CN105030809A

CN105030809A - 抑制靶基因表达的组合物

Info

Publication number: CN105030809A
Application number: CN201510516173.3A
Authority: CN
Inventors: 八木信宏; 榎园淳一
Original assignee: Kyowa Hakko Kirin Co Ltd
Current assignee: Kyowa Kirin Co Ltd
Priority date: 2008-08-01
Filing date: 2009-07-31
Publication date: 2015-11-11
Also published as: EP2319519B1; US9061042B2; KR20110042294A; KR101630888B1; WO2010013815A1; EP2319519A1; JP5801055B2; CN102112136A; CN103585107A; JPWO2010013815A1; ES2561812T3; JP2014177477A; EP2319519A4; US20110182980A1

Abstract

本发明的目的在于提供一种用于抑制靶基因表达的组合物等。本发明提供下述组合物等，所述组合物含有包封了RNA的脂质体，所述RNA含有靶基因mRNA的连续15～30个碱基的序列(以下记为序列X)及与该序列X互补的碱基的序列(以下记为互补序列X’)，与序列X及互补序列X’的碱基键合的糖的总计1～90％为在2’位上被修饰基团取代的核糖，所述脂质体是可到达包含靶基因表达部位的组织或脏器的脂质体。

Description

抑制靶基因表达的组合物

本申请是中国专利申请号为200980130771.X(PCT申请号为PCT/JP2009/063685，PCT公开号为WO2010/013815)、申请日为2009年7月31日、发明名称为“抑制靶基因表达的组合物”的中国发明专利申请的分案申请。

技术领域

本发明涉及用于抑制靶基因表达的组合物等。

背景技术

作为抑制靶基因表达的方法，已知例如利用RNA干涉(RNAinterference，以下称为RNAi)的方法等，具体而言，有报道指出通过在线虫中导入具有与靶基因相同的序列的双链RNA，可特异性地抑制该靶基因表达的现象[参见“自然(Nature)”，1998年，第391卷、第6669号，p.806-811]。另外，发现通过在果蝇中导入21～23碱基长度的双链RNA代替长双链RNA，可以抑制靶基因的表达，将其命名为短干扰RNA(shortinterferingRNA)(siRNA)(参见国际公开第01/75164号说明书)。

哺乳动物细胞中导入长双链RNA时，由于病毒防御机制引起细胞程序死亡，不能抑制特定的基因表达，但发现只要为20～29碱基的siRNA，则不会引起上述反应，可以抑制特定基因的表达。其中21～25个碱基的siRNA的表达抑制效果高[“自然(Nature)”，2001年，第411卷，第6836号，p.494-498，“遗传学自然评论(NatureReviewsGenetics)”，2002年，第3卷，第10号，p.737-747，“分子细胞(MolecularCell)”，(美国)，2002年，第10卷，第3号，p.549-561，“自然生物技术(NatureBiotechnology)”，(美国)，2002年，第20卷，第5号，p.497-500]。另外，已有报道指出，不仅是双链RNA，具有通过分子内杂交形成的发夹(hairpin)结构的单链RNA也与siRNA相同地显示为RNAi[参见“美国国家科学院院刊(ProceedingsoftheNationalAcademyofSciencesoftheUnitedStatesofAmerica)”，2002年，第99卷，第9号，p.6047-6052]。

关于RNAi，在体内试验中也经常得到验证，已经报道了对胎儿动物使用50个碱基对以下的siRNA的效果(参见专利文献1)及对成体小鼠的效果(参见专利文献2)。另外，静脉内给与小鼠胎鼠siRNA时，可确认在肾脏、脾脏、肺、胰脏及肝脏各脏器内具有抑制特定基因表达的效果(参见非专利文献1)。并且，还报道了在脑细胞中直接给与siRNA，也能抑制特定基因的表达(参见非专利文献2)。

另一方面，作为向细胞内输送核酸的方法，已知有使用阳离子脂质体或阳离子聚合物的方法。但是，该方法中，静脉内给与含有核酸的阳离子脂质体或阳离子聚合物后，核酸被迅速地从血中除去，靶组织为肝脏或肺以外的组织时，例如为肿瘤部位等时，不能将核酸输送到靶组织，不能够充分地发挥作用。因此，已有报道指出一种包封核酸的脂质体(在脂质体内包封了核酸的脂质体)可以解决核酸在血中被迅速地除去的问题(参见专利文献3～6及非专利文献3)。作为包封核酸等的脂质体的制备方法，专利文献3中报道了如下方法，即，例如将阳离子性脂质预先溶解在氯仿中，然后加入寡脱氧核苷酸(ODN)的水溶液和甲醇，混合后，通过离心分离使阳离子性脂质/ODN的复合体移至氯仿层中，再取出氯仿层，向其中加入聚乙二醇化磷脂、中性的脂质和水，形成油包水型(W/O)乳剂，采用逆相蒸发法处理，制备ODN内包脂质体，专利文献4及非专利文献3中报道了如下方法，即，将ODN溶解于pH3.8的柠檬酸水溶液中，加入脂质(乙醇中)，使乙醇浓度降低至20v/v％，制备ODN内包脂质体，进行定型过滤，通过透析除去过量的乙醇后，再在pH7.5下透析试样，除去附着在脂质体表面的ODN，制备ODN内包脂质体。上述方法均可制备包封核酸等有效成分的脂质体。

相对于此，在专利文献5及6中报道了通过在液体中用脂双层膜(lipidbilayermembrane)被覆微粒的方法，制备包封了核酸等有效成分的脂质体。在该方法中，通过减少含有分散有微粒且溶解了脂质的极性有机溶剂的水溶液中的极性有机溶剂的浓度，可以在液体中用脂双层膜被覆微粒。该方法中，能够以优异的效率制备例如适于静脉注射用微粒等的大小的用脂双层膜被覆的微粒(被覆微粒)。另外，专利文献5及6中，作为被覆微粒的例子，例如举出了由ODN或siRNA与阳离子性脂质构成的通过静电相互作用形成的复合体。有报道指出被覆该粒子得到的被覆微粒的粒径较小，可以用作注射剂，静脉内给与该被覆微粒时，显示较高的血中滞留性，较多地集聚在肿瘤组织。

专利文献1:美国公开第2002-132788号

专利文献2:国际公开第03/10180号说明书

专利文献3:日本特表2002-508765号公报

专利文献4:日本特表2002-501511号公报

专利文献5:国际公开第02/28367号说明书

专利文献6:国际公开第2006/080118号说明书

非专利文献1:“自然·遗传学(NatureGenetics)”，2002年，第32卷，第1号，p.107－108

非专利文献2:“自然生物技术(NatureBiotechnology)”，2002年，第20卷，第10号，p.1006－1010

非专利文献3:“生物化学与生物物理学报(BiochimicaetBiophysicaActa)”，2001年，第1510卷，p.152－166

发明内容

本发明的目的在于提供用于抑制靶基因表达的组合物等。

本发明涉及以下(1)～(54)项发明。

(1)一种组合物，含有包封了RNA的脂质体，所述RNA含有靶基因mRNA的连续15～30个碱基的序列(以下记为序列X)及与该序列X互补的碱基的序列(以下记为互补序列X’)，与序列X及互补序列X’的碱基键合的糖的总计1～90％为在2’位上被修饰基团取代的核糖，所述脂质体是可到达包含靶基因表达部位的组织或脏器的脂质体。

(2)如上述(1)所述的组合物，其中，所述脂质体是具有可静脉内给药的大小的脂质体。

(3)如上述(1)或(2)所述的组合物，其中，所述RNA是具有利用RNA干涉(RNAi)抑制该靶基因表达的作用的RNA。

(4)如上述(1)～(3)中任一项所述的组合物，其中，所述靶基因是与肿瘤或炎症相关的基因。

(5)如上述(1)～(4)中任一项所述的组合物，其中，所述靶基因是与血管新生(angiogenesis)相关的基因。

(6)如上述(1)～(4)中任一项所述的组合物，其中，所述靶基因是血管内皮生长因子、血管内皮生长因子受体、纤维芽细胞生长因子、纤维芽细胞生长因子受体、血小板衍生生长因子、血小板衍生生长因子受体、肝细胞生长因子、肝细胞生长因子受体、Kruppel样因子、Ets转录因子、核因子及低氧诱导因子中的任一种的基因。

(7)如上述(1)～(6)中任一项所述的组合物，其中，所述mRNA为人或小鼠的mRNA。

(8)如(1)～(7)中任一项所述的组合物，其中，所述包封了RNA的脂质体含有复合粒子及被覆该复合粒子的脂双层膜，所述复合粒子的构成成分为前导粒子(leadparticle)和该RNA，

该脂双层膜的构成成分可溶于极性有机溶剂，该脂双层膜的构成成分及该复合粒子可以分散在以特定浓度含有该极性有机溶剂的液体中。

(9)如(8)所述的组合物，其中，所述极性有机溶剂为醇。

(10)如(8)所述的组合物，其中，所述极性有机溶剂为乙醇。

(11)如(8)～(10)中任一项所述的组合物，其中，所述前导粒子是含有阳离子性物质的前导粒子，所述脂双层膜是以中性脂质及水溶性物质的脂质衍生物、脂肪酸衍生物或脂肪烃衍生物为构成成分的脂双层膜。

(12)如(1)～(7)中任一项所述的组合物，其中，所述包封了RNA的脂质体是含有复合粒子及被覆该复合粒子的脂双层膜的脂质体，所述复合粒子以含有阳离子性物质的前导粒子和该RNA为构成成分，

其中，该脂双层膜是以中性脂质及水溶性物质的脂质衍生物、脂肪酸衍生物或脂肪烃衍生物为构成成分的脂双层膜。

(13)如(11)或(12)所述的组合物，其中，所述阳离子性物质为选自N－[1－(2，3－二油酰丙基)]－N，N，N－三甲基氯化铵、N－[1－(2，3－二油酰丙基)]－N，N－二甲基胺、N－[1－(2，3－二油基氧基丙基)]－N，N，N－三甲基氯化铵、N－[1－(2，3－双十四烷氧基丙基)]－N，N－二甲基－N－羟乙基溴化铵及3β－[N－(N’，N’－二甲基氨基乙基)氨基甲酰基]胆固醇中的一种以上。

(14)如(11)～(13)中任一项所述的组合物，其中，所述水溶性物质的脂质衍生物、脂肪酸衍生物或脂肪烃衍生物为聚乙二醇－磷脂酰乙醇胺。

(15)如(11)～(14)中任一项所述的组合物，其中，所述中性脂质为卵黄卵磷脂。

(16)一种癌症或炎症疾病的治疗剂，所述治疗剂含有脂质体，所述脂质体含有复合粒子及被覆该复合粒子的脂双层膜，

所述复合粒子以前导粒子和RNA为构成成分，所述RNA含有与肿瘤或炎症相关的靶基因mRNA的连续15～30个碱基的序列(以下记为序列X₁)及与该序列互补的碱基的序列(以下记为互补序列X₁’)，与序列X₁及互补序列X₁’的碱基键合的糖的总计1～90％为在2’位上被修饰基团取代的核糖，

其中，该脂双层膜的构成成分可溶于极性有机溶剂，该脂双层膜的构成成分及该复合粒子能够分散在以特定浓度含有该极性有机溶剂的液体中。

(17)如(16)所述的癌症或炎症疾病的治疗剂，其中，所述极性有机溶剂为醇。

(18)如(16)所述的癌症或炎症疾病的治疗剂，其中，所述极性有机溶剂为乙醇。

(19)如(16)～(18)中任一项所述的癌症或炎症疾病的治疗剂，其中，所述前导粒子为含有阳离子性物质的前导粒子，所述脂双层膜是以中性脂质及水溶性物质的脂质衍生物、脂肪酸衍生物或脂肪烃衍生物为构成成分的脂双层膜。

(20)一种癌症或炎症疾病的治疗剂，所述治疗剂含有复合粒子及被覆该复合粒子的脂双层膜，所述复合粒子以含有阳离子性物质的前导粒子和RNA为构成成分，所述RNA含有与肿瘤或炎症相关的靶基因mRNA的连续15～30个碱基的序列(序列X₁)及与该序列互补的碱基的序列(互补序列X₁’)，与序列X₁及互补序列X₁’的碱基键合的糖的总计1～90％为在2’位上被修饰基团取代的核糖，

(21)如(19)或(20)所述的癌症或炎症疾病的治疗剂，其中，所述阳离子性物质为选自N－[1－(2，3－二油酰丙基)]－N，N，N－三甲基氯化铵、N－[1－(2，3－二油酰丙基)]－N，N－二甲基胺、N－[1－(2，3－二油基氧基丙基)]－N，N，N－三甲基氯化铵、N－[1－(2，3－双十四烷氧基丙基)]－N，N－二甲基－N－羟乙基溴化铵及3β－[N－(N’，N’－二甲基氨基乙基)氨基甲酰基]胆固醇中的一种以上。

(22)如(19)～(21)中任一项所述的癌症或炎症疾病的治疗剂，其中，所述水溶性物质的脂质衍生物、脂肪酸衍生物或脂肪烃衍生物为聚乙二醇－磷脂酰乙醇胺。

(23)如(19)～(22)中任一项所述的癌症或炎症疾病的治疗剂，其中，所述中性脂质为卵黄卵磷脂。

(24)如(16)～(23)中任一项所述的癌症或炎症疾病的治疗剂，其中，所述RNA是具有利用RNA干涉(RNAi)抑制该靶基因表达的作用的RNA。

(25)如(16)～(23)中任一项所述的癌症或炎症疾病的治疗剂，其中，与肿瘤或炎症相关的靶基因是与血管新生相关的基因。

(26)如(16)～(23)中任一项所述的癌症或炎症疾病的治疗剂，其中，所述与肿瘤或炎症相关的靶基因是血管内皮生长因子、血管内皮生长因子受体、纤维芽细胞生长因子、纤维芽细胞生长因子受体、血小板衍生生长因子、血小板衍生生长因子受体、肝细胞生长因子、肝细胞生长因子受体、Kruppel样因子、Ets转录因子、核因子及低氧诱导因子中的任一种的基因。

(27)如(16)～(26)中任一项所述的癌症或炎症疾病的治疗剂，其中，所述mRNA是人或小鼠的mRNA。

(28)一种癌症或炎症疾病的治疗方法，所述治疗方法将含有脂质体的组合物给与哺乳动物，所述脂质体含有复合粒子及被覆该复合粒子的脂双层膜：

所述复合粒子以前导粒子和RNA为构成成分，所述RNA含有与肿瘤或炎症相关的靶基因mRNA的连续15～30个碱基的序列(序列X₁)及与该序列互补的碱基的序列(互补序列X₁’)，与序列X₁及互补序列X₁’的碱基键合的糖的总计1～90％为在2’位上被修饰基团取代的核糖，

(29)如(28)所述的癌症或炎症疾病的治疗方法，其中，所述极性有机溶剂为醇。

(30)如(28)所述的癌症或炎症疾病的治疗方法，其中，所述极性有机溶剂为乙醇。

(31)如(28)～(30)中任一项所述的癌症或炎症疾病的治疗方法，其中，所述前导粒子是含有阳离子性物质的前导粒子，所述脂双层膜是以中性脂质及水溶性物质的脂质衍生物、脂肪酸衍生物或脂肪烃衍生物为构成成分的脂双层膜。

(32)一种癌症或炎症疾病的治疗方法，所述治疗方法将组合物给与哺乳动物，所述组合物含有复合粒子及被覆该复合粒子的脂双层膜，

所述复合粒子以含有阳离子性物质的前导粒子和RNA为构成成分，所述RNA含有与肿瘤或炎症相关的靶基因mRNA的连续15～30个碱基的序列(序列X₁)及与该序列互补的碱基的序列(互补序列X₁’)，与序列X₁及互补序列X₁’的碱基键合的糖的总计1～90％为在2’位上被修饰基团取代的核糖，

(33)如(31)或(32)所述的癌症或炎症疾病的治疗方法，其中，所述阳离子性物质为选自N－[1－(2，3－二油酰丙基)]－N，N，N－三甲基氯化铵、N－[1－(2，3－二油酰丙基)]－N，N－二甲基胺、N－[1－(2，3－二油基氧基丙基)]－N，N，N－三甲基氯化铵、N－[1－(2，3－双十四烷氧基丙基)]－N，N－二甲基－N－羟乙基溴化铵及3β－[N－(N’，N’－二甲基氨基乙基)氨基甲酰基]胆固醇中的一种以上。

(34)如(31)～(33)中任一项所述的癌症或炎症疾病的治疗方法，其中所述水溶性物质的脂质衍生物、脂肪酸衍生物或脂肪烃衍生物为聚乙二醇－磷脂酰乙醇胺。

(35)如(31)～(34)中任一项所述的癌症或炎症疾病的治疗方法，其中，所述中性脂质为卵黄卵磷脂。

(36)如(28)～(35)中任一项所述的癌症或炎症疾病的治疗方法，其中，所述RNA是具有利用RNA干涉(RNAi)抑制该靶基因表达的作用的RNA。

(37)如(28)～(35)中任一项所述的癌症或炎症疾病的治疗方法，其中，与肿瘤或炎症相关的靶基因是与血管新生相关的基因。

(38)如(28)～(35)中任一项所述的癌症或炎症疾病的治疗方法，其中，所述与肿瘤或炎症相关的靶基因是血管内皮生长因子、血管内皮生长因子受体、纤维芽细胞生长因子、纤维芽细胞生长因子受体、血小板衍生生长因子、血小板衍生生长因子受体、肝细胞生长因子、肝细胞生长因子受体、Kruppel样因子、Ets转录因子、核因子及低氧诱导因子中的任一种的基因。

(39)如(28)～(38)中任一项所述的癌症或炎症疾病的治疗方法，其中，mRNA是人或小鼠的mRNA。

(40)一种组合物在制备癌症或炎症疾病的治疗剂中的应用，所述组合物含有脂质体，所述脂质体含有复合粒子及被覆该复合粒子的脂双层膜，

(41)如(40)所述的应用，其中，所述极性有机溶剂为醇。

(42)如(40)所述的应用，其中，所述极性有机溶剂为乙醇。

(43)如(40)～(42)中任一项所述的应用，其中，所述前导粒子是含有阳离子性物质的前导粒子，所述脂双层膜是以中性脂质及水溶性物质的脂质衍生物、脂肪酸衍生物或脂肪烃衍生物为构成成分的脂双层膜。

(44)一种组合物在制备癌症或炎症疾病的治疗剂中的应用，所述组合物含有复合粒子及被覆该复合粒子的脂双层膜，

其中，该脂双层膜为以中性脂质及水溶性物质的脂质衍生物、脂肪酸衍生物或脂肪烃衍生物为构成成分的脂双层膜。

(45)如(43)或(44)所述的应用，其中，所述阳离子性物质为选自N－[1－(2，3-二油酰丙基)]－N，N，N－三甲基氯化铵、N－[1－(2，3－二油酰丙基)]－N，N－二甲基胺、N－[1－(2，3－二油基氧基丙基)]－N，N，N－三甲基氯化铵、N－[1－(2，3－双十四烷氧基丙基)]－N，N－二甲基－N－羟乙基溴化铵及3β－[N－(N’，N’－二甲基氨基乙基)氨基甲酰基]胆固醇中的一种以上。

(46)如(43)～(45)中任一项所述的应用，其中，所述水溶性物质的脂质衍生物、脂肪酸衍生物或脂肪烃衍生物为聚乙二醇－磷脂酰乙醇胺。

(47)如(43)～(46)中任一项所述的应用，其中，所述中性脂质为卵黄卵磷脂。

(48)如(40)～(47)中任一项所述的应用，其中，所述RNA是具有利用RNA干涉(RNAi)抑制该靶基因表达的作用的RNA。

(49)如(40)～(47)中任一项所述的应用，其中，所述与肿瘤或炎症相关的靶基因是与血管新生相关的基因。

(50)如(40)～(47)中任一项所述的应用，其中，所述与肿瘤或炎症相关的靶基因是血管内皮生长因子、血管内皮生长因子受体、纤维芽细胞生长因子、纤维芽细胞生长因子受体、血小板衍生生长因子、血小板衍生生长因子受体、肝细胞生长因子、肝细胞生长因子受体、Kruppel样因子、Ets转录因子、核因子及低氧诱导因子中任一种的基因。

(51)如(40)～(50)中任一项所述的应用，其中，所述mRNA为人或小鼠的mRNA。

(52)一种测定血液中siRNA浓度的方法，其特征在于，在含有siRNA的试液中加入与核酸形成复合体的试剂，使其与该siRNA形成电中性的复合体，分离该复合体并在再溶解液中溶解，利用高效液相色谱法分析所得的溶液，由此测定该siRNA的浓度。

(53)如(52)所述的血液中siRNA浓度的测定方法，其特征在于，使与被测定的siRNA具有不同的碱基数的核酸作为IS共存在试液中。

(54)如(52)或(53)所述的血液中siRNA浓度的测定方法，其特征在于，利用高效液相色谱法进行分析时使用的检测装置为质谱仪。

通过将本发明的含有脂质体的组合物给与哺乳动物等，能够抑制该靶基因的表达，所述脂质体包封有RNA，所述RNA含有靶基因RNA的连续15～30个碱基的序列及与该序列互补的碱基序列。

附图说明

[图1]表示给与实施例1中所得的制剂时血液中的RNA浓度。横轴表示给与制剂后的时间(小时)，纵轴表示血液中的RNA浓度(μmol/L)。

[图2]表示给与比较例1中所得的制剂时血液中的RNA浓度。横轴表示给与制剂后的时间(小时)，纵轴表示血液中的RNA浓度(μmol/L)。

[图3]表示给与实施例2中所得的制剂时血液中的RNA浓度。横轴表示给与制剂后的时间(小时)，纵轴表示血液中的RNA浓度(μmol/L)。

[图4]表示给与实施例3中所得的制剂时血液中的RNA浓度。横轴表示给与制剂后的时间(小时)，纵轴表示血液中的RNA浓度(μmol/L)。

[图5]表示给与比较例2中所得的制剂时血液中的RNA浓度。横轴表示给与制剂后的时间(小时)，纵轴表示血液中的RNA浓度(μmol/L)。

[图6]表示给与实施例4中所得的制剂时血液中的RNA浓度。纵轴表示血液中的RNA浓度(μmol/L)。

[图7]表示给与比较例3中所得的制剂时血液中的RNA浓度。纵轴表示血液中的RNA浓度(μmol/L)。

具体实施方式

作为本发明中的靶基因，只要为在哺乳动物中产生mRNA并进行表达的基因即可，没有特殊的限制。例如，优选与肿瘤或炎症相关的基因，较优选与血管新生相关的基因等，例如可以举出编码血管内皮生长因子(vascularendothelialgrowthfactor，以下简称VEGF)、血管内皮生长因子受体(vascularendothelialgrowthfactorreceptor，以下简称VEGFR)、纤维芽细胞生长因子、纤维芽细胞生长因子受体、血小板衍生生长因子、血小板衍生生长因子受体、肝细胞生长因子、肝细胞生长因子受体、Kruppel样因子(Kruppel-likefactor，以下简称KLF)、Ets转录因子、核因子、低氧诱导因子等蛋白质的基因等，具体而言，可以举出VEGF基因、VEGFR基因、纤维芽细胞生长因子基因、纤维芽细胞生长因子受体基因、血小板衍生生长因子基因、血小板衍生生长因子受体基因、肝细胞生长因子基因、肝细胞生长因子受体基因、KLF基因、Ets转录因子基因、核因子基因、低氧诱导因子基因等，优选举出VEGF基因、VEGFR基因、KLF基因等，较优选举出KLF基因，更优选举出KLF5基因。

KLF家族是以C末端的锌指(zincfinger)基序为特征的转录因子家族，已知KLF1、KLF2、KLF3、KLF4、KLF5、KLF6、KLF7、KLF8、KLF9、KLF10、KLF11、KLF12、KLF13、KLF14、KLF15、KLF16等。有报道指出，在哺乳动物中，KLF家族对各种组织或细胞例如红细胞、血管内皮细胞、平滑肌、皮肤、淋巴细胞等的分化十分重要，另外在癌症、心血管疾病、肝硬化、肾疾病、免疫疾病等各种疾病的病理条件的形成中也发挥重要的作用[生物化学杂志(TheJournalofBiologicalChemistry)，2001年，第276卷，第37号，p.34355－34358，基因组生物学(GenomeBiology)，2003年，第4卷，第2号，p.206]。

KLF家族中的KLF5也称为BTEB2(基本转录元件结合蛋白(basictranscriptionalelementbindingprotein2))或IKLF(肠富集Kruppel样因子(intestinal－enrichedKruppel－likefactor))。血管平滑肌中KLF5的表达在发生阶段受到抑制，在胎儿的血管平滑肌中高度表达，而在正常成人的血管平滑肌中未见表达。另外，在用气囊导管削剥后新生的血管内膜的平滑肌中，可见KLF5高度表达，在动脉硬化或再狭窄的病变部的平滑肌中也可见KLF5表达[循环(Circulation)，2000年，第102卷，第20号，p.2528－2534]。

VEGF是Ferrara等于1983年发现的血管内皮细胞特异性的增殖因子。同年，Senger、Dvorak等发现了具有血管透过性作用的因子，并将其命名为VPF(vascularpermeabilityfactor)。从蛋白质的氨基酸序列解析的结果可知，两者是同一物质。VEGF与位于血管内侧的内皮细胞的受体结合促进增殖。VEGF不仅在胎儿期形成血管时发挥作用，而且在病理血管的形成时也发挥作用。例如癌症发展到某种程度并且变得氧不足时，VEGF和其受体增加，引起血管新生。另外血管透过性亢进作用也被认为是癌症性腹水的原因。VEGF在糖尿病发展时视网膜上的新生血管的形成上也发挥作用。即，VEGF是形成新血管的蛋白质。可以说VEGF的表达被低氧状态所诱导，由此在血管新生中发挥重要作用。另外，不仅是血管新生，通过对肿瘤或炎症性病变等中出现的浮肿的机制进行的说明，也明显暗示出与该因子有关。

另一方面，VEGFR存在于血管内皮细胞或癌症细胞自身，通过VEGFR与受体结合，受体自身被磷酸化(活化)，结果向细胞内传达增殖或移动等各种命令。已知通过抑制该受体的磷酸化可以抑制向细胞内的传达、从而抑制血管新生。

另外，作为靶基因，例如可以举出B－CELLCLL/LYMPHOMA(以下简称bcl)基因，优选举出bcl2基因。

Bcl－2是抑制在几种细胞中由凋亡引起的细胞死亡的线粒体内膜蛋白质。Bcl－2蛋白质的大量表达引起的对凋亡的抑制被认为是癌症和血液学的恶性疾病等的原因。实际上，Bcl－2蛋白质在淋巴肉瘤、前列腺癌症、乳癌症、肺癌症、结肠癌症及直肠癌症等多种实体癌中大量产生(T.J.McDonnell等、“CancerResearch”、1992年12月15日，52卷，24号，p.6940-6944)。另外，有报道指出胸腺的凋亡与Bcl－2的表达有关(Kanavarosetal.,Histol.Histopathol.16(4):1005-12(Oct.2001))。

在大量产生Bcl－2蛋白质的细胞中，由于其凋亡抑制作用使得无法诱导细胞死亡，结果产生了对各种抗癌症剂的抗药性。另一方面，已知如果在前列腺癌症细胞中抑制Bcl－2的产生，则可以抑制细胞增殖，容易诱导凋亡(Shietal.,CancerBiother.Radiopharm.,16(5):421-9(Oct.2001))。因此，在实体癌及血液学的恶性疾病等其治愈中需要促进凋亡的疾病中，抑制Bcl－2蛋白质的表达的方法可以作为有效的治疗方法或预防方法。

作为本发明中使用的RNA，可以举出含有上述靶基因mRNA的连续15～30个碱基、优选17～25个碱基、较优选19～23个碱基的序列(以下记为序列X)及与该序列互补的碱基的序列(以下记为互补序列X’)的RNA，例如，本发明中使用的RNA中，可以举出由含有序列X的有义链及含有互补序列X’的反义链组成的双链RNA、或具有由间隔寡核苷酸(spaceroligonucleotide)连接该有义链和该反义链形成的发夹结构的RNA。

作为含有序列X的有义链，可以举出只含有序列X作为碱基的RNA(以下记为序列X链)、或者是在序列X链的3’端、5’端或两端添加相同或不同的1～6个、优选2～4个核苷酸的RNA。

作为含有互补序列X’的反义链，可以举出只含有互补序列X’作为碱基的RNA(以下记为互补序列X’链)、或者是在互补序列X’链的3’端、5’端或两端添加相同或不同的1～6个、优选2～4个核苷酸的双链RNA等。

作为具有由间隔寡核苷酸连接含有序列X的有义链和含有互补序列X’的反义链形成的发夹结构的RNA的间隔寡核苷酸，优选6～12个碱基的核苷酸，其5’端的序列优选为2个U。作为间隔寡核苷酸的例子，可以举出由UUCAAGAGA的碱基序列构成的寡核苷酸。可以将通过间隔寡核苷酸连接的2个RNA中的任一个作为5’端，优选含有序列X的有义链作为5’端。

序列X链及互补序列X’链中添加的核苷酸及间隔寡核苷酸的碱基可以为鸟嘌呤、腺嘌呤、胞嘧啶、胸腺嘧啶及尿嘧啶中的任一种或多种，另外，与各个碱基键合的糖可以为核糖、脱氧核糖或2’位的羟基被修饰基团取代的核糖中的任一种，作为添加的核苷酸，较优选为尿苷酸(U)及脱氧胸苷酸(dT)中的任1种或2种。另外，添加到序列X链的3’端的核苷酸的碱基序列可以为与在靶基因的mRNA内与序列X相邻的核苷酸的碱基序列相同的碱基序列，较优选该结构。另外，添加到互补序列X’链的3’端的核苷酸的碱基序列可以为与在靶基因的mRNA内与序列X相邻的核苷酸的碱基序列互补的碱基序列，较优选该结构。

作为本发明中使用的RNA的较优选例，例如可以举出下述双链RNA等：(a)由含有序列X的有义链及含有互补序列X’的反义链构成的双链RNA，所述序列X是靶基因mRNA的连续19～21个碱基的序列，所述有义链由序列X链及在该序列X链的3’端添加的相同或不同的2～4个的核苷酸构成，所述反义链由互补序列X’链及在该互补序列X’链的3’端添加的相同或不同的2～4个的核苷酸构成；(b)由含有序列X的有义链及含有互补序列X’的反义链构成的双链RNA，所述序列X为靶基因mRNA的连续23～25个碱基的序列，所述有义链为序列X链，所述反义链为互补序列X’链；(c)由含有序列X的有义链及含有互补序列X’的反义链构成的双链RNA，所述序列X为靶基因mRNA的连续23～27个碱基的序列，所述有义链由序列X链及在该序列X链的3’端添加的相同或不同的2～4个的核苷酸构成，所述反义链由互补序列X’链及在该互补序列X’链的3’端添加的相同或不同的2～4个的核苷酸构成，互补序列X’链的3’端添加的核苷酸的碱基序列是与在靶基因的mRNA内与序列X相邻的核苷酸的碱基序列互补的碱基序列。

另外，作为本发明中使用的RNA，优选举出具有利用RNA干涉(RNAi)抑制该靶基因表达的作用的RNA。

此处，以抑制Bcl2基因表达的RNA为例，对利用RNA干涉(RNAi)抑制靶基因表达的RNA进行说明。抑制其他基因表达的RNA也可以通过相同的步骤获得。

抑制Bcl－2基因表达的RNA可以基于与作为GenbankAccessionNo.NM_000633被登记的bcl-2的全长mRNA相对应的DNA碱基序列(序列号29)进行设计。取出该DNA碱基序列的连续15～30个碱基、优选17～27个碱基、较优选19～25个碱基的部分序列。计算取出的序列的GC含量，选择GC含量为20～80％、优选为30％～70％、较优选为40～60％的序列，将序列中的T被U取代的碱基序列作为序列X。由含有所选择的序列X的有义链及含有与序列X为互补序列的互补序列X’的反义链构成的双链RNA、或具有由间隔寡核苷酸连接该有义链和该反义链形成的发夹结构的RNA为抑制bcl－2基因表达的RNA。

进而，本发明中使用的RNA中，与序列X及互补序列X’的碱基键合的糖的总计1～90％、优选10～75％、较优选20～65％、最优选30～55％为2’位上被修饰基团取代的核糖。

本发明中所谓的核糖的2’位被修饰基团取代是指2’位的羟基被修饰基团取代，修饰基团可以与核糖2’位的羟基的立体构型相同或不同，优选与核糖2’位的羟基的立体构型相同。

与序列X及互补序列X’的碱基键合的糖除2’位上被修饰基团取代的核糖之外为核糖或脱氧核糖，优选除2’位上被修饰基团取代的核糖之外的糖全部为核糖。

本发明中使用的RNA，包括核糖核酸结构中的磷酸部、酯部等中含有的氧原子等被例如硫原子等其他原子取代得到的衍生物。

另外，本发明中使用的与RNA的5’末端的碱基键合的糖的各自5’位的羟基可以被磷酸基、修饰基团、或通过生物体内的核酸分解酶等变为磷酸基或修饰基团的基团修饰。优选与有义链的5’末端的碱基键合的糖的5’位羟基被磷酸化。

另外，本发明中使用的与RNA的3’末端的碱基键合的糖的各自3’位的羟基可以被磷酸基、修饰基团、或通过生体内的核酸分解酶等变为磷酸基或修饰基团的基团修饰。

作为本发明中的修饰基团，例如可以举出2’－氰基、2’－烷基、2’－取代烷基、2’－链烯基、2’－取代链烯基、2’－卤素、2’－O－氰基、2’－O－烷基、2’－O－取代烷基、2’－O－链烯基、2’－O－取代链烯基、2’－S－烷基、2’－S－取代烷基、2’－S－链烯基、2’－S－取代链烯基、2’－氰基、2’－NH－烷基、2’－NH－取代烷基、2’－NH－链烯基、2’－NH－取代链烯基、2’－SO－烷基、2’－SO－取代烷基、2’－羧基、2’－CO－烷基、－CO－取代烷基、－Se－烷基、－Se－取代烷基、－SiH₂－烷基、－SiH₂－取代烷基、2’－ONO₂、2’－NO₂、2’－N₃、2’－NH－烷基、2’－NH－取代烷基、2’－氨基酸残基(从氨基酸的羧酸中除去羟基得到的基团)、2’－O－氨基酸残基(与上述氨基酸残基含义相同)，另外，本发明中2’位被修饰基团取代的核糖也包括具有2’位的修饰基团与4’位的碳原子交联的结构的交联结构型人工核酸(BridgedNucleicAcid)(BNA)，更具体而言，也包括2’位的氧原子和4’位的碳原子通过亚甲基交联得到的锁定人工核酸(LockedNucleicAcid)(LNA)、及亚乙基交联结构型人工核酸(Ethylenebridgednucleicacid)(ENA)[NucleicAcidResearch,32,e175(2004)]等。

作为本发明中的修饰基团，优选2’－氰基、2’－卤素、2’－O－氰基、2’－烷基、2’－取代烷基、2’－O－烷基、2’－O－取代烷基、2’－O－链烯基、2’－O－取代链烯基、－Se－烷基、－Se－取代烷基，较优选2’－氰基、2’－氟、2’－氯、2’－溴、2’－三氟甲基、2’－O－甲基、2’－O－乙基、2’－O－异丙基、2’－O－三氟甲基、2’－O－[2－(甲氧基)乙基]、2’－O－(3－氨基丙基)、2’－O－(2－[N，N－二甲基]氨基氧基)乙基、2’－O－[3－(N，N－二甲基氨基)丙基]、2’－O－[2－[2－(N，N－二甲基氨基)乙氧基]乙基]及2’－O－[2－(甲基氨基)－2－氧代乙基]、2’－Se－甲基等，更优选2’－O－甲基、2’－O－乙基、2’－氟等，最优选2’－O－甲基、2’－O－乙基。

另外，本发明中的修饰基团的优选范围也可以基于其大小进行定义，优选相当于氟的大小至相当于－O－丁基大小的修饰基团，较优选相当于－O－甲基大小至相当于－O－乙基大小的修饰基团。

作为修饰基团中的烷基，例如为直链或支链状的碳原子数1～6的烷基，例如可以举出甲基、乙基、丙基、异丙基、丁基、异丁基、仲丁基、叔丁基、戊基、异戊基、新戊基、叔戊基、己基等，优选举出甲基、乙基、丙基、异丙基、异丁基、仲丁基、叔丁基、戊基、新戊基、叔戊基等。作为修饰基团中的链烯基，例如为直链或支链状的碳原子数1～6的链烯基，例如可以举出乙烯基、烯丙基、异丙烯基等。

作为卤素，可以举出氟原子、氯原子、溴原子、碘原子。

作为氨基酸，例如可以举出脂肪族氨基酸(具体而言为甘氨酸、丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸等)、羟基氨基酸(具体而言为丝氨酸、苏氨酸等)、酸性氨基酸(具体而言为天冬氨酸、谷氨酸等)、酸性氨基酸酰胺(具体而言为天冬酰胺、谷氨酰胺等)、碱性氨基酸(具体而言为赖氨酸、羟赖氨酸、精氨酸、鸟氨酸等)、含硫氨基酸(具体而言为半胱氨酸、胱氨酸、蛋氨酸等)、亚氨基酸(具体而言为脯氨酸、4－羟脯氨酸等)等。

作为取代烷基及取代链烯基的取代基，例如可以举出卤素(与上述卤素含义相同)、羟基、硫基(sulfanyl)、氨基、氧代、－O－烷基(与上述烷基含义相同)、－S－烷基(与上述烷基含义相同)、－NH－烷基(与上述烷基含义相同)、二烷基氨基氧基(所述2个烷基相同或不同，与上述烷基含义相同)、二烷基氨基(所述2个烷基相同或不同，与上述烷基含义相同)、二烷基氨基亚烷基氧基(所述2个烷基相同或不同，与上述烷基含义相同，该亚烷基是指从上述烷基中除去氢所得的基团)等，取代数优选为1～3。

需要说明的是，本发明中使用的RNA不依赖于制备方法、原料及中间体，例如即使原料或中间体为DNA或脱氧核糖，但只要最终的结构式相同，则也包括在本发明使用的RNA中。即，本发明中核糖的2’位被脱氧的核糖包括脱氧核糖，2’位被修饰基团取代的核糖包括2’位的氢被修饰基团取代的脱氧核糖。

本发明中使用的RNA中，2’位被修饰基团取代的核糖优选以使相邻的、2’位被修饰基团取代的核糖的数目最少的方式进行分布，较优选使2’位被修饰基团取代的核糖间隔1个、2个及3个位置进行组合且所述核糖全部不相邻地进行分布。另外，特别是与序列X的碱基键合的核糖中，较优选30～55％的所述核糖为2’位被修饰基团取代的核糖，且间隔1个位置，全部不相邻。

另外，序列X及互补序列X’中互补的碱基对中，相对于两方均为2’位被修饰基团取代的核糖，优选只在单侧为2’位被修饰基团取代的核糖，在上述的优选方式中，最优选间隔1个、2个及3个位置组合上述2’位被修饰基团取代的核糖，使上述2’位被修饰基团取代的核糖全部不相邻地进行分布。

本发明中使用的RNA可以使用已知的RNA或DNA合成法及RNA或DNA修饰法进行制备。例如可以委托北海道SystemScience株式会社等进行化学合成而得到。

作为本发明的组合物中的脂质体(以下称为脂质体A)，优选包封了RNA的脂质体，所述RNA含有靶基因mRNA的连续15～30个碱基的序列及与该序列互补的碱基的序列。该脂质体A只要是能够到达含有靶基因表达部位的组织或脏器的脂质体即可，没有特殊限定，但由于已知一些脂质体比其他脂质体更容易到达组织或脏器，所以应该适当选择脂质体A。

作为本发明中使用的脂质体A，例如可以举出下述脂质体，即，将阳离子性脂质/RNA的复合体分散在疏水性的有机溶剂层中，加入聚乙二醇化脂质、中性脂质和水，形成油包水型(W/O)乳剂，利用逆相蒸发法处理而制备得到的脂质体(参见日本特表2002－501511号公报)；将RNA溶解在酸性的电解质水溶液中，加入脂质(乙醇中)，降低乙醇浓度配制内含RNA的脂质体，之后，提高样品的pH并进行透析，除去附着在脂质体表面的上述RNA而制备得到的脂质体(参见日本特表2002－501511号公报及生物化学与生物物理学报(BiochimicaetBiophysicaActa),2001年,第1510卷,p.152－166)；由含有前导粒子和上述RNA的复合粒子及包封该复合粒子的脂双层膜构成的脂质体(参见国际公开第02/28367号说明书及国际公开第2006/080118号说明书)等，优选由含有前导粒子和上述RNA的复合粒子及包封该复合粒子的脂双层膜构成的脂质体，较优选该脂双层膜的构成成分可溶解于极性有机溶剂中，并且该脂双层膜的构成成分及该复合粒子能够分散在以特定浓度含有该极性有机溶剂的液体中。另外，作为脂质体A，优选举出由以含有阳离子性物质的前导粒子和上述RNA为构成成分的复合粒子、及被覆该复合粒子的脂双层膜构成，并且该脂双层膜以中性脂质及水溶性物质的脂质衍生物、脂肪酸衍生物或脂肪烃衍生物为构成成分的脂质体，较优选该脂双层膜的构成成分可溶解于极性有机溶剂中，并且该脂双层膜的构成成分及该复合粒子能够分散在以特定浓度含有该极性有机溶剂的液体中。需要说明的是，本发明中所谓的分散是指不溶解而进行分散。

已有报道指出上述示例的脂质体已被送达到肿瘤或产生炎症的组织或脏器，具体而言被送达到实体肿瘤及实体癌、血管或血管附近的炎症部位等，以与肿瘤或炎症相关的基因为靶基因时，可以优选使用上述脂质体。

另外，已有报道指出上述示例的脂质体在血液中的滞留性高，所以上述脂质体通过体循环送达到任意组织或脏器的可能性高，因此能作为靶基因的基因而不受限制。

作为本发明中的前导粒子，例如可以举出作为脂质集合体、脂质体、高分子胶束等的微粒，优选举出作为脂质体的微粒。本发明中的前导粒子可以为组合脂质集合体、脂质体、高分子胶束等中的2种以上得到的复合体，例如，可以为作为复合体的高分子胶束，所述复合体含有为脂质集合体、脂质体等的构成成分的脂质；或者可以为作为复合体的脂质集合体、脂质体等，所述复合体含有为高分子胶束的构成成分的高分子。

作为前导粒子的脂质集合体或脂质体(以下称为脂质体B)，例如可以由脂质及/或表面活性剂等构成，优选由脂质或脂质及表面活性剂构成。作为该脂质，可以为单纯脂质、复合脂质或衍生脂质中的任一种，例如可以举出磷脂、甘油糖脂、鞘糖脂、鞘氨醇碱(sphingoid)、固醇或阳离子性脂质等，但不限定于此。优选举出磷脂或阳离子性脂质。另外，作为脂质，例如也可以含有表面活性剂(与下述的表面活性剂含义相同)、高分子(与下述的高分子含义相同，具体而言为葡聚糖等)或聚氧乙烯衍生物(具体而言为聚乙二醇等)等脂质衍生物。作为表面活性剂，例如可以举出非离子性表面活性剂、阴离子性表面活性剂、阳离子性表面活性剂或两性表面活性剂等。

作为上述构成前导粒子的脂质中的磷脂，例如可以举出卵磷脂(具体而言为大豆卵磷脂、卵黄卵磷脂(EPC)、二硬脂酰卵磷脂、二棕榈酰卵磷脂、二肉豆蔻酰卵磷脂、二油酰卵磷脂等)、磷脂酰乙醇胺(具体而言为二硬脂酰磷脂酰乙醇胺(DSPE)、二棕榈酰磷脂酰乙醇胺、二油酰磷脂酰乙醇胺等)、甘油磷脂(具体而言为磷脂酰丝氨酸、磷脂酸、磷脂酰甘油、磷脂酰肌醇、溶血卵磷脂等)、鞘磷脂(sphingophospholipid)(具体而言为鞘磷脂(sphingomyelin)、磷酸乙醇胺神经酰胺、磷酸甘油神经酰胺、神经酰胺磷酸甘油磷酸酯(ceramidephosphoglycerophosphate)等)、甘油膦脂(glycerophosphonolipid)、鞘膦脂(sphingophosphonolipid)、天然卵磷脂(具体而言为卵黄卵磷脂、大豆卵磷脂等)或氢化磷脂(具体而言为氢化大豆卵磷脂等)等天然或合成的磷脂。

作为上述构成前导粒子的脂质中的甘油糖脂，例如可以举出磺氧基核糖基甘油酯(sulfoxyribosylglyceride)、二糖基二甘油酯、二半乳糖基二甘油酯、半乳糖基二甘油酯或糖基二甘油酯等。

作为上述构成前导粒子的脂质中的鞘糖脂，例如可以举出半乳糖基脑苷脂、乳糖基脑苷脂或神经节苷脂等。

作为上述构成前导粒子的脂质中的鞘氨醇碱，例如可以举出sphingan、icosasphingan、鞘氨醇或它们的衍生物等。作为衍生物，例如可以举出sphingan、icosasphingan或鞘氨醇等中的－NH₂变为－NHCO(CH₂)xCH₃(式中，x表示0～18的整数，其中优选6、12或18)的衍生物等。

作为上述构成前导粒子的脂质中的固醇，例如可以举出胆固醇、二氢胆固醇、羊毛固醇、β－谷固醇、菜油甾醇、豆甾醇、菜籽甾醇、麦角钙化甾醇(ergocasterol)、岩藻甾醇或3β－[N－(N’，N’－二甲基氨基乙基)氨基甲酰基]胆固醇(DC－Chol)等。

作为上述构成前导粒子的脂质中的阳离子性脂质，例如可以举出N－[1－(2，3－二油酰丙基)]－N，N，N－三甲基氯化铵(DOTAP)、N－[1－(2，3－二油酰丙基)]－N，N－二甲基胺(DODAP)、N－[1－(2，3－二油基氧基丙基)]－N，N，N－三甲基氯化铵(DOTMA)、2，3－二油酰氧基－N－[2－(精胺羧基酰胺)乙基]－N，N－二甲基－1－丙基三氟乙酸铵(DOSPA)、N－[1－(2，3－双十四烷氧基丙基)]－N,N－二甲基－N－羟乙基溴化铵(DMRIE)或N－[1－(2，3－二油基氧基丙基)]－N，N－二甲基－N－羟乙基溴化铵(DORIE)等。

作为上述构成前导粒子的非离子性表面活性剂，例如可以举出聚氧乙烯脱水山梨糖醇单油酸酯(具体而言为聚山梨酸酯80等)、聚氧乙烯聚氧化丙烯二醇(具体而言为普鲁洛尼克(Pluronic)F68等)、脱水山梨糖醇脂肪酸酯(具体而言为脱水山梨糖醇单月桂酸酯、脱水山梨糖醇单油酸酯等)、聚氧乙烯衍生物(具体而言为聚氧乙烯氢化蓖麻油60、聚氧乙烯月桂醇等)或甘油脂肪酸酯等。

作为上述构成前导粒子的阴离子性表面活性剂，例如可以举出酰肌氨酸、烷基硫酸钠、烷基苯磺酸盐、碳原子数7～22的脂肪酸钠等。具体而言可以举出十二烷基硫酸钠、月桂基硫酸钠、胆酸钠、脱氧胆酸钠或牛磺脱氧胆酸钠等。

作为上述构成前导粒子的阳离子性表面活性剂，例如可以举出烷基胺盐、酰基胺盐、季铵盐、胺衍生物等。具体而言可以举出苯扎氯铵、酰基氨基乙基二乙基胺盐、N－烷基聚烷基聚胺盐、脂肪酸聚乙烯聚酰胺、十六烷基三甲基溴化铵、十二烷基三甲基溴化铵、烷基聚氧乙烯胺、N－烷基氨基丙基胺或脂肪酸三乙醇胺脂肪酸酯等。

作为上述构成前导粒子的两性表面活性剂，例如可以举出3－[(3－胆酰胺丙基)二甲基铵基]－1－丙磺酸或N－十四烷基－N，N－二甲基－3－铵基－1－丙磺酸等。

脂质体B中，上述脂质及表面活性剂可以单独使用或组合2种以上进行使用，优选组合2种以上进行使用。作为组合2种以上进行使用时的组合，例如可以举出选自氢化大豆卵磷脂、聚乙二醇化磷脂及胆固醇中的2种成分以上的组合。选自二硬脂酰卵磷脂、聚乙二醇化磷脂及胆固醇中的2种成分以上的组合，EPC和DOTAP的组合，EPC、DOTAP及聚乙二醇化磷脂的组合，EPC、DOTAP、胆固醇及聚乙二醇化磷脂的组合等。

另外，脂质体B可以根据需要含有例如胆固醇等固醇等膜稳定化剂，例如生育酚等抗氧化剂等。上述稳定化剂可以单独使用或者组合2种以上进行使用。

作为脂质集合体，例如可以举出球状胶束、球状逆胶束、腊肠状胶束、腊肠状逆胶束、板状胶束、板状逆胶束、六角相I、六角相II及由2分子以上的脂质构成的缔合体、乳液微粒(例如脂肪乳剂、由非离子性表面活性剂和大豆油构成的乳剂、脂质乳剂(lipidemulsion)、脂质纳米球(lipidnanosphere)等水包油型(O/W)乳剂或水包油包水型(W/O/W)乳液微粒等)。

作为高分子胶束，例如可以举出由蛋白质、白蛋白、葡聚糖、polyfect、脱乙酰壳多糖、硫酸葡聚糖和例如聚－L－赖氨酸、聚乙烯亚胺、聚天冬氨酸、苯乙烯马来酸共聚物、异丙基丙烯酰胺－丙烯酰基吡咯烷酮共聚物、聚乙二醇修饰的树枝状高分子(dendrimer)、聚乳酸、聚乳酸聚乙二醇酸或聚乙二醇化聚乳酸等高分子或它们的盐中的一种以上形成的胶束。

此处，高分子的盐，包括例如金属盐、铵盐、酸加成盐、有机胺加成盐、氨基酸加成盐等。作为金属盐，例如可以举出锂盐、钠盐、钾盐等碱金属盐，镁盐、钙盐等碱土金属盐，铝盐或锌盐等。作为铵盐，例如可以举出铵或四甲基铵等的盐。作为酸加成盐，例如可以举出盐酸盐、硫酸盐、硝酸盐或磷酸盐等无机酸盐，及乙酸盐、马来酸盐、富马酸盐或柠檬酸盐等有机酸盐。作为有机胺加成盐，例如可以举出吗啉或哌啶等的加成盐。作为氨基酸加成盐，例如可以举出甘氨酸、苯丙氨酸、天冬氨酸、谷氨酸或赖氨酸等的加成盐。

另外，本发明中的前导粒子可以含有选自例如糖、肽、核酸及水溶性高分子中的1种以上物质的脂质衍生物或脂肪酸衍生物、或表面活性剂等。选自糖、肽、核酸及水溶性高分子中的1种以上物质的脂质衍生物或脂肪酸衍生物、或表面活性剂可以作为前导粒子的构成成分使用，也可以添加到前导粒子中使用。

作为选自糖、肽、核酸及水溶性高分子中的1种以上物质的脂质衍生物或脂肪酸衍生物、或表面活性剂，优选举出糖脂质、或水溶性高分子的脂质衍生物或脂肪酸衍生物，较优选举出水溶性高分子的脂质衍生物或脂肪酸衍生物。选自糖、肽、核酸及水溶性高分子中的1种以上物质的脂质衍生物或脂肪酸衍生物、或表面活性剂优选为具有两性的物质，即分子的一部分具有通过例如疏水性亲和力、静电相互作用等与前导粒子的其他构成成分键合的性质，另一部分具有通过例如亲水性亲和力、静电相互作用等与制备前导粒子时的溶剂键合的性质。

作为糖、肽或核酸的脂质衍生物或脂肪酸衍生物，可以举出例如蔗糖、山梨糖醇、乳糖等糖，例如来自酪蛋白的肽、来自蛋白的肽、来自大豆的肽、谷胱甘肽等肽，或者例如DNA、RNA、质粒、siRNA、ODN等核酸，与上述前导粒子定义中举出的脂质或例如硬脂酸、棕榈酸、肉豆蔻酸、月桂酸等脂肪酸键合得到的物质等。

另外，作为糖的脂质衍生物或脂肪酸衍生物，也包括例如上述前导粒子的定义中举出的甘油糖脂或鞘糖脂等。

作为水溶性高分子的脂质衍生物或脂肪酸衍生物，例如可以举出聚乙二醇、聚甘油、聚乙烯亚胺、聚乙烯醇、聚丙烯酸、聚丙烯酰胺、寡糖、糊精、水溶性纤维素、葡聚糖、硫酸软骨素、聚甘油、脱乙酰壳多糖、聚乙烯吡咯烷酮、聚天冬酰胺(polyaspartateamide)、聚－L－赖氨酸、甘露聚糖、茁霉多糖、甘油低聚物(oligoglycerol)等或它们的衍生物，与上述前导粒子的定义中举出的脂质、或例如硬脂酸、棕榈酸、肉豆蔻酸、或月桂酸等脂肪酸键合得到的衍生物等，较优选举出聚乙二醇衍生物、聚甘油衍生物等的脂质衍生物或脂肪酸衍生物，更优选举出聚乙二醇衍生物的脂质衍生物或脂肪酸衍生物。

作为聚乙二醇衍生物的脂质衍生物或脂肪酸衍生物，例如可以举出聚乙二醇化脂质(具体而言有聚乙二醇－磷脂酰乙醇胺(更具体而言有1,2－二硬脂酰－sn－甘油基－3－磷酸乙醇胺－N－[甲氧基(聚乙二醇)－2000](PEG－DSPE)等)、聚氧乙烯氢化蓖麻油60、聚氧乙烯蓖麻油(CREMOPHOREL)等)、聚乙二醇脱水山梨糖醇脂肪酸酯类(具体而言为聚氧乙烯脱水山梨糖醇单油酸酯等)或聚乙二醇脂肪酸酯类等，较优选举出聚乙二醇化脂质。

作为聚甘油衍生物的脂质衍生物或脂肪酸衍生物，例如可以举出聚甘油化脂质(具体而言为聚甘油－磷脂酰乙醇胺等)或聚甘油脂肪酸酯类等，较优选举出聚甘油化脂质。

作为表面活性剂，例如可以举出上述前导粒子的定义中举出的表面活性剂、聚乙二醇烷基醚等，优选举出聚氧乙烯聚氧化丙烯二醇、甘油脂肪酸酯或聚乙二醇烷基醚等。

优选上述前导粒子带有正电荷。此处所谓的正电荷包括对上述RNA内的电荷、分子内极化等产生静电引力的电荷、表面极化等。为了使前导粒子带有正电荷，优选前导粒子含有阳离子性物质，较优选前导粒子含有阳离子性脂质。

前导粒子中含有的阳离子性物质为呈现阳离子性的物质，但即使是具有阳离子性基团和阴离子性基团的两性物质，由于相对电负性根据pH或与其他物质键合等而变化，所以根据不同情况，可分类为阳离子性物质。上述阳离子性物质可以作为前导粒子的构成成分使用，也可以添加到前导粒子中加以使用。

作为阳离子性物质，例如可以举出上述前导粒子的定义中举出的物质中的阳离子性物质[具体而言，有阳离子性脂质、阳离子性表面活性剂(与上述含义相同)、阳离子性高分子等]、能够在等电点以下的pH值下呈现阳离子性的蛋白质或肽等。优选举出选自N－[1－(2，3－二油酰丙基)]－N，N，N－三甲基氯化铵、N－[1－(2，3－二油酰丙基)]－N，N－二甲基胺、N－[1－(2，3－二油基氧基丙基)]－N，N，N－三甲基氯化铵、N－[1－(2，3－双十四烷氧基丙基)]－N，N－二甲基－N－羟乙基溴化铵及3β－[N－(N’，N’－二甲基氨基乙基)氨基甲酰基]胆固醇中的一种以上。

作为脂质中的阳离子性物质，例如可以举出DOTAP、DODAP、DOTMA、DOSPA、DMRIE、DORIE或DC－Chol等。

作为阳离子性高分子，例如可以举出聚－L－赖氨酸、聚乙烯亚胺、polyfect或脱乙酰壳多糖等。

作为能够在等电点以下的pH值下呈现阳离子性的蛋白质或肽，只要为能够在该物质的等电点以下的pH值下呈现阳离子性的蛋白质或肽即可，没有特殊限定。作为该蛋白质或肽，例如可以举出白蛋白、血清类粘蛋白、球蛋白、血纤维蛋白原、胃蛋白酶或核糖核酸酶T1等。

本发明中的前导粒子可以采用公知的制备方法或以其为基准进行制备，可以是使用任意制备方法制备得到的前导粒子。例如，作为前导粒子之一的脂质体B的制备可以适用公知的脂质体的制备方法。作为公知的脂质体的制备方法，例如可以举出Bangham等的脂质体制备方法[参见“分子生物学杂志(J.Mo1.Bio1.)”，1965年，第13卷，p.238－252]、乙醇注入法[参见“细胞生物学杂志(J.CellBiol.)”，1975年，第66卷，p.621－634]、法式压滤法(Frenchpressmethod)[参见“FEBSLett.”，1979年，第99卷，p.210－214]、冷冻融解法[参见“生物化学与生物物理学报(Arch.Biochem.Biophys.)”，1981年，第212卷，p.186－194]、逆相蒸发法[参见“美国国家科学院院刊(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)”，1978年，第75卷，p.4194－4198]或pH梯度法(参见例如日本专利第2572554号公报，日本专利第2659136号公报等)等。制备脂质体B时，作为使脂质体B分散的溶液，例如可以使用水、酸、碱、各种缓冲液、生理盐水、氨基酸输液等。另外，制备脂质体B时，也可以添加例如柠檬酸、抗坏血酸、半胱氨酸或乙二胺四乙酸(EDTA)等抗氧化剂，例如甘油、葡萄糖、氯化钠等等渗剂等。另外，可以如下制备脂质体，将脂质等溶解于例如乙醇等有机溶剂中，蒸馏除去溶剂后，添加生理盐水等，振动搅拌，形成脂质体B。

另外，也可以任意地通过例如非离子性表面活性剂(与上述含义相同)、阳离子性表面活性剂(与上述含义相同)、阴离子性表面活性剂(与上述含义相同)、高分子、聚氧乙烯衍生物等进行脂质体B等的前导粒子的表面改质[参见D.D.Lasic、F.Martin编写的“StealthLiposomes”(美国)，CRCPressInc，1995年，p.93－102]。作为可在表面改质中使用的高分子，例如可以举出葡聚糖、茁霉多糖、甘露聚糖、支链淀粉(amylopectin)或羟乙基淀粉等。作为聚氧乙烯衍生物，例如可以举出聚山梨酸酯80、普鲁洛尼克F68、聚氧乙烯氢化蓖麻油60、聚氧乙烯月桂醇或PEG-DSPE等。脂质体B等的前导粒子的表面改质也可以通过使前导粒子含有选自糖、肽、核酸及水溶性高分子中的一种以上物质的脂质衍生物或脂肪酸衍生物、或表面活性剂的方法中的一种进行。

脂质体B的平均粒径可以根据需要自由地选择。优选调节为下述前导粒径。作为调节脂质体B的平均粒径的方法，例如可以举出挤压延伸(extrusion)法、机械式粉碎(具体而言，使用蒙顿胶体磨、超微粒分散乳化机等)较大的多层脂质体(MLV)的方法[参见R.H.Muller、S.Benita、B.Bohm编著的“EmulsionandNanosuspensionsfortheFormulationofPoorlySolubleDrugs”，德国斯图加特，ScientificPublishers，1998年，p.267－294]等。

另外，将选自作为前导粒子的例如脂质集合体、脂质体B、高分子胶束等中的2种以上物质组合得到的复合体的制备方法，例如可以为只在水中混合脂质、高分子等的制备方法，根据需要也可以进一步加入整粒工序或无菌化工序等。另外，也可以在例如丙酮或乙醚等各种溶剂中进行复合体的制备。

本发明中的前导粒子的大小，优选平均粒径为数nm～数十μm，较优选约为10nm～1000nm，更优选约为50nm～300nm。

作为本发明中被覆含有前导粒子和RNA的复合粒子的脂双层膜的构成成分，例如可以举出上述前导粒子的定义中举出的脂质或表面活性剂等，优选举出脂质或表面活性剂中的中性脂质，此处，上述所谓中性脂质，是指下述物质之外的脂质，即脂质、表面活性剂中，上述前导粒子带有正电荷时阳离子性物质中列举的脂质中的阳离子性物质和阳离子性表面活性剂及下述的附着竞争剂中列举的阴离子性脂质和阴离子性表面活性剂之外的脂质，作为中性脂质，优选举出磷脂、甘油糖脂、鞘糖脂等。较优选举出磷脂，更优选举出EPC。上述脂质或表面活性剂可以单独使用或者组合2种以上进行使用。

另外，被覆复合粒子的脂双层膜的构成成分优选可溶于极性有机溶剂，并且优选能够分散在以特定浓度含有该极性有机溶剂的液体中。以特定浓度含有该极性溶剂的液体中的该极性溶剂的浓度优选该脂双层膜的构成成分能够分散、该复合粒子也能够分散的浓度。作为该极性有机溶剂，例如可以举出甲醇、乙醇、正丙醇、2－丙醇、正丁醇、2－丁醇、叔丁醇等醇，甘油、乙二醇、丙二醇等二醇，或聚乙二醇等聚亚烷基二醇等，其中，优选醇，较优选乙醇。

作为本发明中的含有极性有机溶剂的液体中的、极性有机溶剂之外的溶剂，例如可以举出水、液体二氧化碳、液烃、卤化碳或卤化烃等，优选举出水。另外，也可以含有离子或缓冲成分等。可以使用1种或2种以上的溶剂，但使用2种以上时，优选相容的组合。

另外，作为被覆复合粒子的脂双层膜中使用的脂质，例如也可以优选举出合成脂质等。作为合成脂质，例如可以举出氟化卵磷脂、氟化表面活性剂或溴化二烷基铵等，上述物质可以单独使用也可以与其他脂质等组合使用。

另外，被覆复合粒子的脂双层膜优选含有水溶性物质的脂质衍生物、脂肪酸衍生物或脂肪烃衍生物、或上述表面活性剂。作为水溶性物质的脂质衍生物、脂肪酸衍生物或脂肪烃衍生物，例如可以举出选自上述的糖、肽、核酸及水溶性高分子中的1种以上物质的脂质衍生物或脂肪酸衍生物、或者选自糖、肽、核酸及水溶性高分子中的1种以上物质的脂肪烃衍生物。作为水溶性物质的脂质衍生物、脂肪酸衍生物或脂肪烃衍生物，较优选上述水溶性高分子的脂质衍生物或脂肪酸衍生物，更优选上述聚乙二醇化磷脂，最优选聚乙二醇－磷脂酰乙醇胺。需要说明的是，作为本发明中的水溶性物质的脂肪烃衍生物，可以举出水溶性物质与例如长链脂肪醇、聚氧丙烯烷烃或甘油脂肪酸酯的醇性残基等键合形成的衍生物。

作为糖、肽或核酸的脂肪烃衍生物，可以举出下述物质的脂肪烃衍生物，例如蔗糖、山梨糖醇或乳糖等糖、例如来自酪蛋白的肽、来自蛋白的肽、来自大豆的肽或谷胱甘肽等肽、或者例如DNA、RNA、质粒、siRNA或ODN等核酸。

作为水溶性高分子的脂肪烃衍生物，可以举出例如聚乙二醇、聚甘油、聚乙烯亚胺、聚乙烯醇、聚丙烯酸、聚丙烯酰胺、寡糖、糊精、水溶性纤维素、葡聚糖、硫酸软骨素、聚甘油、脱乙酰壳多糖、聚乙烯吡咯烷酮、聚天冬酰胺、聚－L－赖氨酸、甘露聚糖、茁霉多糖、甘油低聚物等或它们的衍生物的脂肪烃衍生物，较优选举出聚乙二醇衍生物或聚甘油衍生物等的脂肪烃衍生物，更优选举出聚乙二醇衍生物的脂肪烃衍生物。

前导粒子是作为脂质体B的微粒时，含有以脂质体B和上述RNA为构成成分的复合粒子及被覆该复合粒子的脂双层膜的脂质体成为脂质体A，根据其构成，分类为狭义的脂质体，即使前导粒子是除作为脂质体B的微粒之外的微粒时，也由于被覆脂双层膜，所以被分类为广义的脂质体。在本发明中，较优选前导粒子是作为脂质体B的微粒。

本发明中以前导粒子和上述RNA为构成成分的复合粒子，可以在制备该前导粒子后或在制备该前导粒子的同时，将该RNA附着在前导粒子上或包封在前导粒子中，制备复合粒子，然后在制备该复合粒子后或制备该复合粒子的同时，用脂双层膜被覆该复合粒子，由此制备脂质体A。脂质体A例如可以根据日本特表2002－508765号公报、日本特表2002－501511号公报、“BiochimicaetBiophysicaActa”，2001年，第1510卷，p.152－166、国际公开第02/28367号说明书等中记载的公知制备方法或以其为基准进行制备，或者例如采用包括下述工序的制备方法进行制备，所述工序为：将上述RNA附着在前导粒子上或包封在前导粒子中制备复合粒子后，使该复合粒子及被覆层成分分散于液体中的工序，所述液体含有可溶解该被覆层成分的极性有机溶剂，其浓度为该复合粒子不溶解、该被覆层成分以分散状态存在的浓度；及用该被覆层成分被覆该复合粒子的工序。本发明中以前导粒子和上述RNA为构成成分的复合粒子优选如下制备：在水中制备前导粒子，在制备该前导粒子后或制备该前导粒子的同时，将上述RNA分散或者溶解在水中并与前导粒子混合，使该RNA附着在前导粒子上或包封在前导粒子中制备复合粒子，或者在任意的溶剂中制备前导粒子后，将该前导粒子分散在水中，将上述RNA分散或溶解于水中并与前导粒子混合，使该RNA附着在前导粒子上进行制备，较优选在水中制备前导粒子，制备该前导粒子后，将上述RNA分散或溶解于水中并与上述前导粒子混合，使该RNA附着在前导粒子上进行制备。

作为本发明的组合物中的脂质体A的优选制备方法，可以举出包括下述工序的制备方法，所述工序为：下述的制备以前导粒子和上述RNA为构成成分的复合粒子的工序(工序1)及用脂双层膜被覆该复合粒子的工序(工序2或工序3)。

工序1)制备以前导粒子和上述RNA为构成成分的复合粒子的工序

优选将前导粒子分散在例如水等溶剂中，通过混合将上述RNA分散或溶解而使其包含在分散有前导粒子的液体中，由此使该RNA附着在前导粒子上。在工序1中，为了抑制前导粒子的凝集，优选前导粒子为含有凝集抑制物质的前导粒子，作为凝集抑制物质，优选举出选自上述糖、肽、核酸及水溶性高分子中的1种以上物质的脂质衍生物或脂肪酸衍生物、或表面活性剂。另外，前导粒子为带有正电荷的粒子时，在分散有前导粒子的溶液中，可以使该RNA和附着竞争剂共存，使附着竞争剂与该RNA一同附着在前导粒子上，进而前导粒子为含有凝集抑制物质的前导粒子时，为了进一步抑制前导粒子的凝集，也可以使用附着竞争剂。作为前导粒子和上述RNA的组合，优选复合粒子能够分散在含有极性有机溶剂的液体中的组合，较优选复合粒子在极性有机溶剂中的溶解度低于工序2或3中使用的脂双层膜的构成成分的组合。另外，较优选在含有该极性有机溶剂的液体中存在以下述浓度含有该极性有机溶剂的液体的组合，以所述浓度含有该极性有机溶剂时该脂双层膜构成成分能够分散、该复合粒子也能分散。

作为附着竞争剂，例如可以举出阴离子性物质等，该阴离子性物质包括通过分子内电荷、分子内极化等产生的静电引力而静电地附着在前导粒子上的物质。用作附着竞争剂的阴离子性物质为呈阴离子性的物质，但即使是含有阴离子性基团和阳离子性基团二者的两性物质，由于通过pH或与其他物质结合等使相对电负性发生变化，所以根据情况可被分类为阴离子性物质。

作为阴离子性物质，可以举出阴离子性脂质、阴离子性表面活性剂(与上述含义相同)、阴离子性高分子等或在等电点以上的pH值下呈阴离子性的蛋白质、肽或核酸等，优选举出硫酸葡聚糖、葡聚糖硫酸钠、硫酸软骨素、软骨素硫酸钠、透明质酸、软骨素、硫酸皮肤素、硫酸乙酰肝素、肝素、硫酸角质素或葡聚糖葡聚糖荧光素阴离子等。上述阴离子性物质可以单独使用或者组合2种以上进行使用。

作为阴离子性脂质，例如可以举出磷脂酰丝氨酸、磷脂酰甘油、磷脂酰肌醇或磷脂酸等。

作为阴离子性高分子，例如可以举出聚天冬氨酸、苯乙烯马来酸共聚物、异丙基丙烯酰胺－丙烯酰基吡咯烷酮共聚物、聚乙二醇修饰的树枝状高分子、聚乳酸、聚乳酸聚乙二醇酸、聚乙二醇化聚乳酸、硫酸葡聚糖、葡聚糖硫酸钠、硫酸软骨素、软骨素硫酸钠、透明质酸、软骨素、硫酸皮肤素、硫酸乙酰肝素、肝素、硫酸角质素或葡聚糖葡聚糖荧光素阴离子等。

作为在等电点以上的pH值下呈阴离子性的蛋白质或肽，只要是在该物质的等电点以上的pH值下呈阴离子性的蛋白质或肽即可，没有特殊限定。例如可以举出白蛋白、血清类粘蛋白、球蛋白、血纤维蛋白原、组蛋白、精蛋白、核糖核酸酶或溶菌酶等。

作为为阴离子性物质的核酸，例如可以举出DNA、RNA、质粒、siRNA或ODN等，只要为不显示生理活性的物质即可，可以为任意长度、任意序列。

优选附着竞争剂静电地附着在前导粒子上，优选大小为即使附着在前导粒子上也不形成使前导粒子凝集之类的交联的物质，或者在分子内具有附着部分、和排斥附着、抑制前导粒子凝集的部分的物质。

工序1，更具体而言可以采用例如下述的制备方法实施，所述制备方法包括如下步骤，即制备分散有含有凝集抑制物质的前导粒子的液体的步骤、及在分散有该前导粒子的液体中使上述RNA分散或溶解而包含在液体中的步骤(例如，在分散有该前导粒子的液体中，加入该RNA使其分散或溶解的步骤，在分散有该前导粒子的溶液中，加入分散或溶解有该RNA的液体的步骤等)。此处，作为通过在分散有前导粒子的液体中使上述RNA分散或溶解而包含在液体中的工序所获得的复合粒子，具体而言可以举出下述复合离子，即，该RNA附着在作为含有该阳离子性物质的脂质体B的微粒上而形成的复合粒子，上述RNA附着在作为含有阳离子性物质的脂质集合体的微粒上而形成的复合粒子，上述RNA附着在作为含有聚－L－赖氨酸等阳离子性高分子的高分子的微粒上而形成的复合粒子。另外，在分散有前导粒子的液体中使上述RNA分散或溶解而包含在液体中的步骤，优选为使在分散或溶解有该RNA的液体中进一步含有附着竞争剂并将其加入到分散有该前导粒子的液体中的步骤。此时，该RNA和该附着竞争剂一同附着在该前导粒子上，制备复合粒子，由此能够在进一步抑制该复合粒子制备中前导粒子的凝集、及制备后复合粒子的凝集的前提下进行制备。

前导粒子在分散有前导粒子的液体中所占的比例，只要上述RNA能够附着在前导粒子上即可，没有特殊的限制，优选约为1μg/mL～1g/mL，较优选约为0.1～500mg/mL。

工序2)用脂双层膜被覆复合粒子的工序(1)

可以通过包含以下步骤的制备方法制备脂质体A，所述步骤包括制备含有极性有机溶剂的液体(液体A)的步骤，所述极性有机溶剂中分散有工序1所得的复合粒子且溶解了脂双层膜的构成成分，以及通过减小液体A中极性有机溶剂的浓度，用脂双层膜被覆复合粒子的步骤。此时，以分散液(液体B)的形态获得脂质体A。优选液体A中的溶剂是含有极性有机溶剂的溶剂，极性有机溶剂的浓度为该脂双层膜构成成分可以溶解、该复合粒子可以分散的浓度，在减小液体A中极性有机溶剂的浓度而得到的液体B中，该脂双层膜的构成成分可以分散，该复合粒子也可以分散。液体A中的溶剂为极性有机溶剂与除极性有机溶剂之外的溶剂的混合液时，通过加入例如含有能够与极性有机溶剂混合的除极性有机溶剂之外的溶剂(液体C)，及/或通过蒸馏除去、半透膜分离、分馏等选择性地除去极性有机溶剂，能够减小极性有机溶剂的浓度。此处，优选液体C含有除极性有机溶剂之外的溶剂，也可以含有极性有机溶剂，只要该极性有机溶剂的浓度低于液体A中极性有机溶剂的浓度即可。

作为工序2中的除极性有机溶剂之外的溶剂，例如可以举出水、液体二氧化碳、液烃、卤化碳或卤化烃等，优选举出水。另外，液体A及液体C可以含有离子或缓冲成分等。上述溶剂可以单独使用或者组合2种以上进行使用。

极性有机溶剂和除极性有机溶剂之外的溶剂的组合，优选为可以相互混合的溶剂的组合，并可以根据在液体A及液体B中的溶剂及液体C中复合粒子和脂双层膜的构成成分的溶解度等进行选择。优选复合粒子在液体A及液体B中的溶剂及液体C中的溶解度均低，还优选在极性有机溶剂及除极性有机溶剂之外的溶剂中的溶解度也低。脂双层膜的构成成分优选在液体B中的溶剂及液体C中的溶解度低，优选在液体A的溶剂中的溶解度高，并且优选在极性有机溶剂中的溶解度高，优选在除极性有机溶剂之外的溶剂中的溶解度低。此处，所谓“复合粒子的溶解度低”是指复合粒子中含有的前导粒子、RNA及附着竞争剂等各成分在溶剂中的溶出性小，即使各成分各自的溶解度高，只要通过各成分间的键合等使得各成分的溶出性变小也可以。例如，即使为前导粒子中含有的任意成分在液体A的溶剂中的溶解度高的情况，在前导粒子带有正电荷时，通过RNA内的电荷、分子内极化等静电键合能够抑制复合粒子中的成分溶出，由此可以降低复合粒子在液体A的溶剂中的溶解度。即，在脂质体A的制备中，前导粒子带正电荷能够抑制复合粒子的成分溶出，具有提高制备性和成品性的效果。

液体A中极性有机溶剂的浓度，只要脂双层膜的构成成分可溶且复合粒子可以分散即可，没有特殊的限制，根据所用的溶剂或复合粒子、脂双层膜的构成成分的种类等的不同而不同，优选约为30v/v％以上，较优选约为60～90v/v％。另外，液体B中的极性有机溶剂的浓度，只要以比液体A低的浓度含有该极性有机溶剂，且脂双层膜的构成成分及复合粒子都可分散即可，没有特殊的限制，优选约为50v/v％以下。

作为制备液体A的工序，可以举出下述工序，即，混合极性有机溶剂、复合粒子及脂双层膜的构成成分、并根据需要混合除极性有机溶剂之外的溶剂来制备液体A。只要复合粒子不溶解，则加入极性有机溶剂、复合粒子及脂双层膜的构成成分、及根据需要加入的除极性有机溶剂之外的溶剂的顺序没有特殊限制，但优选举出下述工序，即，例如制备含有分散有该复合粒子的极性有机溶剂的液体(液体D)，制备使该脂双层膜的构成成分溶解于含有与液体D中的极性有机溶剂相同或不同的极性有机溶剂的溶剂中的液体(液体E)，再混合液体D和液体E进行制备。混合液体D和液体E制备液体A时，优选缓缓地混合。

工序3)用脂双层膜被覆复合粒子的工序(2)

通过含有如下步骤的制备方法，可以制备脂质体A，此时，脂质体A以分散液的状态获得，所述步骤为使工序1所得的复合粒子及脂双层膜的构成成分分散于液体(液体F)中，所述液体F含有可以溶解该脂双层膜的构成成分的极性有机溶剂，其浓度为该脂双层膜的构成成分可以以分散状态存在的浓度。需要说明的是，液体F中含有可以溶解该脂双层膜的构成成分的极性有机溶剂，是以该脂双层膜的构成成分及复合粒子均可以分散的特定浓度含有该极性有机溶剂的液体。

液体F的制备方法可以采取任意方案。例如可以在制备复合粒子的分散液、和脂双层膜的构成成分的溶解液或分散液之后，将两种液体混合，制备液体F；也可以制备复合粒子或脂双层膜的构成成分中任一方的分散液，在此分散液中加入固态的复合粒子或脂双层膜的构成成分的另一方，使其分散，制备液体F。在将复合粒子的分散液和脂双层膜构成成分的溶解液或分散液混合时，复合粒子的分散介质可以预先含有极性有机溶剂，脂双层膜的构成成分的溶剂或分散介质可以为含有极性有机溶剂的液体或只由极性有机溶剂构成的液体。另一方面，制备复合粒子或脂双层膜的构成成分中任一方的分散液，在该分散液中加入固态的复合粒子或脂双层膜的构成成分的另一方的情况下，该分散液优选为含有极性有机溶剂的液体。需要说明的是，制备液体F后复合粒子不溶解、脂双层膜的构成成分分散时，可以在复合粒子不溶解、脂双层膜的构成成分分散的极性有机溶剂浓度的范围内，加入极性有机溶剂，也可以除去极性有机溶剂或减小浓度。另一方面，制备液体F后复合粒子不溶解，但脂双层膜的构成成分溶解的情况下，可以在复合粒子不溶解、脂双层膜的构成成分分散的极性有机溶剂浓度的范围内，除去极性有机溶剂或减小浓度。另外，可以预先在除极性有机溶剂之外的溶剂中混合复合粒子和脂双层膜的构成成分，可以在复合粒子不溶解、脂双层膜的构成成分分散的极性有机溶剂浓度的范围内向其中加入极性有机溶剂，此时，可以使复合粒子和脂双层膜的构成成分分别分散于除极性有机溶剂之外的溶剂中，混合两分散液后，加入极性有机溶剂，也可以使复合粒子或脂双层膜的构成成分的任一方分散在除极性有机溶剂之外的溶剂中，在此分散液中加入固态的复合粒子或脂双层膜的构成成分的另一方，使其分散后，加入极性有机溶剂。另外，优选包括如下步骤，即，使复合粒子和脂双层膜的构成成分分散的含有极性有机溶剂的液体静置或混合充分时间使脂双层膜被覆复合粒子的步骤。使复合粒子和脂双层膜的构成成分分散在含有极性有机溶剂的液体中后，静置或混合的时间，只要不在使复合粒子和脂双层膜的构成成分分散在含有极性有机溶剂的液体中后立刻结束即可，没有限定，可以根据脂双层膜的构成成分、或含有极性有机溶剂的液体的种类任意地设定，优选设定所得脂质体A的收率为定值的时间，例如约3秒～30分钟。

作为液体F中除极性有机溶剂之外的溶剂，例如可以举出工序2中的除极性有机溶剂之外的溶剂中列举的例子，优选举出水。

液体F中极性有机溶剂的浓度，只要满足复合粒子和脂双层膜的构成成分均分散的条件即可，没有特殊的限制，根据所用溶剂或复合粒子、脂双层膜的构成成分的种类等的不同而不同，优选约为1～80v/v％，较优选约为10～60v/v％，更优选约为20～50v/v％，最优选约为30～40v/v％。

本发明中，所谓“脂双层膜的构成成分可溶解在极性有机溶剂中”，包括下述几种情况，即，脂双层膜的构成成分具有溶解于极性有机溶剂中的性质的情况，脂双层膜的构成成分具有通过使用增溶剂溶解于极性有机溶剂中的性质的情况，脂双层膜的构成成分具有能够在极性有机溶剂中形成凝集体或胶束等，发生乳浊或乳剂化的性质的情况等。另外，所谓“脂双层膜的构成成分分散”，包括下述几种状态，即，脂双层膜的构成成分全部形成凝集体或胶束等，发生乳浊或乳剂化的状态；脂双层膜的构成成分的一部分形成凝集体或胶束等，发生乳浊或乳剂化，剩余部分溶解的状态；脂双层膜的构成成分的一部分形成凝集体或胶束等，发生乳浊或乳剂化，剩余部分沉淀的状态等。需要说明的是，所谓“脂双层膜的构成成分溶解”，不包括脂双层膜的构成成分全部形成凝集体或胶束等，发生乳浊或乳剂化的状态。

本发明中，所谓“复合粒子分散”，是指复合粒子悬浊或乳浊或者乳剂化的状态，包括如下几种状态，即，复合粒子的一部分悬浊或乳浊或者乳剂化，剩余部分溶解的状态；复合粒子的一部分乳浊或者乳剂化，剩余部分沉淀的状态等。所谓“复合粒子不溶解”，与上述“复合粒子分散”的含义相同。

在本发明的脂质体A的制备方法中使用的、含有极性有机溶剂的水溶液中的复合粒子的浓度，只要能够用脂双层膜被覆复合粒子即可，没有特殊的限制，优选约为1μg/mL～1g/mL，较优选约为0.1～500mg/mL。另外，所用的脂双层膜的构成成分的浓度，只要能够被覆复合粒子即可，没有特殊的限制，优选约为1μg/mL～1g/mL，较优选约为0.1～400mg/mL。

脂双层膜相对于本发明的脂质体A的比例，以重量比计优选约为1:0.1～1:1000，较优选约为1:1～1:10。

另外，本发明中的脂质体A的大小，优选平均粒径约为300nm以下，较优选约为200nm以下，具体而言，优选例如可以注射的大小。

并且，可以通过抗体等蛋白质、糖类、糖脂质、氨基酸、核酸、各种低分子化合物或高分子化合物等物质对上述得到的脂质体A进行修饰，通过上述修饰得到的被覆复合粒子也包括在脂质体A中。例如，为了用于靶向，也可以进一步用抗体等蛋白质、肽或脂肪酸类等对上述所得的脂质体A进行脂双层膜的表面修饰[参见D.D.Lasic、F.Martin编写的“StealthLiposomes”(美国)，CRCPressInc，1995年，p.93－102]。另外，也可以用例如水溶性物质的脂质衍生物、脂肪酸衍生物或脂肪烃衍生物对脂质体A任意地进行表面改质。用于上述表面改质的水溶性物质的脂质衍生物、脂肪酸衍生物或脂肪烃衍生物，与上述作为脂双层膜构成成分的水溶性物质的脂质衍生物、脂肪酸衍生物或脂肪烃衍生物的含义相同。

通过将本发明的组合物给与包括人在内的哺乳动物，能够将上述RNA送达到靶基因的表达部位，例如，能够在体内向哺乳动物细胞中导入可抑制基因表达的RNA等，抑制基因等的表达。本发明的组合物中的靶基因例如如果为与肿瘤或炎症相关的基因，则可以将本发明的组合物用作癌症或炎症疾病的治疗剂或预防剂，优选用作实体癌或者血管或血管附近炎症的治疗剂或预防剂。具体而言，本发明的组合物中的靶基因如果为与血管新生相关的基因等，由于能够抑制血管平滑肌的增殖或血管新生等，则本发明的组合物例如可以用作伴随着血管平滑肌的增殖或血管新生的癌症或炎症疾病的治疗剂或预防剂。

即，本发明还提供一种将上述说明的本发明的组合物投与哺乳动物的癌症或炎症疾病的治疗方法。投与对象优选人，较优选患有癌症或炎症疾病的人。

另外，本发明的组合物也可以在与癌症或炎症疾病的治疗剂或预防剂相关的体内筛选体系中用作获取POC(Proofofconcept)]的工具。

本发明的组合物也可以用作达到下述目的的制剂，例如血液成分等生物体成分(例如血液、消化管等)中的上述RNA的稳定化、副作用的降低或增加在含有靶基因的表达部位的组织或脏器中的药物的蓄积等。

将本发明的组合物用作癌症或炎症疾病等的治疗剂或预防剂时，作为给药途径，优选使用治疗时最有效果的给药途径，可以举出口腔内、气管内、直肠内、皮下、肌肉内或静脉内等非口服给药或口服给药，优选举出静脉内给药或肌肉内给药，较优选举出静脉内给药。

给药量根据给药对象的病情、年龄、给药途径等的不同而不同，例如换算为RNA的1天给药量约为0.1μg～1000mg。

作为适于静脉内给药或肌肉内给药的制剂，例如可以举出注射剂，通过上述方法制备的脂质体A的分散液也可以直接作为例如注射剂等形态使用，也可以通过例如过滤、离心等从该分散液中除去溶剂后进行使用，也可以冷冻干燥该分散液或冷冻干燥加入了例如甘露糖醇、乳糖、海藻糖、麦芽糖或甘氨酸等赋形剂的分散剂，进行使用。

为注射剂时，优选在上述的脂质体A的分散液或上述除去了溶剂或冷冻干燥后的脂质体A中，混合例如水、酸、碱、各种缓冲液、生理盐水、氨基酸输液等，制备注射剂。另外，也可以添加例如柠檬酸、抗坏血酸、半胱氨酸或EDTA等抗氧化剂，或甘油、葡萄糖或氯化钠等等渗剂等，制备注射剂。另外，也可以加入例如甘油等冷冻保存剂进行冷冻保存。

在上述说明的本发明的组合物中，作为本发明的癌症或炎症疾病的治疗剂，可以举出含有脂质体A的组合物，所述脂质体A为下述脂质体：含有以前导粒子和下述RNA为构成成分的复合粒子及被覆该复合粒子的脂双层膜的脂质体，该脂双层膜的构成成分可溶解于极性有机溶剂，并且该脂双层膜的构成成分及该复合粒子能够分散在以特定浓度含有该极性有机溶剂的液体中；或者是含有以含有阳离子性物质的前导粒子和下述RNA为构成成分的复合粒子及被覆该复合粒子的脂双层膜的脂质体，该脂双层膜以中性脂质及水溶性物质的脂质衍生物、脂肪酸衍生物或脂肪烃衍生物为构成成分。其中，上述RNA含有与肿瘤或炎症相关的靶基因mRNA的连续15～30个碱基的序列(以下记为序列X₁)及与该序列互补的碱基的序列(以下记为互补序列X₁’)，并且与序列X₁及互补序列X₁’的碱基键合的糖的总计1～90％为2’位上被修饰基团取代的核糖。本发明的癌症或炎症疾病的治疗剂中，作为癌症，优选举出实体癌，作为炎症疾病，优选举出血管或血管附近的炎症。

另外，本发明还提供了上述说明的本发明的组合物在制备癌症或炎症疾病的治疗剂优选实体癌或者血管或血管附近炎症的治疗剂中的应用，所述组合物含有包封有RNA的脂质体A，所述脂质体A为下述脂质体：含有以前导粒子和下述RNA为构成成分的复合粒子及被覆该复合粒子的脂双层膜的脂质体，该脂双层膜的构成成分可溶于极性有机溶剂，该脂双层膜的构成成分及该复合粒子能够分散在以特定浓度含有该极性有机溶剂的液体中；或者含有以含有阳离子性物质的前导粒子和下述RNA为构成成分的复合粒子及被覆该复合粒子的脂双层膜，该脂双层膜以中性脂质及水溶性物质的脂质衍生物、脂肪酸衍生物或脂肪烃衍生物为构成成分。其中，上述RNA含有与肿瘤或炎症相关的靶基因mRNA的连续15～30个碱基的序列(记为序列X₁)及与该序列互补的碱基的序列(记为互补序列X₁’)，并且与序列X₁及互补序列X₁’的碱基键合的糖的总计1～90％为2’位上被修饰基团取代的核糖，。

接下来，根据实施例及试验例，更具体地说明本发明。但是，本发明不限于这些实施例及试验例。

[实施例1]

实施例1中使用的RNA是含有BCL2基因的mRNA的连续19个碱基的序列(以下记为序列X₂)及与该序列互补的碱基的序列(以下记为序列X₂’)的双链RNA[有义链：5’－GmUGmAAmGUmCAmACmAUmGCmCUmGCdTdT－3’(与带有d的碱基键合的糖为脱氧核糖，与从5’－端开始的第2、4、6、8、10、12、14、16、18个的前缀为m的碱基键合的糖为2’－O－甲基取代核糖)(序列号1)、反义链；5’－mGCmAGmGCmAUmGUmUGmACmUUmCAmCdTdT－3’(与前缀为d的碱基键合的糖为脱氧核糖，与从5’－端开始的第1、3、5、7、9、11、13、15、17、19个的带有m的碱基键合的糖为2’－O－甲基取代核糖)(序列号2)](以下称作2’－OMeBCL2siRNAExp.1)，与序列X₂及互补序列X₂’的碱基键合的核糖的总计50％为2’－O－甲基取代核糖。有义链及反义链均从Eurogentec公司(Belgium)获得，通过退火制备双链RNA。

将DOTAP(AvantiPolarLipids公司制)/PEG－DSPE(日本油脂公司制)/蒸馏水(大塚制药公司制)按40mg/16mg/1mL混合，用涡流混合器振动搅拌。将该悬浊液于70℃下通过0.4μm的聚碳酸酯微孔滤膜(Costar公司制)10次、0.2μm的聚碳酸酯微孔滤膜(Whatman公司制)3次、0.1μm的聚碳酸酯微孔滤膜(Corning公司制)10次、再通过0.05μm的聚碳酸酯微孔滤膜(Whatman公司制)20次。采用动态光散射法(DLS)测定所得的前导粒子的平均粒径，结果为73.01nm。

另一方面，将EPC(日本油脂公司制)/PEG－DSPE(日本油脂公司制)/乙醇(和光纯药公司制)/水按15mg/3.125mg/0.625mL/0.375mL混合，制备脂双层膜的构成成分的溶液。

将0.2917mL以24mg/1mL混合2’－OMeBCL2siRNAExp.1/水所得的水溶液混合在0.875mL所得的前导粒子的分散液中，制备复合粒子。将所得的复合粒子的分散液添加到4.667mL脂双层膜的构成成分的溶液中，接着添加1.459mL蒸馏水，添加0.4667mL脂双层膜的构成成分的溶液后，缓缓加入54.31mL蒸馏水，将乙醇的浓度调节至5％以下。对所得的脂质体悬浊液进行超离心(80分钟，110,000×g,25℃)，除去上清液。用约5mL的生理盐水(大塚制药公司制)使生成的沉淀再次悬浊。

采用DLS测定脂质体的平均粒径，结果为92.89nm。另外，进行脂质体内2’－OMeBCL2siRNAExp.1的定量，结果浓度为1.2460mg/mL，相对于加入的2’－OMeBCL2siRNAExp.1的量，回收率为88.02％。最后添加3.270mL生理盐水将2’－OMeBCL2siRNAExp.1浓度调节至0.75mg/mL，得到制剂。

比较例1

比较例1中使用的RNA是含有序列X₂及互补序列X₂’的双链RNA[有义链：5’－GUGAAGUCAACAUGCCUGCdTdT－3’(与带有d的碱基键合的糖为脱氧核糖)(序列号3)、反义链：5’－GCAGGCAUGUUGACUUCACdTdT－3’(与带有d的碱基键合的糖为脱氧核糖)(序列号4)](以下称为BCL2siRNACom.1)。有义链及反义链均从Eurogentec公司(Belgium)获得，通过退火制备双链RNA。

与实施例1同样地在0.5mL所得的前导粒子的分散液中混合24mg/mL的BCL2siRNACom.1水溶液0.1667mL，制备复合粒子。将所得的复合粒子的分散液添加到2.667mL脂双层膜的构成成分的溶液中，接着添加0.8334mL蒸馏水，添加0.2667mL脂双层膜的构成成分的溶液后，缓缓加入31.03mL蒸馏水将乙醇的浓度调节至5％以下。对所得的脂质体悬浊液进行超离心(80分钟,110,000×g,25℃)，除去上清液。用约2mL的生理盐水(大塚制药公司制)使生成的沉淀再次悬浊。

采用DLS测定脂质体的平均粒径，结果为88.31nm。另外，对脂质体内的BCL2siRNACom.1进行定量，结果浓度为1.7332mg/mL，相对于加入的BCL2siRNACom.1的量，回收率为90.09％。最后添加0.3232mL生理盐水将BCL2siRNACom.1浓度调节至1.5mg/mL，得到制剂。

试验例1

将200μL含有实施例1及比较例1中得到的制剂的药液(siRNA浓度750μg/mL)以7天的间隔通过尾静脉给与雄性Balb/c小鼠(6周龄、日本CLEA)2次(给药量为150μg/mouse)。第2次给药后，通过尾动脉在给药0.5、3、7及24小时后的每个时间点取血10μL，添加90μL变性溶液(4mol/L硫氰酸胍、25mmol/L柠檬酸钠、0.1v/v％2－巯基乙醇、0.5w/v％N-月桂酰肌氨酸钠；以下称为D溶液)进行混合，得到10v/v％血液。

在实施例1中所得的制剂的给药组的10v/v％血液的10μL中添加焦碳酸二乙酯水溶液(以相对于超纯水为0.1v/v％的容量添加焦碳酸二乙酯并进行混合)10μL、I.S.溶液(将浓度为0.3μmol/L的上述焦碳酸二乙酯水溶液作为I.S.)10μL、D溶液100μL、2mmol/L乙酸钠(pH4.0)10μL及TE(10mMTris-HClpH8.0,1mMEDTA)饱和苯酚/氯仿溶液(使用以1/1的容量比混合TE饱和苯酚和氯仿后的下层)150μL进行混合，于4℃下、以132000×g离心10分钟。在65μL上清液中添加15μLGenTLE溶液(被上述焦碳酸二乙酯水溶液稀释15倍的GenTLEprecipitationcarrier(TakaraBio))进行混合后，添加200μL乙醇进行混合，于室温下静置10分钟以上。于4℃下、132000×g离心10分钟后，丢弃上清液，在沉淀中添加75v/v％乙醇200μL。于4℃下、以132000×g离心15分钟，丢弃上清液，风干沉淀后，溶解在100μL再溶解液(将焦碳酸二乙酯/三乙胺/六氟异丙醇/水以0.1/0.4/30/1000的容量比混合得到)中。于4℃下、以132000×g离心10分钟，将上清液作为分析样品，用HPLC法定量。结果示于图1。

＜装置＞

HPLC装置：ACQUITYUPLC系统(Waters)

质谱仪：API4000QTRAP(AppliedBiosystems/MDSSciex)

分析软件：Analyst1.4.2(AppliedBiosystems/MDSSciex)

＜HPLC条件＞

内标物质(I.S.)

5’－GmUGmAAmGUmCAmACmAUmGCmCUmGCdT－3’(与带有d的碱基键合的糖为脱氧核糖，与从5’－端开始的第2、4、6、8、10、12、14、16、18个的带有m的碱基键合的糖为2’－O－甲基取代核糖)(序列号5)

5’－mGCmAGmGCmAUmGUmUGmACmUUmCAmCdT－3’(与带有d的碱基键合的糖为脱氧核糖，与从5’－端开始的第1、3、5、7、9、11、13、15、17、19个的带有m的碱基键合的糖为2’－O－甲基取代的核糖)(序列号6)

柱：XbridgeC18(3.5μm、2.1mmI.D.×50mm、Waters)

预滤器：Xbridgeguardcartridge(3.5μm、2.1mmI.D.×10mm、Waters)

柱温：65℃

流动相：三乙胺/六氟异丙醇/水(0.4/30/1000)：甲醇＝93:7～75:25

注入量：25μL

检测：质谱仪(离子化法:电喷雾离子，负离子，离子源温度:500℃)

在比较例1中得到的制剂给药组的10v/v％血液的10μL中添加焦碳酸二乙酯水溶液(以相对于超纯水为0.1v/v％的容量添加焦碳酸二乙酯并进行混合)10μL、I.S.溶液(将浓度为0.3μmol/L的上述焦碳酸二乙酯水溶液作为I.S.)10μL、D溶液100μL、2mmol/L乙酸钠(pH4.0)10μL及酸性饱和苯酚/氯仿溶液(使用以1/1的容量比混合酸性饱和苯酚和氯仿后的下层)150μL进行混合，于4℃下、以132000×g离心10分钟。在65μL上清液中添加GenTLE溶液(用上述焦碳酸二乙酯水溶液将GenTLEprecipitationcarrier(TakaraBio)稀释15倍)15μL进行混合，之后添加200μL乙醇混合，于室温下静置10分钟以上。于4℃下、以132000×g离心10分钟后，丢弃上清液，在沉淀中添加75v/v％乙醇200μL。于4℃下、以132000×g离心15分钟，丢弃上清液，风干沉淀后，溶解在100μL再溶解液(将焦碳酸二乙酯/三乙胺/六氟异丙醇/水以0.1/0.4/30/1000的容量比混合得到)中。于4℃下、以132000×g离心10分钟，以上清液作为分析样品，用HPLC法定量。结果示于图2。

＜装置＞

HPLC装置：ACQUITYUPLCsystem(Waters)

质谱仪：API4000QTRAP(AppliedBiosystems/MDSSciex)

分析软件：Analyst1.4.2(AppliedBiosystems/MDSSciex)

＜HPLC条件＞

内标物质(I.S.)

5’－GUGAAGUCAACAUGCCUGdTdT－3’(与带有d的碱基键合的糖为脱氧核糖)(序列号7)

5’－CAGGCAUGUUGACUUCACdTdT－3’(与带有d的碱基键合的糖为脱氧核糖)(序列号8)

柱：XbridgeC18(3.5μm、2.1mmI.D.×50mm、Waters)

预滤器：Xbridgeguardcartridge(3.5μm、2.1mmI.D.×10mm、Waters)

柱温：65℃

流动相：三乙胺/六氟异丙醇/水(0.4/30/1000)：甲醇＝93:7～75:25

注入量:25μL

检测:质谱仪(离子化法:电喷雾离子,负离子，离子源温度:500℃)

本发明还提供一种简便且精度良好的血液中的siRNA浓度的测定方法。作为本发明的血液中siRNA浓度的测定方法，可以举出以通过下述方法测定siRNA浓度为特征的血液中siRNA浓度的测定方法，所述方法正如上述的试验例1具体说明的那样，优选在共存有与被测定的siRNA具有不同碱基数的核酸作为IS的条件下，加入与核酸形成复合体的试剂，例如加入GenTLE溶液使试液中的siRNA形成电中性的复合体，分离该复合体后，用再溶解液溶解，采用高效液相色谱法分析所得的溶液。

需要说明的是，血液中的siRNA浓度的测定不限于本发明的血液中的siRNA浓度的测定方法，也可以按照常规方法测定血液中的siRNA浓度。

图1及图2显示，给与了实施例1中所得制剂的小鼠与给与了比较例1中所得制剂的小鼠相比，RNA的血液中浓度推移较高。即，表明了与序列X及互补序列X’的碱基键合的糖的总计1～90％为2’位上被修饰基团取代的核糖的本发明的组合物的血中滞留性被进一步改善，能够降低副作用或者增大药物在含有靶基因表达部位的组织或脏器中的蓄积。

[实施例2]

实施例2中使用的RNA是含有BCL2基因mRNA的连续19个碱基的序列(以下记为序列X₃)及与该序列互补的碱基的序列(以下记为互补序列X₃’)的双链RNA[有义链：5’－GmAAmGUmGAmCAmUCmUUmCAmGCmAAdTdT－3’(与带有d的碱基键合的糖为脱氧核糖，与从5’－端开始的第2、4、6、8、10、12、14、16、18个的带有m的碱基键合的糖为2’－O－甲基取代核糖)(序列号9)、反义链：5’－mUUmGCmUGmAAmGAmUGmUCmACmUUmCdTdT－3’(与带有d的碱基键合的糖为脱氧核糖，与从5’－端开始的第1、3、5、7、9、11、13、15、17、19个的带有m的碱基键合的糖为2’－O－甲基取代核糖)(序列号10)](以下称为2’－OMeBCL2siRNAExp.2)，与序列X₃及互补序列X₃’的碱基键合的核糖的总计50％为2’－O－甲基取代核糖。有义链及反义链均从北海道SystemScience获得，通过退火制备双链RNA。

将DOTAP(AvantiPolarLipids公司制)/PEG-DSPE(日本油脂公司制)/蒸馏水(大塚制药公司制)按40mg/16mg/1mL混合，用涡流混合器振动搅拌。将该悬浊液于70℃下通过0.4μm的聚碳酸酯微孔滤膜(Costar公司制)10次、0.2μm的聚碳酸酯微孔滤膜(Whatman公司制)3次、0.1μm的聚碳酸酯微孔滤膜(Corning公司制)10次、再通过0.05μm的聚碳酸酯微孔滤膜(Whatman公司制)20次。采用动态光散射法(DLS)测定所得的前导粒子的平均粒径，结果为70.71nm。

另一方面，将EPC(日本油脂公司制)/PEG-DSPE(日本油脂公司制)/乙醇(和光纯药公司制)/水按15mg/3.125mg/0.625mL/0.375mL混合，制备脂双层膜的构成成分的溶液。

在0.225mL所得的前导粒子的分散液中混合0.075mL以24mg/1mL混合2’－OMeBCL2siRNAExp.2/水所得的水溶液，制备复合粒子。将所得的复合粒子的分散液添加到1.2mL脂双层膜的构成成分的溶液中，接着添加0.375mL蒸馏水，然后添加在40vol％乙醇中按62.5mg/62.5mg/mL溶解有EPC/PEG－DSPE所得的溶液0.12mL，之后，缓缓加入13.965mL蒸馏水，将乙醇的浓度调节至5vol％以下。对所得的脂质体悬浊液进行超离心(80分钟，110,000×g，25℃)，除去上清液。用生理盐水(大塚制药公司制)使生成的沉淀再次悬浊。

采用DLS测定脂质体的平均粒径，结果为88.52nm。另外，对脂质体内的2’－OMeBCL2siRNAExp.2进行定量，结果浓度为2.307mg/mL，相对于加入的2’－OMeBCL2siRNAExp.2量，回收率为87.2％。最后添加0.366mL生理盐水，将2’－OMeBCL2siRNAExp.2浓度调至1.5mg/mL，得到制剂。

[实施例3]

实施例3中使用的RNA，为含有序列X₃及互补序列X₃’的双链RNA[有义链：5’－GmAAmGUmGAmCAmUCmUUmCAmGCmAAdTdT－3’(与带有d的碱基键合的糖为脱氧核糖，与从5’－端开始的第2、4、6、8、10、12、14、16、18个的带有m的碱基键合的糖为2’－O－甲基取代核糖)(序列号11)、反义链：5’－UUGCUGAAGAUGUCACUUCdTdT－3’(与带有d的碱基键合的糖为脱氧核糖)(序列号12)](以下称作2’－OMeBCL2siRNAExp.3)，与序列X₃及互补序列X₃’的碱基键合的核糖的24％为2’－O－甲基取代核糖。有义链及反义链分别从北海道SystemScience获得，通过退火制备双链RNA。

除了用2’－OMeBCL2siRNAExp.3代替2’－OMeBCL2siRNAExp.2之外，与实施例2同样地得到制剂。

采用DLS测定脂质体的平均粒径，结果为91.42nm。

比较例2

比较例2中使用的RNA为含有序列X₃及互补序列X₃’的双链RNA[有义链：5’－GAAGUGACAUCUUCAGCAAdTdT－3’(与带有d的碱基键合的糖为脱氧核糖)(序列号13)、反义链：5’－UUGCUGAAGAUGUCACUUCdTdT－3’(与带有d的碱基键合的糖为脱氧核糖)(序列号14)](以下称为BCL2siRNACom.2)。有义链及反义链均从北海道SystemScience获得，通过退火制备双链RNA。

除了用BCL2siRNACom.2代替2’－OMeBCL2siRNAExp.2之外，与实施例2同样地得到制剂。

采用DLS测定脂质体的平均粒径，结果为96.52nm。

试验例2

将200μL含有实施例2、3及比较例2中所得制剂的药液(siRNA浓度750μg/mL)通过尾静脉以7天的间隔给与雄性Balb/c小鼠(6周龄、日本CLEA)2次(给药量为150μg/mouse)。给与2次后，通过尾动脉在给药0.5、3、7及24小时后的每个时间点取血10μL，添加90μL变性溶液(4mol/L硫氰酸胍、25mmol/L柠檬酸钠、1mmol/L二硫苏糖醇、0.5w/v％N－月桂酰肌氨酸钠；以下称为D溶液)进行混合，得到10v/v％血液。

在各给药组的10v/v％血液的50μL中添加焦碳酸二乙酯水溶液(以相对于超纯水为0.1v/v％的容量添加焦碳酸二乙酯并进行混合)5μL、I.S.溶液(将浓度为0.3μmol/L的上述焦碳酸二乙酯水溶液作为I.S.)10μL、D溶液50μL、2mmol/L乙酸钠(pH4.0)10μL及酸性饱和苯酚/氯仿溶液(使用以1/1的容量比混合酸性饱和苯酚和氯仿后的下层)150μL进行混合，于4℃下、以132000×g离心10分钟。在65μL上清液中添加15μLGenTLE溶液(被上述焦碳酸二乙酯水溶液稀释15倍的GenTLEprecipitationcarrier(TakaraBio))并进行混合后，添加200μL乙醇进行混合，在室温下静置10分钟以上。于4℃下、以132000×g离心10分钟后，丢弃上清液，在沉淀中添加75v/v％乙醇200μL。于4℃下、以132000×g离心15分钟，丢弃上清液，风干沉淀后，溶解在100μL再溶解液(以0.1/0.4/30/1000的容量比混合焦碳酸二乙酯/三乙胺/六氟异丙醇/水)中。于4℃下、以132000×g离心10分钟，将上清液作为分析样品，用HPLC法定量。结果分别示于图3～5。

＜装置＞

HPLC装置：ACQUITYUPLCsystem(Waters)

质谱仪：API4000QTRAP(AppliedBiosystems/MDSSciex)

分析软件：Analyst1.4.2(AppliedBiosystems/MDSSciex)

＜HPLC条件＞

实施例2：5’－GmUGmAAmGUmCAmACmAUmGCmCUmGCdT－3’(与带有d的碱基键合的糖为脱氧核糖，与从5’－端开始的第2、4、6、8、10、12、14、16、18个的带有m的碱基键合的糖为2’－O－甲基取代核糖)(序列号15)

5’－mGCmAGmGCmAUmGUmUGmACmUUmCAmCdT－3’(与带有d的碱基键合的糖为脱氧核糖，从5’－端开始的第1、3、5、7、9、11、13、15、17、19的带有m的碱基键合的糖为2’－O－甲基取代核糖)(序列号16)

实施例3：5’－GmUGmAAmGUmCAmACmAUmGCmCUmGCdT－3’(与带有d的碱基键合的糖为脱氧核糖，与从5’－端开始的第2、4、6、8、10、12、14、16、18个的带有m的碱基键合的糖为2’－O－甲基取代的核糖)(序列号17)

5’－GCAGGCAUGUUGACUUCACdT－3’(与带有d的碱基键合的糖为脱氧核糖)(序列号18)

比较例2：5’－GUGAAGUCAACAUGCCUGCdT－3’(与带有d的碱基键合的糖为脱氧核糖)(序列号19)

5’－GCAGGCAUGUUGACUUCACdT－3’(与带有d的碱基键合的糖为脱氧核糖)(序列号20)

柱：XbridgeC18(3.5μm、2.1mmI.D.×50mm、Waters)

预滤器：Xbridgeguardcartridge(3.5μm、2.1mmI.D.×10mm、Waters)

柱温：65℃

流动相：三乙胺/六氟异丙醇/水(0.4/30/1000)：甲醇＝93:7～75:25

注入量:25μL

图3～5显示，给与了实施例2及3中所得制剂的小鼠与给与了比较例2中所得制剂的小鼠相比，RNA的血液中浓度推移较高。即，表明与序列X及互补序列X’的碱基键合的糖的总计1～90％为2’位上被修饰基团取代的核糖的本发明的组合物的血中滞留性被进一步改善，能够降低副作用或者增大药物在含有靶基因表达部位的组织或脏器中的蓄积。

[实施例4]

实施例4中使用的RNA是含有BCL2基因的mRNA的连续23个碱基的序列(以下记为序列X₄)及与该序列互补的碱基的序列(以下记为互补序列X₄’)的双链RNA[有义链：5’－GmAAmGUmGAmCAmUCmUUmCAmGCmAAmAUmAAdAdC－3’(与带有d的碱基键合的糖为脱氧核糖，与从5’－端开始的第2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22个的带有m的碱基键合的糖为2’－O－甲基取代的核糖)(序列号21)、反义链：5’－GUmUUmAUmUUmGCmUGmAAmGAmUGmUCmACmUUmCmUmU－3’(与从5’－端开始的第3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、23、25～27个的带有m的碱基键合的糖为2’－O－甲基取代核糖)(序列号22)](以下称为2’－OMeBCL2siRNAExp.4)，与序列X₄及互补序列X₄’的碱基键合的核糖的总计50％为2’－O－甲基取代核糖。有义链及反义链均从北海道SystemScience获得，通过退火制备双链RNA。

将DOTAP(AvantiPolarLipids公司制)/PEG－DSPE(日本油脂公司制)/蒸馏水(大塚制药公司制)按40mg/16mg/1mL混合，用涡流混合器振动搅拌。将该悬浊液于70℃下通过0.4μm的聚碳酸酯微孔滤膜(Costar公司制)10次、0.2μm的聚碳酸酯微孔滤膜(Whatman公司制)5次、0.1μm的聚碳酸酯微孔滤膜(Corning公司制)10次、再通过0.05μm的聚碳酸酯微孔滤膜(Whatman公司制)20次。采用动态光散射法(DLS)测定所得的前导粒子的平均粒径，结果为72.93nm。

在所得的前导粒子的分散液0.0125mL中混合0.00417mL以24mg/1mL混合2’－OMeBCL2siRNAExp.4/水所得的水溶液，制备复合粒子。将所得的复合粒子的分散液添加到0.06667mL脂双层膜的构成成分的溶液中，接着添加0.02083mL蒸馏水。然后添加在40vol％乙醇中按62.5mg/62.5mg/mL溶解有EPC/PEG－DSPE所得的溶液0.00667mL，然后缓缓加入0.7758mL蒸馏水，将乙醇的浓度调节至5vol％以下。用食盐水使所得的脂质体悬浊液等渗。然后用生理盐水(大塚制药公司制)使最终液体容量为1mL，将2’－OMeBCL2siRNAExp.4浓度调节为0.1mg/mL，得到制剂。

采用DLS测定脂质体的平均粒径，结果为87.50nm。

比较例3

比较例3中使用的RNA为含有序列X₄及互补序列X₄’的双链RNA[有义链：5’－GAAGUGACAUCUUCAGCAAAUAAdAdC－3’(与带有d的碱基键合的糖为脱氧核糖)(序列号23)、反义链：5’－GUUUAUUUGCUGAAGAUGUCACUUCUU－3’(序列号24)](以下称为BCL2siRNACom.3)。有义链及反义链均从北海道SystemScience获得，通过退火制备双链RNA。

除了用BCL2siRNACom.3代替2’－OMeBCL2siRNAExp.4之外，与实施例4同样地得到制剂。

采用DLS测定脂质体的平均粒径，结果为94.32nm。

试验例3

将100μL含有实施例4及比较例3中所得制剂的药液(siRNA浓度50μg/mL)通过尾静脉以7天间隔给与雄性Balb/c小鼠(6周龄、日本CLEA)2次(给药量为5μg/mouse)。给与第2次后，通过尾动脉在投与3小时后的时间点取血10μL，添加90μL变性溶液(4mol/L硫氰酸胍、25mmol/L柠檬酸钠、1mmol/L二硫苏糖醇、0.5w/v％N－月桂酰肌氨酸钠；以下称为D溶液)进行混合，得到10v/v％血液。

在各给药组的10v/v％血液的100μL中添加焦碳酸二乙酯水溶液(以相对于超纯水为0.1v/v％的容量添加焦碳酸二乙酯并进行混合)10μL、I.S.溶液(将浓度为0.3μmol/L的上述焦碳酸二乙酯水溶液作为I.S.)10μL、2mmol/L乙酸钠(pH4.0)10μL及酸性饱和苯酚/氯仿溶液(使用将酸性饱和苯酚和氯仿以1/1的容量比混合后的下层)150μL进行混合，于4℃下、以132000×g离心10分钟。在30μL上清液中添加10μLGenTLE溶液(被上述焦碳酸二乙酯水溶液稀释15倍的GenTLEprecipitationcarrier(TakaraBio))并进行混合，之后，添加100μL乙醇进行混合，于室温下静置10分钟以上。于4℃下、以132000×g离心10分钟后，丢弃上清液，在沉淀中添加75v/v％乙醇100μL。于4℃下、以132000×g离心15分钟后，丢弃上清液，风干沉淀后，溶解于50μL再溶解液(以0.1/0.4/30/1000的容量比混合焦碳酸二乙酯/三乙胺/六氟异丙醇/水)中。于4℃下、以132000×g离心10分钟，以上清液作为分析样品，采用HPLC法定量。结果分别示于图6及图7。

＜装置＞

HPLC装置：ACQUITYUPLCsystem(Waters)

质谱仪：API4000QTRAP(AppliedBiosystems/MDSSciex)

分析软件：Analyst1.4.2(AppliedBiosystems/MDSSciex)

＜HPLC条件＞

内标物质(I.S.)

实施例4：5’－GmUGmAAmGUmCAmACmAUmGCmCUmGCdT－3’(与带有d的碱基键合的糖为脱氧核糖，与从5’－端开始的第2、4、6、8、10、12、14、16、18个的带有m的碱基键合的糖为2’－O－甲基取代核糖)(序列号25)

5’－mGCmAGmGCmAUmGUmUGmACmUUmCAmCdT－3’(与带有d的碱基键合的糖为脱氧核糖，与从5’－端开始的第1、3、5、7、9、11、13、15、17、19个的带有m的碱基键合的糖为2’－O－甲基取代核糖)(序列号26)

比较例3：5’－GUGAAGUCAACAUGCCUGCdT－3’(与带有d的碱基键合的糖为脱氧核糖(序列号27)

5’－GCAGGCAUGUUGACUUCACdT－3’(与带有d的碱基键合的糖为脱氧核糖)(序列号28)

柱：XbridgeC18(3.5μm、2.1mmI.D.×50mm、Waters)

预滤器：Xbridgeguardcartridge(3.5μm、2.1mmI.D.×10mm、Waters)

柱温：65℃

流动相：三乙胺/六氟异丙醇/水(0.4/30/1000)：甲醇＝93:7～75:25

注入量:25μL

图6及图7显示，给与了实施例4中所得制剂的小鼠与给与了比较例3中所得制剂的小鼠相比，RNA的血液中浓度推移较高。即，表明了与序列X及互补序列X’的碱基键合的糖的总计1～90％为2’位上被修饰基团取代的核糖的本发明的组合物的血中滞留性被进一步改善，能够降低副作用或者增大药物在含有靶基因表达部位的组织或脏器中的蓄积。

产业上的可利用性

通过将本发明的含有脂质体的组合物给与哺乳动物等，所述脂质体包封有RNA，所述RNA含有靶基因mRNA的连续15～30个碱基的序列及与该序列互补的碱基的序列，能够抑制该靶基因的表达。

序列表自由文本

序列号1－实施例1的siRNA有义链

序列号2－实施例1的siRNA反义链

序列号3－比较例1的siRNA有义链

序列号4－比较例1的siRNA反义链

序列号5－实施例1的siRNA有义链用IS

序列号6－实施例1的siRNA反义链用IS

序列号7－比较例1的siRNA有义链的IS

序列号8－比较例1的siRNA反义链的IS

序列号9－实施例2的siRNA有义链

序列号10－实施例2的siRNA反义链

序列号11－实施例3的siRNA有义链

序列号12－实施例3的siRNA反义链

序列号13－比较例2的siRNA有义链

序列号14－比较例2的siRNA反义链

序列号15－实施例2的siRNA有义链用IS

序列号16－实施例2的siRNA反义链用IS

序列号17－实施例3的siRNA有义链用IS

序列号18-实施例3的siRNA反义链用IS

序列号19－比较例2的siRNA有义链的IS

序列号20－比较例2的siRNA反义链的IS

序列号21－实施例4的siRNA有义链

序列号22－实施例4的siRNA反义链

序列号23－比较例3的siRNA有义链

序列号24－比较例3的siRNA反义链

序列号25－实施例4的siRNA有义链用IS

序列号26－实施例4的siRNA反义链用IS

序列号27－比较例3的siRNA有义链的IS

序列号28－比较例3的siRNA反义链的IS

序列号29－bcl2mRNA

Claims

1.一种组合物，含有包封了RNA的脂质体，所述RNA含有靶基因mRNA的连续15～30个碱基的序列(以下记为序列X)及与所述序列X互补的碱基的序列(以下记为互补序列X’)，与序列X及互补序列X’的碱基键合的糖的总计30～55％为在2’位上被2’－O－甲基、2’－O－乙基及2’－氟中的任一个取代的核糖，所述脂质体是可到达包含靶基因表达部位的组织或脏器的脂质体，

其中，所述RNA是具有利用RNA干涉(RNAi)抑制所述靶基因表达的作用的RNA，所述靶基因是血管内皮生长因子、血管内皮生长因子受体、纤维芽细胞生长因子、纤维芽细胞生长因子受体、血小板衍生生长因子、血小板衍生生长因子受体、肝细胞生长因子、肝细胞生长因子受体、Kruppel样因子、Ets转录因子、核因子及低氧诱导因子中的任一种的基因。

2.如权利要求1所述的组合物，其中，所述脂质体是具有可静脉内给药的大小的脂质体。

3.如权利要求1所述的组合物，其中，所述mRNA是人或小鼠的mRNA。

4.如权利要求1～3中任一项所述的组合物，其中，所述包封了RNA的脂质体含有复合粒子及被覆所述复合粒子的脂双层膜，所述复合粒子包含前导粒子和所述RNA，

其中，所述脂双层膜的构成成分可溶于极性有机溶剂，所述脂双层膜的构成成分及所述复合粒子可以分散在以特定浓度含有所述极性有机溶剂的液体中。

5.如权利要求4所述的组合物，其中，所述极性有机溶剂为醇。

6.如权利要求4所述的组合物，其中，所述极性有机溶剂为乙醇。

7.如权利要求6所述的组合物，其中，所述前导粒子是含有阳离子性物质的前导粒子，所述脂双层膜是包含中性脂质及水溶性物质的脂质衍生物、脂肪酸衍生物或脂肪烃衍生物的脂双层膜。

8.如权利要求1～3中任一项所述的组合物，其中，所述包封了RNA的脂质体是含有复合粒子及被覆所述复合粒子的脂双层膜的脂质体，所述复合粒子包含含有阳离子性物质的前导粒子和所述RNA，

其中，所述脂双层膜是包含中性脂质及水溶性物质的脂质衍生物、脂肪酸衍生物或脂肪烃衍生物的脂双层膜。

9.如权利要求7所述的组合物，其中，所述阳离子性物质为选自N－[1－(2，3－二油酰丙基)]－N，N，N－三甲基氯化铵、N－[1－(2，3－二油酰丙基)]－N，N－二甲基胺、N－[1－(2，3－二油基氧基丙基)]－N，N，N－三甲基氯化铵、N－[1－(2，3－双十四烷氧基丙基)]－N，N－二甲基－N－羟乙基溴化铵及3β－[N－(N’，N’－二甲基氨基乙基)氨基甲酰基]胆固醇中的一种以上。

10.如权利要求7所述的组合物，其中，所述水溶性物质的脂质衍生物、脂肪酸衍生物或脂肪烃衍生物为聚乙二醇－磷脂酰乙醇胺。

11.如权利要求8所述的组合物，其中，所述水溶性物质的脂质衍生物、脂肪酸衍生物或脂肪烃衍生物为聚乙二醇－磷脂酰乙醇胺。

12.一种癌症或炎症疾病的治疗剂，所述治疗剂含有脂质体，所述脂质体含有复合粒子及被覆所述复合粒子的脂双层膜，

所述复合粒子包含前导粒子和RNA，所述RNA含有与肿瘤或炎症相关的靶基因mRNA的连续15～30个碱基的序列(以下记为序列X₁)及与所述序列互补的碱基的序列(以下记为互补序列X₁’)，与序列X₁及互补序列X₁’的碱基键合的糖的总计30～55％为在2’位上被2’－O－甲基、2’－O－乙基及2’－氟中的任一个取代的核糖，

其中，所述脂双层膜的构成成分可溶于极性有机溶剂，所述脂双层膜的构成成分及所述复合粒子能够分散在以特定浓度含有所述极性有机溶剂的液体中，

13.如权利要求12所述的癌症或炎症疾病的治疗剂，其中，所述极性有机溶剂为醇。

14.如权利要求12所述的癌症或炎症疾病的治疗剂，其中，所述极性有机溶剂为乙醇。

15.如权利要求12～14中任一项所述的癌症或炎症疾病的治疗剂，其中，所述前导粒子为含有阳离子性物质的前导粒子，所述脂双层膜是包含中性脂质及水溶性物质的脂质衍生物、脂肪酸衍生物或脂肪烃衍生物的脂双层膜。

16.一种癌症或炎症疾病的治疗剂，所述治疗剂含有复合粒子及被覆所述复合粒子的脂双层膜，

所述复合粒子包含含有阳离子性物质的前导粒子和RNA，所述RNA含有与肿瘤或炎症相关的靶基因mRNA的连续15～30个碱基的序列(序列X₁)及与所述序列互补的碱基的序列(互补序列X₁’)，与序列X₁及互补序列X₁’的碱基键合的糖的总计30～55％为在2’位上被2’－O－甲基、2’－O－乙基及2’－氟中的任一个取代的核糖，

其中，所述脂双层膜是包含中性脂质及水溶性物质的脂质衍生物、脂肪酸衍生物或脂肪烃衍生物的脂双层膜，

17.如权利要求15所述的癌症或炎症疾病的治疗剂，其中，所述水溶性物质的脂质衍生物、脂肪酸衍生物或脂肪烃衍生物为聚乙二醇－磷脂酰乙醇胺。

18.如权利要求16所述的癌症或炎症疾病的治疗剂，其中，所述水溶性物质的脂质衍生物、脂肪酸衍生物或脂肪烃衍生物为聚乙二醇－磷脂酰乙醇胺。

19.如权利要求12所述的癌症或炎症疾病的治疗剂，其中，所述mRNA是人或小鼠的mRNA。

20.如权利要求16所述的癌症或炎症疾病的治疗剂，其中，所述mRNA是人或小鼠的mRNA。