CN105062906B - 一种优化有机磷水解酶酵母工程菌及其酶的生产方法 - Google Patents

Abstract

本发明提出了一种优化有机磷水解酶酵母工程菌Pichia pastorisGS115/OphcM2，其保藏号为CCTCC No:M2015140，以下简称OphcM2。将保藏号为CCTCC No:M2015140的优化有机磷水解酶酵母工程菌Pichia pastorisGS115/OphcM2进行种子培养、菌体生长阶段、碳源饲喂阶段和甲醇诱导表达阶段等四个常规发酵生产酶的步骤高密度发酵，制备生产有机磷水解酶。利用本发明能够经济方便地生产有机磷水解酶，用以有效降解有机磷农药在自然环境中的污染，保护人类生存的自然环境。

Description

一种优化有机磷水解酶酵母工程菌及其酶的生产方法

技术领域：

本发明涉及一种有机磷水解酶的重组酵母表达菌株的构建方法及该工程菌高密度的发酵方法，属于基因工程和生物技术领域。

背景技术：

有机磷农药因具有高效、低成本、杀虫广泛等特点，对农业发展和人类粮食供给做出了巨大的贡献。目前我国生产的农药中，有机磷农药占到了农药总量的70％以上，有机磷农药的大量不合理使用也使得蔬菜、粮食、瓜果等农产品以及土壤、水体中的有机磷农药残留严重超标。但由于有机磷农药具有较强的毒性，能抑制中枢神经系统中乙酰胆碱酯酶的活性，进而导致体内乙酰胆碱的大量聚集而中毒，和不易被降解等特点，农村大量使用有机磷农药的同时又带来了日益严重的环境污染与人畜健康问题，甚至对农产品出口创汇也造成了严重影响。

有机磷水解酶又称磷酸三酯酶，广泛存在于自然界中的生物体内，它可以降解包括有机磷神经毒化学战剂和一些广泛使用的农用杀虫剂在内的一大类有机磷化合物，其作用原理通常为：将有机磷农药分子中的磷酯键断裂，使有机磷农药分解为环境可以接受的低毒或无毒小分子物质，从而达到降低毒性的目的。自1973年Sethunarhan等从土壤中分离出乙基对硫磷降解Flavobacterium sp.ATCC 27551以来，农药降解菌研究的序幕被正式拉开，农药降解菌的筛选及相关基因的研究也成为了国内外科学家的主要研究方向。目前为止，人们已经筛选出的有机磷农药降解菌近百种，其中包括细菌、真菌、放线菌以及藻类等。然而，随着环境中有机磷农药释放量的日益增加，天然存在于自然界的这些有机磷农药降解菌显然已经不能满足人类的降毒要求。所以研究者们利用微生物高效表达系统(如：大肠杆菌、毕赤酵母表达系统)大量表达了有机磷水解酶，表达量相对原始菌株明显提高。但在原核表达系统中，因既不能对表达的蛋白进行翻译后的加工，也不能对表达蛋白进行糖基化修饰，所以经常导致表达的蛋白没有活性；另外，蛋白质的表达量不高，且胞内表达杂蛋白较多，不易纯化，达不到廉价大规模生产的目的，所以实用性有限。酵母具有微生物和真核生物的双重特点，它可以对体内表达的异源蛋白进行修饰，当采用酵母信号肽时，蛋白能被正确折叠和加工，然后分泌到培养基中。相对原核表达系统而言，真核酵母表达系统表达的酶表达量高且容易纯化，目前已经有多种蛋白利用酵母表达系统进行了大规模工业化生产。其中毕赤酵母表达系统是目前工业化生产蛋白酶常见的表达系统，毕赤酵母表达系统主要有以下特点：①具有强有力的乙醇氧化酶(Alochol Oxidase，AOX1)基因启动子，可严格调控外源蛋白的表达；②作为真核表达系统，可对表达的蛋白进行翻译后的加工与修饰，从而使表达出的蛋白具有生物活性；③营养要求低、生长快、培养基廉价，便于工业化生产；④可高密度发酵培养，在发酵罐中细胞干重甚至可达120g/L以上；⑤表达量高，许多蛋白可达到克级每升以上水平。初晓宇等将假单胞菌来源的有机磷水解酶基因Ophc2克隆并整合到毕赤酵母基因组中，成功实现该酶的异源表达，3L高密度发酵表达量达到5.5g/L。

随着分子生物学研究的飞速发展，各种基因工程操作技术的迅速出现，如今合成生物学已经发展成为一门热门学科，并且被应用到科研和工业生产中。Biobricks技术是近年发展出来的一种广泛应用于合成生物学中的重组DNA的方法，其实质是通过基因片段的巧妙拼接实现DNA片段重组。本发明中即采用Biobricks技术，将有机磷水解酶基因巧妙拼接，获得有机磷水解酶基因多拷贝毕赤酵母表达载体，并成功整合至酵母基因组，获得表达量达到8.1g/L的有机磷水解酶重组菌株，为工业化大规模廉价生产有机磷水解酶奠定了基础。

发明内容：

本发明的目的是首先根据酵母密码子偏爱性，人工优化合成有机磷水解酶基因(OphcM)，然后构建并筛选多拷贝有机磷水解酶基因毕赤酵母高效表达菌株，最后通过高密度发酵的方法提高单位体积的有机磷水解酶产量，降低生产成本，为该酶的大规模工业化生产奠定基础。

本发明的步骤为：

1、优化合成有机磷水解酶基因(OphcM)

将来源于Pseudomonas pseudoalcaligenes的有机磷水解酶基因Ophc2(GenebankID：AJ605330.1，其中，基因长度为906bp，编码301个氨基酸)进行改造，在不改变原氨基酸编码序列的原则下，按照酵母密码子偏爱性对其进行优化，采用套叠PCR的方法进行基因合成，优化改造的基因序列见图1，命名为OphcM。优化后的核酸序列与原始核酸序列相比，253个核酸发生改变，改造前后核苷酸序列相比，同源性为72.08％，同时为了使有机磷水解酶在毕赤酵母中高效稳定地分泌表达，优化后的有机磷水解酶基因去掉了编码5’端信号肽序列的22氨基酸(详见图2的第2至23)。

2、多拷贝有机磷水解酶毕赤酵母表达载体的构建过程

将有机磷水解酶基因OphcM两端引入酶切位点Cop Ⅰ和Not Ⅰ，并克隆到毕赤酵母高效表达载体pHBM905BDM(专利公开号CN103555749A)中，获得单拷贝表达载体BDM-OphcM-1C；然后采用传统的基因工程操作技术，分别通过限制酶EcoR Ⅰ、Xba Ⅰ、Spe Ⅰ和BamH Ⅰ的酶切，先后获得多拷贝表达载体BDM-OphcM-2C、BDM-OphcM-3C、BDM-OphcM-4C。载体构建具体过程如图4。

3、构建多拷贝有机磷水解酶基因毕赤酵母表达重组菌株

将上述多拷贝表达载体BDM-OphcM-2C、BDM-OphcM-3C、BDM-OphcM-4C采用化学转化法，分别转化到Pichia pastoris GS115Mut+中，通过在MD平板上生长，并采用菌落PCR的方法进行验证，然后摇瓶发酵，具体方法为：将转化后重组菌株接种到BMGY培养基中在28℃培养48h后，离心去上清将细胞转移到BMMY培养基中，每24h取样并用1％的甲醇进行诱导。样品离心去除沉淀，用上清跑SDS-PAGE电泳检测目的蛋白表达情况，并用上清与底物甲基对硫磷反应，检测表达产物是否有活性。通过以上筛选方法分别获得单拷贝、二拷贝、三拷贝、四拷贝的重组菌株，分别命名为Pichia pastoris OphcM1、Pichia pastoris OphcM2、Pichia pastoris OphcM3、Pichia pastoris OphcM4。

4、将筛选到的多种重组菌株，分别进行摇瓶发酵，在相同的培养条件下，保证菌体量基本一致的前提下，通过多次摇瓶试验，比较1-4拷贝的重组酵母表达量和酶活，其中，Pichia pastoris OphcM2菌株的表达量和活性最高，如图6所示。

5、将重组酵母高密度发酵，制备生产有机磷水解酶；其中包括种子培养、菌体生长阶段、碳源饲喂阶段和甲醇诱导表达阶段等四个常规发酵生产酶的步骤。

使用本发明将重组酵母Pichia pastoris OphcM2菌株在5升发酵罐发酵144小时表达量达8.1克/升，在发酵96小时，酶比活达到12.85U/mL，均明显高出目前现有技术数据。

所述Pichia pastoris OphcM2菌株于2015年03月25号保藏于武汉大学中国典型培养物保藏中心，名称为毕赤巴斯德酵母工程菌Pichia pastoris GS115/OphcM2，保藏号：CCTCC NO:M2015140，以下简称OphcM2。

OphcM2菌株的菌学特性：

A、形态特征：毕赤酵母属菌种细胞呈球形、椭圆形、拉长形，偶尔呈锥形，但不形成尖顶。菌落颜色为乳白色或奶油色。无性繁殖方式为多边芽殖。

B、生理生化特征：毕赤酵母能利用甲醇，石油，铵盐等特殊物质生长，最适生长温度为28℃-30℃。OphcM2除了具有毕赤酵母的生理生化外，其染色体上整合了有机磷水解酶基因，在甲醇诱导条件下，能够严格调控并高效分泌表达有机磷水解酶基因。(见背景技术里的介绍)

附图说明：

图1人工合成序列OphcM与原始序列Ophc2对比图，其中灰色区域代表同源序列

图2优化的氨基酸序列与原始序列对比图，其中灰色区域代表同源区

图3重组载体BDM-OphcM 1-4拷贝装配及构建过程

图4毕赤酵母高效表达载体pHBM905BDM物理图谱及重组载体构建过程

图5BDM-OphcM 1-4拷贝重组表达载体多拷贝验证，其中图A所示为1-4拷贝质粒，图B为所示为EcoRⅠ和BamHⅠ双酶切验证

图6BDM-OphcM1-4拷贝表达量的SDS-PAGE电泳，其中，M为蛋白质预染marker，1-2泳道依次为Pichia pastoris OphcM1、Pichia pastoris OphcM2、Pichia pastorisOphcM3、Pichia pastoris OphcM4摇瓶6天的上清

图7Pichia pastoris OphcM2菌株发酵的SDS-PAGE电泳图，其中M为蛋白质预染marker，1-8泳道依次为发酵12h，24h，36h，48h，60h，72h，84h和96h的发酵液上清

图8不同温度条件对OphcM酶活性的影响

图9不同pH条件对酶活性的影响

图10在45℃、50℃、55℃温度条件下，对OphcM的热稳定性影响

图11金属离子Ag⁺、Mn²⁺、Zn²⁺、Cu²⁺、Ca²⁺、Mg²⁺、Cd²⁺、Ni²⁺、Co²⁺对OphcM的酶活性的影响

具体实施方式：

实施例1有机磷水解酶基因OphcM的合成及重组表达载体的构建

首先将来源于Pseudomonas pseudoalcaligenes的有机磷水解酶基因Ophc2(Genebank ID：AJ605330.1，其中，基因长度为906bp，编码301个氨基酸)进行改造，在不改变原氨基酸编码序列的原则下，按照酵母密码子偏爱性对其进行优化，采用套叠PCR的方法进行基因合成，优化改造的基因序列见图1，命名为OphcM。优化后的核酸序列与原始核酸序列相比，253个核酸发生改变，改造前后核苷酸序列相比，同源性为72.08％，同时为了使有机磷水解酶在毕赤酵母中高效稳定地分泌表达，优化后的有机磷水解酶基因去掉了编码5’端信号肽序列的22个氨基酸(不包含起始密码子)，其中未重叠区域内为信号肽序列(不包含起始密码子)(详见图2)。

构建优化后的有机磷水解酶基因OphcM毕赤酵母表达载体，其过程如下：

1、有机磷水解酶基因的合成

根据优化的序列设计基因合成的引物，利用套叠PCR的方法合成该基因。设计的引物长度为45-50nt，相邻引物直接有27-20nt的重叠，Tm值为55-60℃，所有的引物均在上海生工生物公司合成，总共26条引物。

DNA合成的方法为：把所有的引物稀释到10μmol/L，然后每条稀释后的引物取0.5ul放到一个反应体系中，50μL体系加5×Prime STAR Buffer 10μL、2.5nmol/L dNTPs 4μL、0.5μL PrimeSTAR HS DNA Polymerase，加水到50微升，引物之间相互为模板退火。然后以退火产物为模板，利用PCR扩增。PCR扩增的条件为：变性98℃，30s；退火56℃，30s；延伸72℃，70s，25个循环；最后72℃，5min。

2、有机磷水解酶表达载体的构建

1)用限制酶Not I和Cpo I切割pHBM905BDM质粒(专利公开号CN103555749A)，胶回收，获取构建单拷贝的线性载体。

2)目的基因通过两条引物OphcM-F(5’-3’)：

GTCAATGGCTGCTCCAGCTCAACAAAAGACACAAGTTC，引入Cop Ⅰ酶切位点；OphcM-R(5’-3’)：GGCCATTATCTATCAGATCTAATTGGAGAAAACTCAACTGGAAC，引入Not Ⅰ酶切位点(酶切位点用下划线表示)。

3)PCR产物经过胶回收纯化之后在dTTP的保护下，用T4DNA聚合酶处理30min，再用凝胶回收试剂盒对其产物进行溶液回收，即可得到含有与线性载体互补的粘性末端。然后将此产物与酶切过的线性载体在Solution I连接酶的作用下连接(如图3所示)，转化大肠杆菌感受态细胞(Escherichia coli XL10-gold，下同)。

4)采用菌落PCR的方法筛选重组子，提取重组子的质粒并送测序，测序正确的即为获得重组载体BDM-OphcM-1C。

3、有机磷水解酶多克隆表达载体的构建

多拷贝的构建通过pHBM905BDM载体上的EcoR Ⅰ、Xba Ⅰ、Spe Ⅰ和BamH Ⅰ酶切位点的剪接实现的，并获得多拷贝重组载体BDM-OphcM-2C、BDM-OphcM-3C、BDM-OphcM-4C。构建重组载体的具体过程如图4所示，构建成功的质粒及双酶切验证如图5所示。

本发明利用生物砖的方法进行基因原件的拼接，载体为pHBM905BDM其多克隆位点包含但不限于EcoR Ⅰ、Xba Ⅰ、Spe Ⅰ和BamH Ⅰ；其中Xba Ⅰ和Spe Ⅰ为同尾酶。

具体构建方法如下：

1)载体的处理：用EcoR Ⅰ和BamH Ⅰ双酶切处理pHBM905BDM载体，胶回收去除填充片段带粘性末端的载体片段，作为构建多拷贝的载体BDM。

2)表达单元的处理：将获得重组载体BDM-OphcM-1C分别用EcoR Ⅰ、Spe Ⅰ双酶切获得片段A，Xba Ⅰ、BamH Ⅰ双酶切获得片段B，分别进行胶回收。其中Xba I和Spe I是同尾酶。

3)两拷贝的构建：将进行双酶切的载体BDM及片段A和片段B在Solution I连接酶的作用下连接，转化到大肠杆菌感受态细胞中；用菌落PCR的方法筛选含有目的基因的重组子，然后提取上述含目的基因的重组子的质粒进行双酶切验证，根据片段的大小筛选出含有目的基因的两拷贝重组子BDM-OphcM-2C。

4)3拷贝和4拷贝的构建：将获得重组载体BDM-OphcM-2C分别用EcoR Ⅰ、Spe Ⅰ双酶切获得片段C，Xba Ⅰ、BamH Ⅰ双酶切获得片段D，分别进行胶回收。将片段A和片段D(或片段B和片段C)与双酶切载体BDM在Solution I连接酶的作用下连接，转化到大肠杆菌感受态细胞中；用菌落PCR的方法筛选含有目的基因的重组子，然后提取上述含目的基因的重组子的质粒进行双酶切验证，根据片段的大小筛选出含有目的基因的三拷贝重组子BDM-OphcM-3C；同理，将片段C和片段D与多拷贝载体BDM进行酶连、转化、筛选可获得含有目的基因的四拷贝重组子BDM-OphcM-4C

构建多拷贝重组载体BDM-OphcM-2C、BDM-OphcM-3C、BDM-OphcM-4C。构建多拷贝重组载体的具体过程如图4所示，构建成功的质粒及双酶切验证如图5所示。

实施例2重组有机磷水解酶基因OphcM酵母表达菌株的筛选

本发明表达菌株为Pichia pastoris GS115Mut⁺(原始菌株购自美国Invitrogen公司)。

本发明将外源基因即有机磷水解酶OphcM在毕赤酵母细胞中进行表达。其中，转化的方法为电转化法，Pichia pastoris GS115Mut⁺菌株是组氨酸缺陷型，重组表达载体上携带有组氨酸基因，可补偿宿主菌的组氨酸缺陷，因此可以在不含组氨酸的培养基MD平板上筛选转化子。重组菌株可以在甲醇诱导条件下启动AOX启动子实现重组基因的表达。据此，使酵母在BMGY的培养基中长生物量，在BMMY培养基中用甲醇诱导蛋白表达，利用SDS-PAGE电泳和底物与酶的反应筛选重组菌株。

本发明采用实时荧光定量PCR(QPCR)的方法对基因组中的拷贝数进行定量分析，采用相对定量的方法，以重组酵母基因组DNA为模板，将Actin基因作为内参基因，做荧光定量PCR，然后用相对定量的方法(ΔΔCt)实现对基因组DNA目的基因拷贝数的分析。

本发明筛选目的菌株是通过以下方式实现的。

1、分别对构建好的重组载体BDM-OphcM-1C、BDM-OphcM-2C、BDM-OphcM-3C、BDM-OphcM-4C用SalⅠ线性化处理并胶回收，用电转化法转入感受态中，涂MD平板，用MD平板对重组的酵母菌株初筛；

2、本发明在BMGY培养基中培养重组酵母表达载体所转化的重组酵母细胞以扩大生物量，在BMMY中用甲醇诱导重组有机磷降解酶的表达，通过SDS-PAGE电泳和底物筛选出具有表达能力和有酶活性表达菌株；

3、用试剂盒提取重组菌株的总DNA，并以此为模板将Actin基因作为内参基因，用ΔΔCt的方法实现对基因组DNA目的基因拷贝数的分析。通过数据分析得到含有目的拷贝数且具有活性的重组酵母菌株。将重组菌株重新命名，其中1拷贝重组菌株为Pichiapastoris OphcM1，2拷贝重组菌株为Pichia pastoris OphcM2，2拷贝重组菌株为Pichiapastoris OphcM3，4拷贝重组菌株为Pichia pastoris OphcM4；

4、将筛选的到的重组菌株，分别进行摇瓶发酵，在相同的培养条件下，保证菌体量基本一致的前提下，通过多次摇瓶试验，比较1-4拷贝的重组酵母表达量和酶活，其中，Pichia pastoris OphcM2菌株的表达量和活性最高。所述Pichia pastoris OphcM2重组菌株送保藏，名称为毕赤巴斯德酵母工程菌Pichia pastoris GS115/OphcM2，保藏号：CCTCCNO:M2015140，简称OphcM2。

实施例35L发酵罐中重组菌株Pichia pastoris OphcM2发酵生产有机磷水解酶的工艺条件

本发明已构建了可稳定表达有机磷水解酶蛋白的毕赤酵母基因工程菌株Pichiapastoris OphcM2，并建立了一条简便可行的发酵生产工艺。本发明公开发酵方法包含但不限于有机磷水解酶的发酵培养基以及发酵流程控制，其中培养基包含种子培养基、发酵培养基，微量元素溶液以及补料培养基；发酵控制流程主要包含种子培养、菌体生长阶段、碳源饲喂阶段和甲醇诱导表达阶段四个控制阶段并通过氨水控制发酵过程中pH值的稳定。

A、发酵生产有机磷水解酶所需的培养基

摇瓶种子培养基：YPD(酵母提取物1％，蛋白胨2％，YNB1.34％，硫酸铵1％)。

发酵基础培养基：CaSO₄·2H₂O，0.93g/L；K₂SO418.20g/L，MgSO₄7.27g/L，C₆H₅Na₃O₇·2H₂O 1.57g/L，KOH 10.60g/L，H₃PO425mL/L，甘油50mL/L，消泡剂0.075mL/L，PTM1微量元素溶液4.0mL/L。

微量元素(PTM1)溶液：MnSO₄·H₂O 6.0g/L，CuSO₄·5H₂O 12.0g/L，KI 0.16g/L，Na₂MoO₄·2H₂O 0.4g/L，H₃BO₃0.04g/L，CoCl₂·6H₂O 1.0g/L，ZnCl₂40.0g/L，FeSO₄·7H₂O130.0g/L，生物素0.40g/L，H₂SO₄10.0mL/L。

补料培养基：①甘油补料液：甘油500mL/L，PTM1微量元素溶液12.0mL/L；诱导液：甲醇988mL/L，PTM1微量元素溶液12.0mL/L。

其中，种子培养基、发酵培养基及甘油补料液在121℃灭菌30分钟，微量元素(PTM1)溶液配置完成后，过滤除菌，然后按照比例补加到培养基中。

B、发酵流程的控制

1、种子培养

将Pichia pastoris OphcM2工程菌株划线接种于YPD平板上，于28℃恒温培养48h，从平板中挑取2-3个单菌落转接于200mL YPD培养液中，28℃，200r/min培养36-48h。

2、基础培养

将种子培养至OD600nm达8～10接种于含有2L培养基的5L发酵罐中。其中，采用火焰接种法，设置初始参数(转速300，pH值5.0，温度28℃)，接种时按比例加入过滤除菌的微量元素(PTM1)溶液。

3、甘油补料阶段

发酵罐培养基中的碳源逐渐耗尽，溶氧DO₂值开始不断上升，当升至峰值时开始流加甘油补料液，调节流速，转速和通气量使溶氧DO₂值维持在高于20％。同时流加氨水控制pH值，使其稳定在5.0左右。设置控制参数(转速500，pH值4.5，温度28℃)。

4、甲醇诱导表达阶段

甘油补料12-24小时，湿重达到200g/L左右，停止流加甘油，观察DO₂值变化，使其处于最高值且稳定确保甘油完全消耗，开始流加含有微量元素PTM1的甲醇诱导液体。设置控制参数(转速800，pH值4.5，温度26℃)。每隔12小时取样，利用SDS-PAGE电泳检测蛋白质表达情况，同时测定酶活和蛋白质含量。

进行5L发酵罐发酵实验结果表明，甲醇未诱导之前，在菌株培养和碳源饲喂两个阶段内，菌体快速增长，其湿重可达150～220g/L，此时在发酵液上清中检测不到有机磷降解酶活性。随着甲醇的诱导时间的延长，发酵液中的有机磷酶活性逐渐增加，诱导96h后发酵液中有机磷降解酶活性约为75U/mL。SDS-PAGE同时表明发酵液中有机磷降解酶蛋白表达量也在不断积累(见图7)。本发明重组有机磷降解酶在5升发酵罐的发酵144h表达量高达8.1克/升，较文献报道的5.5g/L高1.47倍。其中在发酵96小时，酶比活达到12.85U/mg，较文献报道的10.1U/mg高1.27倍。

实施例4重组有机磷水解酶OphcM的纯化及酶学性质分析

本发明中有机磷水解酶的酶活计算方法为：取100μL待测酶液加入含有5μL10mg/mL甲基对硫磷和900μL50mmol/L Tris-HCl(pH 9.0)缓冲液的体系中，37℃保温10分钟，加入1mL10％三氯乙酸终止反应，再加入1mL10％Na₂CO3溶液显色，410nm测定OD值，计算水解产物对硝基酚的含量和酶的活性。一个酶的活性单位(U)定义为在37℃，每分钟释放出1μmol对硝基酚所需酶量。

有机磷降解酶酶活单位计算公式：

其中，3×10^-3：反应总体积(L)；N：酶液的稀释倍数；10^①：将100μL稀释酶液中的酶活性折算为1mL的酶活性；10^②：反应时间。

1、重组有机磷水解酶OphcM的纯化

本发明在对发酵得到的酶液进行纯化，进行了多次探索，找到了一种既可以减少纯化次数提高得率又可以实现高效纯化的方法。经多次重复，采用分子筛对目的蛋白进行纯化，目的蛋白回收率可达到70～75％，纯化倍数为5倍。

2、重组有机磷水解酶OphcM的酶学性质分析

本发明对重组有机磷水解酶OphcM的酶学性质进行了分析，主要包括温度、pH、热稳定性以及金属离子对酶活性的影响。

本发明考察了在20℃-80℃范围内，温度对酶活性的影响如图8所示；在pH5.0-12.0范围内，pH对酶活的影响如图9所示；在45℃、50℃、55℃在半小时内的热稳定性，如图10所示；及Ag⁺、Mn²⁺、Zn²⁺、Cu²⁺、Ca²⁺、Mg²⁺、Cd²⁺、Ni²⁺、Co²⁺。其中在45℃-55℃温度范围内，OphcM都具有较高的活性，其中50℃为最适温度；该酶在pH为11时达到最高活性。金属离子对酶活性的影响如图11所示。

Claims (2)

1.一种优化有机磷水解酶酵母工程菌，该工程菌为毕赤酵母(Pichia pastoris)GS115/OphcM2，其保藏号为CCTCC No:M2015140，简称为OphcM2。

2.一种优化有机磷水解酶的生产方法，其特征在于生产步骤为：

1)、优化合成有机磷水解酶基因OphcM

将来源于类产碱假单胞菌(Pseudomonas pseudoalcaligenes)的有机磷水解酶基因Ophc2，Genebank ID：AJ605330.1进行改造，在不改变原氨基酸编码序列的原则下，按照酵母密码子偏爱性对其进行优化，采用套叠PCR的方法进行基因合成，优化改造的基因命名为OphcM；基因具体序列为SEQ ID NO:1；

2)、多拷贝有机磷水解酶毕赤酵母表达载体的构建

将有机磷水解酶基因OphcM两端引入酶切位点CopⅠ和NotⅠ，并克隆到毕赤酵母高效表达载体pHBM905BDM中，获得单拷贝表达载体BDM-OphcM-1C；然后采用传统的基因工程操作技术，分别通过限制酶EcoRⅠ、XbaⅠ、SpeⅠ和BamHⅠ的酶切，先后获得二拷贝表达载体BDM-OphcM-2C、三拷贝表达载体BDM-OphcM-3C、四拷贝表达载体BDM-OphcM-4C；

3)、构建多拷贝有机磷水解酶基因毕赤酵母表达重组菌株

将上述拷贝表达载体BDM-OphcM-1C、BDM-OphcM-2C、BDM-OphcM-3C、BDM-OphcM-4C采用化学转化法或电转化法，分别转化到毕赤酵母GS115Mut+中，通过在MD平板上生长，并采用菌落PCR的方法进行验证，然后摇瓶发酵，分别获得单拷贝、二拷贝、三拷贝、四拷贝的重组菌株，分别命名为毕赤酵母OphcM1、毕赤酵母OphcM2、毕赤酵母OphcM3、毕赤酵母OphcM4；

4)、将筛选到的多种重组菌株，分别进行摇瓶发酵，在相同的培养条件下，保证菌体量一致的前提下，通过多次摇瓶试验，比较1-4拷贝的重组酵母表达量和酶活，其中，毕赤酵母OphcM2菌株的表达量和活性最高；

5)、选择毕赤酵母OphcM2重组酵母菌株高密度发酵，制备生产有机磷水解酶；所述毕赤酵母OphcM2菌株在5升发酵罐发酵144小时表达量达8.1克/升，在发酵96小时，酶比活达到12.85U/mg。