CN105055412B - Nampt抑制剂在制备治疗可卡因成瘾的药物中的用途 - Google Patents

Abstract

本发明公开了NAMPT抑制剂在制备治疗成瘾药物成瘾的药物中的用途。本发明还公开了一种治疗可卡因成瘾的药物，它是以NAMPT抑制剂为活性成分，加上药学上可接受的辅料或者辅助性成分制备而成的制剂。本发明NAMPT抑制剂可以有效减弱可卡因奖赏行为，治疗可卡因成瘾，临床应用前景良好。

Description

NAMPT抑制剂在制备治疗可卡因成瘾的药物中的用途

技术领域

本发明涉及NAMPT抑制剂在制备治疗可卡因成瘾的药物中的用途。

背景技术

可卡因(Cocaine)又称古柯碱,化学名为苯甲酰甲基芽子碱(methylbenzoylecgonine)，一般呈白色晶体状,无臭,味苦而麻，其最早用于局部麻醉和治疗哮喘，是最强的天然中枢兴奋剂，因其对中枢神经系统的兴奋作用而导致滥用，1985年起成为世界性主要毒品之一。

可卡因成瘾，是一种慢性复发性脑部疾病，属于药物依赖(drug dependence)类疾病，可卡因成瘾会引起大脑结构和功能的可塑性变化，相关脑区包括伏隔核、纹状体、前额皮质、海马和腹侧被盖区，健康也受到多方面的危害，包括精神颓废、人格缺损、心智功能紊乱、并发相应的感染合并症以及吸毒者不顾一切地寻求和使用毒品而诱发各种违法犯罪活动。

可卡因成瘾的主要特点表现为即使患者在知晓用药的严重后果后，依然强迫性索取和使用以满足欲望、对药物的寻觅和索取失去控制、对事物失去兴趣、成瘾记忆十分深刻，即使经过戒断治疗若干年后，接触与成瘾有关的刺激(如毒友、与过去用药有关的环境等)都可能诱发复吸。

鉴于可卡因成瘾危害甚大，找到合适的治疗靶点和药物，治疗可卡因成瘾迫在眉睫。

发明内容

为了解决上述问题，本发明提供了一类治疗可卡因成瘾的药物。

NAMPT：烟酰胺磷酸核糖转移酶。

NAMPT抑制剂：抑制烟酰胺磷酸核糖转移酶的酶活或者表达的物质。

本发明首先提供了NAMPT抑制剂在制备治疗可卡因成瘾的药物中的用途。

优选地，所述治疗可卡因成瘾的降低NAMPT酶活的药物。进一步优选地，所述降低NAMPT酶活的药物是FK866，其结构式如下：

本发明还提供了一种治疗可卡因成瘾的药物，它是以NAMPT抑制剂为活性成分，加上药学上可接受的辅料或者辅助性成分制备而成的制剂。

优选地，所述NAMPT抑制剂为降低NAMPT酶活的药物。进一步优选地，降低NAMPT酶活的药物是FK866，其结构式如下：

优选地，所述制剂是注射制剂。

NAMPT抑制剂可以有效减弱可卡因奖赏行为，治疗可卡因成瘾，临床应用前景良好。

以下通过实施例形式的具体实施方式，对本发明的上述内容作进一步的详细说明。但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实施例。凡基于本发明权利要求书记载的内容所实现的技术均属于本发明的范围。

附图说明

图1SIRT1基因敲除小鼠基因型鉴定。1、5、6、7、8、9为SIRT1中脑条件敲除纯合子小鼠；3为含Wnt1的SIRT1杂合子小鼠；2、4为含Wnt1的野生型小鼠。

图2条件位置偏爱箱

图3条件性位置偏好实验设计示意图

图4小鼠自发活动箱

图5pReceiver-Lv201载体图。

图6VTA定位图谱

图7可卡因条件性位置偏好实验。小鼠经可卡因CPP训练后，可卡因给药组(CO)与生理盐水对照组(SA)相比，CPP效应增加，*p<0.05。

图8可卡因诱导自发活动。可卡因给药组(CO)与生理盐水对照组(SA)相比测得两组小鼠的距离(cm)有统计学差异(*p<0.05)；#p<0.05，给药组分别在Day2、3、4、5、6、7与Day1相比有统计学差异。

图9NAMP在可卡因和生理盐水组CPP模型中不同脑区的表达情况。(A)WesternBlot检测NAMPT在前额叶皮质(PFC)、伏隔核(NAc)、纹状体(Striatum)、海马(Hippocampus)和中脑腹侧被盖区(VTA)的表达。(B)代表A图中NAMPT表达的统计分析结果。*p<0.05，表示可卡因给药组(CO)与生理盐水对照组(SA)相比较有统计学差异。

图10RT-PCR检测可卡因诱导NAMPT的表达。(A)可卡因CPP模型中，NAc和VTA中NAMPT表达变化。可卡因诱导VTA中NAMPT表达的上调，*p<0.05，而NAc没有变化。(B)可卡因急性模型中，NAc和VTA中NAMPT表达变化。可卡因单次给药后30min、单次给药后24h，连续给药7d(1次/天)NAc、VTA脑区NAMPT没有明显变化，可卡因给药组(CO)与生理盐水对照组(SA)。

图11小鼠腹腔注射FK866对行为学的影响。(A)可卡因CPP得分图。小鼠腹腔注射FK866降低可卡因CPP效应，#p<0.05。(B)小鼠自发活动变化。小鼠腹腔注射FK866可抑制自发活动，p<0.05。Con-SA，溶剂-生理盐水组；Con-CO，溶剂-可卡因组；FK866-SA，FK866-生理盐水组；FK866-CO，FK866-可卡因组。

图12小鼠VTA脑内给FK866后对小鼠行为学的影响。(A)可卡因CPP得分图。小鼠VTA脑内注射FK866可卡因CPP降低，#p<0.05。(B)小鼠自发活动变化。小鼠VTA脑内注射FK866可抑制自发活动，p<0.05。Con-SA，溶剂-生理盐水组；Con-CO，溶剂-可卡因组；FK866-SA，FK866-生理盐水组；FK866-CO，FK866-可卡因组。

图13小鼠VTA脑内注射FK866后补充NMN对可卡因CPP的影响。给予FK866后补充NMN，可卡因CPP恢复，#p<0.05。SA表示腹腔给予生理盐水组，CO腹腔给予可卡因组。Control表示对照组；FK866+SA表示VTA脑内给FK86630min后补充SA；FK866+NMN表示VTA脑内给FK86630min后补充NMN。

图14VTA脑内注射NAMPT过病毒对小鼠可卡因CPP的影响。(A)Western Blot检测NAMPT表达情况。过表达(LV-NAMPT)与对照(LV-GFP)组相比NAMPT表达增加，p<0.05。(B)VTA脑内注射NAMPT过表达病毒后对小鼠可卡因CPP的影响。NAMPT过表达(LV-NAMPT)与对照(LV-GFP)可卡因组相比可卡因CPP增加，#p<0.05。LV-GFP SA，GFP-生理盐水组；LV-GFP CO，GFP-可卡因组；LV-NAMPT SA，过表达NAMPT-生理盐水组；LV-NAMPT CO，过表达NAMPT-可卡因组。

图15腹腔注射FK866的可卡因CPP模型小鼠样本的NAc和NAc的OSC-PLS-DA模型载荷图。A、C分别为可卡因组和生理盐水对照组VTA和NAc的OSC-PLS-DA模型载荷图。B、D分别为FK866可卡因给药组和可卡因组VTA和NAc的OSC-PLS-DA模型载荷图。生理盐水对照组(SA)、可卡因给药组(CO)、FK866可卡因给药组(FK866+CO)。

图16腹腔注射FK866的可卡因CPP模型小鼠样本的VTA脑区代谢谱。A基于1H NMR的可卡因组和生理盐水对照组的OSC-PLS-DA得分图。B基于1H NMR的FK866给药组和可卡因组的OSC-PLS-DA得分图。C利用A中相对应的PLS-DA排列分析而得到的统计验证模型，R2代表解释能力变量，Q2代表该模型的验证能力变量D利用B中相对应的PLS-DA排列分析而得到的统计验证模型。生理盐水对照组(SA)、可卡因给药组(CO)、FK866可卡因给药组(FK866+CO)。

图17腹腔注射FK866的可卡因CPP模型小鼠样本的NAc脑区代谢谱。A基于1H NMR的可卡因组和生理盐水对照组的OSC-PLS-DA分析图。B基于1H NMR的FK866给药组和可卡因组的OSC-PLS-DA分析图。C利用A中相对应的PLS-DA排列分析而得到的统计验证模型，R2代表解释能力变量，Q2代表该模型的验证能力变量D利用B中相对应的PLS-DA排列分析而得到的统计验证模型。生理盐水对照组(SA)、可卡因给药组(CO)、FK866可卡因给药组(FK866+CO)。

图18不同给药组组不同脑区代谢物变化箱线图。(A)VTA脑区；(B)NAc脑区。方框中间的线代表中位数；方框的下线和上线分表代表第25个和第75个分位数；最下面的线和最上面的线分别代表最小值和最大值。生理盐水对照组(SA)、可卡因给药组(CO)、FK866可卡因给药组(FK866CO)。

图19不同给药组VTA脑区中NAD的变化图。给药组与对照组相比NAD变化有统计学意义，*p<0.05。Control，脑内注射SA；FK866，脑内注射FK866；FK866+NMN，VTA脑内给FK86630min后补充NMN；LV-NAMPT，过表达NAMPT组。相应的SA和CO分别为生理盐水对照组、可卡因给药组。

具体实施方式

实验例1 NAMPT抑制剂治疗可卡因成瘾

1前言

本研究中，我们首先建立可卡因CPP小鼠模型，通过行为学检测小鼠可卡因奖赏效应，通过PCR、免疫印迹等方法检测VTA、NAc等脑区NAMPT表达变化。脑内定位注射NAMPT抑制剂、补充NMN和NAMPT过表达病毒载体，发现CPP效应抑制或增强。其次，采用基于核磁共振的代谢组学的技术和试剂盒，检测脑区与NAMPT代谢相关代谢物的变化，发现NAMPT抑制或激活，相应的NAD水平降低或升高。该结果说明NAMPT通过影响NAD的合成参与调控可卡因CPP效应。最后通过SIRT1中脑条件性敲除小鼠，验证NAMPT-NAD-SIRT1途径在可卡因CPP中的作用。本研究首次发现NAMPT-NAD-SIRT1通路参与可卡因药物成瘾，为深入认识成瘾机制以及成瘾治疗提供新的试验依据，还发现了NAMPT抑制剂可以治疗可卡因成瘾。

2实验材料与方法

2.1实验材料与设备

2.1.1试验样品

盐酸可卡因购自中国药品生物制品鉴定所，白色粉末，纯度大于99％，生产批号：171210-200803；生理盐水选用四川科伦药业股份有限公司，批准文号：国药准字H51021158，生产批号M12101307。盐酸可卡因用生理盐水稀释到所需浓度。FK866、β-烟酰胺单核苷酸(β-NMN)购于Sigma公司。

2.1.2实验动物

(1)雄性SPF级野生型C57BL/6J小鼠，由北京维多利华实验动物有限责任公司提供，未交配过，体重20-22g。

(2)SIRT1中脑条件敲除小鼠

SIRT1^loxp/loxp小鼠(C57BL/6J小鼠SIRT1基因2、4号外显子连接Loxp位点)由四川大学生物治疗国家重点实验室蒋维教授赠予。Wnt1-Cre转基因小鼠(Wnt1-Cre定位表达于中脑的含Cre重组酶的小鼠，与SIRT1^loxp/loxp小鼠杂交，Cre重组酶可以特异性识别Loxp位点，获得SIRT1中脑条件性基因敲除小鼠)来源于美国Jackson试验室(http://www.jax.org/)。将SIRT1^loxp/loxp小鼠与Wnt1-Cre转基因小鼠交配，获得F1代Wnt1-Cre，SIRT1^loxp/-小鼠。再将F1代Wnt1-Cre，SIRT1^loxp/-雌雄小鼠交配，获得F2代Wnt1-Cre；SIRT1^-/-小鼠。

饲养条件：动物饲养于国家成都新药安全性评价中心SPF级动物房，温度20-25℃，相对湿度55-65％，整个实验过程中，动物自由摄食和饮水。饲养环境符合国标GB14925-2001，试验动物许可证：SCXK(川)2003-01。动物实验中所有操作均符合国际动物福利(AAALAC)的要求。

SIRT1中脑条件敲除小鼠鉴定：将F2代小鼠尾尖剪取0.5-1cm长度尾部组织，放入离心管中，配制Lycis Buffer液(如表1)，0.5mL/管，55°过夜，至尾部组织融化为止。

表1Lycis Buffer液配制表

提取DNA：取出尾部组织颠倒混匀13000rpm，离心10min。倒出上清(勿吸取)。在上清中加入等体积0.5mL无水乙醇，颠倒混匀8次(勿涡旋)。200mL枪头挑出DNA(白色细丝)，溶于50-100μL双蒸水中，55溶解，期间每半小时颠倒混匀(2h左右)

PCR反应及琼脂糖凝胶电泳进行基因鉴定：PCR扩增反应中的引物序列如表2。PCR扩增反应体系如表3。制备含Gold View染料的1.2％琼脂糖凝胶。分子量为2000的DNAMaker和PCR反应终产物DNA样本上样2μL，进行凝胶电泳。小鼠尾巴琼脂糖凝胶电泳基因型片段：SIRT1纯合子为750bp,SIRT1杂合子为750bp和550bp。F2代中出现750bp条带(SIRT1纯合子)且不含100bp条带(Wnt1)的样本对应的小鼠即为SIRT1中脑条件敲除小鼠。如图1中，1、5、6、7、8、9为SIRT1中脑条件敲除纯合子小鼠；3为含Wnt1的SIRT1杂合子小鼠；2、4为含Wnt1的野生型小鼠。选取SIRT1中脑条件敲除纯合子小鼠用于后续实验。

表2基因鉴定引物序列

表3 PCR反应体系

2.1.3主要仪器

(1)电子分析天平，购自上海天平仪器厂

(2)超净工作台，购自上海博迅实业有限公司医疗设备厂

(3)DK-8D型电热恒温水槽，购自上海森信实验仪器有限公司

(4)Gene Amp PCR System 9700，购自Applied Biosystems公司

(5)TaKaRa PCR Thermal Cycler，购自宝生物工程有限公司

(6)高速低温离心机，购自德国eppendorf公司

(7)电泳仪，购自美国Bio-Rad公司

(8)涡旋混匀器，购自海门市其林贝尔仪器有限公司

(9)微量振荡器，购自姜堰市新康医药仪器有限公司

(10)波谱仪，购自德国Bruker公司

(11)稳压稳流电泳仪、垂直板电泳槽、转膜槽，均购自美国Bio-Rad公司

(12)恒温培养振荡器，购自上海智城分析仪器制造有限公司

(13)塑料薄膜封口机，购自温州市亚通包装机械制造有限公司

(14)数显三用恒温水浴箱，购自江苏省金坛市金城国胜实验仪器厂

(15)紫外分光光度分析仪，购自日本SHIMADZU公司

(16)酶联免疫检测仪，购自法国Thermo Fisher公司

(17)荧光电子倒置显微镜，购自德国蔡司光学仪器ZEISS公司

(18)电子天平，购自德国sartorius公司

(19)氮吹仪，购自北京成萌科技有限公司

(20)小鼠不锈钢代谢笼具，购自上海同育医学解剖模型制造公司

(21)大小鼠位置偏爱箱，购自淮北正华生物仪器设备有限公司

(22)移液枪，购自德国eppendorf公司

(23)液氮罐，购自成都液氮容器厂

2.1.4主要实验试剂

(1)TRIZOL试剂，购自购自美国Invitrogen(Life Technologies)公司

(2)氯仿，购自上海化学试剂有限公司

(3)甲醇，购自上海化学试剂有限公司

(4)氘代重水D2O，购自美国CIL(Cambridge Isotope Laboratories)公司

(5)TSP，购自Sigma-Aldrich公司

(6)DNase/RNase-Free ddH2O，购自购自北京天根生化科技有限公司。

(7)逆转录试剂盒(Thermo Scientific RevertAid First Strand cDNASynthesis Kit)，购自DBI Bioscience公司

(8)Stormstar SYBR Green qPCR Mastermix，购自DBI Bioscience公司

(9)RIPA裂解液，购自上海碧云天生物技术有限公司

(10)SDS-PAGE试剂(30％聚丙烯酰胺，Tris-base，SDS，过硫酸铵，TEMED，甘氨酸)，0.22μM孔径PVDF膜，均购自Bio-Rad公司

(11)蛋白质预染marker(PageRulerTM Prestained Protein Ladder，购自ThermoScientfic(Fermentas)公司

(12)化学发光显影试剂盒(SuperSignal West Pico ChemiluminescentSubstrate)，购自美国Pierce

(13)Kodak柯达胶片，购自柯达公司

(14)100％乙醇，购自上海化学试剂有限公司

(15)甲醛，购自上海化学试剂有限公司

(16)Gold View染料，上海赛百胜基因技术有限公司

(17)琼脂糖，生工生物工程有限公司

(18)NAD/NADH Assay Kit，购自Abcam公司

(19)抗β-actin抗体，购自美国CST公司

(20)抗NAMPT抗体，购自Abcam公司

(21)抗Sirt1抗体，购自Santa Cruze公司

其余均为国产分析纯试剂。

2.1.5主要试剂的配制

(1)10％(W/V)过硫酸铵：称取1g过硫酸铵加入10mL的ddH₂O后，搅拌溶解，4℃保存。

(2)5×SDS-PAGE电泳缓冲液：称取15.1g Tris-base、94g甘氨酸和5g SDS，加入约800mL的ddH₂O，搅拌溶解后用ddH₂O定容至1000mL，室温保存备用。

(3)膜转移缓冲液：称取2.9g甘氨酸、5.8g Tris-base和0.37g SDS，置于1000mL烧杯中；加入ddH₂O充分搅拌溶解；ddH₂O定容至800mL，再加入200mL的甲醇，室温保存。

(4)10×TBS缓冲液：称取Tris-base(三羟甲基胺基甲烷)60.5g，NaCl 87.5g，用800mL蒸馏水完全溶解后，滴加浓HCl调节pH为7.4，最后定容至1000mL。

(5)TBST缓冲液：1：10的比例稀释10×TBS缓冲液到1000mL的1×TBS缓冲液，加入1mL Tween-20充分混匀后，4℃保存。

(6)封闭缓冲液：称取5g脱脂奶粉用TBST缓冲液定容至100mL，充分搅拌溶解，4℃保存(需现用现配)。

2.2行为学模型建立

2.2.1可卡因条件性位置偏好模型的建立

小鼠位置偏爱箱如图2所示：

(1)开始试验前3-5天，每天由同一操作人员将小鼠放入实验仪器训练15分钟，让动物对仪器和操作者有一定的适应。

(2)将小鼠放入CPP箱体内，适应性训练3天，第三天测定的数据作为pretest的数据(D0)。每次适应训练和测试时间均为15min，当动物在一侧(黑白两侧)停留的时间超过600s时，应当剔除。将动物停留较长时间的一侧作为自然偏好箱。

(3)小鼠进行腹腔注射给药，给药剂量如下(表4)，给药次数为3次，交替给药，连续6天。第1、3、5天给与给与盐酸可卡因放入非自然偏好箱；第2、4、6天给与生理盐水放入自然偏好箱。对照组每次给与生理盐水并与给药组一样放入对应箱内(图3)。

表4可卡因给药途径、给药剂量、给药体积汇总表

(4)第7天进行CPP测试，将小鼠依次放入灰箱中，让其自由在大小鼠位置偏好箱中穿梭15min，并记录每个箱体停留的时间。

(5)注意事项：每次动物训练时，应该轻拿轻放，不要对动物的情绪造成重大影响；每次训练结束应该对箱体进行擦拭，以消除每个动物的气味。光照强度，注意控制每天的训练时间，训练时长，噪音等。

2.2.2自发活动模型的建立

小鼠自发活动仪器如图4所示：

(1)开始试验前3-5天，每天由同一操作人员将小鼠放入实验仪器训练15min，让动物对仪器和操作者有一定的适应。

(2)将小鼠放入自发活动箱体内，适应性训练3天，第四天测定的数据作为基线的数据(D0)。每次适应训练和测试时间均为15min，记录小鼠活动的距离(cm)。

(3)第五天开始，小鼠先进行腹腔注射给药，每天一次，连续给药7天，给药剂量如上(表4)，3min后放入箱内检测自发活动，据作为第一天的数据(D1)(图4)。第7天自发活动检测后30min内解剖小鼠。

2.3样本取材和准备

条件性位置偏好测试结束后30min内快速断头处死C57小鼠，然后迅速分离大脑，用4℃生理盐水冲洗3遍后，按照脑解剖图谱分离取出前额叶皮质、伏隔核、纹状体，海马、中脑腹侧被盖区。直接将取好的样本快速放入液氮中，并迅速放入-80℃冰箱中储存。

2.4蛋白质印迹

2.4.1样品制备

-80℃冰箱中取出组织样本，冰上操作，加入冰RIPA裂解液，置于冰上裂解5min。超声破碎仪超声10次，3s/次(置与冰上)，把细胞破碎。13000g离心15min(4℃)，弃沉淀，取出上清液。用考马斯亮蓝法测定上清中蛋白浓度。加入RIPA裂解液和Loading Buffer调整样本浓度、上样体积和上样量。煮沸样品5min。离心13000转/分，10min，取上清。

2.4.2制胶

制备分离胶如表5所示。

表5分离胶制备配制图

制备浓缩胶如表6所示。

表6浓缩胶制备配制图

2.4.3电泳分离

将胶浸于转移缓冲液中平衡10min。上样15～20μL至SDS-PAGE胶(10cm×10cm)电泳。浓缩胶电压70-80V，蛋白到浓缩胶分离胶界限处，电压加为90V，直至蛋白跑完(根据蛋白大小决定)，时间大约为120min。

2.4.4转膜

PVDF膜用纯甲醇活化3～5秒钟。依据胶的大小剪取膜和滤纸6片，放入转移缓冲液中平衡10min。装配转移三明治：海绵→3层滤纸→胶→膜→3层滤纸→海绵，每层放好后，赶去气泡。胶放于负极面(黑色面)将转移槽置于冰浴中，放入三明治(黑色面对黑色面)，加转移缓冲液，插上电极，100V，转膜时间由蛋白分子量决定(电流约为0.3A)。转膜结束后，切断电源，取出杂交膜放入备好的封闭液中。

2.4.5封闭

用TBST配制5％的脱脂牛奶的封闭缓冲液，30mL/块胶。倒入平皿中，将PVDF膜完全浸润在牛奶中，放在摇床上，室温孵育1.5h。

2.4.6一抗孵育

将一抗用封闭缓冲液按照需要的比例稀释，用杂交带封好，4℃过夜或者37℃，1-2h。用TBST洗膜三次，每次5-10min。

2.4.7二抗孵育

将相应抗体用封闭缓冲液1：5000稀释，37℃摇床1-2h，用TBST洗膜四次，每次5-10min，然后用TBS洗膜二次，5-10min。

2.4.8显色

配制发光液(1ml A液：1ml B液)，在暗室中将PVDF膜置于发光液中反应1分钟。将PVDF膜取出，用滤纸吸干多余发光液，将PVDF膜放入暗盒中，将膜正面朝上与胶片接触，压紧曝光(条带亮度取决于时间长短)，洗片。

2.4.9结果分析

将免疫印迹胶片用Image-Pro Plus 6.0系统读取灰度值，用β-actin条带灰度值作为内参，进行标准化比较。

2.5 RT-PCR

2.5.1提取组织RNA

试剂准备：Trizol，RNase-free的ddH₂O，氯仿，无水乙醇，75％乙醇，异丙醇，所用的的EP管、枪尖等耗材均为DNase/RNase-free的进口产品。

(1)匀浆处理：组织样品，将组织在液氮中用小号研钵磨碎，研磨过程中保持低温(冰上操作)，不能使组织变软融化，每50-100mg组织加入1mL Trizol试剂，用匀浆仪进行匀浆处理，最后转移至新的1.5mL的EP管中。

(2)相分离：室温15-30℃孵育5min，待匀浆样品中蛋白完全分离，每1mL Trizol试剂添加0.2mL氯仿，小心盖好管盖，反复颠倒混匀8-10次，室温孵育3min，4℃，12,000g离心15min。离心后，混合物分为三层，上层的无色水相、中间相和下层红色的酚-氯仿相，RNA存在于水相中，水相体积约为匀质时所加Trizol量的60％。

(3)RNA沉淀：将水相转移至新的EP管中(注意不要吸到中间层，以免RNA污染)，初始匀浆化时每1mL Trizol试剂使用0.5mL异丙醇，沉淀水相中RNA，室温孵育样品10-20min，12,000g，4℃离心10min。RNA沉淀一般在离心前不可见，但离心后在管底形成絮状沉淀。

(4)RNA洗涤：弃上清，1mL 75％的乙醇洗涤RNA沉淀一次，涡旋混匀后，4℃，7,500g离心5min。

(5)重新溶解RNA：弃上清，瞬离，吸走残留的75％乙醇，干燥RNA沉淀(空气干燥或真空干燥5-10min)，注意不要过分干燥(会降低其溶解度)。使用20-30μL RNase-free的ddH₂O溶解RNA，涡旋混匀后用于后续实验。溶解RNA时，先加入无RNA酶的水用枪反复吹打几次，然后55-60℃孵育10min。获得的RNA溶液-80℃冰箱保存。

2.5.2 RNA质量检测及定量

(1)电泳检测：使用1×TBE配制1％的琼脂糖凝胶，取3μL溶解的RNA和上样缓冲液混合后跑电泳，150V分离20min，进行成像分析。电泳的目的在于检测28S和18S条带的完整性和他们的比值，如果28S和18S条带明亮、清晰、完整，且28S的亮度是18S条带的两倍以上，则认为RNA质量合格，可以用于后续实验。

(2)RNA的吸光度检测：280、320、230、260nm下的吸光度分别表示核酸、背景、盐浓度和蛋白等有机物的OD值，一般来说，我们只分析OD260/OD280的比值(Ratio,R)。当R为1.8-2.0时，认为RNA中蛋白或者其他有机物的污染是可以接受的；当R﹤1.8时，说明RNA中蛋白或者其他有机物的污染比较明显，一般不使用；当R﹥2.0时，说明RNA已经降解，不可用。

(3)在分光光度计上同时可以计算RNA的浓度(μg/μL)：OD260×稀释倍数×40/1000。

2.5.3 RNA逆转录成cDNA

根据DBI Bioscience逆转录试剂盒的说明书操作如下：

(1)融化后，将试剂盒各组分涡旋混匀并稍微离心，置于冰上。如果RNA模板GC含量高或者含有二级结构，将上述混合液轻轻混匀，瞬离，65℃孵育5min，立即插入冰上冷却，离心，再置于冰上。

(2)在置于冰上的无菌无核酸酶的PCR管中，按照顺序配制反应液(如表7所示)：

表7反转录试剂配制表

(3)轻轻混匀，离心。

(4)37℃条件下，进行15min的逆转录反应。

(5)98℃条件下，进行5min的逆转录酶失活反应。反应产物可直接用于后续的PCR检测，或者保存于-80℃备用

2.5.4 Real-Time PCR

(1)将合成的基因引物首先进行离心13,300rpm，5min，确保所有的粉末都集中在管底，按照说明加入足量的无核酸酶的ddH₂O或者TE buffer至终浓度为100μM，此为储存液浓度，再取少量液体稀释10倍为工作液浓度10μM。

(2)按照DBI Bioscience Stormstar SYBR Green qPCR Mastermix说明书配制反应体系(表8)。

表8 RT-PCR反应体系配制表

(3)轻轻混匀，离心。

(4)PCR反应参数为：95℃预变性2min，40个循环(95℃变性10sec，60℃复性、延伸30-34sec)；溶解曲线分析(65-95℃，每5sec上升0.5℃)，引物序列如表9。

表9 RT-PCR引物序列

2.6核磁共振代谢组学

2.6.1准备细胞裂解物

(1)-80℃冰箱中取出待测样本，称取20-200mg冰冻组织，并准备预冷甲醇、氯仿、miniQ水。

(2)按体积加入4ml/g甲醇和0.85mL/g水到组织样品中，超声破碎样品每次3s，超声8-10次，间隔3s并涡旋混匀。

(3)加入2m L/g氯仿，再次涡旋混匀2min，静置2min。

(4)加入2mL/g氯仿和2mL/g双蒸水，再次涡旋混匀。

(5)将样品置于冰上或冰箱中静置15min后，1000g，15min，4℃离心(如无明显分层，则再次离心)。

(6)将上层水相转移到新的EP管中，氮吹后-80℃保存。

(7)若不立即进行检测，则将水相提取物储存于-80℃(主要为降低氧化反应)，并储存于-80℃(但最好不要超过3天)。

(8)水相代谢物：加入580μL重水，含0.1～0.5mM TSP，涡旋混匀，12000g离心5min，并将550μL样品置于核磁管中检测[31]。

2.6.2核磁共振分析

Bruker Avance II 600型(Bruker Biospin，德国)核磁共振波谱仪，设置实验温度300K，在NMR仪上调用弛豫编辑脉冲序列(Carr-Purcell-Meiboom-Gill sequence，CPMGsequence)，采用预饱和方式抑制水峰。检测谱宽12335.5Hz，延迟时间5s，采样时间2.66s，采样数据点数64K，累加次数64次，开始采样，得到自由感应衰减(FID)信号，线增宽因子为-0.3Hz[32]。

2.6.3数据归纳和模式识别分析

NMR的原始数据是FID信号，在电脑软件(MestReNova-6.1.1-6384)上经过傅立叶变换及加窗函数转换成可视的NMR谱图，再对谱图进行处理分析：

(1)定标：由于各样本的PH值不同，为了避免由于波谱漂移所带来的误差，所以要以一个相对稳定的谱峰来定标，本实验中可以用加入的TSP(化学位移为δ0.0)为标准，对所有的谱峰来进行调整。因为组织样本中的乳酸峰(1.336ppm，-CH3双峰)和葡萄糖峰(5.22ppm,-CH1双峰)也相对稳定，所以也可以用二者来进行定标。具体操作是用MestReNova软件打开波谱图，将目的化学位移放大，点击工具栏里的TMS按钮进行定标。

(2)相位调整：通常NMR采集到的谱图都含有吸收与扩散组份，通过相位调整可以得到纯粹的吸收峰，表现在谱图上就是将负象限的峰都调整到正象限。在Bruker的仪器中，相位调整首先对最大峰进行零级相位调整PH₀，然后以一级相位调整PH₁来调节其他的峰。

(3)基线校正：在核磁共振波谱仪中，若发射机的射频频率成分漏到接收机中，经检波后，这些泄露电压就变成直流成分，引起FID信号有一定的直流偏压，数字化后出现在数字信号中，如不加以修正，在傅立叶变换后会引起谱的零额处的尖峰，这要影响到整个谱的动态范围。即调基线的主要目的就是改善谱的外观和提高积分的准确性。所以在预处理NMR波谱图时，一定要进行基线校正。

(4)峰重叠及排除干扰峰：按照上述三步将所有的谱峰进行预处理之后，将所有的谱峰进行重叠，就得到一张叠加的谱峰图。因为在进行样品处理的时候引入了外源的甲醇、氯仿及水，在进行后续分析时排除三者的干扰峰(残留水峰，约4.7ppm；甲醇峰，约3.37-3.34ppm；氯仿峰，大约7.8-7.6ppm)。

(5)分段积：采用的积分范围是0.5-9.5ppm，积分大小是0.004ppm

(6)归一化：相对于全谱积分面积进行归一化，可以弥补各组织样本之间的浓度差异。

(7)数据输出：经过上述步骤，完成波谱的预处理过程，就可以在MestReNova上输出数据，一般保存为TXT格式，再转为2003版Excel。

(8)模式识别分析：用SIMCA-P10.0软件包分析。变量通过均值集中和佩尔托图量化(pareto-scaled)后进行PCA，PLS-DA,OSC分析。通过佩尔托图量化决定组成分是否有意义。二维得分图用于区分样品；对应的载荷图用于区分波谱上有贡献的差异代谢物。核磁化学位移和内源性代谢产物的分配是依据文献和人类代谢组学数据库(Human MetabolomeDatabase)网站上得到的信息。人类代谢组学数据库是生物信息学/化学信息学的网站，可以得到代谢物以及代谢酶的相关信息。

2.7过表达慢病毒载体构建

2.7.1载体

(1)载体信息：

载体为pReceiver-Lv201，如图5。

(2)制备感受态细胞及转化

CaCl₂法制备感受态细胞进行转化实验步骤如下：

①每种感受态细胞悬液各取200μL转移至无菌微量离心管中，每管加入连接液10μL，轻轻旋转混匀，然后置冰中放置30min(制备感受态细胞，使其具有摄取外源DNA的能力)。

②42℃热休克90s，快速将离心管转移到冰浴中冷却细胞1-2min。每管加入800μLLB培养基，水浴加温至37℃，然后放置摇床温育45min以复苏细菌。

③将150μL转化感受态细胞转移到AMP(100μg/ml)抗性的LB琼脂培养基上。把平板置于室温至液体被完全吸收。然后倒置平皿，置于37℃培养箱中培养16h。

④克隆进行后续PCR鉴定。

2.7.2重组质粒构建

PCR产物连接入线性化表达载体反应体系见表10，反应条件：25℃30min；42℃15min。

表10 PCR反应体系

X：线性化载体DNA的体积数；Y：纯化后PCR产物片段体积数。

2.7.3病毒包装

消化293T细胞，调整其密度为每20mL有1.2X 10⁷个细胞，接种细胞于培养皿中，放置37℃，5％CO₂培养箱中培养24h，待细胞密度达70％-80％时可用于细胞转染。细胞状态对于病毒包装至关重要，需要保证良好的细胞状态和较少的传代次数。转染前2h将含胎牛血清培养基更换为无血清培养基。向离心管中加入制备的各DNA溶液(pGC-LV载体20μg、pHelper1.0载体15μg、pHelper 2.0载体10μg)与相应体积培养基混合均匀，调整总体积为2.5mL，室温下温育5min。将Lipofectamine2000试剂轻柔摇匀，取100μLLipofectamine2000试剂在另一管中与2.4mL Opti‐MEM培养基混合，室温下温育5min。把稀释后的DNA与稀释后的Lipofectamine2000进行混合，轻颠混匀，避免振荡，且须5min内混合。混合后室温下温育20min，然后将混合液转移至293T细胞培养液中，混合均匀，放置37℃、5％CO₂培养箱中培养。培养8h后倒去培养基，每瓶细胞加入20mL磷酸盐缓冲液(PBS)，以洗涤残余混合液，移去混合液。每瓶细胞中加入含10％胎牛血清培养基25mL，放置37℃，5％CO₂培养箱内继续培养2天。

2.7.4滴度测定

(1)样品制备

293T细胞传代，24孔中每孔加入1×10⁵个细胞，体积为500μL；次日准备10个无菌Ep管，每管中加90μL培养基；取待测病毒原液10μL加入到第一个管中，混合均匀，取混合均匀的第一管液10μL加入到第二个管中继续相同的操作直到最后一管；选取所需细胞孔，吸去90μL培养基。加稀释好的病毒溶液，放置37℃，5％CO₂培养箱培养；1天后，加入新鲜培养基500μL。小心操作，4天后抽提RNA。

(2)总RNA抽提

去细胞上清液，每孔加入1mL Trizol，吹打，室温静置5min，转移至另一新1.5mLEp管中。每管加200μL氯仿，用力震荡15s，室温静置15min。4℃下120000r/min离心15min。从每管中吸取上清液至另一新1.5mL Ep管中。加入等体积-20℃预冷的异丙醇，混匀后-20℃沉淀10min。4℃下120000r/min离心10min，移去上清液。加入1mL4℃预冷的75％乙醇，洗涤沉淀及离心管壁。4℃下10000r/min离心5min，移弃上清液。4℃下10000r/min再次离心5min，吸去残液，室温下干燥，不需完全干燥。加20μL无RNA酶(RNase)水至完全溶解，紫外分析测定所抽提RNA浓度。

(3)RNA逆转录获cDNA

将1μL Oligo dT(0.5μg/μL)和2.0μg总RNA加入PCR小管，加焦碳酸二乙酯(DEPC)水至9μL。混合均匀、离心，70℃温浴10min。紧接着插入到0℃冰水浴中。按下表比例，根据反应管数算出所需试剂量。将M-MLV酶等在冰上混匀得到逆转录反应液。在每个反应管中加11μL逆转录反应液，混合均匀后离心。其中，11μL逆转录反应液含5×逆转录缓冲液4μL、10mmol/LdNTPs2μL、RNA抑制剂0.5μL、M-MLV-RTase1μL、DEPC水3.5μL。在42℃进行1h完成逆转录反应，后用70℃处理10min使逆转录酶失活。逆转录反应产物cDNA可用于PCR，也可-80℃长期保存。

(4)实时定量PCR检测

配置反应体系：每管加入SYBRpremix ex Taq10μL、上游引物(5μmol/L)1.0μL、下游引物(5μmol/L)1.0μL、cDNA1.0μL、ddH₂O 7.5μL。设定程序为两步法实时定量PCR。预变性95℃5s；变性95℃5s，退火60℃30s，延伸60℃30s，40个循环。每次在延伸阶段读取吸光值，用于制作熔解曲线。PCR结束后，在95℃变性1min。然后冷却至55℃，使DNA双链充分聚合。从55℃开始到95℃，每一步增加0.5℃，保持30s，同时读取吸光值。两个循环后将调定点升高0.5℃。

2.7.5慢病毒的收获及浓缩

收集转染后2d的293T细胞上清液，4℃、4000×g离心10min，以除去细胞碎片。用0.45μm过滤器过滤上清液到40mL超速离心管中。把病毒粗提液样品加入过滤杯中。将过滤杯插到滤过液收集管中，再4000×g离心至所需病毒浓缩体积，时间15min。离心结束后取出离心装置，将过滤杯和滤过液收集杯分开。将过滤杯倒扣在样品收集杯上，离心力不超过1000×g，时间2min(过高转速会使样品损失)。把过滤杯从样品收集杯上移开。样品收集杯中即为病毒浓缩液。

2.8小鼠VTA脑区定位注射

小鼠注射1.5％戊巴比戊钠下(40mg/kg，ip)麻醉，固定于脑立体定位上。根据小鼠VTA定位图谱(图6)，于左侧VTA(前囟后3.l mm，中线旁0.7mm，深度4.5mm)，埋置长约0.5mm的不锈钢管(内径0.34mm，外径0.48mm)，再用牙科水泥将其固定于颅骨表面，将不锈钢管外端固定于头部，缝合伤口，盖上配套内芯。术后注射青霉素钠(0.1万单位/只，每天一次)，连续注射三天防止感染。手术后第七天进行相应的行为学训练，VTA的药物注射量为lμL，注射时先拔出内芯，l min注射完毕，留针2min。小鼠VTA两侧注射病毒时，小鼠用麻醉后固定于脑立体定位上。10ml注射器针头穿孔后，用螺旋微量进样泵双侧注入0.5μL病毒(0.25μL每侧)，0.1μL/min，留针3min，缝合伤口。

2.9 NAD/MADH试剂盒检测

Abcam NAD/NADH Assay Kit材料成分组成如表11所示。

表11NAD/NADH Assay Kit材料成分组成表

(1)标准曲线的绘制

准备NADH标准液。在495μLNADH/NAD提取液中加入5μLNADH标准液进行稀释，得到10pmol/μL(10μM)NADH标准液。微量离心管中稀释标准曲线，如表12所示。

表12 NADH标准液稀释配制表

(2)样本准备

收获组织所必需的每个测定的量(20mg组织)。用冷PBS中洗组织。加入400μL的NADH/NAD提取液使其匀浆。最高速度离心5min，并转移提取的NAD/NADH上清液到一个新管中(冰上操作)。组织可能包含快速消耗NADH的酶。这些酶可通过10kD离心柱(ab93349)过滤而被除去，待用。

(3)检测

样品NADH检测的分解步骤：

①总NAD和NADH：提取样品不需要再处理。

②NADH：NAD+需要被分解。分装200μL提取样品加入微量管中。在水浴中或加热块中60℃加热30min(在这些条件下，所有的NAD+将分解而NADH仍然完好无损)。样本放在冰上。快速离心样品以去除析出的沉淀

③设置反应孔：

标准孔＝50μL标准品稀释。

空白对照样品孔＝1-50μL样品(用提取缓冲液调节体积到50μL/孔)。

NADt样品孔＝1-50μL样品(用提取缓冲液调节体积到50μL/孔)。

NADH样品孔＝1-50μL NAD分解样品(用提取缓冲液调节体积到50μL/孔)。

④反应混合物：

每个反应准备100μL反应预混合液，如表13所示：

表13反应混合液配制表

每个标准和样品孔中加入100μL反应混合物。添加100μL背景反应混合液到空白样品孔。室温下孵育5min，NAD转换到NADH。加入10μL NADH Developer液到每个孔并混匀。在室温下反应循环搅拌1-4h。在OD 450nm波长下，读取1-4h取多个读数。

3实验结果

3.1可卡因诱导条件性位置偏好

通过6天的条件性位置偏好训练，可卡因给药组与生理盐水组C57小鼠训练前后在偏好箱和非偏好箱停留的时间差值出现明显差异(图7)。可卡因给药组训练后测试(test)与测试前(Pretest)的时间差值为295±38s，而生理盐水对照组为44±58s。上述试验结果表明，通过20mg/kg可卡因条件性位置偏好训练，C57小鼠在可卡因训练箱体停留的时间显著增加，表明已建立了可靠的可卡因CPP模型。

3.2可卡因诱导的自发活动

通过10天的自发活动训练后，对比可卡因组和生理盐水组训练前后15min的自发活动量，可以发现可卡因给药组训练后自发活动量显著增加(P<0.05)(图8)。可卡因给药组在给药后2、3、4、5、6、7天的自发活动量也明显高于第一天(Day1)，并有明显统计学差异。说明可卡因可以诱导小鼠自发活动增加。

3.3可卡因诱导不同脑区NAMPT的表达

为了检测NAMPT在可卡因给药组和生理盐水对照组不同脑区的表达情况，CPP模型训练后解剖小鼠，取前额叶皮质(PFC)、伏隔核(NAc)、纹状体、海马和中脑腹侧被盖区进行Westernblot分析。结果表明，可卡因组与生理盐水组相比，NAMPT在前额叶皮质、纹状体和海马区的表达水平没有明显变化，但伏隔核和中脑腹侧被盖区中NAMPT表达水平显著升高(p<0.05)(图9)。

3.4可卡因诱导NAMPT的表达

为了检测NAMPT在NAc和VTA脑区中RNA表达的变化，我们取CPP模型中可卡因和生理盐水组的NAc和VTA脑区组织样本，提取组织RNA，通过质量检测之后，逆转录成cDNA，进行Real-TimePCR检测(各引物序列详见材料部分)，分析NAMPT在可卡因组和生理盐水组之间的相对表达(图10A)，并利用T-test中的双样本检验来计算其P值，从分析结果来看，NAMPT在VTA组织中表达上调具有统计学意义(p<0.05)，在NAc中没有明显变化。可卡因急性模型中：如单次给药后30min、单次给药后24h和连续单次给药7天解剖取相应脑区组织，Real-Time PCR检测，发现NAMPT在NAc和VTA中的表达无明显差异(图10B-C)。

3.5小鼠腹腔注射FK866降低可卡因CPP效应

为探索NAMPT在可卡因成瘾中的作用，我们选择可通过血脑屏障的NAMPT的特异性抑制剂——FK866作为探针，研究对其神经行为学影响。我们发现(如图11)，野生型小鼠腹腔注射4mg/kg FK866后，可卡因CPP和可卡因诱导的自发活动明显降低(P<0.05)，提示了NAMPT在可卡因成瘾中起正向作用。

3.6VTA脑内定位注射FK866抑制可卡因CPP效应

为了进一步验证FK866的可卡因CPP抑制作用，小鼠VTA脑内埋管手术恢复5-7天后，定位给予1μL浓度为10nM的FK866，再进行可卡因CPP训练。结果显示：VTA脑内定位注射FK866与对照组相比，可卡因CPP(如图12A)和自发活动(如图12B)均降低(P<0.05)。

3.7VTA脑内补充NMN逆转FK866的可卡因CPP效应

NMN是NAMPT催化烟酰胺代谢的直接作用产物，为了说明NAMPT在可卡因成瘾中的作用。VTA脑内定位注射1μL浓度为10nM的FK86630min后，再注射1uL浓度为10mg/mL的NMN，然后检测可卡因CPP活动。结果发现，注射抑制剂FK866后，可卡因CPP降低；但补充NMN后，消除了FK866对可卡因CPP的抑制作用(如图13)(P<0.05)。

3.8VTA脑内过表达NAMPT增加可卡因CPP效应

为直接检测NAMPT在可卡因成瘾中的作用，我们构建了NAMPT的过表达慢病毒载体。脑内VTA定位注射0.5uL病毒(每侧0.25uL)，恢复5-7天，再进行可卡因CPP训练。结果发现，小鼠VTA脑区NAMPT的过表达慢病毒载体与对照LV-GFP慢病毒载体相比，NAMPT的表达增加(如图14A)。VTA中过表达NAMPT(LV-NAMPT)与对照组(LV-GFP)相比可卡因的CPP活动增加(P<0.05)(如图14B)。

3.9腹腔给予FK866诱导小鼠代谢物改变

3.9.1组织样本的代谢谱

为了检测腹腔给予FK866后小鼠相关代谢物的改变，利用基于核磁共振代谢组学方法检测小鼠NAc和VTA样本。我们采用PCA模型进行核磁数据分析，以获得更准确的对照组与给药物组小鼠脑区代谢物的差别。结果显示，OSC-PLS-DA模型的载荷图如图所示(图15)，给药组和对照之间相比一系列与NAMPT代谢相关的内源性的代谢物发生了明显的改变，包括NMN和NAD。

3.9.2对照组和给药组之间的模式识别分析

为了更加详细的区分代谢物变化，我们应用一种多变量控制的数据分析手段—OSC-PLS-DA模型，以减小潜在的组内变化差异干扰，更加完善地分离代谢物。OSC-PLS-DA模型分析核磁共振检测数据，结果显示对照组、可卡因组和FK866处理组存在明显的代谢物谱差别(图16，图17)。进一步分析发现，其中与NAMPT代谢相关的代谢物在对照组和FK866处理组的VTA和NAc脑区之间表现出显著差异(表3-1，图3-9)，包括NMN和NAD。

按照双参数归属法，结合VIP＞1和P＜0.05的筛选条件，最终确定可卡因组和生理盐水组以及腹腔给予FK866后与NAMPT代谢相关的代谢物的变化。结果发现：可卡因组与生理盐水组相比，NMN和NAD水平增加；但腹腔给予FK866后，NMN和NAD水平降低(表3-1)。

表3-1腹腔注射FK866可卡因CPP模型代谢物变化概图

注：与对照组样品相比，↑表示含量相对增加，↓表示含量相对下降。

3.9.3关键代谢物的变化

NAMPT是NAD合成途径的关键酶，且NAD是细胞氧化还原反应中的经典辅酶。NAMPT将烟酰胺代谢为NMN，NMN进一步代谢为NAD。可卡因可诱导NAMPT的表达上调，而FK866特异性抑制NAMPT的活性，故影响NAD的合成。我们分析了生理盐水正常对照组、可卡因处理组和FK866给药组之间的差异代谢物，选取了其中与NAMPT代谢相关且具有代表性的代谢物，利用箱线图进行展示(图18)，箱线图可以展示代谢物变化的范围、中位数、四分位数等，可以明显的确定代谢物的变化趋势。

3.10检测可卡因CPP中NAD的变化

为了进一步确定NAD水平的变化，利用NAD/MADH试剂盒检测检测小鼠VTA新鲜样本，确定可卡因给药组和生理盐水对照组在各条件下对NAD的影响。结果显示(图19)，CPP模型中，可卡因可以诱导NAD水平增加；给予FK866后NAD降低；给予FK866后再补充NMN，NAD恢复；过表达NAMPT，NAD水平增加(P<0.05)。

4结论

基于核磁共振(NMR)的代谢组学检测，发现可卡因成瘾小鼠VTA脑区NMN、NAD水平增加，但给与FK866后NMN、NAD水平降低。定量检测也发现卡因成瘾小鼠VTA脑区NAD水平增加；脑区定位注射FK866则可降低NAD水平；但补充NMN，NAD水平得到恢复；VTA脑区过表达NAMPT后，NAD水平也增加。

建立小鼠可卡因条件性位置偏好(CPP)模型，通过行为学检测可卡因对小鼠的奖赏效应。我们发现，可卡因可以明显诱导小鼠NAc和VTA脑区NAMPT的表达上调。通过腹腔或 VTA脑区定位注射FK866后，可明显抑制小鼠可卡因CPP效应。在VTA脑区定位补充注射NMN，可以逆转FK866对可卡因CPP的抑制作用。在VTA定位注射NAMPT过表达病毒载体，可卡因CPP奖赏效应增强。实验结果说明，NAMPT抑制剂FK866可以抑制可卡因CPP奖赏效应。

综上，NAMPT抑制剂能够有效弱化可卡因奖赏行为，治疗可卡因成瘾，临床应用前景良好。

Claims (5)

1.NAMPT抑制剂在制备治疗可卡因成瘾的药物中的用途，

所述NAMPT抑制剂为FK866，其结构式如下：

2.根据权利要求1所述的用途，其特征在于：所述治疗可卡因成瘾的药物是 降低NAMPT酶活的药物。

3.一种以NAMPT抑制剂为活性成分，加上药学上可接受的辅料或者辅助性成分制备而成的制剂在制备治疗可卡因成瘾的药物中的用途；

所述NAMPT抑制剂为FK866，其结构式如下：

4.根据权利要求3所述的用途，其特征在于：所述NAMPT抑制剂为降低NAMPT酶活的药物。

5.根据权利要求3所述的用途，其特征在于：所述制剂是注射制剂。