括制备直至2.0L的果实细胞培养物。

根据一些实施方案，使用玻璃、金属或者塑料瓶进行第一步。根据一些实施方案，该瓶是一次性的。根据进一步的实施方案，该瓶可以重新使用任何次数。根据一些实施方案，该瓶在两次使用之间通过任何适当方式灭菌。

根据一些实施方案，第一步包括使用任何合适的培养基以使得果实细胞生长。根据一些实施方案，用于使果实细胞生长的培养基包括细胞生长培养基、盐、维生素、糖、激素或者其任意组合。根据一些实施方案，细胞生长培养基是B5Gamborg(Gamborg et al.,Exp.Cell Res.50:151,1968)， 或者其任何变型。根据一些实施方案，Gamborg B5包含盐如镁、磷酸盐、硝酸盐或其任何组合。根据本发明的一些实施方案，Gamborg B5培养基包含KNO₃、MgSO₄、NaH₂PO₄或者其任何组合。根据一些实施方案，培养基包含Gamborg B5维生素或者其任何组合。根据进一步的实施方案，培养基包含糖如蔗糖、Gamborg B5或者其任何组合。

在本发明的实施方案中，加入Gamborg B5中的KNO₃的浓度为25mM-45mM。

在本发明的实施方案中，加入B5Gamborg中的MgSO₄的浓度为1mM-15mM。

在本发明的实施方案中，加入B5Gamborg中的MgNO₃的浓度为5mM-35mM。

在本发明的实施方案中，加入Gamborg B5中的KNO₃的浓度为15mM-60mM。

在本发明的实施方案中，加入B5Gamborg中的MgSO₄浓度为0.5mM-25mM。

在本发明的实施方案中，加入B5Gamborg中的MgNO₃浓度为1mM-50mM。

在本发明的实施方案中，加入Gamborg B5中的KNO₃浓度为30mM-40mM。

在本发明的实施方案中，加入B5Gamborg中的MgSO₄浓度为5mM-10mM。

在本发明的实施方案中，加入B5Gamborg中的MgNO₃浓度为20mM-30mM。

在本发明的实施方案中，将肌醇加入Gamborg B5中。

在本发明的实施方案中，将H₃BO₃加入Gamborg B5中。

在本发明的实施方案中，将MnSO₄加入Gamborg B5中。

在本发明的实施方案中，将NaH₂PO₄加入Gamborg B5中。

在本发明的实施方案中，将生物素加入Gamborg B5中。

在本发明的实施方案中，将D-泛酸钙加入Gamborg B5中。

在本发明的实施方案中，将大约0.5mM肌醇加入Gamborg B5中。

在本发明的实施方案中，将大约0.05mM H₃BO₃加入Gamborg B5中。

在本发明的实施方案中，将大约0.04mM MnSO₄加入Gamborg B5中。

在本发明的实施方案中，将大约1mM NaH2PO₄加入Gamborg B5中。

在本发明的实施方案中，将大约0.004mM生物素加入Gamborg B5中。

在本发明的实施方案中，将大约0.2mM D-泛酸钙加入Gamborg B5中。

在本发明的实施方案中，将大约0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1.0、2、3、4、5、6、7、8、9、10mM肌醇加入Gamborg B5中。

在本发明的实施方案中，将大约0.01、0.02、0.03、0.04、0.05、0.06、0.07、0.08、0.09、0.1mM H₃BO₃加入Gamborg B5中。

在本发明的实施方案中，将大约0.01、0.02、0.03、0.04、0.05、0.06、0.07、0.08、0.09、0.1mM MnSO₄加入Gamborg B5中。

在本发明的实施方案中，将0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1.0、2、3、4、5、6、7、8、9、10mM NaH2PO₄加入Gamborg B5中。

在本发明的实施方案中，将大约0.001、0.002、0.003、0.004、0.005、0.006、0.007、0.008、0.009、0.01mM生物素加入Gamborg B5中。

在本发明的实施方案中，将大约0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1.0、2、3、4mM D-泛酸钙加入Gamborg B5中。

在本发明的实施方案中，加入Gamborg B5中的蔗糖浓度为2-4％。在另一实施方案中，浓度为大约3％。

根据进一步的实施方案，酪蛋白可以包含在细胞生长培养基中。根据进一步的实施方案，生长激素可以包含在细胞生长培养基中。根据进一步的实施方案，生长培养基包含激素。根据一些实施方案，果实细胞不用添加激素而生长。

根据一些实施方案可以在所述方法的一或多个阶段使用的植物培养基的例子包括但不限于：Anderson(Anderson,In Vitro 14:334,1978；Anderson,Act.Hort.,112:13,1980),Chee and Pool(Sci.Hort.32:85,1987),CLC/Ipomoea(CP)(Chee et al.,J.Am.Soc.Hort.Sci.117:663,1992),Chu(N.sub.6)(Chu et al.,ScientiaSinic.18:659,1975；Chu,Proc.Symp.Plant Tiss.Cult.,Peking 43,1978),DCR(Gupta and Durzan,Plant Cell Rep.4:177,1985),DKW/Juglans(Driver and Kuniyuki,HortScience 19:507,1984；McGranahan et al.,in:Bonga and Durzan,eds.,Cell and Tissue Culturein Forestry,MartinusNijhoff,Dordrecht,1987),De Greef and Jacobs(De Greef andJacobs, Plant Sci.Lett.17:55,1979),Eriksson(ER)(Eriksson,Physiol.Plant.18:976,1965),Gresshoff and Doy(DBM2)(Gresshoff and Doy,Z Pflanzenphysiol.73:132,1974),Heller's(Heller,Ann.Sci.Nat.Bot.Biol.Veg.11th Ser.14:1,1953),Hoagland's(Hoagland and Arnon,Circular 347,Calif.Agr.Exp.Stat.,Berkeley,1950),Kao andMichayluk(Kao and Michayluk,Planta 126:105,1975),Linsmaier and Skoog(Linsmaier and Skoog,Physiol.Plant.18:100,1965),Litvay's(LM)(Litvay et al.,Plant Cell Rep.4:325,1985),Nitsch and Nitsch(Nitsch and Nitsch,Science 163:85,1969),Quoirin and Lepoivre(Quoirin et al.,C.R.Res.Sta.Cult.Fruit Mar.,Gembloux 93,1977),Schenk and Hildebrandt(Schenk and Hildebrandt,Can.J.Bot.50:199,1972),White's(White,The Cultivation of Animal and Plant Cells,RonaldPress,NY,1963)等。

根据一些其它举例的实施方案，果实细胞和培养基在第一个步骤期间持续混合。根据进一步的实施方案，果实细胞和培养基在第一个步骤期间间歇混合。根据一些实施方案，第一个步骤期间的温度为20℃-30℃。根据一些实施方案，在第一个步骤期间的温度为22℃-28℃。根据一些实施方案，果实细胞在第一个步骤生长多于5天。根据一些实施方案，果实细胞在第一个步骤生长多于7天。根据一些实施方案，果实细胞在第一个步骤生长多于5天但少于2周。根据一些实施方案，果实细胞在第一个步骤生长多于5天以上但少于12天。

根据一些举例的实施方案，本发明方法中使用的生物反应器包括一个进口，在第一个步骤果实细胞通过其进入，培养基和任何其它物质置于生物反应器中。根据进一步的实施方案，本发明方法中使用的生物反应器包括排出任何希望的物质的出口。根据一些实施方案，出口包括玻璃出口，设计为释放生物反应器中过量的气体。根据一些实施方案，气体出口是人工操作的。根据其它的实施方案，气体出口是自动操作的，其中一旦瓶中的气压(atmosphere)达到预定压力，则气体从瓶中释出。根据一些实施方案，预定的压力直至8PSI。

根据一些举例的实施方案，结束果实细胞生长的第一步之后，将果实细胞接种于小规模生物反应器中，在此也称作第一生物反应器。对于大规模方法的第二步，根据一些实施方案，小规模生物反应器是4L反应器。根据进一步的实施方案，小规模生物反应器是3-5L反应器。根据进一步的实 施方案，小规模生物反应器是3-10L反应器。根据进一步的实施方案，小规模生物反应器是4-8L反应器。

小规模生物反应器可以由任何合适材料制成，如玻璃、金属、塑料和/或任何类型聚合物。根据一些实施方案，小规模生物反应器是一次性的。如果小规模生物反应器不是一次性的，根据一些实施方案，在两次使用期间通过任何合适方式清洁和灭菌。

如上所述，已知当较大数量的果实细胞在生物反应器中生长时，次生代谢物包括多酚如白藜芦醇的产生与在小规模生产如使用玻璃瓶如Erlenmeyers中相同代谢物相比显著降低。然而，本文详细描述的大规模方法提供果实细胞，当在生物反应器中生长时其中的次生代谢物的量不降低。进一步地，某些次生代谢物的产生甚至是扩大的。

因此，根据本发明的实施方案，在小规模生物反应器中生长的果实细胞的次生代谢物的相对量与其在第一步中的相对量相比不显著降低。根据一些实施方案，上述用于第一步中生长培养基中的成分也可用于第二步。根据一些实施方案，小规模生物反应器中使用的生长培养基与大规模生产方法的第一步中使用的培养基相同。根据一些实施方案，在第二步生长培养基中发现的不同成分的相对量与第一步相同。根据其它的实施方案，在第二步生长培养基中发现的不同成分的相对量与在第一步中使用的相对量不同。根据一些实施方案，在第二步将另外的物质加入生长培养基中。

根据一些实施方案，小规模生物反应器包括一个入口，果实细胞(来自第一步)、空气、培养基及任何其它物质通过其置于生物反应器中。根据进一步的实施方案，小规模生物反应器包括一个出口，由此排出任何希望的物质。根据一些实施方案，出口包括一个气体出口，设计为释放生物反应器中过量的气体。根据一些实施方案，气体出口是人工操作的。根据其它的实施方案，气体出口是自动操作的，其中一旦生物反应器中气压达到预定压力，则气体从生物反应器中释出。根据一些实施方案，预定压力是8PSI。

根据一些实施方案，果实细胞和培养基在第二步是持续混合的。根据进一步的实施方案，果实细胞和培养基在第二步是间歇混合的。根据一些实施方案，第二步的温度是20-30摄氏度。根据一些实施方案，果实细胞在第二步生长多于一周但少于两周。在本发明的一些实施方案中果实细胞 在接种于下一个生物反应器中之前生长9-16天。

对于大规模方法的第三步，将收获的果实细胞置于大规模生物反应器中。根据一些实施方案，大规模生物反应器是30-50L反应器。根据进一步的实施方案，大规模生物反应器是40-60L反应器。根据进一步的实施方案，大规模生物反应器是30-70L反应器。根据进一步的实施方案，大规模生物反应器是20-100L反应器。

大规模生物反应器可以由任何合适材料制成，如玻璃、金属、塑料和/或任何类型聚合物。根据一些实施方案，大的生物反应器是一次性的。如果大规模生物反应器不是一次性的，根据一些实施方案，在两次使用期间通过任何合适方式清洁和灭菌。

与小规模生物反应器相似，根据本发明的实施方案，在大规模生物反应器中生长的果实细胞的次生代谢物与其在该方法的任何先前步骤中的相对量相比不显著降低。根据一些实施方案，上述任何先前步骤中用于生长培养基中的成分也可以用于第三步。根据一些实施方案，大规模生物反应器中使用的生长培养基与该方法的任何先前步骤中使用的培养基相同。根据一些实施方案，第三步生长培养基中发现的不同成分的相对量与该方法任何先前步骤中的量相同。根据其它的实施方案，第三步生长培养基中发现的不同成分的相对量与该方法任何先前步骤中使用的相对量不同。根据一些实施方案，在第三步将另外的物质加入生长培养基中。

根据一些实施方案，大规模生物反应器包括一个入口，果实细胞(来自第二步)、培养基、空气和任何其它物质通过其置于生物反应器中。根据进一步的实施方案，大规模生物反应器包括一个出口，以排出任何希望的物质。根据一些实施方案，出口包括一个气体出口，设计为释放生物反应器中过量的气体。根据一些实施方案，气体出口是人工操作的。根据其它的实施方案，气体出口是自动操作的，其中一旦生物反应器中气压达到预定压力，则气体从生物反应器中释出。根据一些实施方案，预定的压力为直至8PSI。

根据一些举例的实施方案，果实细胞和培养基在第三步持续混合。根据进一步的实施方案，果实细胞和培养基在第三步间歇混合。根据一些实施方案，第三步的温度是20-30℃。根据一些实施方案，果实细胞在第三步生长大约2-3周。根据一些实施方案，果实细胞在第三步生长大约3-5周。 根据一些实施方案，果实细胞在第三步生长大约12-30天。

第三步果实细胞生长结束后，通常通过任何适当方式将果实细胞从中等规模生物反应器接种。对于大规模生产方法的第四步，将收获的果实细胞置于更大规模生物反应器中。根据一些实施方案，更大规模生物反应器是1000L反应器。根据进一步的实施方案，更大规模生物反应器是200-500L反应器。根据进一步的实施方案，更大规模生物反应器是500-1000L反应器。根据进一步的实施方案，更大规模生物反应器是1000-1500L反应器。根据进一步的实施方案，更大规模生物反应器是500-1100L反应器。

更大规模生物反应器可以由任何合适材料制成，如玻璃、金属、塑料和/或任何类型聚合物。根据一些实施方案，大规模生物反应器是一次性的。如果大规模生物反应器不是一次性的，根据一些实施方案，在两次使用之间通过任何合适方式清洁和灭菌。

与小规模生物反应器相似，根据本发明的实施方案，在更大规模生物反应器中生长的果实细胞的次生代谢物的量与其在该方法的先前步骤中的相对量相比不显著降低。根据一些实施方案，上述在任何先前步骤中用于生长培养基中的成分也可用于该方法的第四步。根据一些实施方案，在更大规模生物反应器中使用的生长培养基与在任何先前步骤中使用的培养基相同。根据一些实施方案，在第四步中生长培养基中发现的不同成分的相对量与先前任何步骤中的量相同。根据其它的实施方案，在第四步中生长培养基中发现的不同成分的相对量与在任何先前步骤中使用的相对量不同。根据一些实施方案，在该方法的第四步将其它物质加入生长培养基中。

根据一些实施方案，更大规模生物反应器包括一个入口，果实细胞(来自第三或第二步)、培养基、空气和任何其它物质通过其置于生物反应器中。根据进一步的实施方案，更大规模生物反应器包括一个出口，以排出任何希望的物质。根据一些实施方案，出口包括一个气体出口，设计为释放生物反应器中过量的气体。根据一些实施方案，气体出口是人工操作的。根据其它的实施方案，气体出口是自动操作的，其中一旦生物反应器中气压达到预定压力，则气体从生物反应器中释出。

根据一些实施方案，果实细胞和培养基在第四步持续混合。根据进一步的实施方案，果实细胞和培养基在第四步间歇混合。根据一些实施方案，第四步的温度是20-30℃。根据一些实施方案，果实细胞在第三步或第四步 生长直至达到细胞生物量为10％-70％。

根据一些实施方案，在果实细胞在更大规模生物反应器中生长之后终止该大规模生产方法。根据这种实施方案，果实细胞在更大规模生物反应器中生长直至达到细胞生物量为10％-70％。细胞生物量达到10％-70％后，通过任何合适方式从该大规模生物反应器中收获果实细胞并进一步加工。根据一些实施方案，将果实细胞通过干燥、冻干、冷冻干燥和喷雾干燥等进一步加工。根据一些实施方案，果实细胞的加工不包括从中提取活性成分。

根据一些实施方案，大规模方法可包括将细胞从培养瓶中接种于可以是任何大小的生物反应器并收获细胞的一个步骤。根据其它的实施方案，果实细胞可以接种于一系列生物反应器中，其中每个生物反应器通常大于前一个使用的生物反应器。根据本发明大规模方法进行任何数目的额外的步骤。额外的步骤包括可能的中间步骤，其中收获细胞或接种及置于更大的生物反应器中及生长直至收获或接种并转移至更大的生物反应器。根据进一步的实施方案，该方法包括使从大规模生物反应器中收获的果实细胞生长的额外步骤。

本发明的各个方面在如下实施例中更详细描述，这些代表本发明的实施方案，不限制本发明的范围。

实施例

实施例1：生产-工业化水平规模

1.材料和方法

生产方法涵盖在具有五个阶段的逐步方法中增殖葡萄细胞。从在Erlenmeyer摇瓶中增殖葡萄细胞开始，在小和大规模生物反应器中进一步增殖。关键因素是在不同的生物反应器规模中的增殖期间维持细胞中次生代谢物白藜芦醇的高水平。在最后的大规模增殖阶段结束时，在要求的生物量，收获细胞并干燥以产生精细的粉-紫色粉末，产生干燥细胞(RGC)生物量，用于不同的医学应用。

形成葡萄细胞系

来自葡萄横切片的愈伤组织:从田间生长在开花后20-50天的葡萄植物中收获4-8cm长的幼葡萄串，在流动的自来水中彻底冲洗。将无种子葡萄 Vitis vinifera cv."AVNIR 825"(Agraman与Gamay red的杂交种)的绿色未成熟浆果在含有1.3％w/v次氯酸钠和(0.1％v/v)Tween 20(作为增湿剂)的溶液中灭菌10分钟，。使用外科手术刀将外植体切成2-3mm长度横切片，在补加过滤灭菌的1.7mM抗坏血酸和0.8mM柠檬酸、100mg/l DTT(二硫苏糖醇)和50mg/l乙酰半胱氨酸的半强度MS(Murashige and Skoog,1962,Physiol Plant15:473-497)液态基本培养基中进行。将如下抗氧化剂加入切割培养基中：PVP(0.5和1g/l)、L-半胱氨酸(150mg/l)、五倍子酸(1.5mg/l)、DTT(70mg/l)、生物喋呤(15mg/l)，抗坏血酸(150mg/l)和柠檬酸(150mg/l)，以抑制细胞坏死(necrogenesis)及使得可以回收绿色健康浆果片。

将浆果片置于100个含有25ml高压灭菌的用0.25％Gelrite固化Murashige andSkoog，MS培养基的15mm培养平板中。在102kpa高压灭菌15分钟之前将pH调节为pH 5.9。将每个均含有25个浆果片的30个平板用Parafilm密封及在26℃避光温育3天。将培养物在25℃由冷白光荧光管提供15-30μmolm^-2s^-1.辐照度的16小时光照期下温育。MS盐和维生素培养基也补加250mg/l酪蛋白水解物、2％蔗糖和100mg/l肌醇。对于愈伤组织诱导，还补加0.2mg/l激动素和0.1mg/l NAA(α-萘基乙酸)，培养基称作RD1。

在培养开始3-4周后，沿着浆果片可见绿色和红色愈伤组织混合物。该愈伤组织由易碎的延长的细胞组成，其中一些呈现出花青素深色着色。选择富集花青素的愈伤组织部分并单独传代培养增殖。绿色愈伤组织部分单独培养。

来自葡萄皮细胞的愈伤组织:从田间生长的葡萄植物在开花20-50天后收获4-8cm长的幼葡萄串，在流动的自来水中彻底冲洗。将无种子葡萄Vitisvinifera cv."AVNIR825"(Agraman与Gamay red的杂交种)的绿色不成熟浆果在含有1.3％w/v次氯酸钠和(0.1％v/v)Tween 20(作为增湿剂)的溶液中灭菌10分钟。通过在浆果皮做3-8mm切口并使用无菌镊子仅剥皮而分离浆果皮。果皮分离在补加过滤灭菌的1.7mM抗坏血酸和0.8mM柠檬酸、100mg/l DTT(二硫苏糖醇)和50mg/l乙酰半胱氨酸的半强度MS(Murashige and Skoog,1962)液态基本培养基中进行。

将果皮置于RD-1培养基中。在大约10-14天后，在果皮切割表面上开始发育出细胞丛。选择富集花青素的细胞并在新鲜培养基中传代培养以进 一步增殖。

来自葡萄种皮的愈伤组织:从田间生长的葡萄植物在开花20-50天后收获4-8cm长的幼葡萄串，在流动的自来水中彻底冲洗。将无种子葡萄Vitisvinifera cv."AVNIR 825"(Agraman与Gamay red的杂交种)的绿色不成熟浆果在含有1.3％w/v次氯酸钠和(0.1％v/v)Tween 20(作为增湿剂)的溶液中灭菌10分钟。将浆果切开以显露幼绿色发育中种子。切下未成熟种皮并置于培养基上。在补加过滤灭菌的1.7mM抗坏血酸和0.8mM柠檬酸、100mg/lDTT(二硫苏糖醇)和50mg/l乙酰半胱氨酸的半强度MS(Murashige and Skoog,1962)液态基本培养基中进行分离。

将种皮切片置于RD-1培养基中。在大约12-20天后，种皮变成褐色，在种皮外植体的顶部开始出现愈伤组织。选择富于红-褐色着色的细胞并在新鲜培养基中进一步传代培养以进一步增殖。

液态培养物的建立:液态培养物通过在50ml不同培养基(RD1-RD6，见下文)中加10g愈伤组织而建立。在固体培养基上成功建立的所有细胞系在缺少胶凝剂的相同培养基组合中呈现均匀细胞悬浮液。加入70mg/l DTT或者150mg/l抗坏血酸或柠檬酸改善浆果来源的悬浮培养物的生长及抑制细胞necrogenesis。所有外植体类型均成功用于建立液态培养物。每7-10天将培养物在新鲜生长培养基中常规传代培养。

导入以建立浆果来源的愈伤组织细胞系的其它葡萄种属：使用上述方案培养如下葡萄属物种：

森林葡萄、V.muscadinia、圆叶葡萄、河岸葡萄、夏特沃氏葡萄、V.lubrisca、V.daviddi、山葡萄、V.romanelli、夏葡萄、辛西安那葡萄、V.cineria、V.palmate、V.munsoniana、霜葡萄、Hybrid A23-7-71、V.acerifolia、V.treleasei和桦叶葡萄。

欧洲葡萄横切片、葡萄皮和葡萄种子的愈伤组织产生的效力在下表A中例证。

表A

在这项研究中使用的一些葡萄属物种的不同愈伤组织“类型”产生的效力在下表B中概括显示。

表B

(B-浆果片，SC-种皮，S-果皮)

阶段1:Erlenmeyer，摇瓶

将红葡萄细胞在持续荧光(1000lx)在25±5℃温度下在定轨摇床上的1LErlenmeyer瓶中悬浮生长。生长培养基含有Gamborg B5培养基和维生素，及补加250mg/l酪蛋白水解物、2-4％蔗糖、100mg/l肌醇、0.2mg/l激动素和0.1mg/l NAA(1-萘乙酸)、25-45mMKNO₃、1-15mM MgSO₄或者5-35mM MgNO₃及1mM NaH₂PO₄(pH 5.8)。每6-11天将细胞传代培养。

阶段2:小规模生物反应器

通过将在阶段1的Erlenmeyer中生长7-16天的细胞悬浮液在25±5℃接种于4-8L一次性生物反应器中。将细胞在持续荧光(1000lx)下在生长培养基中悬浮生长，所述生长培养基含有补充的Gamborg B5盐和维生素培养基，补加250mg/l酪蛋白水解物、2-4％蔗糖、100mg/l肌醇、25-45mM KNO₃、1-15mM MgSO₄或5-35mM MgNO₃及1mM NaH₂PO₄、0.2mg/l激动素和0.1mg/l NAA(1-萘乙酸)(pH 5.4-5.8)。每9-16天将细胞传代培养。

阶段3:大规模生物反应器

将在小规模生物反应器中生长的细胞悬浮液接种于30-50L一次性生物反应器中。将细胞在持续荧光(1000lx)下在25±5℃悬浮生长。生长培养基含有补充的Gamborg B5盐和维生素培养基，补加250mg/l酪蛋白水解物、2-4％蔗糖、100mg/l肌醇、25-45mM KNO₃、1-15mM MgSO₄或5-35mM MgNO₃及1mM NaH₂PO₄、0.2mg/l激动素和0.1mg/l NAA(1-萘乙酸)(pH5.4-5.8)。每12-30天将细胞传代培养。

阶段4:更大规模生物反应器

将在小或大规模生物反应器中生长的细胞悬浮液接种于300-1000L一次性生物反应器中。将细胞在持续荧光(1000lx)下在25±5℃悬浮生长。生长培养基含有补充的Gamborg B5盐和维生素培养基，补加250mg/l酪蛋白水解物、2-4％蔗糖、100mg/l肌醇、25-45mM KNO₃、1-15mM MgSO₄或5-35mM MgNO₃及1mM NaH₂PO₄、0.2mg/l激动素和0.1mg/l NAA(1-萘乙酸)(pH 5.4-5.8)。

阶段5:收获

细胞达到10％-70％(w/v)细胞生物量后，收获细胞。将收获的细胞干燥以产生精细的粉色-紫色粉末，具有典型成分、味道和气味。

实施例2：培养基成分和生物反应器设计对在大规模生物反应器中生长的红葡萄细胞中白藜芦醇水平的影响

2.1培养基成分

实验1:培养基成分对在Erlenmeyer摇瓶中生长的红葡萄细胞中白藜芦醇量的影响

将红葡萄细胞如实施例1阶段1所述在Erlenmeyer摇瓶中不同培养基成分中生长：MS、WP、WP+酪蛋白、Gamborg B5。结果示于表1，表明在Gamborg B5培养基中生长的细胞与在MS、WP、WP+酪蛋白培养基中生长的细胞相比产生高大约4-15倍的白藜芦醇水平。

表1

*数据是至少两个实验的平均数。

**MS-Murashige and Skoog培养基(Toshio Murashige and Folke K.Skoog in1968)

***WP–Woody植物培养基(WP)(Lloyd and McCown,1981)

实验2：培养基成分对生长及在大规模一次性生物反应器中生长的红葡萄细胞中的白藜芦醇水平的影响

将红葡萄细胞在大规模一次性生物反应器中如实施例1阶段3所述在不同培养基成分中生长。

将红葡萄细胞在两种类型培养基中生长：Gamborg B5培养基和补充的GamborgB5。如下表2所示，补加的具有高水平镁、磷酸盐和硝酸盐或硫酸盐(KNO₃、MgSO₄、MgNO₃、NaH₂PO₄)的Gamborg B5培养基与在非补充的Gamborg B5培养基中生长相比获得较高的红葡萄细胞生物量。

表2：在Gamborg B5和补充的Gamborg B5培养基中在大规模生物反应器中红葡萄细胞的生长

*数据是三个实验的平均数。

此外，检验培养基成分对于在大规模一次性生物反应器中生长的红葡萄细胞中白藜芦醇和总多酚水平的影响。将细胞在WP培养基及在含有不同浓度镁、硝酸盐和磷酸盐(相应的是KNO₃、MgSO₄、MgNO₃、KNO₃和NaH₂PO₄)的Gamborg B5培养基中生长。表3表明这些盐为生产高水平多酚和白藜芦醇所需要，特别是当加入补充的Gamborg B5培养基中时。在WP培养基中不同，其总多酚和白藜芦醇水平非常低。

图4显示红葡萄细胞在大规模一次性生物反应器在补充的Gamborg B5培养基中生长的生长曲线。细胞经历指数生长，在第20直至40天产生500gr/l新鲜生物量。这些细胞持续生长及可达到更高生物量。

表3：在大规模生物反应器(50L)中具有不同水平盐的不同培养基中生长的RGC中白藜芦醇和总多酚的水平

注意-部分数值以范围呈现。

*括号内的数字描述加入Gamborg B5中的矿物质的其它浓度

**数据是至少三个实验的平均数

***数据是至少十个实验的平均数

****McCown's Woody植物培养基(Lloyd and McCown,Proc.Int.PlantProp.Soc.30:421,1981

实验3：在从摇瓶中至大规模生物反应器中不同生长阶段生长的RGC中白藜芦醇和总多酚水平的一致

如实施例1阶段1-4所述将红葡萄细胞从Erlenmeyer摇瓶至大规模一次性生物反应器中在存在补充的Gamborg B5中在不同规模阶段生长。

表4中的结果显示红葡萄细胞在Erlenmeyer中生长良好及合成高数量的白藜芦醇和总多酚。当细胞在50L、300-100L规模在一次性生物反应器中生长时，与在Erlenmeyer培养瓶中生长相比获得更高的生长速度，通过细胞的鲜重和干重揭示，见表4中数据所示。在所有规格的大规模生物反应器中，鲜重大于230g/l(表4)，而在Erlenmeyer中为166g/l。此外，在大规模一次性生物反应器中在补充的培养基中总多酚以及白藜芦醇的水平高于在Erlenmeyer培养瓶中获得的水平，分别为901mg/l和200mg/l(表4)。与由其它人观测的结果不同，这是首次证实果实植物细胞在大规模一次性生物反应器中的成功生长，具有高水平的白藜芦醇和多酚产生。

表4：在摇瓶和不同规模阶段生长的RGC中白藜芦醇和总多酚水平*

*数据是至少三个实验的平均数。

实验4：加入酪蛋白水解物对于在大规模一次性生物反应器中生长的红葡萄细胞中白藜芦醇和总多酚水平的影响

如实施例1阶段3所述将红葡萄细胞在大规模一次性生物反应器中在补充的Gamborg B5中生长。

如表5所示，当在一次性大规模生物反应器中在有或无酪蛋白水解物的补充的培养基中生长时，红葡萄细胞中白藜芦醇和总多酚的水平相似。

表5

*数据是三个实验的平均数。

实验5：加入植物激素对于在大规模一次性生物反应器中生长的红葡萄细胞中白藜芦醇和总多酚水平的影响

如实施例1阶段3所述将红葡萄细胞在大规模一次性生物反应器中在补充的Gamborg B5中生长。如表6所示，当在有或没有0.5mg/l NAA和0.2mg/l激动素的一次性大规模生物反应器中生长时，红葡萄细胞中产生的白藜芦醇和总多酚水平相似(表6)。

表6

*数据是三个实验的平均数。

实验6：蔗糖浓度对于在大规模一次性生物反应器中生长的红葡萄细胞的影响

如实施例1阶段3所述将红葡萄细胞在大规模一次性生物反应器(50L)中在具有不同蔗糖浓度的补充的Gamborg B5培养基中生长。

将红葡萄细胞在含有2、3、4和6％蔗糖的补充的培养基中生长。如下表6所示，当细胞在2-4％蔗糖中生长时达到最佳细胞生长和生物量(143-260克/L)。较高的蔗糖浓度如6％蔗糖抑制细胞生长达10倍(24克/L)。

表6A

实验7：生物反应器构造、设计和结构对于在大规模一次性生物反应器中生长的红葡萄细胞中的白藜芦醇和总多酚的影响

在由灭菌的一次性的透明塑料容器制成的20L生物反应器中评定两种培养基-IM1培养基和补充有镁、磷酸盐和硝酸盐的Gamborg B5培养基-对于由细胞产生的白藜芦醇的量的影响，并与在A.Decendit(1996)Biotechnology Letters中公开的数据进一步对比，后者细胞在20L玻璃容器中在IM1培养基中生长。

结果表明在一次性生物反应器中在IM1培养基中生长的红葡萄细胞产生93mg/l白藜芦醇(表7)，其与使用相同培养基(Decendit)在搅动的玻璃生物反应器中产生的水平高大约3倍。此外，当这些细胞在一次性生物反应器中在补充的Gamborg B5中生长时，产生显著高水平的白藜芦醇，为387mg/l(表7)。

表7：生物反应器类型和培养基成分对红葡萄细胞产生的白藜芦醇水平的影响

*IM1培养基-Ref.文章A.Decendit(1996)Biotechnology Letters

**数据是至少三个实验的平均数

进一步地，含有补充的Gamborg B5的特定培养基成分与设计一次性生物反应器的组合诱导细胞产生比在IM1培养基和搅动玻璃生物反应器中产生的水平高10-12倍的白藜芦醇，及在一次性生物反应器中在IM1培养基中生长的细胞高4倍(表7)。

这些结果显示生物反应器类型和培养基成分均为维持在20L或更大生物反应器中产生的RGC中白藜芦醇的高水平所必需。

实施例3：成分

红葡萄和紫葡萄均含有有效的多酚、抗氧化剂和白藜芦醇，其有助于防止动脉狭窄和硬化。越来越多的研究表明在红葡萄和紫葡萄中及最后在红葡萄酒中发现的白藜芦醇影响机体的重要代谢途径及可有益于健康。然而，其确实具有非常高的糖含量，因此应适度摄食。

在大规模一次性生物反应器中生长的红葡萄细胞的成分是独特的。

除了糖和白藜芦醇水平之外，所述红葡萄细胞的化学成分与使用标准农业实践生长的葡萄相当。

实验8：与在葡萄园中生长的红葡萄相比在大规模一次性生物反应器中生长的红葡萄细胞中的总糖、葡萄糖和果糖水平较低

如实施例1阶段3和4所述在大规模一次性生物反应器中在补充的Gamborg B5中生长的红葡萄细胞中的总糖、葡萄糖和果糖的量与通过农业方式生长的不同类型红葡萄的这些糖的水平相比低25-50倍(表8)。

表8；在大规模一次性生物反应器中生长的红葡萄细胞与农业生产的红葡萄细胞之间糖水平对比(鲜重)(gr/100gr)

A.

B.

样品1-农业餐桌红葡萄(以色列)-用于食用的红葡萄

样品2-酿酒红葡萄1(以色列)Cabernet-用于制成葡萄酒的红葡萄

样品3-酿酒红葡萄2(以色列)Cabernet-用于制成葡萄酒的红葡萄

样品4-酿酒红葡萄1(南非)Cabernet-用于制成葡萄酒的红葡萄

实验9:在大规模一次性生物反应器中生长的红葡萄的总多酚和白藜芦醇成分的水平

除了白藜芦醇之外，所述红葡萄细胞中总多酚的水平与田间生长的红葡萄中的量相似，前者比后者中白藜芦醇的水平高40-800倍(表9和10)。如实施例1阶段3和4描述的大规模一次性生物反应器中生长的5个批次的红葡萄细胞中的白藜芦醇的范围是726-916mg/kg鲜重，相比之下农业生产的红葡萄中为0-42.5mg/kg(表9)。在干燥之后红葡萄细胞干粉中白藜芦醇水平为6000-31000mg/kg粉末(表10)。

方法：使用HPLC结合在280、520和306nm的UV/VIS检测分析红葡萄细胞中多酚和白藜芦醇的水平。

表9：红葡萄细胞和农业生产红葡萄中酚含量成分(mg/kg鲜重)

ND-未检测到；NT-未测试

样品1-农业餐桌红葡萄(以色列)-用于食用的红葡萄

样品2-酿酒红葡萄1(以色列)Cabernet-用于制成葡萄酒的红葡萄

样品3-酿酒红葡萄2(以色列)Cabernet-用于制成葡萄酒的红葡萄

样品4-酿酒红葡萄1+酿酒红葡萄2(以色列)Cabernet-用于制成葡萄酒的红葡萄

样品5-酿酒红葡萄1(南非)Cabernet-用于制成葡萄酒的红葡萄

表10：红葡萄细胞中白藜芦醇和总多酚化合物含量

(结果为gr/kg干粉)

实施例4：培养的葡萄细胞在体内角叉菜胶诱导的足水肿大鼠模型中的作用

本项研究的目的在于评估根据本发明的大规模生产方法产生的RGC(红葡萄细胞)在大鼠急性炎症模型中的体内抗炎活性，以证实根据本发明产生的细胞的效力。最广泛用于研究急性炎症的实验模型之一基于足底内施用角叉菜胶。

该研究通过两种方法评定RGC的效力：

1.足体积测量

2.自由活动的大鼠中炎性疼痛

材料和方法：

根据实施例1制备的红葡萄细胞(RGC)

在注射角叉菜胶之前2小时，将RGC作为在无菌饮用水中的悬浮液以 400mg/kg体重(2ml/40mg)的剂量口服。

RGC组合物：给每只大鼠注射的多酚和白藜芦醇的量分别为14和4.8mg(3.5mg多酚每100mg RGC，以及1.2mg白藜芦醇每100mg RGC)。

角叉菜胶诱导的大鼠足水肿：将大鼠分为3组，每组8只大鼠。所有组的大鼠均在左后足足底注射1％角叉菜胶(0.1mg/足)或无菌盐水(0.9％NaCl)。

进行如下检测：

足体积测量

·在注射角叉菜胶之前0及在注射后1、2、4小时用测径器按小时测量注射角叉菜胶的足体积。

·以两个轴测量足直径并计算足体积。在这个模型中的足水肿是炎症严重度的指征。

·对于每个时间点，通过减去基线足体积或者与基线足体积的百分比计算足体积的变化。

在自由行动的大鼠中测量炎性疼痛的热板方法

使用热板方法确定自由行动的大鼠中的炎性疼痛。在诱导水肿并用运载体、吲哚美辛或RGC制备物处理后，将大鼠置于维持55±0.5℃温度的热板上。轻拂或舔舐后足或者从热板上跳起的延时与其基线对比，作为反应时间。反应时间标示为在注射后1、2和4小时。在无反应的情况中，使用30秒截止值以防止组织损害。

组分配：

运载体对照组(1M)：对照大鼠在注射角叉菜胶之前2小时接受无菌饮用水(运载体)。

阳性对照组(“2M”)：阳性对照组的大鼠在注射角叉菜胶之前2小时接受2mg/kg体重的吲哚美辛。

测试组(“3M”)：在注射角叉菜胶之前2小时给大鼠口服施用在无菌饮用水中的悬浮液400mg/kg体重剂量的RGC(2ml/40mg RGC)。

结果

足水肿:

图1显示用RGC制备物、作为对照的吲哚美辛和水处理的大鼠的足水肿(体积％)的结果。使用重复测量的双向ANOVA及随后的Bonferroni事后 检定进行统计学分析。对照组(1M)与阳性对照组(2M)的对比在2和4小时显示统计学显著差异(p<0.001)。对照组与RGC制备物(3M)组的对比在2和4小时显示统计学显著差异(p<0.001)。

如图1所示，当用RGC制备物处理大鼠时，在1或2小时后足水肿降低至少为阳性对照的水平。此外，在4小时后，用RGC制备物处理的大鼠表明足水肿降低甚至比对照组还低。

炎性疼痛

图2显示在用RGC制备物、用作对照的吲哚美辛和水处理后每组的痛觉过敏作用。使用重复测量的双向ANOVA及随后事后检定进行统计学分析。对照组1M与阳性对照组2M的对比在2和4小时显示统计学显著差异(p<0.05-0.01)。对照组与RGC(3M)对比在4小时显示统计学显著差异(p<0.01)。

如在图2中可见，在注射角叉菜胶2和4小时后，运载体处理的对照组(1M)(接受无菌饮用水)显示对热刺激的反馈时间δ(时间)显著增加。这通过这组中大鼠的足底热刺激反应性降低表明。

如在图3中可见，在注射角叉菜胶后2和4小时，与运载体对照组相比阳性对照组(吲哚美辛处理的大鼠，2M)显示对热刺激的反应延时δ显著降低。

RGC处理的大鼠(3M)显示在注射角叉菜胶4小时后对热刺激的反应延时δ降低，与运载体处理的对照组相比有统计学显著性。

综上所述，这个实施例的结果表明与角叉菜胶诱导的大鼠后足炎症相关的足水肿和行为痛觉过敏通过口服根据实施例1所述方法制备的RGC而显著减弱，表示甚至在大规模方法中制备的RGC制备物的抗炎作用。这与Gentilli等(2001)描述的使用相同的角叉菜胶诱导的痛觉过敏模型的研究不同。该研究显示，在角叉菜胶注射到足里之前给大鼠施用的高浓度的白藜芦醇(50mg/kg体重，与本研究中所使用的等价于6mg/kg体重不同)没有降低足水肿。

实施例5：

动物测试

从Harlan Laboratories Ltd.,Jerusalem,Israel获得40只Sprague-Dawley(SD)雄性大鼠，体重250±25克。所述大鼠养殖于位于动物房中的普通笼子内，22℃，14小时光照/10小时黑暗的周期。所述大鼠维持标准的大鼠饮食，并给予自来水随意饮用，进行为期5天的适应环境期。适应环境期之后，所述大鼠换为由21％蛋白质、5％脂肪、60％碳水化合物、0.49％钠和0.49％钾组成的富含果糖的饮食(Teklad-Harlan,Madison,USA)，并分为四组(每组10只大鼠)。

所有SD大鼠饲喂高果糖饮食五周。对于部分大鼠(30只大鼠)，在饲喂高果糖饮食三周后，向大鼠饮食直接添加不同剂量(200、400和800mg/Kg/天)的RGC。

在基线和饮食三周和五周后测量体重、收缩血压、血浆甘油三酯、胰岛素和脂联素水平，第一和第二次测量是在给30只大鼠补充RGC之前，而第三次测量是五周后，即在补充RGC时期的两周后。在研究开始及饮食三周和五周后，20只大鼠(对照组的10只大鼠和补充400mg RGC的10只大鼠)养殖于代谢笼，以分析尿钠排泄。

血压测量

通过间接尾袖套法测量收缩血压(BP)，使用电子血压计和气动脉搏传感器(58500BP Recorder,UGO BASILE,Varese,Italy)。当所述大鼠固定在普通温度的大鼠夹时进行所述测量。5次连续读数的平均值用于确定收缩BP。

实验室测量

在指示的时间点(第一和第二次测量是在给30只大鼠补充RGC之前，而第三次测量是起始点五周后，即在补充RGC时期的两周后)饥饿五小时后，在用异氟烷轻微麻醉下，通过眼窝后静脉窦穿刺从所有大鼠采集血液样品。

在存在EDTA的情况下收集用于血浆的血液，以防止凝血，并将血液保持于冰上。离心后，分离血浆并在-80℃冷冻直至进一步分析。用酶比色反应自动分析仪(Olympus AU2700,Hamburg,Germany)测定甘油三酯水平。用I-125RIA试剂盒(INSIK-5,Diasorin,USA)评估血浆胰岛素。用脂联素RIA试剂盒(Cat.#MADP-60HK来自Linco Research Inc.,St.Charles,MO)测量总血浆脂联素浓度。用自动分析仪(Olympus An 2700；OlympusDiagnostics,Hamburg,Germany)测量尿钠排泄速率。

结果

RGC对血压、血浆甘油三酯、胰岛素、脂联素和钠排泄的作用

用高果糖饮食饲喂的大鼠补充或不补充RGC体重增加是相似的(表11)。高果糖饮食诱导了显著的血压、血浆甘油三酯、胰岛素和脂联素水平(图5，表4)。在高果糖饮食五周后，收缩BP升高19.1±1.1mm Hg(p<0.001)，从137mm Hg到156mm Hg。补充RGC减少了由高果糖饮食诱导的BP升高，在接受200mg/Kg/天的RGC的第一组中从161±4.5到151±3.6mmHg，在接受400mg/Kg/天的RGC的第二组中从162±5到152±3mmHg以及在接受800mg/Kg/天的RGC的第三组中从162±2.8到150±1.8mm Hg(p<0.05)。补充RGC减少了血浆中的甘油三酯的水平，在接受200mg/Kg/天的RGC的第一组中从234±14到171±12mg/dL，在接受400mg/Kg/天的RGC的第二组中从235±12到167±24mg/dL，在接受800mg/Kg/天的RGC的第三组中从219±31到142±21mg/dL。RGC减少了由高果糖饮食诱导的血浆胰岛素水平，在以200、400和800mg/Kg/天剂量的RGC处理的大鼠组中，从对照组(富含果糖饮食)的±43.5mg/dL分别到33.9±2.6、34.4±3.8和31.6±2.9mg/dL。

如以下数据显示，RGC对脂联素水平没有一致的作用，对照组中脂联素水平5.8±0.3，与之相比，在以200、400和800mg/Kg/天剂量的RGC处理的大鼠组中，分别为6.0+0.4,4.5±0.2和5.4±0.5。

在补充或不补充RGC的大鼠中，基线尿钠排泄是相同的(分别为0.5±0.1和0.7±0.2mmol/天，p＝0.43)。在高果糖饮食三周后，尿钠排泄显著升高，并在补充RGC后保持不变(三周后，补充或不补充RGC的大鼠中分别为3.5±0.2和2.3±0.3mmol/天，都是p<0.05；而五周后，分别为3.1±0.2and 1.8±0.3mmol/天，组间p＝0.4)。

表11：所研究的组中的体重、甘油三酯、胰岛素和脂联素水平

*p<0.05vs.基线，#p<0.05vs.富含果糖饮食

实施例6：RGC-RES的化学性质(与其它来源的RES相比)及RGC-RES的人体生物利用度性质

材料和方法

红葡萄细胞(RGC)根据实施例1所述制备。RGC的白藜芦醇(RES)含量通过HPLC在306nm针对合成的RES标定曲线确定。

RGC-RES的LC/MS分析

将RGC粉末溶解于80％甲醇中。使用Accela LC系统结合装备电喷射离子源的Linear Trap Quadrupole(LTQ)Orbitrap Discovery hybrid FT质谱仪(Thermo FisherScientific Inc.)对样品进行液态层析质谱分析(LC-MS)。质谱仪以负离子化模式运行，质谱在m/z 150-2000获得。

溶解性测定

将RGC、合成的白藜芦醇(S-RES；Sigma-Aldrich)及从植物虎杖(Polygonumcapsidatum)中提取的白藜芦醇(植物-RES)溶解于80％甲醇中以实现100％溶解。然后，将所有RES来源在pH 2和pH 7均溶解于水中，在水中的溶解百分比与在甲醇中的溶解百分比对比。所有样品中的RES均在306nm基于其特征性吸光图谱监测，其浓度通过白藜芦醇分析标准的标定曲线确定。

结果

LC/MS

RGC粉末的负离子模式的质谱和代表性LC/MS层析图在图6A和6B中显示。针对RGC中白藜芦醇(m/z-227.0701-227.0737的四种衍生物检测的LC-MS分析，均显示在306nm的UV吸光度。这些衍生物中三种是反式-RES异构体的己糖苷，在4.6、5.3和6.1分钟的保留时间检测到。第四种衍生物是反式-RES，在6.9分钟的保留时间检测到(表12)。证实四种衍生物的相同性，如通过ESI质谱显示(图7)。

表12：RGC中白藜芦醇衍生物的鉴定

溶解性

将RGC-RES的溶解性与两种反式-RES产物对比：合成的RES和植物虎杖RES。所有三种所检测的产物均完全溶解于80％甲醇溶液中。然而，当这三种RES产物溶解于模拟胃pH条件的酸化水(pH＝2)以及在pH 7.0时，RGC-RES的溶解比两种其它RES的溶解高6倍，RGC-RES为44％，两种其它RES为7％(图8)。

人生物利用度研究

该研究是单一剂量随机的交叉对比性药动学研究。15个成人健康禁食男性对象接受研究产物RGC(口服剂量等价于50mg或150mg反式-RES)，间隔至少7天冲洗(washout)期)。在给药后4小时提供标准饮食。遵循以色列卫生部(MOH)的所有规章制度及根据ICHGCP指导进行研究。该方案由Soroka University Medical Center IRB许可，包括给每个患者施用一次50或150mg剂量，随后7天冲洗，第二次施用，这次与第一次不同，由此开始接受50mg的患者将接受150mg，反之亦然。在这项研究中征募15个健康非吸烟男性志愿者。志愿者资格标准包括年龄在18-55岁，BMI≥19及≤30。 要求对象在第一次给药之前7天及在整个研究期间禁食含有RES的食物、营养补充剂或饮料，及禁食所有药物包括非处方药。

样品收集和处理

将在施用前(t0)和施用后0.33、0.67、1、1.5、2、2.5、3、4、5、6、8、10和12小时的静脉血样品收集在含有K₂EDTA的试管中。将血液样品保持在冰浴中，并在黄光下立即处理。

血浆中白藜芦醇含量分析

由PRACS Institute(Toronto,Canada)进行样品制备及血浆样品中游离和总RES的LC-MS分析。血浆样品经液体-液体提取并用于LC-MS/MS系统进行分析。对于游离和总RES的较低限度定量(LLOQ)分别为0.5和20ng/mL。对于总RES分析，在LC-MS/MS分析之前进行酶促水解和蛋白质沉淀提取。

药代动力学分析

使用未分区药代动力学方法针对游离RES和总RES(游离和缀合的)计算下列药代动力学变量：最大血浆浓度(Cmax)和最大血浆浓度时间(Tmax)，在整个收集期间的平均浓度，通过梯形法的从时间(0)至最后可计量浓度(Clast,高于LOQ)的血浆浓度对时间曲线下面积(AUC)。

LDL氧化试验

LDL制备：通过不连续的密度梯度超速离心法从健康正常血脂的志愿者分离LDL。

铜离子诱导的LDL氧化：LDL(100mg蛋白质/mL)与各实验中浓度升高的葡萄粉末的乙醇提取物在室温温育10分钟。添加CuSO₄并将试管在37℃温育2小时。在温育结束后，通过测量所产生的硫代巴比妥酸反应性物质(TBARS)和脂质过氧化物的量确定LDL氧化的程度。

脂质过氧化试验：通过在532nm的硫代巴比妥酸反应性物质(TBARS)试验直接在培养基中测量LDL氧化的程度，使用丙二醛(MDA)做标准曲线。还通过脂质过氧化物测试确定脂蛋白氧化，所述测试通过脂质过氧化物将碘化物转变成碘的能力(如在365nm用分光光度计所测量的)分析脂质过氧化物形成。

结果

人口统计学和安全性:15个健康男性志愿者参与这项研究。对象年龄 范围是28-55岁(平均42.1岁)，BMI范围是21.4-30(平均25.8)。所有对象在筛选和准入时均检测对药物和乙醇是阴性的，关于实验室参数和生命体征测量无临床显著异常。在整个研究中无不利事件观测到或报道。

游离和总白藜芦醇的血浆药代动力学：总RES和游离RES的平均反式-RGC-RES血浆浓度与时间曲线在图9中显示。正如所见，在两个浓度的RGC图展示两个清晰的浓度峰，第一个峰在1小时后，第二个峰(更高)在5小时后。

t-RES的平均药代动力学参数在表12A和12B中概括。

表13A和13B：在补加RGC之后血浆药代动力学数值

A.总白藜芦醇

B.游离白藜芦醇

在前两个测量时间点0.33和0.67小时分析表明在接受RGC的对象血浆中RES的可测量数量(表14)。此外，在0.33小时时间点期间，RGC组中所有对象(除了RGC 150mg组中的一个)均具有可测量的总RES浓度(表14和15)。

表14：在前两个测量时间点血浆中具有可检测量RES(总/游离)的对象

表15：在施用后前三个测量时间点的总RES和游离RES的浓度(ng/mL)

结论

源自RGC中的RES特征在于添加一个己糖部分。尽管己糖的提取类型及其精确定位还未鉴定，但是很可能的是，RGC RES是云杉新甙-天然存在于红葡萄中的最常见类型的RES。在游离和总体形式的RES中证实的两个峰的现象是独特的及在其它类型RES中未观测到。可能RGC RES中糖苷基团的存在使其更可溶，这可以在溶解性检测中观测到，其中RGC-RES与合成的和植物衍生的RES相比更溶于水。这种独特的两个浓度峰的模式也可归因于RGC的独特成分及之间的协同，所述RGC含有完全的红葡萄基质和高水平的糖苷白藜芦醇。发现这种性状在高浓度RES存在的情况下以高速率表现，快达施用后20分钟。

如在浓度/时间曲线(图9A)中清晰可见的，RGC-RES在1和5小时出现两个非常明显的浓度峰。

重要地，合成的或酵母发酵来源的RES(Poulsen,et al.,2013)以及植物来源的RES(Amiot,et al.,2013)的浓度时间曲线显示明显的单一浓度峰。这显示一天补充一次RGC对于延长作用是足够的，而在其它产物中，可需要多于一次的补充或者每天更高水平以达到相同作用。

实施例7：临床研究-RGC粉末对患有高血压前期或轻微高血压的人中的血压、血管功能和血浆氧化参数的作用

进行随机、双盲、安慰剂对照的研究。登记合格的对象并将其分为三个治疗方案，接受200mg RGC粉末或400mg RGC粉末或安慰剂。所治疗的对象不同时摄取其他相关的药物。临床试用的产品或安慰剂每天摄取一次，共12周。在所施用的剂量中的白藜芦醇和总多酚的量在下表16中显示。

表16：RGC中的白藜芦醇和总多酚水平

结果

55个对象中的46个(92％)完成了研究。在所有处理组中基线标准是相当的。200mg组与其它两个处理组相比具有更高的BMI。研究人群的平均年龄是57.5±7.2岁(范围：41.7–70.0岁)。

安全性

用RGC治疗是安全且耐受良好的。一起严重的不良事件是烧心转变为胸部疼痛，在第二天同时解决了，并且被认为是中度的SAE，不太可能与研究的产品有关。所有其它的不良事件是轻微或中度的，并且不被认为与研究的产品有关。在研究过程中没有出现临床显著的至关重要的标志或实验室值的变化。

效力

表17：比较RGC对所有补充12周的测量结果的作用

*括号中的数字代表“N”，是所测试的对象的数量。

血压(BP)

在RGC 200mg组中，舒张BP降低-4.18±8.96mm Hg。不同组间的比较显示，这一变化与安慰剂组具有统计学显著地差异(表17，p＝0.0320)。

在RGC 200mg组中，观察到在基线和治疗结束时收缩BP的细小变化(表17)。

血浆氧化参数

如表17所示，用RGC 400mg治疗使脂质过氧化物值在基线和治疗结束之间显著降低了31.4±56.0(nmol/ml)。在200mg治疗组中还观察到30.0±48.2(nmol/ml)的脂质过氧化物值降低。

当将来自两个RGC治疗组的脂质过氧化物值结合而得到更大的样品量时，平均脂质过氧化物值降低31.0±52.3nmole/ml(图10，p＝0.013)。

通过流量介导的扩张(FMD)测量的血管功能

通过FMD在来自200mg组的六个对象、来自400mg组的八个对象和解释安慰剂的九个对象中测量血管功能。在RGC 400mg组中在基线与治疗结束之间观察到FMD的2.14±1.82mm Hg的统计学显著性增加(表17，p＝0.013)。通过给上臂上的血压袖套充气到200mmHg 5分钟然后在松释所述袖套后60、90和120秒超声测量动脉扩张来进行FMD。

与来自200mg治疗组的六个对象中的两个(33.3％)和接受安慰剂的九个对象中的两个(22.2％)相比，来自400mg治疗组的所有八个对象经历阳性的相对变化(FMD>70％)(图11)。400mg治疗组中所观察到的改进率与200mg组和安慰剂组所观察到的具有统计学显著性差异(对于400mg vs200mg，p＝0.015，而对于400mg vs安慰剂，p＝0.0023)。

本文显示的结果表明，每天摄取RGC粉末改进FMD并且可以改进轻微高血压对象中的氧化胁迫。RGC还可以未受医学治疗的具有中度高血压的对象中的降低舒张和收缩血压。

实施例8：随机、双盲、安慰剂对照的红葡萄细胞(RGC)粉末摄取对健康的适度训练的自行车运动员的量度的作用的研究

实验步骤

根据实施例1制备RGC细胞培养物粉末。

在三组健康的适度训练的自行车运动员进行临床研究。15个对象接受剂量为200mg每天的RGC，并且14个对象接受剂量为1000mg每天的RGC，共六周。15个对象(对照组)接受安慰剂六周。

在摄取RGC前的基线访视，所述对象经历人体测量学检测，包括体重和身高和体脂百分比测量。然后所述对象经历使用固定的自行车测力器的心肺运动测试。所测量的参数包括静息和运动高峰期的心率和血液，以及一系列有氧健身参数。在摄取RGC或安慰剂六周后，重复精确的测量。

如表18中可见的，补充后仅在两个RGC组中发现静息舒张血压的显著的5％-6％的降低。相似地，平均静息收缩压也更低。测量舒张和收缩血压降低的对象的数量表明，与安慰剂相比，两个RGC组中这样的对象的数量将近两倍。

在运动高峰期(表19)，仅在低剂量组中在研究结束时舒张血压更低，具有边界(borderline)统计学显著性。与安慰剂组相比，在两个RGC组中，在研究结束时运动高峰期舒张血压降低的参与者的数量都要高超过三倍。对于高峰期的最大收缩血压测量观察到相似的趋势。

表18显示在基线和在研究结束时的平均静息心率和血压以及其组间差异的数据。各参数改进的参与者的比例也在括号中显示。

表19显示在基线和在研究结束时的最大有氧能力的度量以及其组间差异的数据。各参数改进的参与者的比例也在括号中显示。

虽然本发明的某些特征在本文已经例证和描述，但是本领域技术人员对本发明可以进行一些修改、取代、改变和等价处理。因此，应理解所附权利要求涵盖在本发明原理内的所有这些修改和变化。

Claims (18)

1.包含体外生长的葡萄浆果细胞的细胞系愈伤组织培养物的组合物在制备用于治疗、减轻、缓解或预防代谢综合征或代谢疾病的药物中的用途，其中所述葡萄浆果细胞的细胞系愈伤组织培养物在大规模方法中体外生长，所述大规模方法包括：

使果实细胞在瓶中生长；

将果实细胞从所述瓶接种到第一生物反应器中；

将果实细胞从所述第一生物反应器接种到另一个生物反应器中，其中所述另一生物反应器是最后的生物反应器或者是中间生物反应器，且其中所述第一生物反应器和另一个生物反应器的至少一个是一次性的；及

从最后的生物反应器收获果实细胞；

其中使从最后的生物反应器收获的果实细胞干燥，其中所述果实细胞在补充有KNO₃、MgSO₄、MgNO₃或NaH₂PO₄、糖和酪蛋白水解物或者其组合的Gamborg B5培养基中生长，其中加入Gamborg B5中的KNO₃的浓度为15mM-60mM；加入B5Gamborg中的MgSO₄浓度为0.5mM-25mM；加入B5 Gamborg中的MgNO₃浓度为1mM-50mM；且加入B5 Gamborg中的NaH₂PO₄浓度为1-3mM。

2.权利要求1的用途，其中所述代谢综合征或代谢疾病与选自如下的一或多种病症相关：

慢性肾病(CKD)和肾脏疾病、系统性硬化、高血压、高脂血症、糖耐量异常、肝性脂肪变性、高血糖症、糖尿病前状态、胰岛素抗性、糖尿病、空腹血糖异常、高甘油三酯血症、抗炎症、高胆固醇血症、低HDL水平、脂肪肝和肥胖症。

3.权利要求2的用途，其中所述糖尿病是新发糖尿病。

4.权利要求1的用途，其中所述组合物是营养组合物。

5.权利要求1的用途，其中所述药物的形式选自漱口水、粉末、条、泡沫、口香糖、口腔喷雾剂、锭剂、胶囊、牙膏、饮食补剂、食品成分和食品以及饮料。

6.用于治疗、减轻、缓解或预防炎症的包含果实细胞的细胞系愈伤组织培养物的组合物，所述果实细胞是根据包括如下步骤的方法制备的：

使果实细胞在瓶中生长；

将果实细胞从所述瓶接种到第一生物反应器中；

将果实细胞从所述第一生物反应器接种到另一个生物反应器中，其中所述另一生物反应器是最后的生物反应器或者是中间生物反应器，且其中所述第一生物反应器和另一个生物反应器的至少一个是一次性的；及

从最后的生物反应器收获果实细胞；

其中使从最后的生物反应器收获的果实细胞干燥，且其中所述果实细胞在补充有KNO₃、MgSO₄、MgNO₃或NaH₂PO₄、糖和酪蛋白水解物或者其组合的Gamborg B5培养基中生长，其中加入Gamborg B5中的KNO₃的浓度为15mM-60mM；加入B5 Gamborg中的MgSO₄浓度为0.5mM-25mM；加入B5 Gamborg中的MgNO₃浓度为1mM-50mM；且加入B5 Gamborg中的NaH₂PO₄浓度为1-3mM。

7.权利要求1的用途，其中所述药物为每天施用一次而设计。

8.粉末形式的组合物，其包含大规模方法中体外生长的葡萄浆果细胞的细胞系愈伤组织培养物，其中所述葡萄浆果细胞的细胞系愈伤组织培养物源自葡萄浆果横切片、葡萄浆果皮、葡萄浆果肉、葡萄种子、葡萄有种子或无种子栽培种的胚或葡萄种皮中的一或多种；其中所述葡萄浆果细胞的细胞系愈伤组织培养物包含配糖体白藜芦醇(白藜芦醇苷)的量为至少1000mg/kg粉末，其中所述组合物根据如下方法制备：

使果实细胞在瓶中生长；

将果实细胞从所述瓶接种到第一生物反应器中；

将果实细胞从所述第一生物反应器接种到另一个生物反应器中，其中所述另一生物反应器是最后的生物反应器或者是中间生物反应器，且其中所述第一生物反应器和另一个生物反应器的至少一个是一次性的；及

从最后的生物反应器收获果实细胞；

其中使从最后的生物反应器收获的果实细胞干燥，且其中所述果实细胞在补充有KNO₃、MgSO₄、MgNO₃或NaH₂PO₄、糖和酪蛋白水解物或者其组合的Gamborg B5培养基中生长，其中加入Gamborg B5中的KNO₃的浓度为15mM-60mM；加入B5 Gamborg中的MgSO₄浓度为0.5mM-25mM；加入B5 Gamborg中的MgNO₃浓度为1mM-50mM；且加入B5 Gamborg中的NaH₂PO₄浓度为1-3mM。

9.权利要求8的组合物，其特征在于在施用一次所述组合物后血浆中配糖体白藜芦醇(白藜芦醇苷)的浓度的两个峰。

10.降低对象中的血压的包含在大规模方法中体外生长的果实细胞的细胞系愈伤组织培养物的组合物，其中所述组合物根据如下方法制备：

使果实细胞在瓶中生长；

将果实细胞从所述瓶接种到第一生物反应器中；

将果实细胞从所述第一生物反应器接种到另一个生物反应器中，其中所述另一生物反应器是最后的生物反应器或者是中间生物反应器，且其中所述第一生物反应器和另一个生物反应器的至少一个是一次性的；及

从最后的生物反应器收获果实细胞；

其中使从最后的生物反应器收获的果实细胞干燥，且其中所述果实细胞在补充有KNO₃、MgSO₄、MgNO₃或NaH₂PO₄、蔗糖/糖和酪蛋白水解物或者其组合的Gamborg B5培养基中生长，其中加入Gamborg B5中的KNO₃的浓度为15mM-60mM；加入B5Gamborg中的MgSO₄浓度为0.5mM-25mM；加入B5 Gamborg中的MgNO₃浓度为1mM-50mM；且加入B5 Gamborg中的NaH₂PO₄浓度为1-3mM。

11.权利要求10的组合物，其中所述对象是轻微高血压和/或高血压前期的对象，并且其中所述降低血压是通过改进至少70％的血管功能进行的，所述血管功能是通过流量介导的扩张(FMD)测量的。

12.权利要求8的组合物，其中所述配糖体白藜芦醇溶解性比合成的白藜芦醇高至少六倍。

13.权利要求1的用途，其中所述生物反应器包括进口、出口和气体出口，通过所述进口将来自第一步骤的果实细胞、培养基和任何其它物质置于生物反应器中，所述出口用于排出任何希望的物质，所述气体出口设计为释放生物反应器中过量的气体。

14.权利要求1的用途，其中所述糖是蔗糖，且加入B5 Gamborg中的蔗糖的浓度是2-6％。

15.权利要求14的用途，其中添加的蔗糖的浓度是2-4％。

16.权利要求6、8和10任一项的组合物，其中所述生物反应器包括进口、出口和气体出口，通过所述进口将来自第一步骤的果实细胞、培养基和任何其它物质置于生物反应器中，所述出口用于排出任何希望的物质，所述气体出口设计为释放生物反应器中过量的气体。

17.权利要求6、8和10任一项的组合物，其中所述糖是蔗糖，且加入B5 Gamborg中的蔗糖的浓度是2-6％。

18.权利要求17的组合物，其中添加的蔗糖的浓度是2-4％。