CN105062992A - 一种细胞内溶素和编码此细胞内溶素的多核苷酸 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种细胞内溶素及编码该蛋白的基因，该具有胞壁质水解活性的细胞内溶素编码基因序列如SEQ？ID？NO：1所示，其氨基酸序列如SEQ？ID？NO：2所示；通过构建重组载体并在大肠杆菌中表达表达产物具有胞壁质水解功能，本发明的细胞内溶素可作为对抗蜡样芽孢杆菌致病性的良好材料。

Description

一种细胞内溶素和编码此细胞内溶素的多核苷酸

技术领域

本发明涉及生物化学及分子生物学研究，用于治疗或预防革兰氏阳性细菌感染、作为诊断手段等疾病治疗领域，及食品加工处理过程，医疗设备表面的细菌污染等，具体涉及一种革兰氏阳性菌细胞内溶素蛋白，编码该蛋白的基因、含有其编码基因的重组载体、基因工程菌及其应用。

背景技术

蜡样芽孢杆菌是需氧型、β溶血性革兰氏阳性菌，能形成芽孢抵抗强酸、强碱、高氧、低氧等极端环境。其分布较为广泛，土壤、空气、肠道和许多事物上都能分离得到。一部分属于益生菌，具有一定的经济价值，可产生抗菌物质以改善生态环境，还可用于明胶液化，牛奶解冻，水解淀粉等。少数属于机会致病菌，可引起食物中毒，眼内炎等疾病。芽孢杆菌噬菌体是以蜡样芽孢杆菌为宿主的病毒，在生物发酵、农业生产和生态循环上是一把双刃剑，既有潜在的应用价值，少部分又有摧毁性的损害。

细胞内溶素是噬菌体在侵染细菌时裂解期合成的，作用于细胞壁肽聚糖并能破坏肽聚糖层，具有胞壁质水解活性的蛋白。革兰氏阳性菌噬菌体的细胞内溶素蛋白通常由两个功能结构域构成：氮末端催化结构域和碳末端细胞壁结合结构域。根据酶的作用位点专一性，可将细胞内溶素蛋白划分为四类：（1）氮-乙酰胞壁质酶（溶菌酶或胞壁质酶），作用于氮-乙酰胞壁酸和氮-乙酰-D-葡糖胺之间的β-1,4-糖苷键；（2）内切-β-氮-乙酰氨基葡萄糖苷酶（氨基葡糖苷酶），切割肽聚糖中的糖基；（3）氮-乙酰胞壁酰-L-丙氨酸酰胺酶（NAM-酰胺酶），切割氮-乙酰胞壁酸和L-丙氨酸之间的酰胺键；（4）内肽酶，切割肽链之间的连接。细胞内溶素可作为生物抗菌剂，具有很低的细菌抗性发生率；菌种特异性的裂解活性，不会影响宿主周围其它菌种；同时有很高的酶活性，使得细胞可在数分钟甚至在数秒内被裂解。

荷兰Micreos公司改造的细胞内溶素可有效的杀灭耐药性葡萄球菌，PritchardDG，CeliaLK，ShuklaSK，等的实验证明，噬菌体细胞内溶素能快速溶解多种奶牛乳房炎环境致病菌，在未来几年细胞内溶素可能作为主要成分运用到抗菌喷雾剂，漱口剂，栓剂及滴眼液中。蜡样芽孢杆菌噬菌体细胞内溶素也可能有相似的运用前景，可用于防治蜡样芽孢杆菌引起的感性染性眼内炎和食物中毒；也可用作为化妆物质或消毒剂，用来处理或防止食品、食品加工设备，餐具等表面的细菌污染；此外，还可能作为刺参培育中蜡样芽孢杆菌引起的腐皮综合征专一性抑菌剂。

发明内容

本发明的目的旨在提供一种从蜡样芽孢杆菌噬菌体VMY22中克隆得到的细胞内溶素（Endolysin）基因，该基因核苷酸序列或核苷酸序列的片段如SEQIDNO：1所示，或与SEQIDNO：1互补的核苷酸序列，该基因序列长度为738bp（碱基）。

本发明的核苷酸序列是DNA形式的，包括cDNA、基因组DNA或人工合成的DNA，可以是单链的或是双链的。由于核苷酸序列的特殊性，任何与SEQIDNO：1所示的核苷酸序列具有80%以上同源性且具有相同功能的多核苷酸变体，均在本发明的保护范围之内。所述多核苷酸变体是指一种具有一个或多个核苷酸改变的多核苷酸序列，可以使用本领域所熟知的取代、缺失或插入变异来获得。

本发明中的细胞内溶素基因编码的氨基酸序列是具有SEQIDNO：2所示的氨基酸残基序列的多肽或蛋白质。由于氨基酸序列的特殊性，只要是含有SEQIDNO：2所示氨基酸序列的多肽片段或其变体，如其保守性变体、生物活性片段或衍生物与SEQIDNO：2所示的氨基酸残基序列具有90%以上同源性且具有相同活性的蛋白质，均在本发明的保护范围之内。这些方法包括氨基酸序列中氨基酸残基的缺失、插入、化学修饰或替换，所述蛋白可以是重组蛋白、天然蛋白或合成蛋白。

本发明的另一目是提供一种含有细胞内溶素基因的重组表达载体，是将SEQIDNO：1所示基因直接与不同表达载体连接所构建的重组载体。

本发明中，编码细胞内溶素的多核苷酸序列可以插入到载体中，以构成含有本发明所述的重组载体，载体是指本领域所熟知的质粒、病毒或其他载体，建议优选pET载体系列及其他原核表达载体。可用本领域技术人员熟知的方法来构建含编码细胞内溶素的核苷酸序列和合适的转录/翻译调控元件的表达载体。这些方法包括体外重组DNA技术、DNA合成技术、体内重组技术等。所述编码细胞内溶素的核苷酸序列可以有效连接到表达载体中的适当启动子上，以指导mRNA的合成。这些启动子的代表性例子有：大肠杆菌的lac或trp启动子；λ噬菌体的PL启动子；真核启动子包括CMV早期启动子、HSV胸苷激酶启动子、早期和晚期SV40启动子、反转录病毒的LTRs和其它一些已知的可控制基因在原核细胞或真核细胞或其病毒中表达的启动子。表达载体还包括翻译起始用的核糖体结合位点和转录终止子等。在载体中插入增强子序列将会使其在高等真核细胞中的转录得到增强。增强子是DNA表达的顺式作用因子，通常大约有10-300bp，作用于启动子以增强基因的转录，如腺病毒增强子。

本发明中，编码细胞内溶素蛋白的多核苷酸或含有该多核苷酸的重组载体可以用本领域的技术人员熟知的方法转化或者导入到宿主细胞中，该细胞可以是细菌细胞、真菌细胞、植物细胞或动物细胞，或这些宿主细胞的后代，代表性例子有：大肠杆菌；真菌细胞或酵母；植物细胞如油菜、烟草、大豆；昆虫细胞如果蝇S2或Sf9；动物细胞如CHO、COS或Bowes黑色素瘤细胞等。

本发明还涉及所述编码基因在制备重组细胞内溶素蛋白中的应用，通过常规的重组DNA技术，利用本发明的多核苷酸序列可以构建表达或生产重组的细胞内溶素。一般来说可以通过以下步骤实现：构建重组载体，转化入宿主细胞构建重组细胞，在合适的培养基中培养宿主细胞，从培养基或细胞中分析、纯化蛋白。

芽孢杆菌噬菌体分布广泛，但是只有一小部分分离到的噬菌体能侵染蜡样芽孢杆菌，因此从中克隆纯化得到的Endolysin蛋白显得尤其重要且珍贵。本发明涉及所述多肽及其衍生物与已报道的勒芬天主教大学的新的细胞内溶素相比具有更高的专一性，易于得到，制剂效率高，经济实惠。

附图说明

图1是本发明构建的大肠杆菌BL21(DE3)表达载体endolysin-pET-28a示意图；

图2是本发明重组质粒双酶切琼脂糖电泳图；其中M为DNAmarker；1、2、3为都为重组质粒双酶切；

图3是本发明SDS-PAGE检测诱导效果示意图，图中M是marker，泳道1是未加诱导剂对照；第2-6条泳道分别为诱导3h、5h、7h、9h和过夜；

图4是本发明中用不同浓度咪唑洗脱蛋白后SDS-PAGE检测结果示意图，图中M是marker，泳道1为蛋白透过液；第2-5分别为：80mM、100mM、150mM、200mM咪唑洗脱液；

图5是本发明中以MYB41-22为底物时，不同温度下酶的活性示意图；

图6是本发明中以MYB41-22为底物时，细胞内溶素蛋白温度耐受性结果示意图。

具体实施方式

下面结合附图，用实施例来进一步说明本发明的实质性内容，但并不以此来限定本发明。实施例中使用的试剂和仪器，如无特殊说明，均为常规试剂和常规方法。

实施例1：从蜡样芽孢杆菌噬菌体VMY22中扩增得到的细胞内溶素（Endolysin）的核苷酸序列。用试剂盒提取提取噬菌体VMY22基因组DNA，取1μl为模板进行聚合酶链式反应（PCR），根据VMY22基因组测序结果及已发表的细胞内溶素同源序列的保守区，结合所用载体设计引物（引物F和引物R），在此PCR反应过程中所用引物、组分和扩增条件如下：

引物F：CATGCCATGGGCAAAGCTAGAGACATGAGT

引物R：CCGCTCGAGGTATTTAAATGAACCCCACG；

PCR扩增体系组成如下：

；

扩增条件：94℃预变性5min，94℃变性1min，55.5℃退火1min，72℃延伸2min，72℃补齐末端10min，变性、退火、延伸三步进行30个循环。PCR扩增结束后用琼脂糖凝胶电泳检测，结果显示，得到了大小约750bp的片段，用多功能DNA纯化回收试剂盒（离心柱型）（天根生化科技有限公司）回收，把回收片段亚克隆到pMD-18T（TaKaRa公司产品）中，连接产物转化到用化学法处理的大肠杆菌DH5α感受态细胞中，涂布于含氨苄青霉素（100μg/ml）的LB固体平板上进行培养，挑取平板上生长的单克隆菌落，通过菌落PCR验证阳性克隆，将验证为阳性的单克隆接入到LB液体培养基（加入100μg/ml氨苄青霉素），37℃过夜培养后分装（700μl菌液+300μl50%灭菌甘油，甘油终浓度为15%），-20℃保存后送昆明硕阳公司测序，同时用高纯质粒小量提取试剂盒（离心柱型）（北京百泰克生物技术有限公司）提取质粒。截取所有测序结果中endolysin序列，在MegAlign软件中与蜡样芽孢杆菌噬菌体MYBP41-22中endolysin序列进行同源比对，同时将核苷酸序列均翻译成氨基酸序列，再次进行比对。测序结果显示endolysin能完全正确的编码Endolysin蛋白。

实施例2：重组表达载体的构建

实施例1中扩增得到的片段，因其引物5’端下划线部分分别含有NcoI和XhoI酶切位点，所以使用这两个酶对片段进行双酶切，同时将pET28a用相同的酶进行双酶切，电泳回收酶切大片段，并用SolutionI在16℃连接12h，连接产物用化学转化法转化入大肠杆菌BL21(DE3)中，在含卡那霉素（100μg/ml）的LB固体平板上进行培养，挑取平板上生长的单克隆，通过菌落PCR和提取质粒单、双酶切筛选到阳性克隆并测序鉴定，成功构建含有endolysin基因的大肠杆菌宿主细胞（图1、2）。

实施例3：Endolysin目的蛋白在大肠杆菌BL21中的诱导表达

将实施例2中得到的重组工程菌按1%接种量接到50mlLB液体培养基（含Kana抗生素，终浓度为100mg/L），37℃，150rpm培养到OD₆₀₀=1.5，取样1ml作为SDS-PAGE中的诱导前样品，余样加入1‰的1mmol/lIPTG（异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷），转到28℃培养箱中静置培养5小时，离心收集菌体，将菌体用80μl灭菌ddH₂O悬浮细胞，然后加入20μl5×上样缓冲液(稀释为1×上样缓冲液)，沸水浴中裂解15min作为样品。分别取诱导前和诱导后样品20μl进行SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE），目的条带出现在诱导后的样品中，说明目的蛋白诱导表达成功（见图3）。

实施例4：Endolysin蛋白的纯化以及蛋白酶活检测

将过夜培养的含有重组质粒的大肠杆菌BL21以1%接种量接种至500mlLB液体培养基，诱导条件同实施例3。诱导菌液离心弃上清，用10ml磷酸缓冲液（50mM磷酸钾缓冲液，pH7.4）重悬菌体，超声破碎，离心取上清过膜除去细胞碎片，过镍柱使蛋白挂柱，用150mM咪唑洗脱液对Endolysin蛋白的洗脱，纯化蛋白做SDS-PAGE检测（见图4）。

酶活力单位的定义：每毫克的Endolysin蛋白每分钟内使细菌底物OD值下降0.001所需要酶量定义为1个酶活力单位；Endolysin酶的比活力则为每毫克蛋白中含有酶单位的数量（U/mg）。

酶活的测定：以溶壁微球菌为底物的酶活检测，取1.5mlOD₄₅₀值1.0以下的溶壁微球菌一管，加入150μl的磷酸钾缓冲液作为空白对照；加入150μl的空载诱导后上清液作为阴性对照；加入150μl的lysozyme标准蛋白（20ng）作为阳性对照；加入150μl4℃保存的Endolysin纯化蛋白作为样品；记录初始OD₄₅₀值，然后每隔1小时记录OD₄₅₀值。以蜡样芽孢杆菌MYB41-22、枯草芽孢杆菌、解淀粉芽孢杆菌为底物的酶活检测对照设置同上，记录初始OD₆₀₀值，分别置于4℃、15℃、37℃、42℃、55℃和70℃培养箱中反应，每隔1h后在每个温度下的反应体系中取出200μl，检测并记录OD₆₀₀值。实验结果表明，Endolysin蛋白只显示了裂解蜡样芽孢杆菌MYB41-22的活性，说明了Endolysin蛋白具有很强的底物特异性。将以MYB41-22为底物测定酶活得到的数据导入Excel表格中，以时间为横坐标，以OD值为纵坐标绘制平滑直线图。选中所有数据点，得到每条直线的斜率，选取反应温度下斜率最大的定义其为100%，其它温度下实际斜率进行转换。15℃反应条件下实际斜率最大，为0.3375，定义为100%，其它温度下实际斜率进行转换，结果如下：4℃：86.12%、15℃:100%、37℃:18.67%、42℃:12.59%、55℃:11.70%、70℃:-8.30%。以温度作为横坐标，斜率百分比作为纵坐标绘制平滑直线图（见图5）。从图可以知道15℃时斜率最高，为其最适酶活温度；4℃时仍能达到86%以上，37℃后斜率百分比较低且趋于平缓，推测此蛋白为低温蛋白。

实施例5：Endolysin蛋白的温度耐受性检测

选择MYB41-22作为底物，先将磷酸缓冲液、阴性对照上清液、Endolysin纯化蛋白在4℃、15℃、37℃、42℃、55℃和70℃下处理30min。每个相同温度下处理的磷酸缓冲液、阴性对照上清液及Endolysin纯化蛋白150μl与1.5ml底物作为一个反应体系。将所有的反应体系放在15℃反应，每隔1h检测并记录OD₆₀₀值。获得经每个温度处理后Endolysin蛋白反应体系OD₆₀₀值斜率，将斜率换算成百分数，以温度为横坐标，斜率为纵坐标绘制平滑直线图，得到Endolysin蛋白能耐受的最大温度（见图6）。由图可知，Endolysin蛋白经过低温处理后仍能保持很好的活性，但当蛋白经37℃甚至更高温度处理后，Endolysin蛋白的活性明显出现了下降，但当蛋白经55℃处理后仍能检测到活性，而经70℃处理后，Endolysin蛋白对蜡样芽孢杆菌MYB41-22几乎无活性。据此推测来自于蜡样芽孢杆菌噬菌体VMY22的Endolysin蛋白属于低温蛋白，且在实验条件下耐受的最高温度为70℃。

序列表

<110>昆明理工大学

<120>一种细胞内溶素和编码此细胞内溶素的多核苷酸

<160>4

<170>PatentInversion3.5

<210>1

<211>738

<212>DNA

<213>蜡样芽孢杆菌噬菌体VMY22

<400>1

atgaaagctagagacatgagtgtatctgataacggtgttaattttgtaaagagttttgaa60

ggttattttcaagatgcttactgggacaaatggggttctgtttggacgattggttatgga120

catacaaaaggtgttaaacgtggtgacagattagaaaatgaacgagaagcgcacaacatt180

ttaaaaagggatcttgactcacatatgattatcccgaaacaagacattacttctaatttg240

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cgtaataaccgtaatttattagatgctatcaattctagtaactggaatgaagcgtcaaga360

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gttaactacgatgcttacggaattgagcaagatggttttgtttggatacgacaaccgaga660

agtaacggttatggttatcttgcaactggtgagactagaaacggaaaacgtatagatacg720

tggggttcatttaaatag738

<210>2

<211>245

<212>PRT

<213>蜡样芽孢杆菌噬菌体VMY22

<400>2

METLysAlaArgAspMETSerValSerAspAsnGlyValAsnPheValLysSerPheGlu

11020

GlyTyrPheGlnAspAlaTyrTrpAspLysTrpGlySerValTrpThrIleGlyTyrGly

3040

HisThrLysGlyValLysArgGlyAspArgLeuGluAsnGluArgGluAlaHisAsnIle

5060

LeuLysArgAspLeuAspSerHisMETIleIleProLysGlnAspIleThrSerAsnLeu

7080

SerGlnSerGlnTyrAspAlaLeuThrSerPheAlaPheAsnLeuGlyAlaSerIlePhe

90100

ArgAsnAsnArgAsnLeuLeuAspAlaIleAsnSerSerAsnTrpAsnGluAlaSerArg

110120

IleMETLysLeuPheAsnArgAlaGlyGlyGlnValLeuProGlyLeuThrArgArgArg

130140

AsnAlaGluAlaAspMETMETLeuLysThrAspGluGlyGlnProThrAlaThrGluThr

150160

TyrAspSerSerTrpPheThrLysGluThrGlyValPheLysLeuAspSerAsnIleLys

170180

LeuArgThrAlaProPheThrGlyAlaThrValLeuAlaThrLeuProIleAspSerLeu

190200

ValAsnTyrAspAlaTyrGlyIleGluGlnAspGlyPheValTrpIleArgGlnProArg

210220

SerAsnGlyTyrGlyTyrLeuAlaThrGlyGluThrArgAsnGlyLysArgIleAspThr

230240

TrpGlySerPheLys

245

<210>3

<211>30

<212>DNA

<213>人工合成

<400>3

catgccatgggcaaagctagagacatgagt30

<210>4

<211>29

<212>DNA

<213>人工合成

<400>4

ccgctcgaggtatttaaatgaaccccacg29

Claims (4)

1.一种细胞内溶素，其氨基酸序列如SEQIDNO：2所示。

2.编码权利要求1所述细胞内溶素的基因，其特征在于：核苷酸序列如SEQIDNO：1所示。

3.一种含有权利要求2所述细胞内溶素基因的重组表达载体。

4.权利要求1所述的细胞内溶素在抑制蜡样芽孢杆菌中的应用。